亚核定位与印迹Dlk1-Dio3位点的基因表达比亲本起源更相关
拉希亚·马斯胡德 ，丽莎·胡尔斯曼 ，弗朗西丝·迪尔登，高桥信美，卡罗尔?爱德华兹，安妮·弗格森-史密斯
出版日期： 2022年04月28日
抽象
在相间，去凝聚的染色体在细胞核内具有非随机的三维结构，然而，人们对核组织可能影响表达的程度知之甚少，反之亦然。在这里，使用印记作为模型，我们使用正常和突变小鼠胚胎干细胞系中的3D RNA和DNA荧光原位杂交来评估印记控制，基因表达和与核外围等位基因距离之间的关系。我们比较了Dlk1-Dio3结构域中的两个亲本遗传印记结构域，发现母体遗传结构域远离外围的一个小而可重复的趋势，但是我们没有观察到核包膜附近无活性等位基因的富集。使用Zfp57KO ES细胞，其具有父系到母体表观型的转换，我们观察到表达的等位基因离核外围明显更远。
然而，在单个细胞核内，靠近外围的等位基因与更远的等位基因同样可能表达。换句话说，绝对位置并不预测表达。综上所述，这表明虽然随机激活可能导致该位点定位的微妙变化，但在基因激活时等位基因没有显着的重新定位。我们的研究结果表明，转录活性，而不是原产母，定义了内源性印记域的亚核定位。
作者简介
基因组印记是一种表观遗传调节过程，导致来自母系或父系遗传染色体的发育调节基因子集的优先表达。我们使用印记基因作为模型系统来研究染色体的亲本起源，细胞核内基因的定位及其活性表达之间的关系。通过评估Dlk1-Dio3区域的位置和Gtl2 / Meg3基因在其内的表达，我们发现父系染色体更接近外围存在一个小的偏好，但Gtl2 / Meg3基因的转录与到细胞核边缘的距离之间存在显着相关性。此外，靠近外围的染色体与更远的染色体一样可能表达基因。这些发现表明，染色体的亲本起源在定义细胞核内印记区域的位置方面可能不如基因的转录重要。
引文： Mashoodh R，Hülsmann LC，Dearden FL，Takahashi N，Edwards C，Ferguson-Smith AC （2022）亚核定位与印迹Dlk1-Dio3位点的基因表达比亲本起源更相关。PLoS Genet 18（4）：e1010186。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186厦门杂志期刊论文发表=
编辑 器： Marisa S. Bartolomei，宾夕法尼亚大学，美国
收到： 一月 18， 2021;接受： 四月 4， 2022;发表： 四月 28， 2022
版权所有： ? 2022 Mashoodh 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。
数据可用性： 所有数据都在手稿和/或支持信息文件中。
资金： 这项工作由DFG博士后奖学金资助给LCH（NE 1959 / 1-1）和CIHR博士后奖学金资助RM（MFE-146785）。ACFS的资金来自MRC计划赠款（MR/J001597/1）和惠康信托调查员奖（WT095606）。资助者在研究设计、数据收集和分析或手稿准备方面没有任何作用。
相互竞争的利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。
介绍
相间核中染色体的空间组织是非随机的，涉及染色质上的3D相互作用以及与各种核结构域的相互作用，核包膜是表征最好的[1]。虽然大部分染色体被排列成相对紧凑和空间定义的染色体区域[2]，但这些染色质之间的开放染色质包含转录工厂，其中来自不同基因组位点的活性基因在转录时共同定位[3]。最近，人们对了解染色质的3D定位如何影响或受基因表达影响的方式产生了浓厚的兴趣[4，5]。虽然染色质组织成染色体区域，拓扑相关结构域和环对转录调控具有复杂的影响，但与核包膜的相互作用通常被视为转录抑制[1]。层相关结构域（LADs）被表征为基因不良，转录不活跃的区域[6]，即使这些抑制区域已被证明在分裂细胞中是动态的，因此并不总是在群体内的每个细胞中与层相关[7]。核外围抑制环境的一个值得注意的例外是核孔复合物，其中面向染色质的核蛋白与酵母中的转录激活而不是抑制有关[8]。然而，在果蝇中，核蛋白似乎主要在核内部具有这种激活作用[9-11]。根据核外围作为抑制环境的一般观点，一些（尽管不是全部）单个基因组位点已被证明在人工靶向核层后被转录抑制[12-17]。这些发现表明亚核位置在基因调控中的作用，然而，非随机定位的程度和重要性知之甚少。
小鼠12号染色体上的Dlk1-Dio3印记结构域具有良好的表征，是比较分析基因调控机制的宝贵模型。印记基因组区域包含优先从母系或父系遗传染色体表达的基因，但也受到与控制其他基因表达相同的调节和随机转录机制的影响。因此，印记基因受种系来源的亲本来源的表观遗传机制和特定细胞类型的转录环境的调控[18，19]。Dlk1-Dio3印记（图1A）由基因间差异甲基化区域（IGDMR）调节，并包含许多亲子表达的蛋白质编码基因以及母体表达的非编码RNA。最近的证据已经探索了这个印记域的亲本起源与其亚核位置之间的关系。Kota及其同事在小鼠胚胎干（ES）细胞系中发现了Gtl2 / Meg3基因的差异定位，其中未表达的父系拷贝比表达的母系等位基因更接近核外围[20]。此外，位于簇内Begain和Dlk1之间的LINE1（L1）重复簇（图1A）被描述为代表小鼠ES细胞来源的神经干细胞中的兼性LAD[21，22]。尽管这表明L1重复序列可能通过层系留对局部基因表达产生抑制作用，但重复簇本身的缺失并未导致相邻基因的表达增加[21]。在这里，我们在多个正常和突变小鼠ES细胞系中使用广泛的3D RNA-DNA荧光原位杂交（FISH），并表明基因表达状态而不是等位基因的亲本起源与核内定位的差异有关，并认为与核包膜的并置似乎在该内源位点的基因调控中起次要作用（如果有的话）。
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图 1. 试验设计。
（A）使用包含Dlk1-Dio3印记区域中LINE1簇的260kb删除来标记等位基因的亲本起源。使用来自突变小鼠的ES细胞，模仿Dlk1-Dio3区域的单亲起源。具有染色质修饰剂Zfp57的纯合缺失的ES细胞在父系遗传的染色体上显示母体表达模式，而具有母体遗传的IGDMR缺失的ES细胞显示来自母体遗传染色体的父系表达模式。ES细胞的FISH图像，其中母体L1簇用于3D测量和Gtl2 / Meg3表达并行评估。正如预测的那样，许多Zfp57KO ES细胞显示出母体表达的Gtl2 / Meg3的双等位基因表达，而matIGDMRKO ESC显示没有Gtl2 / Meg3表达。染色体图来自Soares等人，2018年[21]。FISH图像表示采集的图像堆栈的最大投影为20-30个中心z平面。框架区域的爆炸显示在右侧。比例尺表示5μm。（B）所有基因型的预期DNA和RNA FISH组合结果的细胞核示意图。（C） 使用斐济成像包进行自动、无偏倚的距离测量。从FISH图像堆栈中手动选择每个细胞核，两个通道都二值化并添加到斐济的3D管理器中，以自动测量从FISH信号中心到3D染色质边界的最短距离。最短距离可能更多地位于图像堆栈的 xy 轴 （i） 中，或更多位于 z 轴 （ii） 中。偶尔，外周FISH信号位于染色质表示（iii）之外，因此测量为负距离（参见方法）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186.g001
结果
Dlk1-Dio3区亲本等位基因的差异核内分布
为了分析Dlk1-Dio3区域等位基因的核内定位，同时了解它们的亲本来源，我们生成了来自del的ES细胞系。L1rep母系和父系杂合子小鼠[21]。本研究仅使用雄性ES细胞系，因为先前已经表明，与雌性ES细胞相比，雄性ES细胞的印记状态更稳定[23]。这些细胞在基因Begain和Dlk1之间携带缺失，其中包括一个170kb的L1重复阵列（图1A和S1），并且具有正常的表观基因型。使用特定于L1重复阵列的DNA FISH探针，我们使用缺失来区分3D DNA FISH实验中的两条亲本染色体，与基因表达无关。重要的是，我们量化了WT染色体不携带缺失的行为。对于每个细胞，我们以自动方式测量了DNA FISH探针到染色质DAPI染色边缘定义的核外围的3D距离（图1C）。为了确保DAPI染色忠实地捕获了层的位置，使用一组单独的ES细胞（n = 84），我们比较了DAPI染色与相同细胞中层粘连蛋白染色的边缘测量值。虽然层粘连蛋白染色结果在两个可见边界（外部和内部）中，但两个测量值都是高度相关的，这表明DAPI提供了细胞系之间相对距离关系的合理估计（t = 94.309，p<2e-16，估计（斜率）= 0.993和t = 138.12，p<2e-16，估计（斜率）= 0.996对于内部和外部层粘连边界， 分别;S2 图）。因此，DAPI边缘测量被用作Dlk-Dio3印记区域核内位置的读数，该区域位于ES细胞中的单个TAD内（S1图）[24，25]。同时，我们使用新生的RNA FISH来获得每个等位基因的Gtl2 / Meg3表达状态（表达或未表达）。
我们在三个生物学复制品中进行了DNA FISH探针距离测量，每个生物复制品均来自del的母体遗传的杂合子ES细胞。L1rep（matrepKO），del的父系继承L1rep（patrepKO）和WT ES细胞，以这种方式比较亲子遗传的等位基因，母体遗传的等位基因和两者的混合物作为对照。使用多重最小二乘线性回归模型，我们发现在控制核体积后，与母体等位基因相比，父系等位基因明显更接近核外围（t = 2.946，p = 0.00334，估计（斜率）= 0.22μm;图2A）。鉴于WT细胞含有两个等位基因，我们决定表征两个等位基因之间的关系，以了解它们在这些细胞中相对于彼此的自然分布。在WT细胞中，一个等位基因总是比另一个等位基因更接近核边界，并且两个等位基因之间存在显着差异（t = 22.80，p<2e-16，估计（斜率）= 1.08μm;图2A）。这与本研究中使用的第二组WT细胞一致（WT2; t = 22.59，p<2e-16，估计（斜率）= 0.99μm）。虽然WT等位基因的亲本起源尚不清楚，但我们认为这种差异可能至少部分反映了父系等位基因偏向边缘的趋势，如先前的报告所示[20]。然而，在确保亲本来源准确性的KO细胞中，母体（M = 1.81μm，SD = 1.00μm）和父系等位基因（M = 1.58μm，SD = 0.954μm）之间的平均距离差异出乎意料地小（绝对原始均值差?230nm）。Kota及其同事先前的工作发现差异超过一千微米[20]，无论亲本来源如何，这种差异与WT近等位基因和远等位基因之间的差异一致，但不是本研究中的母系和父系等位基因（图2A）。我们在KO细胞中观察到的这种微小差异不是由于重复的变异性，因为重复之间没有显着差异（S3图），但表明我们观察到的亲本起源效应可能具有有限的功能意义。因此，我们开发了一种遗传方法，在功能更强大的背景下比较两条亲本染色体。厦门杂志期刊论文发表=
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图 2. 按亲本来源分布等位基因。
（A）如前所述，Dlk1-Dio3的父系等位基因（matrepKO-蓝色数据点）比母系等位基因（patrepKO-red数据点）明显更接近核外围。这种差异不如WT细胞内两个等位基因（近等位基因和远距离）之间的自然差异（**p<0。（B）来自matIGDMRKO ES细胞的父系和父系化等位基因（蓝色数据点）或来自WT细胞的Zfp57KO ES细胞的母系和母系化等位基因（红色数据点）之间的距离没有差异。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186.g002
表观型切换不会改变定位
为了更公开地解决原代父母与功能之间的关系，我们利用了表现出表观基因型开关的遗传模型，该模型逆转了母体或父系染色体上的印记。我们使用术语“表观遗传型”来指代区分两条亲本染色体的亲本起源特异性表观遗传标记（组蛋白修饰和DNA甲基化）。例如，父系和母体IG-DMR分别富集了H3K9me3和H3K4me3/H3K27ac[19，26–28]。母系遗传的Gtl2启动子也表现出实质性的亲本来源特异性差异DNA甲基化 - 父系等位基因被高甲基化，母系等位基因被低甲基化[19，28]。
Zfp57KO ES细胞在染色质修饰因子ZFP57中携带空突变，这对于维持印记非常重要，并且在Dlk1-Dio3区域的情况下，导致父系到母体表观基因型切换，导致父系遗传染色体的母体表达模式（图1A和1B和S4）[26，29相反，matIGDMRKO ES细胞来自具有母体遗传性IGDMR缺失的囊胚，导致母系到父系表观基因的切换和来自母系遗传染色体的亲子表达印记基因的表达[30]。因此，在 matIGDMRKO 和 Zfp57KO 行中，印记域的两个副本现在都表现为 （i.e.，表示）好像它们分别是父系或母体的副本。对于该实验，我们像以前一样使用KO囊胚的WT凋落物生成了额外的匹配的WT对照ES细胞（WT2）（参见方法）。对每个突变体和对照系使用三个生物学重复，我们发现与细胞类型之间的WT染色体相比，突变染色体的亚核定位没有显着差异（t = 0.143，p = n.s;图2B）。即使在考虑到核体积的影响之后，情况也是如此。这些发现表明，母系域母系化和母系域父系化不会导致预期的定位转移，因此表明表观遗传型不能决定定位。然而，这些数据没有考虑这些模型中印迹位点的当前转录状态。
母体表达的Gtl2 /Meg3基因的随机或发育抑制与ES细胞中等位基因向核外围的转移相关
虽然Dlk1在ES细胞中不表达，但Gtl2 / Meg3强烈表达。虽然Gtl2 / Meg3基因的所有母系遗传等位基因都具有表达该基因的潜力，但它并非在所有细胞中都活跃（S5图）。目前尚不清楚表达中的这种异质性是随机的还是受调控的。我们知道，基因表达可以通过转录开关周期进行微调，有时称为“爆裂”，这可能反映基因进出转录工厂[3]。或者，一些单独的ES细胞可能会改变其性质，导致基因表达的变化，其中可能包括Meg3（i.e.，通过分化）。由于我们无法在实验中区分这些可能的抑制类型，因此我们将Gtl2 / Meg3非表达母体等位基因称为“随机或发育抑制”。在29.5%的WT ES细胞和32.3%的patRepKO ES细胞中观察到Gtl2 / Meg3的规范活性母体等位基因的随机或发育抑制（S5图）。我们利用这一特性来测试Gtl2 /Meg3等位基因在核内定位方面是否不同（i.e.，从L1到核包膜的距离）基于它们通过RNA FISH测量的表达状态（对于活性等位基因）。我们使用逻辑回归方法来测试到外围的距离是否预测了Gtl2 / Meg3的表达状态（在控制核体积变化之后）。在patrepKO ES细胞系的三个生物学重复中，其中单个母体遗传的Meg3等位基因具有表达或不表达的潜力，我们发现无论Gtl2 / Meg3的表达如何，在定位上都没有差异（z = 1.059，p = n.s;图3A）。
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图 3. 等位基因的分布取决于Gtl2 / Meg3基因表达状态。
（A）定位（L1探针相对于外围的位置）与patrepKO ESC的Gtl2/Meg3表达状态之间没有关系。（B）当Gtl2 / Meg3不表达时，来自所有Zfp57KO ES细胞的母系等位基因略微接近边缘（#p<0。1），（C）母体（化）细胞按表达的等位基因数量分裂。单位基因表达细胞中的等位基因比没有等位基因表达的细胞离外围稍远。然而，在细胞内表达两个等位基因（双等位基因表达）的细胞离外围明显更远（#p<0。1， *p<0.05）.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186.g003
然而，由于Zfp57KO ES细胞的母系（化）等位基因数量是patrepKO ES细胞的两倍，我们推断这些细胞系的实验将具有更大的能力来检查距离和表达之间的关系。使用相同的统计方法和相同的重复次数，我们发现一个不显着的趋势（估计= 0.927μm，p = 0.0721，图3B），与表达的等位基因相比，非表达等位基因略微更接近外围。和以前一样，核体积也被考虑在内。这些发现共同表明，印记压抑的影响微不足道（i.e.，表观遗传沉默）相对于核外围的定位。因此，我们专注于母体化表达等位基因，以考虑随机表达状态而不是印记抑制是否能更好地预测定位。
基因表达比亲本表观型更好地预测定位
使用Zfp57KO细胞，我们可以测量双等位基因表达是否可以比单斜面表达或两个等位基因的无表达更好地预测与核边界的距离。使用多线性混合模型方法，我们发现当细胞内只有一个等位基因表达时，距离略有增加（t = 1.837，p = 0.067，估计（斜率）= 0.175μm），但是当两个等位基因都表达时，等位基因显着远离核边界（t = 1.989，p<0.05，估计（斜率）= 0.185μm;图3C）。这表明，考虑到转录状态，可以预测更集中的本地化。这可能是由于基因剂量或反映了细胞内两个活性等位基因的转录活性的总体增加。然而，它表明激活与远离核边界有关。这与母系抑制等位基因在定位上与父系等位基因（表观遗传沉默）比逃脱印记的父系等位基因更相似（S6图）的观点一致。
我们通过检查被归类为“近”和“远”核边界的等位基因是否或多或少地根据其相对位置表达来进一步探索定位和表达之间的关系。我们在WT中没有发现这种关系（日志2（OR） = 0.95， p = 0.80;Fishers Test）或Zfp57KO单元格（对数2（OR） = 0.93， p = 0.77;渔夫测试;图4A）表明近等位基因和远等位基因表达的概率相等。这不考虑与外围的距离，而是考虑两个等位基因在原子核内的相对位置。因此，这并没有声称核外围的功能，因为该模型中的母系和父系等位基因都可能离外围太远而无法进行与层相关的抑制。与此一致，如图4B所示，受抑制的母系化等位基因（patrepKO和Zfp57KO在这里组合在一起）距离外围的可能性不大于0.5μm（χ2= 0.10，df = 1，p = n.s）。为了以更高的分辨率检查这一点，我们绘制了将细胞核按体积（外部，中间，内部）分成三分之三的区域位置，如前所述[20]。结果表明，随机抑制等位基因不优先位于外围（χ2= 2.3834， df = 2， p = n.s;图4B）。在WT细胞中发现了类似的模式（见S7图），表明表达和转录沉默的等位基因之间没有明显的定位区域。
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图 4. Gtl2/Meg3-非表达母体（化）等位基因在核外围不富集。
（A）作为近等位基因与远等位基因不影响在野生型（WT）或Zfp57KO ES细胞中表达的可能性。（B）大多数母体（patrepKO）和母系等位基因（Zfp57KO）位于远离外围的位置，Gtl2 / Meg3表达和非表达等位基因之间没有差异（上图）。当细胞核被分成三个相等体积的箱子（内部，中间和外部;底部）时，表达和非表达等位基因的分布也没有任何显着差异。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186.g004
讨论
我们在总共18个小鼠ES细胞系中进行了3D RNA-DNA FISH测量，并观察到Dlk1-Dio3印记区域的Gtl2 / Meg3表达等位基因定位到核内部并且非表达等位基因定位到核外围的非常小但总体上非常显着的影响。如前所述[20]，不表达Gtl2 / Meg3的父亲等位基因总体上比母体等位基因更接近外围，其中Gtl2 / Meg3在70.5%的WT ES细胞中表达。父系化等位基因和母系化等位基因之间的定位差异（i.e.， IGDMRKO vs ZFP57KO） 只有在考虑表达状态时才明显。换句话说，表达的Gtl2 / Meg3等位基因比未表达的等位基因更远离外围。这一观点与先前的工作一致，表明将转录激活物拴在外周染色体位点上可导致染色体位点向核内部移动[31，32]。此外，细胞核内的位置与给定细胞内表达的等位基因数量直接相关，这通过分析表达零个，一个或两个等位基因的细胞可以明显看出。未来的研究可以解决这一有趣发现的生物学相关性（如果有的话）。
在我们的研究中，表达和非表达等位基因之间定位差异的影响大小远小于先前描述的效应（19）。我们的工作与之前的研究之间的三个显着差异可以解释这一点：1）Kota等人[33]使用Gtl2 / Meg3表达作为亲本起源的读数，同时我们包括一个独立的DNA标记和遗传方法，使我们能够区分和量化表达和非表达的母体染色体。2）Kota等人[33]使用较少的生物重复，因此无法考虑线之间明显的变异性。3）我们的测量利用距离被询问的基因400kb的DNA标记，这可能导致较低的数据分辨率（S1图）。然而，这两个遗传位置位于ES细胞中的同一TAD内[24，25]，并且在双探针DNA FISH实验中使用探针对抗L1重复序列和Gtl2 / Meg3基因（S1和S8 Figs）时经常重叠。然而，这些位置确实位于不同的子TAD中，这可能部分解释了我们的结果与Kota等人之间的差异[33]。我们的发现反映了独立区分亲本染色体本身与其表达的重要性，然后确定每个染色体对亚核定位的贡献。
小鼠ES细胞显示出不寻常的细胞周期分布，其中大多数细胞（75%）在生长的细胞群中处于S期[34]。S期可能对基因表达产生影响，因此细胞周期异质性可能是生物重复之间变异性的来源。然而，当比较表达和非表达等位基因以及生物重复的核大小（作为细胞周期差异的代理）时，在某些情况下核大小的一些微小变化是显而易见的（S9图）。因此，我们在所有分析中都包括核体积作为协变量，以纠正核体积的任何微小波动。因此，我们对核体积微小变化的控制等位基因分布差异的所有估计。
尽管来自我们所有ES细胞系的数据显示对亚核定位具有显着的表达依赖性效应，但效应量非常小，Gtl2 / Meg3非表达等位基因平均仅比Gtl2 / Meg3表达等位基因更接近核外围170nm。事实上，大多数表达的等位基因可以更广泛地归类为远离外围（或最外层区域），尽管不是原子核的极中心。考虑这样一个小的影响是否具有生物学意义是很有趣的。由于我们没有观察到核包膜附近无活性等位基因的显着富集，因此与核层的失活相互作用不太可能在这个印记结构域中发挥主要的功能作用。值得注意的是，Gtl2 / Meg3表达经常被发现在DAPI染色的边缘，可能代表细胞核最外围的低密度染色质区域（有关详细信息，请参阅方法部分）。虽然可以设想在某些情况下，Gtl2 / Meg3表达可能已被瞬时核包膜相互作用抑制，并且在实验时已经远离外围，但这种等位基因仍应显示为外周富集，因为间期单个位点的迁移率通常限制在约1μm，并且已经表明定位的大规模变化需要细胞分裂[1，[35].
更可能的解释是，观察到的等位基因定位模式是由于核内部结构的一些激活作用。这与当两个等位基因表达与给定细胞中的一个等位基因相比时观察到的内化增加一致。已知转录优先发生在转录机制和活性基因聚集成所谓的转录工厂和相邻位点（称为斑点）的位点[3，4，32]。这样的工厂存在于染色体区域边界的开放染色质中，并且似乎合乎逻辑的是，它们偏向于在转录更有利的核内部更频繁。因此，对于在核外围观察到的未富集和我们的表达-定位相关性的小效应量，一种可能的解释可能是Gtl2 / Meg3不表达等位基因均匀分布在它们可以占据的染色体周围空间内，独立于核包膜相互作用，而Gtl2 / Meg3-表达等位基因需要定位于转录工厂，这些转录工厂偏向于内部。通过将表达和非表达等位基因与转录工厂的组分共同定位来测试这个想法会很有趣。然而，我们在多个遗传模型中使用多个生物学重复突显了等位基因在细胞核内可以采取的广泛位置，而不管表达状态如何。
对于核定位和表达的所有相关性，都出现了因果问题。外周定位是否被用作微调基因表达的手段，使与转录工厂的共定位的可能性更大或更小？在核外围没有富集非活性等位基因并不能证明这种机制。Kota及其同事已经证明，Dlk1-Dio3区域的位置变化是局部的，不涉及染色体区域的粗暴变化[20]。同样，我们的Zfp57突变体表明，顺式作用的表观遗传变化与诱导Gtl2 / Meg3基因表达的同时定位的转变有关。这说明，在远处起作用的核包络锚定机制不太可能参与其中。局部锚定机制应显示为外围富集，我们没有观察到这一点。因此，我们认为，我们观察到的外周定位的微小变化是一种结果，而不是表达变化的原因，并且功能上更相关的方面是表达等位基因的内部位置。
方法
细胞培养
使用基于无饲养层的2i LIF培养条件从单个囊胚中产生突变体和相应的对照ES细胞（N2B27，干细胞科学）[36]。简而言之，从怀孕的雌性小鼠中收集桑菶胚胎并用2i抑制剂在KSOM中培养，然后在免疫手术后使用滋养外胚层对每个囊胚进行基因分型。戴尔L1rep小鼠具有白化C57BL / 6J背景（BL6）[21]并杂交到白化BL6小鼠以获得WT，母系和父系杂合子。将 IG - DMR 杂合子雌性 [ 30 ] 与 BL6 雄配，以获得 IG - DMR 母体 KO 并控制 WT morula 胚胎。Zfp57合子KO ES细胞和相应的对照ES细胞在之前的一项研究中产生[26]。我们在五个Zfp57KOES细胞系中的两个中观察到Gtl2 / Meg3的表达水平出乎意料地低，因此从这些研究中排除了这两个细胞系。对于我们所有基因型的ES细胞的分析，我们使用来自三个生物学重复的数据，这些数据显示了非表达，单节表达和双节表达细胞的预期和相似比例（S5图）。这项研究得到了剑桥大学动物福利和伦理审查机构（AWERB）的批准，并根据英国内政部动物科学程序法在项目许可80/2567下进行。
荧光原位杂交
我们生成了用于检测LINE重复序列（BAC bMQ-177C10，从CHORI获得）和新生Gtl2 / Meg3转录本（fosmid WIBR1-2686H19，来自巴黎Heard实验室的实物礼物）的荧光探针，方法是首先用Illustra TempliPhi大型构建试剂盒（GE Healthcare）扩增质粒迷你制剂，然后根据制造商的说明使用绿色UTP或Red UTP（Abbott Molecular）通过刻痕翻译标记2μg扩增产物。如前所述，进行序贯RNA和DNA 3D荧光原位杂交（FISH）[37]。然而，在固定之前，在层粘连蛋白包被的盖玻片上生长ES细胞，以确保在杂交和洗涤后用0.2μg/ ml DAPI复染均匀单层生长和细胞核。使用卡尔蔡司Axiovert 200M显微镜获取每个盖玻片10-15个位置的3D图像堆栈，该显微镜具有63x / 1.25 Plan Apochromat物镜，每个图像堆栈以0.15μm的z间距拍摄100个图像平面。对于双探针DNA FISH，使用与顺序FISH相同的方案，并使用Gtl2 / Meg3 fosmid探针来检测基因而不是新生RNA。
图像分析
使用惠更斯专业反卷积软件（版本14.10.1p8，SVI，荷兰）对DNA FISH图像堆栈进行后处理，并使用斐济进行3D测量[38]。我们开发了一个斐济脚本，使我们能够生成DAPI染色的原子核和FISH信号的二进制表示，并对这些对象及其之间进行自动3D测量，称为斐济的3D管理器功能（图1C）。如果FISH信号由于DNA复制而重复，我们使用两个测量值的平均值进行分析。由于使用染色质DAPI染色的二值化过程的性质，细胞核的二进制图像有时在形状上与原始图像中的眼睛略有不同，因为根据图像背景水平或相邻细胞核的接近程度，非致密染色质区域被算法解释为背景。这导致少数DNA FISH信号（2.8%）在核体积之外。为了避免对外围位置的信号产生偏差，我们将此类信号纳入负距离测量。在极少数情况下，该算法在非致密染色质区域中的FISH信号周围生成一个海湾状的背景区域，我们的标准自动测量会导致错误的结果。同样，为了避免对外围信号产生偏差以及不准确的手动测量，在这些罕见的情况下（0.3%），我们使用了一种替代算法，通过在原始形状周围拟合椭圆来近似核体积，并将此形状用于距离测量。对于相对距离测量，我们使用斐济3D管理器的“radiusCen”测量，该测量了原子核的二进制表示中心与其边界之间通过FISH信号的二进制表示中心之间的距离，作为局部核半径。相对距离计算为绝对距离/局部核半径。在DNA FISH分析的同时，Gtl2 / Meg3基因的表达状态从原始（非解卷积）新生RNA FISH图像堆栈中评估每个等位基因表达（FISH信号高于背景水平）或未表达（无信号）。
通过免疫荧光进行层粘连蛋白染色
将E14tg2a ES细胞在层粘连蛋白包被的盖玻片上培养，在3%多聚甲醛中固定10分钟，并在0.5%Triton X-100中透化。然后将细胞在1%BSA中阻断15分钟，然后在1：200山羊α层粘连蛋白B中孵育1（圣克鲁斯SC-30264）1%BSA在室温下45分钟。将二抗1：500驴α山羊IgG Alexa 633 1%BSA，在室温下在黑暗潮湿的室中孵育细胞40分钟。然后将细胞在含有0.2mg / ml DAPI的1X PBS中复染1分钟，并安装在安装培养基中。获取3D图像堆栈（参见荧光原位杂交方法），并使用惠更斯专业反卷积338软件（版本14.10.1p8，SVI，荷兰）对图像堆栈进行后处理。使用斐济测量距离。
统计方法
所有分析都使用线性回归模型框架，使用基R回归函数使用核大小作为协变量（以控制对表达和/或定位的任何体积效应）[39]。鉴于一些细胞具有多个等位基因的测量值，在适当的情况下，我们使用混合效应多元线性回归模型，使用R[40，41]中的lme4和lmerTest包，以允许随机截距（唯一细胞），从而有效地控制重复测量独特细胞产生的变异性[42]。R中的数据处理和可视化是使用“tidyverse”包进行的[43]。使用R.Fishers中的基数chi.sq函数计算核体积分布差异的卡方检验，使用基数R fisher.test函数进行富集试验。
支持信息
UCSC （https://genome.ucsc.edu/） - 小鼠mm9中Dlk1-Dio3印记区域的屏幕截图，显示了RNA（Meg3）和DNA（L1重复）FISH探针的确切位置，以及它们之间的基因组距离（内部，中心和外部距离）。
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S1 图 UCSC （https://genome.ucsc.edu/） - 小鼠mm9中Dlk1-Dio3印记区域的屏幕截图显示了RNA（Meg3）和DNA（L1重复）FISH探针的确切位置，以及它们之间的基因组距离（内部，中心和外部距离）。
还显示了LINE1重复删除[21]相对于重复探头和UCSC重复掩模器的确切位置。顶部面板显示来自 Schoenfelder 及其同事 （Bab_ESC） 和 Dixon 及其同事 （Ren_ESC） 的 ES 单元 TAD，这些 TAD 作为自定义轨道加载 [24，25]
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186.s001
（TIFF）
S2 图 DAPI边缘测量值（μm）与层压内（a）和外（b）边界（μm）的相关性图。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186.s002
（TIFF）
S3 图 在研究中测量的所有KO和WT组的单个生物重复中，相对于Gtl2 / Meg3表达的与核边界的距离图。
我们发现复制对整体距离测量没有显着影响。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186.s003
（TIFF）
S4 图 在较大放大倍率下五个ES细胞基因型中基因表达的其他例子（比较图1）。
Gtl2/Meg3 探针染色图像来自新生的 RNA FISH，L1 重复探针染色图像来自后续 DNA FISH。FISH图像表示采集的图像堆栈的最大投影为10-30个中心z平面。框架区域的爆炸显示在右侧。比例尺表示 5 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186.s004
（TIFF）
S5 图 每个细胞系的细胞数，无单斜、单斜或双等位基因Gtl2/Meg3表达。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186.s005
（TIFF）
S6 图
A）按基因型和表达类型划分的等位基因分布。非表达的母系和母系等位基因在分布上与未表达的父系和父系化等位基因相似（没有显着差异）。激活的等位基因（通过印记逃逸或正常的母系表达）通常远离核边界。我们确实正式测试了印记逃逸的效果，因为这个组中的功耗很低。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186.s006
（TIFF）
S7 图
A）大多数母系化等位基因（patrepKO和Zfp57KO）位于远离外围的位置，表达Gtl2 / Meg3和不表达等位基因之间没有差异（数据以总等位基因的百分比表示）。B）当细胞核被分成三个相等体积的箱子（内部，中间和外部;底部）时，表达和未表达等位基因的分布也没有任何显着差异 C）这与WT细胞相似，既表示为C）所有等位基因的比例，也表示为D）表达状态的比例（与正文中的图4A相当）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186.s007
（TIFF）
S8 图 WT ES细胞中的双探针DNA FISH（ES细胞系WT8）。
这些图像仅显示一个 z 图像平面。所有三个位置，其中L1重复信号和Gtl2 / Meg2基因信号的中心大致在同一z图像平面上，在右侧显示为爆炸。在这三个例子中，信号中心之间的距离在0.25和0.36μm之间。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186.s008
（TIFF）
S9 图 表达Gtl2 / Meg3和不表达ES细胞之间的核大小的密度没有显着差异，因此不暗示在s期期间基因活性的特定下调或上调。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186.s009
（TIFF）
S1 表。 来自所有实验细胞系的原始数据和元数据的CSV文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186.s010
（CSV）
S1 代码。 RMarkdown 文件，其中包含用于分析的代码。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010186.s011
（马币）
确认
我们要感谢剑桥戈登研究所成像设施的Richard Butler帮助编写用于3D图像分析的斐济宏，巴黎Pierre et Marie Curie研究所的Edith Heard，Simao daRocha和Luca Giorgetti对FISH方法的有用建议，以及遗传学系的David Glover和George Tsolovsky， 剑桥，用于显微镜支持。
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