PfMDR1和PfCRT多态性赋予疟疾寄生虫多药耐药性和侧支药物敏感性的机制基础
莎拉·赫克马特·沙菲克 ，萨希卡娜塔莎·理查兹 ，本·科里，罗伊娜·伊丽莎白·马丁
出版日期： 2022年05月04日-厦门杂志期刊论文发表
象
恶性疟原虫多药耐药蛋白1（pfmdr1）基因和恶性疟原虫氯喹耐药转运蛋白（pfcrt）基因中的多态性改变了疟疾寄生虫对当前大多数抗疟药物的易感性。然而，PfMDR1促成多药耐药性的确切机制尚未得到充分阐明，也不明白为什么pfmdr1和pfcrt中的多态性同时导致氯喹耐药性会增加寄生虫对苯芫蒽碱和甲氟喹的敏感性 - 这种现象称为附带药物敏感性。在这里，我们提出了一种强大的PfMDR1在非洲爪蟾卵母细胞中的表达系统，该系统能够对蛋白质进行直接和高分辨率的生化表征。我们表明野生型PfMDR1运输多种药物，包括苯芪蒽碱，甲氟喹，双氢青蒿素，哌喹，阿莫地喹，亚甲蓝和氯喹（但不是抗病毒药物金刚烷胺）。PfMDR1的现场衍生突变同种型与野生型蛋白质不同，并且彼此在运输这些药物的能力方面存在差异，这表明PfMDR1诱导的寄生虫消化液泡（DV）和细胞质基质之间药物分布的变化是抗疟耐药性和多药耐药表型之间变异性的关键驱动因素。值得注意的是，在耐氯喹分离株中流行的PfMDR1亚型表现出氯喹，苯芪蒽碱和甲氟喹转运能力降低。我们观察到PfCRT中氯喹耐药性突变与药物运输活性之间的相反关系。使用我们建立的用于表征非洲爪蟾卵母细胞系统和活寄生虫测定中PfCRT的测定，我们证明这些PfCRT亚型运输所有3种药物，而野生型PfCRT则不然。我们提出了一种侧支药物敏感性的机制模型，其中PfMDR1和PfCRT的突变亚型导致氯喹，苯苉碱和甲氟喹留在细胞质基质中，而不是隔离在DV内。药物分布的这种变化增加了苯芴蒽碱和甲氟喹获得其主要靶标（被认为位于DV之外）的途径，同时减少了氯喹在DV内获得其靶标的机会。这里介绍的机制见解为开发通过利用抗疟药对PfCRT和PfMDR1施加的相反选择力来延长抗疟药使用寿命的方法提供了基础。
引文： Shafik SH，Richards SN，Corry B，Martin RE（2022）PfMDR1和PfCRT中多态性赋予疟疾寄生虫的多药耐药性和侧支药物敏感性的机制基础。https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616
学术编辑： Andrew Fraser Read，宾夕法尼亚州立大学，美国
收到： 八月 23， 2021;接受： 三月 31， 2022;发表： 五月 4， 2022
版权所有： ? 2022 Shafik et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。
资金： 这项工作得到了澳大利亚研究委员会（奖学金FT160100226到R.E.M），国家卫生和医学研究委员会（项目赠款1127338到R.E.M和研究金1053082到R.E.M）和澳大利亚教育部（澳大利亚研究生奖给S.H.S.和S.N.R.）的支持。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
相互竞争的利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。
缩写：： ABC，ATP结合盒;BLAST，基本局部对齐搜索工具;应用公里，明显的迈克尔斯常数;应用Vmax，表观最大速度;原液，离散优化的蛋白质能量;DV，消化液泡;HA，血凝素;NBD，核苷酸结合结构域;ne，非表达性卵母细胞;PfCRT，恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白;PfMDR1，恶性疟原虫多药抗药蛋白1;PfNT1，恶性疟原虫核苷转运蛋白1;P-gp，P-糖蛋白;VMD， 视觉分子动力学
介绍
阐明疟疾寄生虫获得多药耐药性的分子机制对于正在进行的控制和消除疟疾的努力至关重要。2 个基因的多态性与在寄生虫田间分离株中发现的许多多药耐药表型相关 — 恶性疟原虫多药耐药蛋白 1 （pfmdr1） 基因和恶性疟原虫氯喹抗转运蛋白 （pfcrt） 基因。PfMDR1和PfCRT的突变和/或pfmdr1拷贝数的变化可以改变寄生虫对各种药剂的易感性，包括大多数当前的抗疟药物和开发管道中的一些抗疟候选药物[1]。此外，PfMDR1和PfCRT的某些场同种型增加了寄生虫对苯芪蒽碱、甲氟喹和双氢青蒿素的敏感性，同时增加了对氯喹和阿莫地喹的耐药性[2-4]。然而，这种附带药物敏感性模式的分子基础-即对一种抗疟药物的耐药性导致对另一种抗疟药物的敏感性-仍未解决。
PfMDR1和PfCRT存在于寄生虫消化液泡（DV）的膜中，溶酶体型室（pH 5.0至5.5），其中许多抗疟药在其中积聚，起作用和/或被激活。因此，这两种蛋白质都处于理想的位置，可以调节寄生虫对许多不同药物的易感性。PfMDR1和PfCRT除了在介导多药耐药性方面的作用外，对寄生虫的存活至关重要，因此它们本身也是潜在的药物靶点[1，5]。异源表达系统在表征PfCRT的自然功能及其在多药耐药性中的作用方面具有无可估量的价值[6-14]。PfCRT通常介导血红蛋白衍生肽从DV到寄生虫细胞质基质的H依赖性转运[10]，但与耐药性相关的突变（通常包括具有N75E或N326D的K76T[7，15-17]）改变其底物范围，以包括许多其他化合物，如氯喹，奎宁，喹那克林和亚甲蓝以及抗病毒药物金刚烷胺[6-9，18-22]。这使得PfCRT的突变亚型能够将这些药物从DV（它们通常会积聚的地方）转运回寄生虫的细胞质基质中。+
人们对PfMDR1的功能知之甚少。与多药耐药性和侧支药物敏感性相关的pfmdr1多态性包括N86Y和N1042D。这些突变与寄生虫对氯喹（N86Y）[23-28]或奎宁（N1042D）[29]的敏感性降低以及寄生虫对苯芫蒽碱和甲氟喹的敏感性随之增加有关[3，4，23，24，29-35]。然而，目前尚不清楚这些突变或pfmdr1中的任何其他多态性如何改变寄生虫对药物的易感性。PfMDR1是一种假定的ATP结合盒（ABC）转运蛋白（即，消耗ATP以使其电化学梯度移动溶质的泵）和人P-糖蛋白（P-gp）的同源物，其介导癌细胞中的多药耐药性。PfMDR1的ATP酶结构域位于膜的胞质表面，表明它将溶质转运到DV中[36]。在异源表达系统中表征PfMDR1的尝试尚未提供可靠的结果和/或对其转运活性的直接测量[1]。例如，试图在非洲爪蟾卵母细胞中表达PfMDR1导致转运信底比较差[37]，其他努力没有直接测量药物转运，因此仅从ATP酶活性中推断PfMDR1的功能[38-41]（一项研究随后被撤回[42]）。
我们试图为PfMDR1的异源表达开发一种可靠的系统，该系统能够详细检查其运输特性，从而解决其在多药耐药性和附带药物敏感性中的作用。使用非洲爪蟾卵母细胞，我们实现了一个强大的表达系统，该系统提供了非常高的转运信背景比，并允许通过PfMDR1直接和高分辨率地测量药物转运。我们的研究结果表明，野生型PfMDR1运输结构多样化的抗疟药物，包括苯芫定碱、双氢青蒿素、哌喹和亚甲蓝，以及已知的人P-gp底物（例如，长春花碱和罗丹明B[43-45]）。我们通过显示（1）PfMDR1介导的传输的时间和ATP依赖性来提供对我们系统的广泛验证;（2）人P-gp抑制剂抑制PfMDR1;（3）没有与金刚烷胺的相互作用（金刚烷胺也不与人P-gp相互作用[46-48]）。
在所有一种情况下，将场源性突变引入PfMDR1会降低蛋白质的药物转运活性，并且我们还观察到突变同种型之间以及给定同种型的药物之间的转运能力差异。唯一的例外是突变同种型，相对于野生型PfMDR1，抗疟药奎宁和奎尼丁表现出增强的转运。通过生成PfMDR1的同源模型，我们突出了奎宁与转运蛋白结合腔之间的相互作用，并提出这创造了奎宁和奎尼丁特异性的替代结合位点。
将药物从其主要靶标中隔离是一种常见的耐药机制，我们发现PfMDR1的多种场同种型具有不同的转运能力，这表明药物在DV和细胞质基质之间的再分布是pfmdr1中的多态性有助于多药耐药表型的关键机制。我们通过描述PfMDR1和PfCRT在疟疾寄生虫中观察到的苯芫蒴碱，甲氟喹和氯喹的附带药物敏感性模式中的作用来扩展这些机制见解。我们证明野生型PfMDR1比突变的PfMDR1亚型具有更大的这些药物的运输能力。我们观察到PfCRT的相反趋势：赋予PfCRT氯喹转运活性的突变也允许蛋白质转运苯芫蒽碱和甲氟喹，而野生型蛋白缺乏这些活性。因此，当一起存在时，PfMDR1和PfCRT的突变同种型会改变这3种药物的分布，使得它们保留在细胞质基质中而不是在DV内积聚。这显然增加了苯芴碱和甲氟喹获得其主要靶标的机会（甲氟喹被认为在寄生虫细胞质基质中起作用[49，50]，目前尚不清楚苯芪蒽碱的靶标），从而增强其抗疟活性。相比之下，氯喹的杀伤作用（主要用于对抗DV内血红素的解毒）[51，52]被大大降低。总之，我们的数据集为PfMDR1和PfCRT如何促进多药耐药表型提供了重要的新机制见解。
结果
人P-gp和PfMDR1在非洲爪蟾卵母细胞中的表达和功能表征
由于人类转运蛋白在卵母细胞中表达相对简单[53]，因此人类P-gp首先在非洲爪蟾卵母细胞中表达，以优化表达条件并开发转运测定法。然后将优化的方法应用于PfMDR1.通过微注射tritiated版本的长春花碱（[3H]长春花碱;人P-gp的已知底物）进入卵母细胞并测量其流出量（图1A）。鉴于微注射到卵母细胞中的cRNA的数量与[3测量的H]长春花碱转运大约在2.5和10ng之间线性（图1B），所有后续实验都使用卵母细胞微注射10ng人P-gp cRNA。接下来，我们确定[3H]长春花碱通过人P-gp与时间近似线性至少2小时（图1C）。因此，所有后续的运输测量都是在1.5小时内进行的。确认 [3在这些测定中检测到的H]长春花碱转运由人P-gp介导（并且不是由于[3来自卵母细胞的H]长春花碱），已知与转运蛋白相互作用的化合物（尼卡地平[46，54]，PSC833 [55，56]，钒酸盐[57，58]和维拉帕米[46，59]）被证明抑制[3H]长春花碱外排量（图1D和S2图）。此外，[3H]长春花碱转运不受金刚烷胺的影响，金刚烷胺是一种人类P-gp不与之相互作用的药物[46-48]（图1D）。最后，我们发现人P-gp的其他已知底物，如罗丹明B，喹那克林和亚甲蓝，也被人类P-gp在我们的卵母细胞系统中运输（S1数据）。这些实验中使用的阴性对照是非表达卵母细胞（ne）和表达不相关转运蛋白的卵母细胞，恶性疟原虫核苷转运蛋白1（PfNT1;S1 图）[60，61].[3H]长春花碱来自阴性对照卵母细胞，很可能是由于药物的中性物质的简单扩散（图1C和1D）。总之，这些数据集证实了我们已经在非洲爪蟾卵母细胞中实现了人P-gp的功能表达，优化过程产生了相对较高的长春花碱（304±10 fmol / oocyte / h）和人类P-gp的其他已知底物（S1 Data）的运输率，以及高运输信背景比（约28倍）。
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图 1. 功能性人P-gp和PfMDR1在非洲爪蟾卵母细胞中的异源表达。
（a） 示意图显示[3H]药物通过人类P-gp或PfMDR1在非洲爪蟾卵母细胞系统中。（b）注射到卵母细胞中的人P-gp cRNA的数量与人P-gp介导的水平之间的关系[3H]长春花碱运输测量。（c） [3H]长春花碱通过人P-gp与时间近似线性，至少2小时。（d） 人类 P-gp 介导的 [3来自卵母细胞的H]长春花碱被已知的转运蛋白抑制剂（尼卡地平，PSC8333，钒酸盐和维拉帕米）降低，并且不受金刚烷胺（一种不与人P-gp相互作用的药物）的影响。（e） 本研究中描述的PfMDR1的场同种型。与野生型氨基酸序列不同的残基呈灰色阴影。（f） 免疫荧光显微镜图像证实PfMDR1定位于卵母细胞质膜上。3xHA标记的PfMDR1的表达奈森德导致色素层外部的荧光条带，表明蛋白质在卵母细胞表面表达。乐队没有出现在ne中。比例尺的长度为50μm。显示卵母细胞表面存在其他HA标记的PfMDR1亚型的图像显示在S4图中。（g）表达不同3xHA-PfMDR1亚型的卵母细胞膜中PfMDR1蛋白水平的半量化表明，7种亚型以相似的水平表达。（h） [ 的运输3H]长春花碱通过PfMDR1.（i）[3来自表达PfMDR1的卵母细胞的H]苯苉碱奈森德被尼卡地平，PSC8333，钒酸盐和维拉帕米还原，并且不受金刚烷胺的影响。（j） PfMDR1数量之间的关系奈森德cRNA微注射到卵母细胞和PfMDR1水平奈森德-介导 [3H]测量的苯芪碱转运。（k） [3H]通过PfMDR1的苯芪苋碱奈森德与时间近似线性，至少2小时。（l）显微注射额外的ATP进入卵母细胞受到极大刺激[3H]通过PfMDR1的苯芴碱运输断续器.数据是n = 4到9个独立实验的平均值，每个实验产生相似的结果，并叠加为面板d，g，h和i中的单个数据点，误差是SEM。在不可见的情况下，误差线落在交易品种内。星号表示与人类P-gp（图d），3xHA-PfMDR1的显着差异奈森德（面板 g），或 PfMDR1奈森德（图h和i）;P < 0.001， ns， 不显著（单因子方差分析）。此图的基础数据在 S3 数据中提供。ne，非表达性卵母细胞;PfMDR1，恶性疟原虫多药抗药蛋白1;P-gp，P-糖蛋白。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.g001
然后将优化的方法和测定应用于野生型PfMDR1（PfMDR1奈森德），PfMDR1（PfMDR1）的5种田间突变同种型NFSDD， PfMDR1YYSND， PfMDR1财政年度， PfMDR1断续器和 PfMDR1断续器）以及PfMDR1的催化非活性版本奈森德 (图1E，S1表，S3图和S1文件）。后者含有蛋白质核苷酸结合结构域（NBDs）中的突变，这些突变阻碍了ATP水解。免疫荧光测定证实了卵母细胞质膜上存在每种亚型的血凝素（HA）标记版本（图1F和S4图）。此外，PfMDR1在卵母细胞质膜中采用与寄生虫DV膜相同的取向[36]，其氨基末端和羧基末端位于细胞质基质中（S4图）。半定量蛋白质印迹分析和总蛋白的密度测定评估证实，每种PfMDR1亚型在卵母细胞膜中的表达水平相当（图1G，S5图和S1文本）。因此，这些PfMDR1亚型之间药物转运活性的任何差异都可以归因于其转运特性（以及它们携带的突变）的差异，而不是表达水平的差异。
PfMDR1 的所有 6 种场同种型均已传输 [3H]长春花碱，尽管程度不同（图1H）。PfMDR1的催化非活性版本奈森德表现出非常低水平的[3H]长春花碱转运活性，与阻碍ATP水解的NBD突变一致。PfMDR1的能力奈森德以传输 [3然后在没有或存在人P-gp抑制剂的情况下测试H]苯芫蒽碱（图1I）。The PfMDR1奈森德-介导的 [3H]苯芫蒽碱被尼卡地平，PSC833，钒酸盐和维拉帕米抑制，但不受金刚烷胺的影响（图1I和S2图）。PfMDR1的量之间的关系奈森德cRNA微注射到卵母细胞中并且水平[3H]苯芴碱运输与[3H]长春花碱通过人P-gp（含10ng PfMDR1）奈森德cRNA落在线性范围内）（图1J）和[3H]通过PfMDR1的苯芪苋碱奈森德至少2小时也与时间近似线性（图1K）。此外，与人P-gp的情况一样，PfMDR1获得了高长春碱转运率（275±3 fmol / 卵母细胞/小时）和高转运信底比（约29倍）奈森德.ATP向卵母细胞的显微注射极大地刺激了[3H]通过PfMDR1的苯芴碱运输断续器但对PfMDR1的影响较轻奈森德 (图1L）。这与之前的报告D1246Y（位于PfMDR1的NBD 2中）一致。断续器）阻碍了ATP水解[39]和PfMDR1断续器其基础ATP酶活性低于野生型蛋白[39，40]。
PfMDR1的场同种型在抗疟药物转运能力方面存在显著差异
我们实现了PfMDR1的强大表达系统，能够直接表征其功能以及蛋白质不同亚型之间的差异。我们发现PfMDR1的6种场同种型在运输各种药物和相关化合物方面表现出不同的能力（图2-4，S1数据和S2文本）。所有测试的抗疟药物 - 苯芪定林，甲氟喹，氯喹，奎宁，奎尼丁，阿莫地喹，哌喹，双氢青蒿素，亚甲蓝和喹那克林 - 被证明是纳入研究的PfMDR1亚型的底物。PfMDR1亚型也转运了长春花碱和罗丹明B（已知人P-gp的底物），但没有一种蛋白质转运金刚烷胺（图2和S1数据）。通过PfMDR1的抗疟药物转运率奈森德（在fmol/卵母细胞/小时中）如下：苯芪蒽碱（731±22），甲氟喹（657±23），阿莫地喹（552±11），氯喹（531±18），哌喹（491±17），奎尼丁（439±11），奎宁（432±13），喹那克林（356±11），亚甲蓝（333±10）和二氢青蒿素（293±10）。从阴性对照卵母细胞中观察到的药物流出水平低，很可能是由于中性药物种类的简单扩散。
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图 2. PfMDR1的场同种型在抗疟药物转运能力方面存在显着差异。
（a–i）PfMDR1的场同种型运输了抗疟药物[3黄芪蒽碱 （a）， [3甲氟喹 （b）， [3氯喹 （c）， [3奎尼丁（d）， [3羟氨苄啶（e），[3H]哌喹 （f）， [3H]二氢青蒿素（g），亚甲蓝（h）和喹那克林（i）。（j–l）PfMDR1的所有场同种型也运输了人P-gp底物罗丹明B（j）和[3H]长春花碱（k），但没有运输[3金刚烷胺 （l）.使用这些化合物的固有荧光和基于荧光的转运测定法检测亚甲蓝，喹那克林和罗丹明B的转运（见S2文本）。数据是 n = 4 个独立实验的平均值（每个实验产生相似的结果并叠加为单个数据点），误差为 SEM。星号表示与PfMDR1的显着差异奈森德; *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，ns，不显著（单因子方差分析）。此图的基础数据在 S3 数据中提供。ne，非表达性卵母细胞;PfMDR1，恶性疟原虫多药抗性蛋白1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.g002
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图 3. 通过PfMDR1表征苯芪蒽碱，甲氟喹和氯喹转运。
（a–c）PfMDR1场同种型之间苯苉碱（a）、甲氟喹（b）和氯喹（c）的表观动力学参数存在显著差异。通过从每个药物浓度下表达PfMDR1亚型的卵母细胞的泄漏中减去ne的泄漏来计算PfMDR1介导的药物转运的浓度依赖性。（d–f）[3H]长春花碱通过PfMDR1被苯芪定碱（d），[3H]甲氟喹（e）和[3氯喹（f）。数据是n = 4个独立实验的平均值（每个实验产生相似的结果），误差为SEM。星号表示与PfMDR1的显着差异奈森德; *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，ns 不显著（单因子方差分析）。此图的基础数据在 S3 数据中提供。ne，非表达性卵母细胞;PfMDR1，恶性疟原虫多药抗性蛋白1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.g003
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图 4. 奎宁通过PfMDR1运输。
（a） PfMDR1运输的场同种型 [3H]奎宁，含PfMDR1NFSDD表现出最高水平的奎宁运输活动。（b） 奎宁通过PfMDR1场同种型的表观动力学参数存在显著差异。通过从每个药物浓度下表达PfMDR1亚型的卵母细胞的泄漏中减去ne的泄漏来计算PfMDR1介导的奎宁转运的浓度依赖性。数据是n = 4个独立实验的平均值（每个实验产生相似的结果并叠加为面板a中的单个数据点），误差为SEM。星号表示与PfMDR1的显着差异奈森德; **P < 0.01，***P < 0.001（单因子方差分析）。此图的基础面板 a 和 b 的数据在 S3 数据中提供。（c） 基于C的PfMDR1向内开同源模型。秀丽隐杆线虫P-gp晶体结构（PDB 4F4C）显示了在本研究中表征的5个PfMDR1同种型（橙色）中发现的突变的位置。图中显示了奎宁在中央腔中的推定结合姿势（粉红色）。（d） 向内开放模型和向外开放模型的比较（基于人类P-gp的晶体结构;PDB 6C0V），从面向DV腔的蛋白质侧面观察。N86Y突变是形成转运蛋白细胞外门的3个残基簇的一部分（显示了参与的残基）。这3个残基在向内开放状态下非常接近，但在向外开放构象中分开。（e） PfMDR1中推定的奎宁结合位点NFSDD.指示与奎宁相互作用的氨基酸（除了L71，I1071和F1072，它们被移除以清楚地查看结合姿势）。原子的阴影如下：奎宁中的碳，粉红色;碳在1042D残留物中，橙色;氮气，蓝色;氧气，红色;氢，白色。ne，非表达性卵母细胞;PfMDR1，恶性疟原虫多药抗药蛋白1;P-gp，P-糖蛋白。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.g004
在几乎所有情况下，将突变引入PfMDR1奈森德导致药物运输活动显着降低。这一观察结果最引人注目的例子是PfMDR1。断续器，其在所有测试化合物中具有最低的运输活性水平（图2-4和S1数据）。通过PfMDR1的抗疟药物转运率断续器（在fmol/卵母细胞/h中）以及相对于通过PfMDR1的药物转运的相应折叠变化奈森德分别为：苯蚜芴碱（299±23，约0.4倍），氯喹（286±11，约0.5倍），哌喹（223±9，约0.5倍），奎尼丁（191±8，约0.4倍），奎宁（188±10，约0.4倍），甲氟喹（175±7，约0.3倍），阿莫地喹（155±9，约0.3倍），奎那克林（121±4，约0.3倍），亚甲蓝（108±3，约0.3倍）， 和双氢青蒿素（92±3，约0.3倍）。
没有2种药物在PfMDR1的6种现场同种型中产生相同的运输活性。但是，某些数据集之间存在很强的相似性（有关扩展分析，请参阅 S3 文本）。例如，在以下组中具有明显的共性（1）苯芪定和甲氟喹;（2）氯喹和哌喹;（3）甲氟喹、奎宁、奎尼丁和双氢青蒿素;和（4）苯芪苐碱，亚甲蓝和喹那克林（图2和4，以及S3文本）。
通过PfMDR1表征苯芴蒽碱、甲氟喹和氯喹的转运
在确定PfMDR1的6种场亚型表现出不同的卢芬坦，甲氟喹和氯喹的转运能力（图2A-2C）之后，我们更详细地表征了这3种药物与转运蛋白的相互作用。对 PfMDR1 介导的苯芴芴碱、甲氟喹和氯喹转运的动力学分析显示，明显的米氏常数（app Km）和视在最大速度（应用 V麦克斯） 值按 PfMDR1 的顺序减少奈森德≥ PfMDR1NFSDD> PfMDR1YYSND> PfMDR1断续器 (图3A–3C）。因此，PfMDR1断续器具有最低的应用程序 Km和最低的应用 V麦克斯对于所有 3 种抗疟药。PfMDR1断续器是本研究中唯一含有D1246Y的同种型。该突变位于NBD 2内Q环的上游，被认为参与协调Mg2+用于ATP水解和/或促进人P-gp中NBD的构象改变[62-65]。因此，D1246Y有可能破坏ATP水解和/或ATP水解与PfMDR1中药物转运的耦合，并且这有助于PfMDR1表现出较低的药物转运活性。断续器.
测量苯芴碱、甲氟喹和氯喹抑制能力的实验子集 [3H]长春花碱通过PfMDR1运输奈森德和 PfMDR1断续器进行以确定这些药物是否是转运蛋白的有效抑制剂。没有一种抗疟药是通过蛋白质同种型的有效运输抑制剂，所有3种药物都产生IC50s比用尼卡地平获得的s高20至11倍（图3D-3F和S2图）。此外，在所有情况下，抗疟药在抑制通过突变场同种型的转运方面略微更有效。如果这些药物对野生型PfMDR1（例如，通过阻断其（目前未知）天然底物的运输）发挥抗疟作用，则这不是预期的趋势，通过向转运蛋白引入突变来缓解。
通过PfMDR1运输奎宁
虽然在PfMDR1中增加了突变奈森德在大多数情况下，药物运输活性降低，这一趋势有2个例外。引入Y184F和N1042D突变-产生PfMDR1NFSDD—增加了蛋白质运输奎宁及其立体异构体奎尼丁的能力（图2D和4A）。通过PfMDR1对奎宁运输的动力学分析揭示了几个有价值的见解（图4B）。一、应用范围Km通过不同的PfMDR1亚型（5.5±0.1μM至21.9±0.9μM）获得的奎宁转运值与观察到的苯芴蒽碱，甲氟喹和氯喹（例如，苯芪定碱app K）的转运值相似m值范围从2.9±0.03μM到21.9±0.9μM）。相比之下，应用 V麦克斯奎宁转运值（0.4 ± 0.01~5.0±0.2 pmol/卵母细胞/小时）低于其他3种药物（例如，苯芪蒿碱应用V）的值麦克斯值为3.7±0.1至10.3±0.4 pmol/卵母细胞/小时）。一般而言，这些观察结果表明，奎宁占据转运蛋白结合腔的时间比苯芪芴碱、甲氟喹或氯喹长得多。在寄生虫中，这种相对较低的奎宁易位率可能阻碍了PfMDR1天然底物的运输。
奎宁输运动力学分析的第二个关键观察结果是发现PfMDR1NFSDD具有更高的应用 V麦克斯（5.0 ± 0.2 pmol/卵母细胞/小时对比 3.4 ± 0.3 pmol/卵母细胞/小时）以及略高的应用 Km（21.9±0.9μM，而野生型蛋白质±19.1±0.2μM）（图4A和4B）。我们通过生成PfMDR1的同源模型来确定奎宁如何与转运蛋白的结合腔相互作用，为这一不寻常的结果寻求结构解释。
先前已使用细菌MsbA蛋白或小鼠P-gp作为模板序列生成PfMDR1的两个同源模型[66，67]。然而，PfMDR1和这些序列之间的低序列同一性（26%至29%）降低了这些同源模型的多功能性。我们确定了最近阐明的秀丽隐杆线虫P-gp [68]和人P-gp [69]的结构，它们具有略高的序列同一性（33%），作为PfMDR1（S1文件）的向内开放和向外开放同源模型的更好模板，尽管在这种序列身份水平上仍应谨慎进行结构预测。5个场突变的位置在PfMDR1的向内开放模型中描绘（图4C）。与之前的报道一致，S1034和N1042都沿着中心腔（它们可以与底物相互作用），Y184面进入膜，D1246位于蛋白质的NBD 2中[66，67]。然而，与先前的模型相反，该模型表明N86形成底物结合腔的一部分[66，67]，我们的向内开放模型提出N86位于面向DV腔的蛋白质的一侧，形成门的一部分并遮挡该隔室蛋白质的中心腔（图4D).与向外开放模型的比较表明，该栅极（N86，F818和D1061）中的残留物移得很远，以使基底结合腔暴露于DV腔内（图4D）。因此，N86的突变可以改变这些相互作用，从而稳定向内开放的构象。
自PfMDR1中的Y184F突变以来NFSDD突出到膜中（而不是进入结合腔），它不太可能参与配位奎宁。因此，N1042D突变更有可能是PfMDR1表现出的奎宁转运活性增强的原因。NFSDD.为了研究这一假设，我们使用含有N1042D的PfMDR1的分子动力学模拟来检查奎宁在结合腔中可能的结合姿势。进行了七次模拟，每种模拟都有不同的随机起始位置和奎宁在底物结合腔内的方向。在7个模拟中的4个中，奎宁迅速与1042D相互作用（在20 ns内;S6 图）。这种与天冬氨酸残基的带负电荷的羧酸盐氧的相互作用是通过奎宁环胺环上的质子化氮发生的。事实上，奎宁在一个疏水性占主导地位的口袋中采取了非常稳定的位置，其中分子上的4个极性原子中的3个在蛋白质上找到了氢键伙伴（由环胺环上的氮稳定，以及奎宁分子上的中心羟基与1042D形成氢键，此外奎宁的醚氧与Y810形成氢键;图4E）。因此，推定的奎宁结合位点的稳定性（如我们的模拟中确定的）可能合理地代表PfMDR1中药物的替代结合位点。NFSDD在其他亚型中不存在。这可以通过影响蛋白质构象变化的速率来改变奎宁转运速率，或者可能不太可能影响配体解绑。
非洲爪蟾卵母细胞中通过PfMDR1的药物转运速率与体外耐药性指数之间的相关性
我们使用在非洲爪蟾卵母细胞系统中获得的PfMDR1介导的苯芪蒽碱，甲氟喹，氯喹和奎宁转运率（S1数据）来确定不同PfMDR1场同种型的药物转运能力与表达这些蛋白质的寄生虫菌株的体外药物反应之间的关系。使用IC计算体外耐药指数50根据文献[16，23，24，26，70-86]（S3表）整理的值，然后根据相关药物和寄生虫菌株的PfMDR1介导的转运速率绘制。我们发现苯芪蒽碱有很强的正相关（Pearson相关系数= 0.76;图5A和S3文本）和甲氟喹（皮尔逊相关系数=0.75;图5B和S3文本），氯喹呈强负相关（皮尔逊相关系数=?0.86;图5C和S3文本）。通过PfMDR1的奎宁转运速率与体外奎宁反应之间没有发现相关性（图5D和S4文本）。
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图 5. 非洲爪蟾卵母细胞中通过PfMDR1的药物转运速率与体外寄生虫耐药性指数之间的相关性。
将PfMDR1介导的苯芪定林，甲氟喹，氯喹和奎宁的转运速率（图2和4以及S1数据）与相关药物和寄生虫菌株的体外耐药指数（S3表）绘制。如果未显示，则误差线落在交易品种内。（a） 通过PfMDR1的苯芴蒽碱转运速率与体外苯芴碱反应呈正相关（Pearson相关系数= 0.76，r2= 0.58，P = 0.078）。（b） 通过PfMDR1的甲氟喹转运速率与体外甲氟喹反应呈正相关（Pearson相关系数= 0.75，r2= 0.56，P = 0.008）。Dd2 的数据点是异常值，其去除显著提高了相关性（Pearson 相关系数 = 0.97， r2= 0.94，P = 0.006）。Dd2寄生虫通常含有2-4个PfMDR1拷贝，据报道，与分析中包含的其他寄生虫菌株相比，其PfMDR1水平更高[85，87]。鉴于pfmdr1扩增与甲氟喹耐药性相关[30–32，88，89]，Dd2寄生虫中PfMDR1的过表达可能赋予了对该菌株更高水平的耐药性（参见S3文本进行扩展分析）。（c） 观察到通过PfMDR1的氯喹转运速率与体外氯喹反应呈负相关。去除7G8数据点（参见S3文本进行扩展分析）导致通过PfMDR1的氯喹转运速率与寄生虫在体外的氯喹反应之间的相关性更强（Pearson相关系数= ?0.86，r2= 0.74，P = 0.054）。（d）奎宁通过PfMDR1的转运速率与体外奎宁反应之间没有相关性（参见S4文本进行扩展分析）。体外耐药性指数的数据是n = 2至18项已发表研究的平均值，PfMDR1介导的药物转运率的数据是n = 4个独立实验的平均值。误差是SEM，除了从2项研究中计算的体外抵抗指数，在这种情况下，误差是范围/ 2。此图的基础数据在 S3 数据中提供。PfMDR1，恶性疟原虫多药抗性蛋白1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.g005
通过PfCRT在非洲爪蟾卵母细胞和原位中运输苯芪蒽碱和甲氟喹
我们试图通过测量PfCRT在非洲爪蟾卵母细胞中转运这些药物的能力来阐明PfCRT在调节寄生虫对苯芴碱和甲氟喹的反应中的作用（参见S2表和S3图，了解这里研究的PfCRT亚型突变的位置）。野生型PfCRT （PfCRT3D7）未转运苯芪碱或甲氟喹，而 PfCRT （PfCRT） 的 2 种赋予氯喹的亚型7G8和PfCRTDd2）表现出两种药物的显着转运（图6A和6D以及S7图）。通过PfCRT运输苯芪蒽碱和甲氟喹7G8和PfCRTDd2被已知与转运蛋白相互作用的化合物抑制，包括维拉帕米[6，18]，氯苯那敏[90]和沙奎那韦[10，91]，但不受组氨酸和二肽LH的影响（它们均不与PfCRT相互作用[10，91]）（图6A和6D以及S7图）。通过PfCRT转运苯芪碱和甲氟喹7G8和PfCRTDd2是可饱和的，与PfCRTDd2与PfCRT相比，具有略低的亲和力和较高的药物运输能力7G8 (图6B和6E）。与通过PfCRT运输氯喹相比Dd2（Km= 232 ± 11 μM;V麦克斯= 61±6 pmol/卵母细胞/小时[7]），苯芪蒽碱和甲氟喹的转运是一个高亲和力、低容量的过程。
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图 6. 通过PfCRT在非洲爪蟾卵母细胞和原位运输苯芪蒽碱和甲氟喹。
（一、四）[3H]苯芴碱（a）和[3H]甲氟喹（d）通过PfCRTDd2和PfCRT7G8被维拉帕米（VP; 100μM）还原。星号表示与 ne（灰色星号）的显著差异，即 PfCRT7G8控件（橙色星号）或 PfCRTDd2控件（红色星号）。（二、五）通过PfCRT运输苯芴碱（b）和甲氟喹（e）Dd2和PfCRT7G8很可怜。星号表示与PfCRT的显着差异Dd2（红色星号）。（c， f）未标记的苯芴碱（c）和未标记的甲氟喹（f）对[3H]通过 PfCRT 传输 VDPVNF3D7， PfCRTDd2和 PfCRT7G8.星号表示与PfCRT的显着差异3D7（蓝色星号）。（g） 鲁芬专和甲氟喹（2.5 μM）提高了耐氯喹C6中DV碱化的速率7G8和 C4Dd2寄生虫线，但不在氯喹敏感的 C2 中GC03线。除非标记ns，否则P相对于没有测试溶质<0.05。（h）VP（50μM）抑制了由苯芪蒽碱和甲氟喹引起的DV碱化速率的增加。星号表示与相关 C2 的显著差异GC03（蓝色星号），C67G8（橙色星号），或 C4Dd2（红色星号）在没有维拉帕米的情况下进行治疗。（一、j）鲁芬他林（i）和甲氟喹（j）以浓度依赖性方式增加了DV碱化的速率。数据是 n = 4 个独立实验的平均值，每个实验产生相似的结果，并叠加为面板 a、d、g 和 h 中的单个数据点，误差为 SEM。在不可见的情况下，误差线落在交易品种内。**P < 0.01， ***P < 0.001， ns， 不显著（单因子方差分析）。此图的基础数据在 S3 数据中提供。ne，非表达性卵母细胞;PfCRT，恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.g006
Lumefantrine和甲氟喹被证明通过所有3种亚型抑制PfCRT（血红蛋白衍生的六肽VDPVNF [10]）的天然底物的运输（图6C和6F）。但是，所有生成的 IC50s 高于 45 μM，远高于 IC50s 先前获得的奎宁二聚体“Q2C“（IC50s = 0.01至0.6μM）—一种已被证实通过其有效抑制PfCRT自然功能而发挥抗疟原作用的药物[10，92]。苯芪蒽碱和甲氟喹 IC50s 也显著高于其他 2 种 PfCRT 抑制剂 — 维拉帕米 （IC） 观察到的50s = 6.8 至 17.5 μM） 和氯苯那敏 （IC50s = 5.0 至 9.8 μM）—但与 IC 非常相似50s 用氯喹（例如，110 ± 5.9 μM 对 PfCRT 得到3D7和 53 ± 2.8 μM 的 PfCRTDd2) [因此，苯芪蒽碱和甲氟喹似乎不太可能具有显著的抗PfCRT活性。
然后，我们测试了PfCRT是否7G8和PfCRTDd2在活寄生虫的DV膜中，在其天然环境中运输苯芴碱和甲氟喹。使用“H-外排测定法”和一组P，原位测量通过PfCRT的苯芫蒴碱和甲氟喹的转运。恶性疟原虫转染剂—C2+GC03， C67G8和 C4Dd2线 — 除 pfcrt 等位基因外，它们是等基因的。这些线路表示 PfCRT3D7（C2GC03）， PfCRT7G8（C67G8）或 PfCRTDd2（C4Dd2) [Lumefantrine和甲氟喹通过中性物质的简单扩散以及PfMDR1（图2和3）进入DV，在那里它们在酸性腔中变成质子化。H-外排测定使用荧光pH敏感探针提供一种间接方法，通过PfCRT检测DV中质子化药物的流出，其表现为DV碱化速率的增加。阳性对照是氯喹和沙奎那韦（一种肽模拟物，是所有3种PfCRT亚型的底物[10]）。与先前的报告[9，10，20-22]一致，氯喹增加了C6中DV碱化的速率。+7G8和 C4Dd2线，在C2中没有效果GC03线，而沙奎那韦增加了所有3条寄生虫线的DV碱化速率（图6G）。我们发现苯芪定碱和甲氟喹诱导了C6中的H泄漏+7G8和 C4Dd2行，但不在 C2 中GC03线。这些观察结果与两种药物都是PfCRT的底物一致。7G8和PfCRTDd2，但不是 PfCRT3D7 (图 6G–6J）。此外，维拉帕米抑制了苯芴碱和甲氟喹诱导的H泄漏（图6H），进一步证明药物诱导的H从DV流出是由PfCRT介导的++7G8和PfCRTDd2.两种药物均以浓度依赖性方式增加了DV碱化速率，PfCRTDd2再次表现出比PfCRT更高的苯蒽碱和甲氟喹转运能力7G8 (图6I和6J）。总之，这些发现支持了非洲爪蟾卵母细胞系统获得的数据集，通过提供原位证明，苯芫蒽碱和甲氟喹在DV内积累，并且PfCRT的氯喹抗性亚型将这两种药物转运回寄生虫的细胞质基质中。
如果苯芫蒽碱和甲氟喹对DV外的靶标发挥其主要抗疟活性，则PfCRT介导的这些药物从C6的DV流出7G8和 C4Dd2线应提高寄生虫对苯芴碱和甲氟喹的敏感性，而维拉帕米应降低这种作用。我们通过测量异源寄生虫系在存在或不存在维拉帕米的情况下对苯芪芴碱，甲氟喹和氯喹的敏感性来测试这一假设。生成的 IC50s 确认C67G8和 C4Dd2品系比 C2 更易受苯芪蒽碱和甲氟喹影响GC03寄生虫（表1），这一发现与先前的报告一致[2，17]。此外，维拉帕米降低了C6的敏感性。7G8和 C4Dd2与苯芴碱和甲氟喹相关，同时增加其对氯喹的敏感性。总之，我们的原位数据集表明，PfCRT的氯喹耐药性亚型可以介导苯芪芴碱和甲氟喹从DV向寄生虫细胞质基质的转运，并且这种“转运功能的获得”是氯喹耐药寄生虫对苯芪蒽碱和甲氟喹敏感性提高的基础。
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表 1. 氯喹、鲁非蒽碱和甲氟喹对P的体外抗浆酶活性。恶性疟原虫 pfcrt 转染线。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.t001
讨论
几十年来，PfMDR1在抗疟药物耐药性现象中的作用仍不清楚，尽管它是寄生虫中多药耐药性的关键决定因素之一。我们为非洲爪蟾卵母细胞中PfMDR1开发了一种强大的表达系统，能够直接和详细地表征其药物运输能力，以及转运蛋白的不同场同种型之间的差异。使用该系统，我们为PfMDR1的功能提供了新的基本见解，例如它能够运输各种结构多样化的药物，包括目前使用的大多数抗疟药。我们发现PfMDR1的突变同种型在运输这些药物的能力上与野生型蛋白质以及彼此不同。此外，在几乎所有情况下，将突变引入PfMDR1会降低其药物运输能力。在寄生虫中，用于药物运输的突变同种型的能力降低将导致较少的药物进入和积聚在DV内，因此更大比例的药物将保留在细胞质基质中。相比之下，PfMDR1的过表达（增加DV膜上PfMDR1的水平[93，94]）将提高药物转运到DV的速率，从而增加该细胞器内药物的封存。这些发现表明，PfMDR1的变化主要通过改变寄生虫细胞质基质和DV之间的药物分布来促进多药耐药表型。
我们通过研究pfmdr1和pfcrt中多态性诱导的侧支药物敏感性模式的机制基础，进一步深入研究了这种可能性。我们重点研究了氯喹、苯芴碱和甲氟喹与PfMDR1的相互作用，以及苯芪定和甲氟喹与PfCRT的相互作用（鉴于通过PfCRT的氯喹转运已经在非洲爪蟾卵母细胞系统和原位中进行了广泛的研究[6，7，9，20，21]).动力学分析证实，野生型PfMDR1具有最高的运输苯芪君定，甲氟喹和氯喹的能力，并且所有用于研究的突变同种型都表现出这些药物的转运能力降低。在所有情况下，PfMDR1断续器亚型（由耐氯喹菌株7G8携带）表现出最低的药物运输能力。我们观察到PfCRT突变与蛋白质的药物运输能力之间存在非常不同的关系。发现野生型PfCRT在非洲爪蟾卵母细胞系统和互补原位测定中缺乏转运苯蒽碱或甲氟喹的能力。相比之下，PfCRT的突变亚型（由氯喹耐药菌株7G8和Dd2携带）显示出显着的转运这2种药物的能力。也就是说，相对于通过PfCRT的氯喹运输Dd2 [[7]，突变蛋白是高亲和力、低容量的鲁芬坦林和甲氟喹转运蛋白。在寄生虫中，突变转运蛋白将介导氯喹，苯蒽专宁或甲氟喹从DV流回寄生虫的细胞质基质，从而降低DV中这些药物的浓度。相比之下，很少或没有药物会从携带野生型PfCRT的寄生虫的DV中退出，这意味着氯喹，苯芫蒽碱和甲氟喹将继续隔离在这个隔室内。
鉴于PfMDR1和PfCRT本身是潜在的药物靶标[1，95]，我们研究了它们是否可能被苯芪定碱，甲氟喹或氯喹有效阻断。然而，所有3种抗疟药都是通过PfMDR1运输的相对较差的抑制剂，并且所有3种药物也缺乏对PfCRT的效力;氯喹[10]，苯芪蒽碱和甲氟喹（类似地）是天然底物通过PfCRT转运的弱抑制剂。因此，PfMDR1和PfCRT的自然功能不太可能在很大程度上被氯喹，苯花定或甲氟喹靶向。
在通过PfMDR1的6种现场同种型获得苯芪蒽碱，甲氟喹和氯喹的运输率后，我们试图确定药物运输能力与携带这些PfMDR1亚型的寄生虫的体外药物反应之间的关系。我们观察到通过PfMDR1的苯芫定和甲氟喹转运速率与相应的体外药物反应之间存在正相关（参见S3文本进行扩展讨论）。例如，甲氟喹转运能力相对较高的PfMDR1亚型往往存在于甲氟喹IC相对较高的寄生虫中。50s（因此增加了对药物的耐药性），而甲氟喹转运能力低的亚型往往存在于甲氟喹IC低的寄生虫中50s（因此增加了对药物的敏感性）。我们观察到氯喹的相反关系，PfMDR1场亚型的氯喹转运能力与相应的体外氯喹反应呈负相关（参见S3文本进行扩展讨论）。这些分析确定，通过PfMDR1的药物转运速率是在现场分离株和实验室适应菌株中观察到的苯芴蒽碱，甲氟喹和氯喹的附带药物敏感性模式的关键因素。在携带突变PfMDR1亚型的寄生虫中，药物转运到DV的速率降低将减少该细胞器中苯芪蒽碱，甲氟喹和氯喹的积累，并导致这3种药物的胞质浓度随之增加。相反，PfMDR1的过表达会增加药物转运到DV的速率，导致Lumefantrine，mefloquine和氯喹在DV内的封存性增强，并且这些药物的胞质浓度降低。这些发现，加上我们之前证明PfCRT场同种型的氯喹转运能力与相应寄生虫的体外氯喹反应之间存在正相关关系[7]，表明药物在DV和细胞质基质之间的再分布是pfmdr1和pfcrt中的多态性引起附带药物敏感性的关键机制。
我们在这里介绍的PfMDR1和PfCRT的详细生化表征使得能够构建疟疾寄生虫中附带药物敏感性的机制模型（图7和S3文本）。鲁芬他林，甲氟喹和氯喹通过2条主要途径进入DV并在其中积累：（1）中性物质在膜上的简单扩散以及随后在酸性DV腔内的质子化;野生型PfMDR1具有相对较高的药物运输能力，这种活性，加上野生型PfCRT无法从DV中排出苯芫醌碱，甲氟喹或氯喹，导致这些药物在DV内积累到高水平。PfMDR1的过表达导致从细胞质基质到DV的药物转运速率进一步增加，从而在DV中对苯芪蒽碱，甲氟喹和氯喹的封存更大（以及伴随其胞质浓度的降低）。因此，携带野生型pfmdr1（和/或pfmdr1的多个拷贝）以及野生型pfcrt的寄生虫对氯喹敏感，因为氯喹在其抗疟作用的主要部位积聚到高水平，即DV内血红素的解毒[96-98]。鉴于这些寄生虫对苯芪蒽碱和甲氟喹的易感性降低而不是增加，我们的模型表明这两种药物在DV之外发挥其主要抗疟作用（甲氟喹被认为靶向寄生虫的细胞质80S核糖体[50]，而苯芫蒽碱的主要靶标仍然未知）。在携带突变PfMDR1同种型（和/或仅一个pfmdr1拷贝）以及PfCRT突变同种型的寄生虫中，由于（1）通过PfMDR1的药物进口率降低，氯芬他林，甲氟喹和氯喹的DV积累显着减少;（2）PfCRT介导的药物从DV流回细胞质基质中。氯喹主要作用部位浓度的降低使寄生虫能够逃避其杀伤作用，从而引起氯喹耐药性。另一方面，伴随的胞质药物浓度增加使这些寄生虫对苯芪苋碱和甲氟喹更敏感。我们在这里提出的机制模型与先前提出的PfMDR1和PfCRT在调节寄生虫对这些药物的敏感性方面相互作用的假设一致[2-4，15，99，100]。我们的模型还表明，先前提出的DV内甲氟喹和苯芫蒽碱靶标（例如血红素的解毒）在这些药物的抗疟活性中起次要作用，或者可能没有作用。
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图 7. PfMDR1和PfCRT在寄生虫对苯芴碱，甲氟喹和氯喹的敏感性中的作用。
pfmdr1和pfcrt中的多态性如何改变寄生虫对苯芫蒽碱和甲氟喹（a）和氯喹（b）的反应的机制解释。鲁芬坦，甲氟喹和氯喹是弱碱基，通过2个主要途径进入DV：（1）中性物质在膜上的简单扩散以及随后在酸性DV腔内的质子化;野生型PfMDR1具有很高的药物运输能力，这种活性，加上野生型PfCRT无法从DV中排出苯芪蒽碱，甲氟喹或氯喹，导致这些药物在DV内隔离。PfMDR1的过表达导致从细胞质基质到DV的药物转运速率进一步增加，从而在DV中积累更多的苯苉碱，甲氟喹和氯喹（以及伴随其胞质浓度的降低）。在携带突变PfMDR1同种型（和/或仅一个pfmdr1拷贝）以及PfCRT突变同种型的寄生虫中，由于（1）通过PfMDR1的药物进口率降低，氯芬他林，甲氟喹和氯喹的DV积累显着减少;（2）PfCRT介导的药物从DV流回细胞质基质中。氯喹主要作用部位浓度的降低使寄生虫能够逃避其杀伤作用，从而引起氯喹耐药性。另一方面，伴随的胞质药物浓度增加使这些寄生虫对苯芪苐碱和甲氟喹更敏感，表明两种药物的主要靶标都位于DV之外。CQ， 氯喹;DV，消化液泡;LM， 苯芪芴;MQ，甲氟喹;PfCRT，恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白;PfMDR1，恶性疟原虫多药抗性蛋白1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.g007
我们的数据集还提供了关于为什么PfMDR1和PfCRT亚型的某些配对导致寄生虫对氯喹具有意外的低或高敏感性的见解[7]。pfcrt突变是氯喹耐药性的主要决定因素，根据我们提出的模型，pfmdr1中的多态性对给定氯喹耐药表型的贡献程度将取决于几个因素。这些包括（1）氯喹通过寄生虫表达的突变PfCRT亚型流出速率;（2）氯喹通过简单扩散进入DV的速率（这取决于寄生虫细胞质基质中氯喹的浓度，进而取决于氯喹的细胞外浓度）;（3）通过寄生虫表达的PfMDR1亚型进口氯喹的速率;（4）DV膜上PfMDR1表达水平。例如，介导高氯喹外排率的突变PfCRT亚型的组合（例如，PfCRTDd2）并且与氯喹进口能力降低的突变PfMDR1亚型相比，可以预期药物的DV浓度略低（因此可能具有更高的耐药性水平）。然而，当突变体PfCRT的氯喹流出能力相对较低时，PfMDR1影响寄生虫对氯喹的敏感性的能力可能更为明显（例如，PfCRT7G8).我们之前曾报道过，7G8寄生虫表现出比PfCRT介导的氯喹转运水平低而预测的更高水平的氯喹耐药性。7G8 [在这里，我们的发现是PfMDR1断续器（由7G8寄生虫携带的同种型）具有非常低的氯喹运输能力，为这一观察结果提供了机制解释;通过PfMDR1进口氯喹的比率显着降低断续器有助于抵消通过PfCRT排出的氯喹相对较低的速率7G8，导致氯喹的DV浓度低于PfCRT所能达到的DV浓度（因此具有更高的耐药性）7G8使用野生型PfMDR1（甚至使用其他突变PfMDR1亚型之一）。因此，我们的数据集表明PfMDR1断续器与其他PfMDR1同种型相比，由于其氯喹运输能力非常低，因此有可能在更大程度上对氯喹抗性表型做出贡献。
一些证据表明，PfCRT的突变同种型在赋予奎宁耐药性方面起着关键作用[9，18，22，37，92]，我们之前已经使用非洲爪蟾卵母细胞系统来证明PfCRT的突变同种型具有将奎宁转运出DV的能力，而野生型蛋白质缺乏这种活性[9，18]（有关扩展分析，请参阅 S4 文本）。总的来说，这些发现表明PfCRT在奎宁耐药性中的作用与其在氯喹耐药性中的作用相似（图7）。也就是说，奎宁通过突变PfCRT同种型从DV流出到寄生虫细胞质基质中降低了药物在其DV靶标处的浓度（抑制血红素解毒和/或血红蛋白消化的另一个方面[101]），从而降低了寄生虫对奎宁的易感性。因此，可以预测，PfMDR1在氯喹和奎宁耐药性中的作用同样相似。事实上，我们的数据集显示，大多数突变PfMDR1亚型相对于野生型蛋白的奎宁转运能力较低，我们的观察结果与先前发现PfMDR1突变与寄生虫对奎宁的易感性降低之间存在关联一致[70，102]。然而，我们对PfMDR1的奎宁运输能力与相应寄生虫的奎宁耐药指数之间关系的分析并未发现这两个因素之间的相关性。这也许反映了奎宁耐药性的复杂和多因素途径，有时可能涉及pfmdr1中的多态性，而其他时候则不涉及。事实上，当与先前的大量研究（参见S4文本进行扩展讨论）的背景下考虑时，我们的研究结果表明，PfMDR1在奎宁耐药性中的作用比简单地导致药物在DV内积累的减少或增加（即，我们为PfMDR1在氯喹耐药性和甲氟喹/苯蒽碱耐药性中的角色）更复杂和微妙。 分别）。相反，我们的分析表明，pfcrt和pfmdr1中奎宁敏感性和多态性之间的复杂和可变关系可能集中在2个关键因素上：（1）奎宁穿过DV膜的净通量;（2）PfMDR1的天然底物被输送到DV中的速率（参见S4文本进行扩展讨论）。
我们为研究非洲爪蟾卵母细胞中的PfMDR1而建立的强大的系统提供了期待已久的方法，可以对其功能进行直接和详细的表征，并在不同的PfMDR1亚型和不同的药物之间进行比较。我们的研究结果为PfMDR1提供了基本的见解，从而更好地了解了PfMDR1在多药耐药现象中的作用，并制定了PfMDR1对疟疾寄生虫附带药物敏感性的贡献的机制模型。总之，这里介绍的工作为合理设计方法提供了宝贵的分子基础，这些方法通过利用它们对PfCRT和PfMDR1施加的相反选择力来维持和延长当前抗疟药的使用寿命。展望未来，我们的系统可用于解决有关PfMDR1和PfCRT的未解决的问题，例如PfMDR1的天然底物的身份， 新的PfMDR1和PfCRT亚型的功能和作用，这些同种型继续出现在该领域，以响应药物压力的变化，以及PfMDR1和PfCRT与开发管道中候选抗疟药相互作用的性质。
方法
非洲爪蟾青蛙
对女性X进行的工作的道德认可。laevis青蛙是从澳大利亚国立大学动物实验伦理委员会（动物伦理协议编号A2013/13和A2019/26）获得的，符合澳大利亚科学目的动物护理和使用行为准则。这些青蛙是从纳斯科美国购买的（目录号。LM00535M），并按照相关机构和澳大利亚政府的规定安置在非洲爪蟾青蛙设施（澳大利亚国立大学生物研究学院）。X. laevis青蛙是完全水生动物，被关在大型水箱中（每个水箱8至20只青蛙）。水在封闭的系统中渗透和过滤，水温保持在19至20°C。 每天检查pH值、硬度、氨和其他水参数，并将其保持在健康卵母细胞生产所必需的水平[103，104]。
编码序列的制备和cRNA合成
人类P-gp的编码序列是从GenScript购买的（目录号。OHu23307;NM_000927;New Jersey USA）并插入pGEM-He-Juel卵母细胞表达载体[105]。The PfMDR1奈森德编码序列与密码子协调，以促进非洲爪蟾卵母细胞中转运蛋白的正确折叠，从而促进其功能表达。该密码子协调序列被定制合成，然后通过GenScript插入到pGEM-He-Juel卵母细胞表达载体中。PfMDR1的其余亚型，以及PfMDR1的版本奈森德携带双羧基端HA标签（PfMDR1奈森德-2xHA），由PfMDR1生成奈森德模板使用位点导向诱变[7]和S4表中列出的引物。通过测序验证了由此产生的PfMDR1编码序列（由澳大利亚国立大学ACRF生物分子资源设施进行）。这些 PfMDR1 变体的氨基末端 HA 标记版本，以及 PfMDR1 的版本奈森德在羧基终点（PfMDR1）携带三重HA标签奈森德-3xHA），由 GenScript 生成。
含有PfNT1、PfCRT的卵母细胞表达载体3D7， PfCRTDd2或 PfCRT7G8以前做过[6，7，106]。PfCRT编码序列经过密码子协调，编码不含内体-溶酶体运输基序的PfCRT版本，从而导致转运蛋白在非洲爪蟾卵母细胞质膜上的表达[6，7]。
含有人类P-gp，PfMDR1，PfCRT或PfNT1编码序列的质粒用Sali线性化（Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，USA;目录号。ER0642）和5′封端的cRNA是使用mmESSAGE mmachine T7转录试剂盒（美国德克萨斯州Ambion;目录号）合成的。AM1344）。根据制造商的说明进行体外转录反应，并进行以下微小修饰以合成人P-gp和PfMDR1 cRNA：在40μL反应中，使用500ng线性化模板质粒，并在2小时孵育中途加入30 nmol GTP。用MEGAclear试剂盒（Ambion，目录号，AM1908）并使用无RNase洗脱缓冲液调节至所需浓度。通过琼脂糖凝胶电泳评估cRNA的质量。
非洲爪蟾卵母细胞的分离和显微注射
成年雌性青蛙在3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐溶液中麻醉（美国密苏里州西格玛奥尔德里奇;目录号。A5040） 和 1 mM NaHCO3（西格玛-奥尔德里奇，目录号。S5761） [8].使用手术级镊子和剪刀从青蛙中取出卵巢的一部分。将卵巢切片切成含有约20个卵母细胞的片段，转移到100mL锥形瓶中，然后用“无钙卵母细胞铃声”缓冲液（OR2）轻轻冲洗5次?;82.5 mM 氯化钠， 2.5 mM 氯化钾， 1 mM 氯化镁2， 1 mM Na2断续器4， 5 mM HEPES;pH 7.8）。通过将卵巢切片在25mL OR2中孵育来降解包裹卵母细胞的胶原膜?补充有0.5 M Na的缓冲液2断续器4（Sigma-Aldrich，目录号342483），牛血清白蛋白（250毫克/毫升;西格玛-奥尔德里奇，目录号A7030）和胶原酶B（罗氏，巴塞尔，瑞士;目录号11088831001）在16°C下在轨道振荡器上放置12至13小时。根据烧瓶中卵巢切片的体积调整眼眶振荡器的速度，使得卵巢部分在烧瓶周围轻轻循环（振荡器速度过低将导致不完全的解滤，而速度过高会导致卵母细胞的质膜损坏）。添加到溶液中的胶原酶B的量取决于卵巢切片周围的胶原蛋白量，通过在解剖显微镜下进行目视检查来评估。将胶原酶处理的卵母细胞用OR2洗涤10次?缓冲液，5次与“含钙卵母细胞铃声”（OR2）缓冲液（OR2）+?补充有1 mM氯化钙的缓冲液2和50μg/ mL青霉素和链霉素），然后用L-15（Leibovitz）培养基用L-谷氨酰胺（在0.5×使用一次;西格玛-奥尔德里奇，目录号L4386）补充了10 mM HEPES和50μg/ mL青霉素和链霉素。用编码PfMDR1亚型（每个卵母细胞10ng），PfCRT亚型（每个卵母细胞20ng），人P-gp（每个卵母细胞10ng，这些卵母细胞作为阳性对照）或PfNT1（每个卵母细胞20ng，这些卵母细胞作为阴性对照）的cRNA进行微注射。在为优化人P-gp或PfMDR1表达所需的cRNA量而进行的实验子集中，卵母细胞被微注射cRNA量范围为2.5至50ng。将卵母细胞储存在16至18°C的L-15培养基中，补充有10mM HEPES和50μg/ mL青霉素和链霉素。
用于非洲爪蟾卵母细胞转运测定的放射性标记和未标记药物
放射性标记的药物是从Pharmaron（中国北京;[3H]氯喹， 27 Ci/mmol;[3H]二氢青蒿素，14 Ci / mmol），美国放射性标记化学品（美国密苏里州;[3H]苯芪芴碱， 10 Ci/mmol;[3甲氟喹， 20 Ci/mmol;[3H]阿莫地喹， 15 Ci/mmol;[3H]哌喹， 15 Ci/mmol;[3H]奎宁， 20 Ci/mmol;[3H]奎尼丁， 20 Ci/mmol;[3H]硫酸长春花碱，20 Ci / mmol），莫拉维克（美国加利福尼亚州;[3H]金刚烷胺，137 mCi / mmol），剑桥研究生化物（英国比林汉姆;[3H]VDPVNF，20 Ci/mmol）或PerkinElmer（美国马萨诸塞州;[3H]次黄嘌呤，13.3 Ci / mmol）。这些药物的结构和质子化状态分别显示在S8图和S2数据中。未标记的化合物从Sigma-Aldrich（苯芪芴碱，甲氟喹，氯喹，奎宁，喹那克林，罗丹明B，亚甲蓝，金刚烷胺，尼卡地平，钒酸盐，维拉帕米，PSC833，氯苯那敏，沙奎那韦，组氨酸和铁螯合剂IV）或GenScript（肽LH和VDPVNF）购买。这些化合物的子集的结构如图8所示。
通过人P-gp和PfMDR1测量非洲爪蟾卵母细胞中的药物转运
在cRNA注射后1天进行人P-gp和PfMDR1转运测定，除非另有说明，否则在ND96缓冲液（96mM NaCl，2mM KCl，1mM MgCl）中在27.5°C下进行1.5小时2， 1.8 mM 氯化钙2、10 mM MES 和 10 mM Tris 碱基），已调整至 pH 值 5.5 以模拟 DV 腔的 pH 值 [107，108]。由于ABC转运蛋白（如PfMDR1和人P-gp）的ATP酶结构域位于细胞的细胞质基质中[36]，因此PfMDR1和人P-gp都预测其ATP酶结构域在卵母细胞细胞质基质中定向。因此，已建立的外排量测定[10]用于将正在研究的放射性标记药物微注射到卵母细胞中，并通过人P-gp或PfMDR1测量其流出量。在该测定中，底物通过人P-gp从卵母细胞质基质转运到细胞外溶液类似于P-gp介导的底物从人细胞的细胞质基质到细胞外空间的转运。同样，对于PfMDR1，转运方向类似于PfMDR1介导的底物从寄生虫的细胞质质质到DV的转运（S9图）。在所有情况下，进行了4次独立实验（在不同的日子，使用来自不同青蛙的卵母细胞），并且在每次实验中，每次处理从10个卵母细胞进行测量。
用35 nL ND96缓冲液（pH 8.0）微注射卵母细胞，并补充[3H]正在研究的药物。估计的细胞内浓度（根据V期和VI期卵母细胞的水体积为400 nL[109]计算）如下： [3H]硫酸长春花碱， 4.4 μM;[3H]苯芴碱， 2.2 μM;[3氯喹， 5.9 μM;[3H]奎宁， 4.4 μM;[3H] 甲氟喹， 4.4 μM;[3H]阿莫地喹， 3.1 μM;[3H]哌喹， 3.1 μM;[3H]二氢青蒿素， 3.1 μM;[3奎尼丁， 4.4 μM;[3金刚烷胺， 30 μM.在实验中测量[3H]二氢青蒿素转运，1mM铁螯合剂IV也被微注射到卵母细胞中以结合卵母细胞中存在的任何游离铁（游离铁可以激活双氢青蒿素，这反过来又会损害卵母细胞，从而干扰运输的测量;S10 图）。将10个在注射部位重新密封的卵母细胞转移到5mL聚苯乙烯圆底管（美国纽约康宁;目录号352008）中，并用3.5mL ND96缓冲液（pH 5.5）洗涤一次，然后转移到白色96孔板的单独孔中（PerkinElmer，目录号6005299）。该处理在测定开始时确定卵母细胞内的放射性量（T = 0）。将另外10个重新密封的卵母细胞转移到5-mL管中，用3.5mL ND96缓冲液（pH 5.5）洗涤一次，并悬浮在100μLND96缓冲液（pH 5.5）中以开始测定。通过用移液管除去反应缓冲液并用3.5mL冰冷ND96缓冲液（pH 5.5）洗涤卵母细胞两次来终止孵育。将每个卵母细胞转移到白色96孔板的单独孔中，通过在室温下用20μL10%（w / v）SDS孵育过夜来裂解，然后与150μLMicroScint-40微闪烁剂（PerkinElmer，目录号6013641）结合。用TopSeal-A（PerkinElmer，目录号6050185）覆盖板，并用MicroBeta测量每个孔内的放射性2微孔板液体闪烁分析仪（珀金埃尔默，目录号2450-0010）。通过减去孵育结束时卵母细胞中存在的放射性量（以每分钟计数测量）来计算药物转运，该量与测定开始前立即在取样的卵母细胞中测量的放射性量相减。
使用亚甲蓝，喹那克林和罗丹明B通过PfMDR1的转运使用这些化合物的固有荧光和基于荧光的转运测定法进行测量。用35 nLND96缓冲液（pH 8.0）微注射卵母细胞，并补充所研究的荧光化合物。喹啉、罗丹明B或亚甲蓝的估计细胞内浓度（基于V期和VI期卵母细胞的水体积为400 nL[109]）为4μM。在注射部位重新密封的卵母细胞中，将10个转移到5-mL聚苯乙烯圆底管中，并用3.5mL ND96缓冲液（pH 5.5）洗涤一次，然后转移到透明96孔板的单独孔中。该处理在测定开始时确定卵母细胞内的荧光量（T = 0）。将另外10个重新密封的卵母细胞转移到5-mL管中，用3.5mL ND96缓冲液（pH 5.5）洗涤一次，并悬浮在100μLND96缓冲液（pH 5.5）中以开始测定。通过用移液管除去反应缓冲液并用3.5mL冰冷ND96缓冲液（pH 5.5）洗涤卵母细胞两次来终止孵育。将每个卵母细胞转移到透明96孔板的单独孔中。此外，通过将10个卵母细胞转移到5-mL管中并用3.5mL ND96缓冲液（pH 5.5）洗涤它们3次，然后将它们转移到透明96孔板的单独孔中，来测量未用药物微注射的卵母细胞的自发荧光。将卵母细胞在室温下用20μL10%（w / v）SDS孵育过夜来裂解。使用Infinite M1000 PRO读板器（Tecan，Mannedorf，瑞士;目录号30064852）在以下激发和发射波长下测量每个孔中的荧光强度：喹那克林为440nm和510nm;罗丹明B为546 nm和568 nm;亚甲蓝为668 nm和682 nm。首先通过减去从所有处理中测量的自发荧光来计算药物转运，然后在孵育结束时从测定开始前立即取样的卵母细胞中测量的荧光中减去卵母细胞中存在的荧光。
一组测定测定了未标记化合物抑制顺式的能力 [3H]通过人P-gp和PfMDR1运输药物。在这些实验中，卵母细胞被微注射与35nL的相关[3H]药物溶液补充未标记的测试化合物，其浓度将达到所需的细胞内浓度（0.1至30μM）。测试溶质包括已知的人P-gp抑制剂（尼卡地平[46，54]，PSC833 [55，56]，钒酸盐[57，58]和维拉帕米[46，59]）和一种不与人P-gp相互作用的化合物（抗病毒药物金刚烷胺[46-48]）。未标记的苯芪蒴碱、甲氟喹和氯喹（细胞内浓度为1至200μM）抑制顺式的能力[3还评估了通过PfMDR1的H]长春花碱运输。集成电路50每个抑制剂的值在 GraphPad Prism 版本 8 中通过方程 y = y 的最小二乘拟合确定最小值+ [（y麦克斯? y最小值）/（1 + （[测试化合物]/IC50)c]到数据，其中y是P-gp或PfMDR1介导的药物转运，y最小值和 y麦克斯是 y 的最小值和最大值，c 是拟合常数。
通过PfMDR1的苯芴碱转运的ATP依赖性是通过微注射卵母细胞来确定的[3H]苯芪蒴碱悬浮在含有不同浓度ATP的35 nLND96缓冲液（pH 8.0）中。未受精的V期和VI期卵母细胞通常含有约2.3mM ATP [110，111]，并且计算出不同ATP溶液的显微注射使细胞内浓度升高了0至2mM。
通过PfMDR1的药物运输动力学的分析是通过用ND96缓冲液（pH 8.0）微注射卵母细胞并补充[3H]正在研究的药物和不同浓度的未标记药物（达到0至100μM之间的细胞内浓度）。通过PfMDR1的不同亚型进行药物运输的动力学参数在GraphPad Prism版本8中通过Michaelis-Menten方程与数据的最小二乘拟合来确定。
通过人类P-gp或PfMDR1测量药物转运的实验包括ne和表达PfNT1 [60，61]（一种不相关的转运蛋白）作为阴性对照的实验。后一种对照证实，卵母细胞质膜的完整性没有受到外来蛋白异源表达和第二次注射事件的综合作用的影响（即膜没有泄漏）。为了确认PfNT1在卵母细胞表面表达，摄取[3H]次黄嘌呤（PfNT1的已知底物）在cRNA注射后第1天在ne和表达PfNT1的人中测量。简而言之，用3.5mL ND96缓冲液（pH 6.0）洗涤10个卵母细胞两次，并用移液管除去残留溶液。测定开始时加入100μLND96缓冲液（pH 6.0），含有0.38μM [3H]次黄嘌呤和潜伏期为30分钟。通过除去反应缓冲液并用3.5mL冰冷的ND96缓冲液（pH 6.0）洗涤卵母细胞两次来终止测定。将每个卵母细胞转移到白色96孔板的孔中，并对样品进行处理，并如上所述测量放射性。
通过PfCRT测量非洲爪蟾卵母细胞中的药物转运
除非另有说明，否则PfCRT转运测定在cRNA注射后2至3天进行，并在27.5°C下进行1.5小时以上。 PfCRT在寄生虫DV膜中的取向使得其氨基末端和羧基末端延伸到细胞质基质中，因此，预测蛋白质在卵母细胞质膜中的方向相同。因此，底物通过PfCRT从酸性细胞外溶液转运到卵母细胞质质[6]类似于PfCRT介导的底物从寄生虫的酸性DV流出并进入细胞质质质[6]（S9图）。这是在PfCRT卵母细胞测定中测量甲氟喹转运的方向。简而言之，用3.5mL ND96缓冲液（pH 5.0）洗涤10个卵母细胞两次，并用移液管除去残留溶液。测定开始时加入100μLND96缓冲液（pH 5.0），含有0.125μM [3H]甲氟喹和0.5μM未标记的甲氟喹，并且在指定的情况下，100μM的已知转运蛋白抑制剂（维拉帕米[6，18]，氯苯那敏[90]或沙奎那韦[10，91]）或不与PfCRT相互作用的化合物（组氨酸或二肽LH [9，10]）。进行了四次独立实验（在不同的日子，使用来自不同青蛙的卵母细胞），并在每个实验中，每次处理从10个卵母细胞进行测量。
通过PfCRT对甲氟喹运输的动力学进行了分析，方法是测量[3H]甲氟喹（0.125μM）在0至50μM未标记甲氟喹的存在下。在所有情况下，通过除去反应缓冲液并用3.5mL冰冷ND96缓冲液（pH 5.0）洗涤卵母细胞两次来终止孵育。将每个卵母细胞转移到白色96孔板的孔中，并对样品进行处理，并如上所述测量放射性。可归因于PfCRT的运输成分（即PfCRT介导的运输）是通过减去[3在阴性对照卵母细胞（ne）中检测到的甲氟喹积累，从表达PfCRT的卵母细胞中测量的3D7， PfCRT7G8或 PfCRTDd2.通过PfCRT的甲氟喹输运的动力学参数在GraphPad Prism版本8中通过Michaelis-Menten方程与数据的最小二乘拟合来确定。
我们最近确定PfCRT的天然底物是长度为4至11个氨基酸残基的宿主衍生肽[10]。此外，我们发现，除了H依赖性之外，通过PfCRT的肽转运还需要第二个尚待鉴定的共本质，但其天然存在于非洲爪蟾卵母细胞中。因此，PfCRT介导的血红蛋白肽VDPVNF的转运通过微注射[+3H]VDPVNF进入卵母细胞并测量其从卵母细胞的流出[10]。此外，经过初步实验后发现[3H]苯芴蒽碱同样依赖于第二共物质的存在通过PfCRT进行运输（[3在表达PfCRT的卵母细胞中无法检测到细胞外溶液中的H]苯芫葸碱摄取），该药物的转运也使用外排测定法测量。通过微注射卵母细胞用25 nL ND96缓冲液（pH 5.5）补充[3H]苯芪蒴碱和未标记的苯芫蒴碱（分别达到估计的细胞内浓度为1.6μM和1μM）。[3H]VDPVNF 和 [3通过PfCRT的H]苯芴碱转运按上述方法进行PfMDR1外排测定。进行了四次独立实验（在不同的日子，使用来自不同青蛙的卵母细胞），并在每个实验中，每次处理从10个卵母细胞进行测量。
通过PfCRT对苯芴氨酸转运的动力学进行分析，方法是用[3H]苯芪蒽碱补充不同浓度的未标记的苯芫葸碱（达到估计的细胞内浓度在0和50μM之间）。通过PfCRT的lumefantrine传输的动力学参数在GraphPad Prism版本8中通过Michaelis-Menten方程与数据的最小二乘拟合来确定。
未标记的维拉帕米、氯苯那敏、沙奎那韦、组氨酸或 LH 对顺式抑制的能力 [3H]黄芪碱转运通过补充含有[3H]苯芪蒴碱和未标记的苯芴蒽碱与未标记的测试化合物（以达到100μM的细胞内浓度）。
未标记的甲氟喹或苯芫蒳碱抑制顺式的能力 [3H]VDPVNF转运通过微注射卵母细胞与25 nL ND96缓冲液（pH 5.5）补充[3H]VDPVNF和未标记的VDPVNF（分别达到估计的1.4μM和200μM的细胞内浓度）以及未标记的药物，其浓度将达到所需的细胞内浓度（10至250μM）。集成电路50在 GraphPad Prism 版本 8 中，值由方程 y = y 的最小二乘拟合确定最小值+ [（y麦克斯? y最小值）/（1 + （[测试化合物]/IC50)c]到数据，其中 y 是 PfCRT 介导的 VDPVNF 传输，y最小值和 y麦克斯是 y 的最小值和最大值，c 是拟合常数。
蛋白质印迹分析
使用获得卵母细胞膜蛋白制剂的既定方法，对cRNA注射后1天卵母细胞膜中HA标记的PfMDR1蛋白水平进行了半定量测量[7]。将含有膜蛋白级分的沉淀溶解在含有10mM二硫黄醇，1.5%（v / v）SDS，10%（v / v）β巯基乙醇，9mM Tris-HCl（pH 7.6），4.5mM NaCl，0.45%（v / v）Triton X-100和27.5%（v / v）NuPage LDS样品缓冲液（Life Technologies，加利福尼亚州，美国;目录号：）的溶液中溶解。NP0007）。卵母细胞膜制剂中存在的蛋白质在NuPage 3至8%Tris-Acetate聚丙烯酰胺凝胶中分离（Thermo Fisher Scientific，目录号。EA03752）使用三醋酸SDS电泳缓冲液，然后转入0.45μM硝酸纤维素转印膜（Bio-Rad，加利福尼亚州，美国;目录号1620115）。用小鼠抗HA抗体（1：5，000;西格玛-奥尔德里奇，目录号H9658）接着是辣根过氧化物酶偶联的马抗小鼠抗体（1：3，000;细胞信号技术公司， 马萨诸塞州， 美国;目录。没有 7076S）。使用SuperSignal West Pico化学发光试剂（赛默飞世尔科技，目录号34578）检测每种PfMDR1同种型的条带，使用ImageJ软件[112]进行定量，并以PfMDR1测量的条带强度的百分比表示奈森德.总蛋白染色用于评估样品上样量和转移效率[7，113]。简而言之，用Ponsceau S染色硝酸纤维素膜5分钟，然后使用超纯水去污。使用Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统对染色的蛋白质条带进行可视化，并在Image Lab 6.0.1版软件（Bio-Rad）中进行密度分析，以量化每个泳道内70至180 kDa（检测到PfMDR1的区域）之间所有蛋白质条带的总和强度。至少进行了4次独立实验（使用来自不同青蛙的卵母细胞），在每个实验中，测量值均来自2个单独的重复。
免疫荧光检测
使用来自Richards及其同事的方法，使用免疫荧光测定法在cRNA注射后1至2天定位卵母细胞中HA标记的PfMDR1[9]。除非另有说明，否则所有孵育和洗涤步骤均在室温下温和摇晃或旋转进行。所有孵育均使用500μL的体积进行，所有洗涤步骤均使用1mL的体积进行。将每种卵母细胞类型的六个卵母细胞用4%（v / v）多聚甲醛固定在PBS中30分钟。然后将卵母细胞在PBS中洗涤3次，每次10分钟，然后通过在?20°C下在100%甲醇中孵育20分钟而不摇晃来渗透。在封闭溶液（4%（w / v）BSA，2%（v / v）正常山羊血清和PBS中的0.1%（v / v）Triton X-100）中孵育卵母细胞2小时之前，在PBS中进行了另外三次10分钟的洗涤。用第二种封闭溶液（PBS中的4%（w / v）BSA和2%（v / v）正常山羊血清）代替该溶液，并在4°C下孵育过夜。 第二天，将卵母细胞在室温下在同一封闭溶液中再孵育4小时，然后在含有小鼠抗HA抗体的溶液中孵育（1：100;在含有1.5%（w / v）BSA和0.01%（v / v）Triton X-100的PBS溶液中孵育;西格玛-奥尔德里奇，目录号H9568）在室温下4小时，然后在4°C下过夜。 第二天，在补充了1.5%（w / v）BSA的PBS中洗涤卵母细胞3次，每次10分钟。其余所有步骤均在室温下的黑暗中进行。将卵母细胞在含有Alexa Fluor 488驴抗小鼠抗体（1：500;在含有4%（w / v）BSA和2%（v / v）正常山羊血清的PBS溶液中孵育4小时;分子探针， 俄勒冈州， 美国;目录号A21202）。然后将卵母细胞在PBS中洗涤3次，每次10分钟，用PBS中3.7%（v / v）多聚甲醛固定30分钟，并在PBS中洗涤两次，每次15分钟。通过在乙醇含量增加的溶液中通过一系列15分钟的孵育对卵母细胞进行脱水：PBS中30%（v / v）乙醇，PBS中50%（v / v）乙醇，超纯水中70%（v / v）乙醇，超纯水中90%（v / v）乙醇和100%乙醇（在100%乙醇中进行3次孵育）。使用Technovit 7100塑料包埋系统将脱水的卵母细胞嵌入丙烯酸树脂中（美国印第安纳州库尔泽;目录号64709003）。使用带有玻璃刀的切片机获得2μm的切片，并在显微镜载玻片上干燥切片。一滴ProLong黄金抗淬灭衬垫（Life Technologies，目录号。P36934）被放置在#1.5盖玻片上，然后将其放置在每个载玻片上的卵母细胞切片上，并使用透明指甲油密封。使用63×物镜使用徕卡Sp5倒置共聚焦激光显微镜（徕卡显微系统公司，德国韦茨拉尔）捕获图像。使用488nm氩激光器实现激发，并使用500至550nm滤光片捕获发射。图像是使用徕卡应用套件高级荧光3.6版软件（徕卡显微系统）采集的。对每种卵母细胞类型进行了至少2次独立实验（在来自不同青蛙的卵母细胞上），其中检查了至少5个卵母细胞的切片。
PfMDR1在非洲爪蟾卵母细胞质膜中的取向
为了确定PfMDR1在非洲爪蟾卵母细胞表面的取向，开发了一种免疫荧光测定法，并在cRNA注射后1天对卵母细胞进行了测定。该方法使用未固定或透化的活卵母细胞，从而防止抗体渗透到卵母细胞细胞质基质中。因此，在这些条件下，抗体只能与同源的细胞外表位结合。所有孵育步骤均在16至18°C下以500μL的体积进行，并轻轻摇动。该实验包括以下卵母细胞类型：ne（阴性对照），表达HA的卵母细胞断续器-AmDAT（阳性对照）和表达3xHA-PfMDR1的卵母细胞奈森德或 PfMDR1奈森德-3xHA.将每种类型的6个卵母细胞在封闭溶液中孵育6小时（3%（w / v）BSA和1%（v / v）正常山羊血清在OR2缓冲液中）。随后与小鼠抗HA抗体（在OR2缓冲液中1.5%（w / v）BSA的溶液中1：250）孵育2小时;西格玛-奥尔德里奇目录号H9568）。将样品用OR2缓冲液洗涤3次，每次10分钟，然后用Alexa Fluor 488驴抗小鼠抗体（1：500在OR2缓冲液中1.5%（w / v）BSA的溶液中孵育2小时;分子探针，目录号A21202）。然后将卵母细胞用OR2缓冲液冲洗3次（每次10分钟）。使用徕卡M205 FA荧光立体显微镜和徕卡应用套件4.12版软件（徕卡显微系统）进行成像。使用488 nm激光实现激发，并使用500至550 nm滤光片捕获发射。对每种卵母细胞类型进行了至少2次独立实验（使用来自不同青蛙的卵母细胞）。-厦门杂志期刊论文发表
寄生红细胞培养
使用人类血液进行这项工作得到了澳大利亚国立大学人类研究伦理委员会的批准（人类伦理批准号2017/351）。无性红细胞内3 P期。恶性疟原虫 pfcrt 转染品系和 3 P.研究了恶性疟原虫菌株。3个pfcrt转染线是氯喹敏感线C2GC03（保留野生型 pfcrt 等位基因 PfCRT 的重组对照3D7）和耐氯喹线C67G8和 C4Dd2（其中“GC03”系的野生型pfcrt等位基因分别被7G8或Dd2菌株的突变等位基因取代[17]）。C6 生成过程中的 PCR 错误7G8线引入了额外的突变（I351M）[22]，这在PfCRT序列中找不到7G8.这些菌株包括3D7和HB3，它们是携带PfCRT的氯喹敏感寄生虫。3D7，但表示 PfMDR1奈森德或 PfMDR1NFSDD分别。耐氯喹菌株为Dd2，表达PfCRTDd2和 PfMDR1财政年度和/或 PfMDR1YYSND.寄生虫培养物维持在4%的血细胞比容，并与5%（w/v）山梨醇同步[114]。pfcrt转染品系在选择试剂杀伤剂（5μM;Sigma-Aldrich，目录号 30891）和 WR99210 （5 nM;MedChemExpress，目录号HY-116387）。这些选择试剂在实验过程中不存在。
使用两种细胞系鉴定方法来验证6种寄生虫培养物的身份。第一个通过进行增殖测定评估了每种培养物的氯喹抗性表型，从而产生氯喹IC50s 表示每个寄生虫线或菌株。通过将结果与先前公布的数据进行比较[9，10，20，21]进行了验证（见P。恶性疟原虫增殖测定部分有关详细信息）。还通过PCR对6种寄生虫培养物中的每一种进行支原体检测测定，并使用引物混合物扩增来自各种支原体菌株的核糖体DNA[115]。在整个研究过程中，在任何寄生虫培养物中均未检测到支原体感染。
恶性疟原虫 H-外排量测定+
通过磁分离富集寄生虫培养物以滋养体期寄生虫，并用装载膜不透水性pH敏感荧光指示剂荧光素 - 葡聚糖（10，000 MW;生命技术，目录号D1821）。当这种染料在红细胞内生长时，它们被吸收到寄生虫的DV中。在完全无性循环（约48小时）之后，使用0.05%（w / v）皂苷从红细胞中分离出成熟的滋养体阶段寄生虫，并悬浮在盐水溶液（125mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl）中2， 20 mM 葡萄糖， 和 25 mM HEPES;pH 7.1）密度为1×107细胞/毫升。荧光测定实验如前所述[21]。简而言之，使用Cary Eclipse荧光分光光度计（美国加利福尼亚州安捷伦科技公司）在37°C下监测DV的pH值（激发波长490nm和450nm;发射波长520nm）。将药物加入寄生虫悬浮液（2.5μM氯喹，沙奎那韦，甲氟喹或苯芫葸碱），并将溶液孵育4分钟（氯喹，沙奎那韦和甲氟喹）或8分钟（鲁芬蒽碱），以使药物在DV内积累至高浓度。随后加入V型H-ATP酶抑制剂康那霉素A（100nM;西格玛-奥尔德里奇，目录号 27689）。在 GraphPad Prism 版本 8 中，DV 碱化速率的一半时间由方程 F = F 的最小二乘拟合确定+0+ F麦克斯/[1 + （吨/吨1/2)c]其中 F 是荧光比，F0是初始荧光比（在打开荧光计腔室并加入康那霉素A之前超过20秒的平均值），t是时间，t1/2是DV碱化的半衰期，F麦克斯是荧光比的最大变化，c是拟合常数[20]。PfCRT介导的DV碱化速率是通过从每个寄生虫管路内每个处理的DV碱化速率中减去溶剂控制的DV碱化速率来计算的。在所有情况下，在不同的日子进行了4次独立实验。
恶性疟原虫增殖试验
如前所述，使用荧光DNA插层染料在透明的96孔板中进行寄生虫增殖测定[116，117]。简言之，将同步环期寄生虫培养物（约1%血细胞比容和1%寄生虫血症）与浓度增加的奎宁或氯喹在37°C和减少O下孵育72小时2条件。通过冷冻和解冻样品终止测定，然后将每个孔中的100μL转移到另一个96孔板中。随后加入100μLSYBR安全DNA凝胶染色剂（0.2μL / mL;分子探针，目录号S33102）在裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，5 mM EDTA，0.008%（w / v）皂苷和0.08%（v / v）Triton X-100;pH 7.5）中到每个孔。使用Tecan Infinite M1000 PRO酶标仪（激发波长490nm;发射波长520nm）测量荧光。对于每个96孔板，对含有最高浓度化合物的孔的荧光值进行平均，然后从每个孔获得的荧光值中减去该值。存在每种化合物浓度时寄生虫增殖水平表示为在没有化合物的情况下测量的增殖的百分比。集成电路50在 GraphPad Prism 版本 8 中，s 由方程 y = a/[1 + （[化合物]/IC） 的最小二乘拟合确定50)c]到数据中，其中y是寄生虫增殖的百分比，a是寄生虫增殖百分比的最大变化，c是拟合常数。在所有情况下，进行了4次独立实验（在不同日期），并且在每个实验中，测量值均来自3次重复。
MDR1对准的构建和PfMDR1同调模型的生成
使用基本局部比对搜索工具（BLAST）从NCBI数据库中检索属于MDR1家族的蛋白质，其中PfMDR1（PF3D7_0523000）作为查询序列。使用ClustalW程序[118]对61种这些蛋白质（包括已经确定结构的蛋白质）进行了具有代表性的选择，并在MacVector版本12.7.5中手动编辑了所得到的对齐。与使用简单的成对比对相比，生成包含大量相关蛋白质的比对可能会增强PfMDR1与模板结构比对的信心。使用这种大型多序列比对，我们鉴定了2种与PfMDR1相关的蛋白质，这些蛋白质具有已知的结构和显着的序列同一性：秀丽隐杆线虫P-gp处于向内开放状态[68]（PDB加入代码4F4C，32.6%序列同一性）和人P-gp处于向外开放状态[69]（PDB加入代码6C0V，33.2%序列同一性）。使用MODELLER版本9.17 [119]的自动建模协议，从每个模板构建100个PfMDR1模型，并根据MODELLER版本9.17计算的最低离散优化蛋白质能量（DOPE）[120]值选择最佳模型。分子图是使用视觉分子动力学（VMD）建模程序制作的[121]。
使用NAMD版本2.13仿真代码[122]对向内开放PfMDR1同源模型结合口袋中奎宁进行分子动力学模拟。首先，使用自动化的ParamChem CGENFF工具[124，125]生成奎宁的CGENFF力场[123]参数。进行了7次独立模拟，在PfMDR1的大水腔内随机起始位置和奎宁的方向。在PfMDR1的结构中，距离结合口袋中心超过17 ?的原子（由L327和F1072的骨架中点定义，位于腔体的相对侧）受到谐波约束，而该范围内的原子不受约束。蛋白质约束从1 kcal/mol/?开始降低2至 0.001 千卡/摩尔/埃2超过8个步长（值为1，0.5，0.2，0.1，0.05，0.02，0.01和0.001），系统能量最小化100步，然后每步100 ps动态。一旦该平衡阶段完成，模拟继续30 ns，并保持蛋白质的最终谐波约束。用 TIP3P 水分子溶解PfMDR1的中心空腔，TIP3P水分子被限制保持在结合口袋中心的球体（半径为20 ?）内，使用施加到力常数为20 kcal/mol/?的水分子氧原子上的球形谐波边界电位2.具有CMAP校正[126]的CHARMM36力场用于蛋白质，并使用Langevin恒温器在300 K的温度下进行模拟。所有与氢的键都保持固定，允许使用2 fs时间步长。
体外耐药指数与通过PfMDR1的药物运输速率之间的相关性
集成电路50s用于苯芪蒽碱，甲氟喹，氯喹和奎宁从相关文献中整理（参见S3表作为参考）。适用于先前已发表研究的纳入标准是：（1）IC50对于一种或多种感兴趣的寄生虫菌株（即 HB3、Dd2、K1、GB4 或 7G8），以及 （2） IC50对于3D7控制应变成对执行。对于苯芪蒽碱、甲氟喹和奎宁，4至10项研究符合这些标准，因此被纳入分析。测量氯喹IC的几项研究50s不包括与3D7的成对测量;相反，使用HB3或GC03寄生虫进行成对测量（这两种菌株均表达PfCRT3D7和 PfMDR1NFSDD和它们的氯喹IC50在成对研究中，s通常与3D7非常相似）。由于这些研究测量了氯喹IC50对于不经常研究的寄生虫菌株，如GB4，将它们纳入我们的分析非常重要。因此，氯喹研究的纳入标准被修改为包括那些测量了氯喹IC的研究。50s在HB3或GC03寄生虫中作为对照菌株，无论是否包括3D7菌株。通过除以IC来计算每项研究的体外抵抗指数50IC 对每个菌株50对照菌株（3D7用于苯芪蒽碱，甲氟喹和奎宁;HB3或GC03用于氯喹）。然后对多项研究的指数进行平均，并计算平均值的标准误差（或仅从2项研究中计算的耐药指数的范围/2）。对于每种药物，将耐药性指数与实验确定的非洲爪蟾卵母细胞中PfMDR1亚型的转运活性进行对比图（S1数据）。
量化和统计分析
使用ImageJ版本1.8.0，GraphPad Prism版本8，徕卡应用套件高级荧光软件版本3.6，徕卡应用套件软件版本4.12，Image Lab版本6.0.1软件（Bio-Rad），MODELLER版本9.17，VMD，NAMD版本2.13和MarvinSketch软件版本18.10进行统计测试，数据收集和分析。使用单向ANOVA结合Tukey多重比较测试进行统计比较。文本中引用并如图所示的所有错误均代表SEM或范围/ 2。如果未显示，则误差线落在交易品种内。显著性定义为 P < 0.05。每个数据集的关键统计详细信息包含在图例中。
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PfNT1 传输 [3H]次黄嘌呤在非洲爪蟾卵母细胞中表达时。
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S1 图 PfNT1 传输 [3H]次黄嘌呤在非洲爪蟾卵母细胞中表达时。
表达PfNT1的卵母细胞在实验中用作阴性对照，测量[3H]表达人P-gp或PfMDR1的卵母细胞的药物流出和在实验中测量[3H]苯芴碱或[3H]VDPVNF从表达PfCRT的卵母细胞流出。该对照表明，非洲爪蟾卵母细胞中转运蛋白的异源表达不影响卵母细胞膜在显微注射后重新密封的能力[3H]药物或[3H]VDPVNF.为了确认PfNT1在卵母细胞质膜上表达和功能，在表达转运蛋白的卵母细胞以及非表达（ne）卵母细胞中测量了次黄嘌呤（PfNT1的已知底物）的摄取。[3H]次黄嘌呤在ne中的积累是由于未质子化物质的简单扩散。数据是n = 4个独立实验的平均值，每个实验产生相似的结果并叠加为单个数据点，误差为SEM。星号表示与 ne 的显著差异;P < 0.001（单因子方差分析）。此图的基础数据在 S3 数据中提供。ne，非表达性卵母细胞;PfCRT，恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白;PfNT1，恶性疟原虫核苷转运蛋白1;PfMDR1，恶性疟原虫多药抗药蛋白1;P-gp，P-糖蛋白。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s001
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S2 图 已知的人P-gp抑制剂通过PfMDR1抑制苯芪蒽碱的转运。
（a） 示意图显示[3H]通过人P-gp或PfMDR1通过非洲爪蟾卵母细胞系统中已知的P-gp抑制剂进行药物运输。（b） 国际刑事调查委员会50尼卡地平、PSC833、钒酸盐和维拉帕米对 [3H]长春花碱通过人P-gp和[3H]通过PfMDR1的苯苐碱运输。数据为n = 4个独立实验的平均值，误差为SEM。此图的基础数据在 S3 数据中提供。PfMDR1，恶性疟原虫多药抗药蛋白1;P-gp，P-糖蛋白。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s002
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S3 图 PfMDR1 和 PfCRT 的预测拓扑。
（a） PfMDR1由1，419个氨基酸残基组成，排列成12个TMD和2个NBD。围绕NBD显示的循环长度是近似值。（b） PfCRT由424个氨基酸残基组成，这些残基排列成10个TMD。所有循环都代表真实循环长度。本研究中使用的PfMDR1和PfCRT同种型中突变的位置由粉红色圆圈表示，并且附着在每个多态性残基上的框列出了在该位置发生的（非野生型）氨基酸。NBD，核苷酸结合结构域;PfCRT，恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白;PfMDR1，恶性疟原虫多药抗药蛋白1;TMD，跨膜结构域。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s003
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S4 图 PfMDR1在卵母细胞表面表达，并在细胞质基质中取向其末端。
（a）免疫荧光显微镜图像证实，每种3xHA标记的PfMDR1亚型的表达导致色素层外部的荧光条带，表明蛋白质在卵母细胞质膜中表达。乐队没有出现在ne中。表达 APIs mellifera 多巴胺转运蛋白 （HA） 的 HA 标记版本的卵母细胞断续器-AmDAT）在质膜上作为阳性对照[113]。比例尺的长度为50μm。这些图像代表了至少2个独立实验（使用来自不同青蛙的卵母细胞进行），其中图像是从每种卵母细胞类型至少3个卵母细胞中获得的。（b） 使用免疫荧光显微镜使用抗HA抗体和荧光二抗确定PfMDR1在活卵母细胞质膜中的方向。抗HA抗体将与细胞外HA标签结合，并且不能进入细胞内HA标签。因此，抗HA抗体只会检测到具有细胞外HA标签的蛋白质。表达HA的卵母细胞中的荧光信号断续器-AmDAT在卵母细胞的外围最强，表明AmDAT在卵母细胞膜中定向，使得HA标记的环是细胞外。在ne（阴性对照）或表达3xHA-PfMDR1的卵母细胞中没有荧光信号奈森德或 PfMDR1奈森德-3xHA（请参阅 S1 文本）。这表明PfMDR1的氨基末端和羧基末端位于卵母细胞的细胞质基质中。比例尺的长度为 1 mm。这些图像代表了3个独立实验，其中图像是从每种卵母细胞类型中至少3个卵母细胞获得的。HA，血凝素;ne，非表达性卵母细胞;PfMDR1，恶性疟原虫多药抗性蛋白1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s004
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S5 图 测量蛋白质水平和[3H]黄芪碱在非洲爪蟾卵母细胞中HA标记的PfMDR1亚型的转运活性.
（a） 分析3xHA-PfMDR1膜蛋白制剂不同稀释液中的PfMDR1水平奈森德-表达卵母细胞揭示了膜蛋白的相对数量与相应PfMDR1条带的强度之间的S形关系（r2= 0.99）。（b） 观察到3xHA-PfMDR1强度之间的乙状体关系奈森德蛋白条带和3xHA-PfMDR1的量奈森德cRNA微注射到卵母细胞中（r2= 0.99）。这种关系在2.5和10 ng的cRNA之间近似线性。（c） 在[3H]苯芴氨酸转运和3xHA-PfMDR1的量奈森德cRNA微注射到卵母细胞中（r2= 0.99）。这种关系在 1 和 10 ng 的 cRNA 之间是线性的，[3H]苯芪碱迁移饱和高于此范围。（d）结合图b和c中的图，发现在卵母细胞中微注射2.5至10 ng的3xHA-PfMDR13D7cRNA，3xHA-PfMDR1的强度奈森德蛋白条带与3xHA-PfMDR1水平密切相关奈森德-介导 [3H]苯芪碱转运（r2= 0.9904）。（e）表达3xHA-PfMDR1的卵母细胞膜中PfMDR1蛋白水平的半量化奈森德， PfMDR1奈森德-2xHA，或 PfMDR1奈森德-3xHA显示，相对于3xHA-PfMDR1奈森德，在蛋白质的羧基末端添加HA标签显着降低了PfMDR1水平。（f） 表达PfMDR1的卵母细胞奈森德-2xHA 或 PfMDR1奈森德-3xHA还显示出显着较低的水平[3H]苯芴碱转运相对于表达3xHA-PfMDR1的那些奈森德.（g）总蛋白质的密度分析表明，在产生图1G的蛋白质印迹实验中，样品泳道之间没有显着差异。在每个实验中，用Ponceau S染色硝酸纤维素膜上的蛋白质，并在每个泳道内测量70至180 kDa之间的强度。（h） 3xHA-PfMDR1奈森德和 3xHA-PfMDR1断续器相对于各自的未标记蛋白质，苯芪苋碱转运活性略有降低。数据是4到9个独立实验的平均值（每个实验产生相似的结果，并叠加为面板e-h中的单个数据点），误差是SEM。在不可见的情况下，误差线落在交易品种内。星号表示与 3xHA-PfMDR1 的显著差异奈森德控件或 PfMDR1奈森德控制;*P < 0.05，***P < 0.001，ns，不显著（单因子方差分析）。此图的基础数据在 S3 数据中提供。ne，非表达性卵母细胞;PfMDR1，恶性疟原虫多药抗性蛋白1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s005
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S6 图 奎宁与PfMDR1中1042D残基的相互作用NFSDD.
奎宁分子在7个分子动力学模拟过程中的运动由奎宁的质子化环胺环与1042D侧链上的羧酸盐氧原子在模拟持续时间内的距离表示。执行了七个模拟，每个模拟由不同颜色的线表示。奎宁在7个模拟中的4个（用黄色，蓝色，海军和绿色线表示）中接近D1042，在其中2个模拟中形成稳定，持久的氢键（用海军和绿线表示）。PfMDR1，恶性疟原虫多药抗性蛋白1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s006
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S7 图 通过PfCRT在非洲爪蟾卵母细胞中运输苯芪蒽碱和甲氟喹。
（一、三）[3H]苯芴碱（a）和[3H]甲氟喹（c）通过PfCRTDd2与时间近似线性，至少2小时。（二、四）[3H]苯芴碱 （b） 和 [3H]甲氟喹（d）通过PfCRTDd2和PfCRT7G8被已知的转运蛋白抑制剂（维拉帕米，氯苯那敏和沙奎那韦）减少，并且不受组氨酸和LH（不与PfCRT相互作用的代谢物）的影响。数据是n = 4个独立实验的平均值，每个实验产生相似的结果，并叠加为面板b和d中的单个数据点，误差为SEM。在不可见的情况下，误差线落在交易品种内。星号表示与 PfCRT 的显著差异Dd2控件（红色星号）或 PfCRT7G8对照（橙色星号）：**P < 0.01，***P < 0.001（单因子方差分析）。此图的基础数据在 S3 数据中提供。PfCRT，恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s007
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S8 图 本研究中使用的化合物子集的结构。
pK一个标明了每种化合物中质子化氮的值。结构和 pK一个这些值是从文献[127]中整理出来的，或者在MarvinSketch软件（ChemAxon）中生成的。pK一个，酸解离常数的碱基数 10 的负对数。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s008
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S9 图 通过PfMDR1和PfCRT原位的药物运输方向与非洲爪蟾卵母细胞中的药物运输方向。
PfMDR1在DV膜中定向，使其氨基末端和羧基末端以及其NBD位于寄生虫细胞质基质中[36]。由于“阳性内部规则”，预计PfMDR1将在卵母细胞质膜中采用相同的取向（即其末端和NBD延伸到卵母细胞细胞质基质中）[128，129]。使用免疫荧光显微镜和表达HA标记版本的PfMDR1的活卵母细胞证实了这一方向（S4图）。PfCRT还在其氨基末端和羧基末端位于寄生虫细胞质基质中，在DV膜中定向[130]，并且根据“阳性内部规则”预测在卵母细胞质膜中采用相同的方向（即，其氨基末端和羧基末端在卵母细胞质基质基质中）。（a）在疟疾寄生虫中，PfMDR1介导药物从寄生虫细胞质基质（pH约为7.3）转运到DV的酸性环境（pH 5.0至5.5），其中弱碱性药物将变成质子化[94]。在非洲爪蟾卵母细胞系统中，所研究的药物被微注射到卵母细胞细胞质基质中（pH约为7.2），并通过PfMDR1转运到细胞外溶液（pH 5.5）中。因此，在这两种情况下，PfMDR1介导的药物运输方向是从细胞细胞质基质进入酸性DV腔或酸性细胞外溶液。（b）弱碱基药物也通过中性物质的简单扩散积聚在寄生虫DV中，中性物质在进入该细胞器的酸性腔时变成质子化。在表达PfCRT的氯喹抗性亚型的寄生虫中，转运蛋白介导质子化药物从DV到寄生虫细胞质基质的转运。在非洲爪蟾卵母细胞表达系统中，所研究的药物通常被添加到酸性细胞外溶液中，PfCRT的突变同种型将质子化的药物转运到卵母细胞细胞质基质中。因此，在这两种情况下，PfCRT介导的药物转运方向都是从酸性DV腔/酸性细胞外溶液进入细胞细胞质基质。也就是说，在苯芴苋碱的情况下，将药物微注射到卵母细胞中，并测量其从细胞质基质到细胞外溶液的运输。之所以使用这种修改方案，是因为通过PfCRT的苯芴蒽碱转运似乎依赖于转运蛋白的第二共本质[10]。PfCRT的内源性底物，例如血红蛋白衍生的六肽VDPVNF，与H和天然存在于卵母细胞细胞质基质内的第二共底物易位[10]。然而，应该注意的是，PfCRT是载体[6，10，131]，这意味着它可以介导底物在任一方向上穿过膜的运输（假设存在必要的协质），其净运输方向由底物的普遍电化学梯度决定。在寄生虫DV中，这些梯度将导致苯芴碱与H（以及未识别的第二共本体）从DV腔共转入寄生虫细胞质基质。DV，消化液泡;NBD，核苷酸结合结构域;PfCRT，恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白;PfMDR1，恶性疟原虫多药抗性蛋白1.++
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s009
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S10 图 铁螯合剂IV不影响通过PfMDR1的药物运输。
[ 的测量值3通过PfMDR1的H]双氢青蒿素转运是在铁螯合剂IV存在下进行的，以结合卵母细胞中存在的任何游离铁。游离铁可以激活双氢青蒿素，从而损害卵母细胞并干扰运输的测量。铁螯合剂IV（估计细胞内浓度为1mM）对[3在表达PfNT1，PfMDR1的ne和卵母细胞中测量H]苯芪碱转运奈森德或 PfMDR1断续器.数据是 n = 4 个独立实验的平均值（每个实验产生相似的结果并叠加为单个数据点），误差为 SEM。在不可见的情况下，误差线落在交易品种内。对PfMDR1进行统计分析奈森德控制（蓝色）或 PfMDR1断续器（深粉红色）控制;ns，不显著（单因子方差分析）。此图的基础数据在 S3 数据中提供。ne，非表达性卵母细胞;PfMDR1，恶性疟原虫多药抗药蛋白1;PfNT1，恶性疟原虫核苷转运蛋白1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s010
（TIF）
S1 表。 PfMDR1亚型中的氨基酸突变包括用于研究。
PfMDR1，恶性疟原虫多药抗性蛋白1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s011
（英文）
S2 表。 PfCRT亚型中的氨基酸突变包括用于研究。
PfCRT，恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s012
（英文）
S3 表。 P的体外耐药性指数。恶性疟原虫菌株用于苯芪碱、甲氟喹、氯喹和奎宁。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s013
（英文）
S4 表。 生成用于在非洲爪蟾卵母细胞中表达的PfMDR1编码序列。
PfMDR1，恶性疟原虫多药抗性蛋白1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s014
（英文）
S1 文本。 氨基末端或羧基末端表位标签对非洲爪蟾卵母细胞中PfMDR1表达和功能的影响。
PfMDR1，恶性疟原虫多药抗性蛋白1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s015
（英文）
S2 文本。 通过PfMDR1直接测量荧光化合物的转运。
PfMDR1，恶性疟原虫多药抗性蛋白1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s016
（英文）
S3 文本。 PfMDR1在调节寄生虫对一系列抗疟药物的反应中的作用。
PfMDR1，恶性疟原虫多药抗性蛋白1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s017
（英文）
S4 文本。 疟疾寄生虫中的奎宁耐药性是一种多因素现象。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s018
（英文）
S1 文件。 用于生成PfMDR1同源模型的MDR1蛋白的比对。
PfMDR1，恶性疟原虫多药抗性蛋白1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s019
（英文）
S1 数据。 PfMDR1介导的药物转运率。
PfMDR1，恶性疟原虫多药抗性蛋白1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s020
（XLSX）
S2 数据。 质子化药物比例。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s021
（XLSX）
S3 数据。 源数据文件包含图 1–6、表 1 和 S1、S2、S5、S7 和 S10 图中所示的基础数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001616.s022
（XLSX）
确认
我们感谢David Fidock教授提供转染剂P。恶性疟原体谱系，Jamie Robertson产生PfMDR1财政年度构建Richard Callaghan教授对手稿进行有益的讨论，澳大利亚红十字会堪培拉分部负责提供血液，成像和细胞计数设施（澳大利亚国立大学）提供设施和技术援助，澳大利亚显微镜高级显微镜中心（由澳大利亚国立大学和联邦政府资助）提供设施以及科学和技术援助。
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