厦门杂志期刊论文发表=光神经素通过GSK3β的自噬降解促进小鼠肌肉再生过程中的肌生成

肖晨石 ，夏博 ，张健峰，张睿鑫，张丹阳，刘欢，鲍才谢，王永亮，吴江伟

出版日期： 2022年04月27日

抽象

骨骼肌再生对于在受伤和肌肉疾病中维持肌肉功能至关重要。在此过程中，肌发生过程在形成新的肌峰仪中起着关键作用。在这里，通过从5个独立的微阵列数据集中筛选出潜在的肌原发生调节因子的生物信息学筛选，我们确定了重叠的差异表达基因（DEG）光神经素（OPTN）。Optn敲低（KD）延缓小鼠的肌肉再生，并在不影响其增殖的情况下损害C2C12肌母细胞分化。相反，Optn过表达（OE）促进成肌细胞分化。从机制上讲，OPTN增加β-连环蛋白的核水平并增强T细胞因子/淋巴增强因子（TCF / LEF）转录活性，提示Wnt信号通路的激活。激活伴随着糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的蛋白质水平降低，糖原合成酶激酶3β（GSK3β）是该途径的负调节剂。我们进一步表明，OPTN与GSK3β物理相互作用并靶向GSK3β进行自噬降解。GSK3β的药理学抑制挽救了Opten KD在肌肉再生和成肌细胞分化过程中诱导的肌原受损，证实GSK3β是OPTN介导的肌原的下游效应子。总之，我们的研究描绘了OPTN作为肌原发生的潜在调节剂的新作用，并可能为肌肉再生开辟创新的治疗前景。

引文： Shi XC，Xia B，Zhang JF，Zhang RX，Zhang DY，Liu H等人（2022）光神经素通过GSK3β的自噬降解促进小鼠肌肉再生过程中的肌原生成。PLoS Biol 20（4）：e3001619。https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619

学术编辑： Simon M. Hughes，伦敦国王学院，英国

收到： 十月 14， 2021;接受： 四月 4， 2022;发表： 四月 27， 2022

版权所有： ? 2022 施等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

资金： JWW收到陕西省重点研发项目（批准号：2020NY-012）。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

相互竞争的利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。

缩写：： AAV，腺相关病毒载体;肌萎缩性肌萎缩性侧索硬化症;方差分析，方差分析;APC，腺瘤性息肉病大肠杆菌蛋白;AXIN，轴抑制蛋白;cDNA，互补DNA;CHX， 环己酰亚胺;CTX，心脏毒素;CSA，横截面纤维面积;DEG，差异表达基因;DMD，杜氏肌营养不良症;DMEM，杜尔贝科的改良鹰介质;DVL2，凌乱-2;EdU， 5-乙炔基-20-脱氧尿苷;eMYHC，胚胎肌球蛋白重链;Fermt2， 费米蛋白家族同系物 2;FRAT，经常在晚期T细胞淋巴瘤中重新排列;GEO， 基因表达综合;GSK3β，糖原合成酶激酶3β;HE，苏木精-曙红;H3，组蛋白H3;KD，击倒;LIR，LC3相互作用区域;mdx，小鼠X连锁肌肉萎缩症;MYHC，肌球蛋白重链;肌瘤，成肌细胞测定蛋白;肌群，肌原蛋白;Myf5，肌源因子5;OE，过度表达;OPTN，光神经素;Pax7，配对框7;聚偏氟乙烯，聚偏二氟乙烯;SC，卫星单元;SDS-PAGE，十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳;shOptn，针对OPTN的短发夹;shRNA，短发夹RNA;TA，胫骨前部;TCF / LEF，T细胞因子/淋巴样增强因子;TCF4，转录因子4;UBAN，泛素结合结构域;WGA，小麦胚芽凝集素;WT，野生型;3-甲基腺嘌呤

介绍

骨骼肌是我们体内最丰富的组织，在姿势，活动性和能量代谢中起着关键作用[1]。在肌肉损伤和肌肉疾病中，骨骼肌的再生能力对于恢复这些功能至关重要[2，3]。作为对肌肉损伤的反应，卫星细胞（SC）将被激活以开始肌源性分化，伴随着肌原蛋白（MYOG）和肌肉特异性调节因子4的上调表达[4，5]。然后，通过激活肌肉特异性蛋白质（例如成肌细胞中的MYHC）来完成分化程序，这些蛋白质随后融合以再生肌纤维以修复受损的肌肉[2]。因此，成肌细胞分化介导的肌原在肌肉再生中起着至关重要的作用。尽管如此，肌肉再生过程中肌生成的潜在机制在很大程度上仍然是未知的。

为了探索肌原发生的潜在调节因子，我们从5个与肌原相关的微阵列数据集中进行了生物信息学筛选，并将optin（Optn）鉴定为5个重叠基因之一，在成肌细胞分化和肌肉再生期间上调，同时在杜氏肌营养不良症（DMD）患者和mdx小鼠中下调。人OPTN是一种74kDa支架蛋白，由577个氨基酸组成，小鼠Optn基因编码584-氨基酸蛋白（67 kDa），与人OPTN相同78%[6]。OPTN在大多数组织中表达，包括肌肉，肝脏和大脑[7-9]，并在许多细胞功能中起重要作用[6]。它已被确定为一种选择性自噬受体，参与自噬过程的各个阶段，如货物识别，自噬体形成和自噬降解[10]。OPTN突变见于多种家族性疾病，且常发生于其自噬相关泛素结合域（UBAN）[11]，例如OPTN E478G在肌萎缩性侧索硬化症 （ALS） [7] 和 OPTN 中 R545Q型见于正常张力型青光眼[12]。OPTN在骨骼肌中高度表达[13]，但对OPTN在肌生成中的作用及其在骨骼肌中的功能是否与自噬有关知之甚少。

规范的Wnt信号通路在促进骨骼肌再生过程中SC的分化中起着关键作用[14-16]。Wnt配体与毛躁受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白家族的成员结合，激活β-连环蛋白的核易位，并形成具有T细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）的复合物[17]。它增强肌原因子的转录活性，例如肌原因子5（Myf5）[18]，成肌细胞测定蛋白（Myod）[19]，铁蛋白家族同源物2（Fermt2）[20]和肌群[21]在肌肉再生过程中。Wnts通过抑制糖原合酶激酶3β（GSK3β）促进β-连环蛋白核易位，糖原合酶激酶是β-连环蛋白破坏复合物的重要组成部分[22]。GSK3β的遗传缺失或药理学抑制导致C2C12细胞的分化增强和肌肉再生[23，24]，表明GSK3β对于Wnt信号通路介导的成肌细胞分化至关重要。然而，Wnt介导的GSK3β抑制机制仍未完全解决和争议。在胚胎发生过程中，GSK3β介导的自噬和规范Wnt信号通路串扰已被证明[25-27]。自噬受体OPTN是否参与肌肉再生过程中GSK3β介导的规范Wnt信号通路是完全未知的。

在这项研究中，我们表明OPTN是小鼠肌肉再生过程中成肌细胞分化介导的肌原发生所必需的。OPTN通过直接的物理相互作用和GSK3β的自噬降解促进Wnt信号通路介导的肌原。我们的研究结果揭示了对肌肉再生过程中肌原发性机制的新见解，并为肌肉再生提供了潜在的靶标。厦门杂志期刊论文发表=

结果

生物信息学筛查显示OPTN是肌生成的潜在调节剂

为了寻找潜在的肌原发生调节因子，我们从基因表达综合（GEO）数据库中汇编并交叉了5个与肌原相关的独立微阵列数据集中的差异表达基因（DEGs）：（i）C2C12细胞分化过程中的DEGs（GSE11415）;（ii）心脏毒素（CTX）诱导的小鼠肌肉再生期间的DEGs（GSE45577）;（iii） DMD患者骨骼肌中的DEG（GSE1004）;（iv）小鼠X连锁肌营养不良症（mdx）小鼠腓肠肌中的DEGs（GSE16438）;和（v）年轻（21至31岁）和老年（62至77岁）男性（GSE80）之间的侧腹肌的DEGs。对数据集的综合分析产生了5个重叠的基因ankyrin重复结构域1（Ankrd1），半乳糖凝集素3（Lgals3），双皮质素样激酶1（Dclk1），肌球蛋白重链8（Myh8）和Opten（图1A）。其中，Ankrd1、Lgals3、Dclk1和Myh8在肌原生成调控方面具有良好的表征[28-32]。OPTN是一种选择性自噬受体[33]，在肌原中的作用尚不清楚。

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图 1. OPTN对于骨骼肌再生过程中的肌生成至关重要，以应对肌肉损伤。

（A）维恩图显示了与肌原或肌肉萎缩相关的5个独立微阵列数据集中的5个重叠DEGs。（B）eMYHC和OPTN在损伤后0，3，5和14天（每组n = 3只小鼠）的TA中的代表性免疫印迹分析。（C）CTX未治疗或损伤后5天TA肌中OPTN亚细胞分布的代表性免疫荧光分析。分别用抗OPTN抗体（红色），WGA（绿色）和DAPI（蓝色）染色OPTN，肉瘤和细胞核。比例尺：20微米。（D）在损伤后0天，3天，5天和14天在争夺shRNA或shOptn小鼠中对TA进行代表性HE染色。黄色箭头表示炎症细胞浸润。比例尺：50 μm。（E）损伤后5天在争夺shRNA或shOptn TA肌肉中对eMYHC纤维进行代表性的免疫荧光染色。比例尺：20 μm。（F）受伤后5天（每组n = 5只小鼠）在争夺shRNA或shOptn TA肌肉中eMYHC肌纤维CSA的分布。（G）受伤后5天在争夺shRNA或shOptn TA肌肉中再生eMYHC肌纤维的平均CSA（每组n = 5只小鼠）。（H–J）损伤后5天在争夺shRNA或shOptn TA肌肉（每组n = 3只小鼠）中肌原标志物（eMYHC和MYOG）的代表性免疫印迹分析（H）和定量（I，J）。M，标记。数据以平均±SEM表示，*P<0.05与对照组。此图的基础数据可在 S1 数据中找到。此图的原始印迹可以在S1 Raw Image中找到。AAV，腺相关病毒载体;Ankrd1， ankyrin repeat domain 1;CTX，心脏毒素;CSA，横截面纤维面积;Dclk1，双皮质素样激酶1;DEG，差异表达基因;DMD，杜氏肌营养不良症;eMYHC，胚胎肌球蛋白重链;HE，苏木精-曙红;Lgals3， 半乳糖凝集素3;mdx，小鼠X连锁肌肉萎缩症;Myh8，肌球蛋白重链8;肌群，肌原蛋白;Optn， optineurin;SEM，均值的标准误差;shRNA，短发夹RNA;TA，胫骨前部;WGA，小麦胚芽凝集素;WT，野生型。+++

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.g001

OPTN对于骨骼肌再生过程中的肌原生成至关重要

为了研究OPTN在肌肉再生过程中的肌原作用，我们分析了CTX诱导的小鼠肌肉损伤期间OPTN的表达。与未受伤的肌肉（第0天）相比，OPTN表达在肌肉再生的初始阶段（第5天）显着上调，然后在第14天降低，类似于新再生的肌纤维标志物胚胎肌球蛋白重链（eMYHC）的表达谱（图1B，S1A和S1B图）。与此相一致，免疫荧光分析还显示，在损伤后5天，新再生肌纤维的细胞质中的OPTN增加（图1C，S2图）。这些结果表明OPTN在肌肉再生中的潜在作用。我们进一步生成了一个重组腺相关病毒载体（AAV），其短发夹RNA（shRNA）靶向Optn（AAV-shOptn）（S3A和S3B图），与胫骨前肌（TA）中的扰动shRNA相比，其mRNA水平降低了72%，蛋白质水平降低了76%（S3C和S3D图）。接受AAV争夺shRNA或shOptn的TA肌肉受到单次CTX损伤，然后在分析再生组织之前恢复3至14天。在争夺shRNA肌肉中，SCs后代融合形成新的肌纤维，其特征在于再生的急性期（损伤后3至5天）中心定位的细胞核（图1D）。eMYHC纤维在受伤后第5天丰富（图1E）。相比之下，AAV-shOptn肌肉由该阶段退行的肌纤维，纤维化组织和炎症细胞组成（图1D）。与争夺shRNA肌肉相比，AAV-shOptn肌肉中的eMYHC再生纤维在受伤后第5天越来越小（图1E-1G）。与此一致，在受伤后第5天，AAV-shOptn肌肉中eMYHC和MYOG的蛋白质水平显着降低（图1H-1J）。受伤后14天，shRNA肌肉中的肌肉损伤和炎症细胞基本清除，再生的肌纤维继续生长和成熟，因为它们的大小变得均匀（图1D），而小的再生纤维和一些炎症细胞仍然显示在shOptn TA肌肉中（图1D）。这些数据表明，Optn敲低（KD）延缓了成年小鼠的骨骼肌再生，表明OPTN在肌肉再生过程中的肌原发生中起着至关重要的作用。++

OPTN 促进成肌细胞分化介导的肌生成

作为对肌肉损伤的反应，肌肉SC经历大规模的增殖和分化，形成新的肌管，取代受损的肌纤维[34]。为了探索OPTN在肌肉再生过程中的肌原生成中的作用，我们首先检测了OPTN对肌肉SC增殖的影响，并发现了类似的配对盒7（Pax7）5-乙炔基-20-脱氧尿苷（EdU）SCs频率在shOptn和受伤后第3天争夺shRNA TA肌肉（S4A-S4D图）。此外，C2C12细胞中的Opten KD对EdU细胞的数量和细胞增殖相关基因的表达没有影响（S4E–S4G Fig）。这些结果表明，OPTN在肌肉再生过程中不影响SC增殖。接下来，我们研究了OPTN介导的肌生成是否通过调节成肌细胞分化来实现。在MYHC共定位的C2C12成肌母细胞分化过程中，OPTN表达增加，类似于MYOG的表达模式（图2A和2B，S5A和S5B图）。奥普腾C2C12细胞中的KD减少了细胞融合和多核肌管形成事件（图2C-2E），以及MYOG和MYHC水平的降低（图2F-2H，S6A和S6B图）。相比之下，C2C12细胞中的Opton过表达（OE）（质粒HA-Optn）显着增强了肌母细胞分化（图2I-2K），伴随着MYOG和MYHC水平的增加（图2L-2N，S6C和S6D图）。总之，这些发现表明OPTN促进成肌细胞分化介导的肌原。+++

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图 2. OPTN促进成肌细胞分化介导的肌生成。

（A）在指定时间点（0，2，4，6和8天）分化期间，C2C12细胞中OPTN和MYOG的代表性免疫印迹分析（每组n = 3）。（B）肌管中OPTN亚细胞分布的代表性免疫荧光分析。在分化后4 d，在C2C12细胞中用抗OPTN抗体和抗MYHC抗体染色OPTN和MYHC。比例尺：10微米。（C）在分化后4天对对照（si-对照）或Optn KD（si-Optn）C2C12细胞中的MYHC进行代表性免疫荧光染色。在开始分化之前，将si-对照或si-Optn转染到C2C12细胞中48小时。比例尺：50 μm。（D， E）在分化后4天（每组n = 4）对照（si-对照）或Optn KD（si-Optn）C2C12细胞中定量每个肌管的细胞核分布和融合指数（具有至少3个细胞核的MYHC细胞）。（F–H）对照（si-对照）或Optn KD（si-Optn）C2C12细胞（每组n = 3）中MYHC和MYOG的代表性免疫印迹分析（F）和定量（G，H）。分别在分化后0，2和4天收集细胞。（I）在发分后4天对照（空载体）或Opten-OE C2C12细胞的MYHC进行代表性免疫荧光染色。在分化开始之前，将空的pcDNA 3.1-HA载体或pcDNA 3.1-HA-Optn载体转染到C2C12细胞中48小时。比例尺：50 μm。（J， K）定量对照（空载体）或Opten-OE C2C12细胞在分化后4天（每组n = 4）中每个肌管的细胞核分布和融合指数（具有至少3个细胞核）。（L–N）对照（空载体）或Opten-OE C2C12细胞（每组n = 3）中MYHC和MYOG的代表性免疫印迹分析（L）和定量（M，N）。分别在分化后0，2和4天收集细胞。数据以均值±SEM表示。*P<0.05与对照组。此图的基础数据可在 S1 数据中找到。此图的原始印迹可以在S1 Raw Image中找到。KD，击倒;肌群，肌原蛋白;MYHC，肌球蛋白重链;OE，过度表达;OPTN，光神经素;扫描电镜，均值的标准误差。++厦门杂志期刊论文发表=

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.g002

OPTN通过激活规范Wnt信号通路增强肌原生成

为了探索OPTN介导的肌原发生的潜在机制，我们分析了Opten KD Hela细胞（GSE6819）中可用的基因表达谱，这是深转录组分析的常用模型[35，36]，也是获得初步适应症的快速方法。结果表明，OPTN在Wnt信号通路的调控中具有很高的意义（图3A），这是一种表征良好的肌原通路[15]，具有Wnt信号通路靶基因[MYC原癌基因（Myc）[37]，细胞周期蛋白D3（Ccnd3）[38]，扭曲家族BHLH转录因子2（Twist2）[39]和MYCN原癌基因（Mycn）[40]]的下调（图3B).与此一致，我们在Opten KD C2C12细胞中显示Wnts靶基因的mRNA水平降低（图3C）。TCF/LEF是Wnts靶基因的主要转录因子[41]。TOP/FOP报告基因检测显示Opten KD C2C12细胞中TCF/LEF的转录活性显著降低，而Opten-OE C2C12细胞的转录活性升高（图3D）。已经表明，TCF/LEF转录活性增强是由β-连环蛋白核易位增加介导的，这进一步与TCF/LEF转录因子形成复合物以调节Wnts靶基因[17]。与此一致，Optn OE增加了C2C12细胞中β-连环蛋白的核水平，而Optn KD降低了这些水平（图3E，S7A和S7B图）。同样，Optn KD在小鼠受伤后第5天也降低了TA肌肉中活性β-连环蛋白的核水平（图3F）。此外，Wnt3a（Wnt信号通路的经典配体[20]）的治疗未能有效增加Optn KD C2C12细胞（图4A）和损伤后第5天TA肌肉中β-连环蛋白的核水平（图4B），这表明OPTN是激活规范Wnt信号通路所必需的。总之，这些结果表明OPTN在肌原发生过程中激活规范的Wnt信号通路。

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图 3. OPTN激活成肌细胞中的规范Wnt信号通路。

（A）来自GEO数据集（GSE6819）的si-Optn Hela细胞中的KEGG途径富集分析。（B）来自GEO数据集（GSE6819）的RNA-seq对照和si-OPTN Hela细胞中所选Wnts靶基因表达水平变化的热图。（C）分化后4天（每组n = 3）的Wnt靶基因在si-对照或si-Optn C2C12细胞中的代表性mRNA表达分析。（D）在分化后4天（每组n = 5）的OPten-KD（左图）和Opten-OE（右图）C2C12细胞中TOP/FOP的代表性荧光素酶活性。（五、法）在分化后4天（E）（每组n = 3只小鼠）从Opton-OE和Opton KD C2C12细胞中提取的核裂解物中具有代表性的免疫印迹分析和定量活性β-连环蛋白蛋白水平，以及在损伤后5天从争夺shRNA或shOptn TA肌肉中提取的核裂解物中（F）（每组n = 3只小鼠）。*P < 0.05 与对照组相比，以均值±表示。此图的基础数据可在 S1 数据中找到。此图的原始印迹可以在S1 Raw Image中找到。AAV，腺相关病毒载体;AMPK，AMP激活蛋白激酶;Birc5，杆状病毒IAP重复序列含5;Ccnd3， 细胞周期蛋白D3;GEO， 基因表达综合;HIF，缺氧诱导因子;H3，组蛋白H3;KD，击倒;KEGG，京都基因和基因组百科全书;霉菌，霉菌原癌基因;霉菌素，霉菌原癌基因;OE，过表达;Optn， optineurin;PPAR，过氧化物酶体增殖物激活受体;SEM，均值的标准误差;shRNA，短发夹RNA;TA，胫骨前部;Tcf7l2，转录因子7样2;TCF / LEF，T细胞因子/淋巴样增强因子;Twist2，Twist家族BHLH转录因子2。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.g003

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图 4. GSK3β在肌原发生过程中受到OPTN的负调节。

（A、 B）在分化后4天（N = 3独立实验）与Wnt3a或PBS一起孵育24小时的核裂解物中提取的核裂解物中活性β-连环蛋白水平的代表性免疫印迹分析和定量（在受伤后1.5天肌内注射Wnt3a）（每组n = 3只小鼠）。（C–E）在分化后4天（每组n = 3只小鼠）以及受伤后5天（每组n = 3只小鼠）中Opton-OE（C）和Optn KD（D）C2C12细胞中DVL2磷酸化，GSK3β，AXIN和APC蛋白水平的代表性免疫印迹分析（上图）和定量（下图）以及损伤后5天的shRNA或shOptn肌肉TA肌肉中（每组n = 3只小鼠）。数据以均值表示为 SEM ±*P < 0.05 与对照组的关系。此图的基础数据可在 S1 数据中找到。此图的原始印迹可以在S1 Raw Image中找到。AAV，腺相关病毒载体;APC，腺瘤性息肉病大肠杆菌蛋白;AXIN，轴抑制蛋白;BSA，牛血清白蛋白;DVL2，凌乱-2;GSK3β，糖原合成酶激酶3β;H3， 组蛋白 H3， KD， 击倒;OE，过度表达;Optn， optineurin;SEM，均值的标准误差;shRNA，短发夹RNA;TA，胫骨前部。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.g004

OPTN通过抑制GSK3β激活规范Wnt信号通路

为了进一步研究OPTN如何促进活性β-连环蛋白的核易位，我们测量了Wnt信号通路公认的阳性调节因子Wnt信号通路的wished-2（DVL2）的磷酸化和总水平[42]，发现Opten OE（图4C）或KD C2C12细胞（图4D）以及受伤后第5天的shOptn肌肉没有变化（图4E） 与各自的控件进行比较。轴抑制蛋白（AXIN）/腺瘤性息肉病大肠杆菌蛋白（APC）/GSK3β破坏复合物是Wnt/β-连环蛋白通路的负调节因子[43-45]。奥普腾C2C12细胞中的OE显着降低了GSK3β的蛋白质水平，而不会影响AXIN和APC的蛋白质水平（图4C）。与此一致，小鼠损伤后第5天C2C12细胞（si-Optn）（图4D）和骨骼肌（shOptn）中的Optn KD增加了GSK3β水平，AXIN和APC的表达水平没有变化。总之，这些结果表明，OPTN通过在肌原发生过程中抑制GSK3β来激活规范的Wnt信号通路。

OPTN与GSK3β物理相互作用并靶向GSK3β进行自噬降解

鉴于OPTN是一种选择性自噬受体[11]，我们推断OPTN可能直接介导GSK3β的降解。环己酰亚胺（CHX）追逐测定显示，在si对照中GSK3β的半衰期约为7小时，但在Opten KD细胞中约为10小时（图5A，S8A图）。相比之下，Optn OE将GSK3β的半衰期从大约8小时缩短到大约5小时（图5A，S8A图）。这些结果表明，OPTN加速了GSK3β的降解。OPTN介导的GSK3β降解可以被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）阻断，但不能被蛋白酶体抑制剂MG132阻断（图5B，S8B图）。我们进一步证明，在自噬缺陷ATG5 KO HEK 293T细胞中，Optn OE中显示的GSK3β的还原被消除（S8C和S8D图）。同时，LC3II与I的比率与自噬通量相关，代表自噬的可靠指数[46]，在Opten OE C2C12细胞中上调，而在Opten KD C2C12细胞中下调（图5C和5D，S8E图）。这些结果表明，OPTN通过自噬途径降解GSK3β。免疫沉淀测定揭示了C2C12细胞中OPTN和GSK3β之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用（图5E）。免疫荧光染色分析显示OPTN，GSK3β和LC3在C2C12细胞中的共定位（S8F图）。奥普腾KD减少了小鼠损伤后第5天TA肌中LC3和GSK3β的相互作用，如免疫沉淀所示（S8G图）。与此一致，Optn KD降低了C2C12细胞中LC3和GSK3β的共定位，如免疫荧光染色所示（图5F）。由于OPTN已被证明可以通过LC3相互作用区（LIR）基序与LC3 / GABARAP结合以及UBANs与泛素结合[47-49]介导自噬降解，因此我们构建了2个小鼠Optn点突变体（LIR基序结构域中的F188A和UBAN结构域中的E481G），它们与与其自噬功能相关的人类突变体同源[7，47，50]（S8H图）。与野生型（WT）Optn相比，C2C12细胞中任一突变体的OE都未能降低GSK3β水平（图5G，S8I图），也没有促进成肌细胞分化（图5H和5I），伴随着MYOG和MYHC水平的降低（图5G，S8I图）。这些数据表明，OPTN通过激活LC3介导的自噬来降解GSK3β。

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图 5. OPTN通过激活LC3介导的自噬降解GSK3β。

（A）在分化后4天对Opten KD（上图）和Opten OE（下图）C2C12细胞中的GSK3β进行代表性免疫印迹分析，然后在指定时间点用50μg/ ml CHX处理（每组n = 3）。（B）在分化后4天对对照（空载体）或Opten-OE C2C12细胞中的GSK3β进行代表性免疫印迹分析，然后用DMSO，蛋白酶体抑制剂MG132（25μM）或自噬抑制剂3-MA（5mM）处理6小时（每组n = 3）。（C、D）LC3在Opten OE（C）和Opten KD（D）C2C12细胞中差异化后4天的代表性免疫印迹分析（每组n = 3）。（E）OPTN和内源性GSK3β在Opten OE C2C12细胞中的免疫沉淀。在HA-Optn OE C2C12细胞中进行免疫沉淀分析，该细胞与抗HA抗体或非特异性兔IgG（对照）一起孵育以拉低内源性GSK3β。（F）GFP-LC3和FLAG-GSK3β在si-对照和si-Optn C2C12细胞中的差异化后4天的代表性免疫荧光分析。比例尺：5 μm。（G）在分化后4天（每组n = 3）的空载体，WT-Optn，Optn-F188A和Opten-E481G OE C2C12细胞中OPTN，GSK3β，MYOG和MYHC的代表性免疫印迹分析。 （H， I）在分化后4天（每组n = 3）对MYHC（H）进行具有代表性的免疫荧光染色，并定量载体，WT-Optn，Optn-F188A和Opten-E481G OE C2C12细胞中的融合指数（I）。将空pcDNA 3.1-HA载体、pcDNA 3.1-HA-Optn、pcDNA 3.1-HA-Optn-F188A和pcDNA 3.1-HA-Optn-E481G的质粒转染至C2C12细胞中，在分化开始前48小时。比例尺：50 μm。*P < 0.05 与对照组相比，以均值±表示。此图的基础数据可在 S1 数据中找到。此图的原始印迹可以在S1 Raw Image中找到。CHX， 环己酰亚胺;GSK3β，糖原合成酶激酶3β;KD，击倒;Optn， optineurin;OE，过度表达;MYHC，肌球蛋白重链;肌群，肌原蛋白;SEM，均值的标准误差;3-MA，3-甲基腺嘌呤。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.g005

抑制GSK3β挽救Opten KD细胞和骨骼肌中受损的肌原

为了确定GSK3β是否是OPT介导的肌原所必需的，我们通过其特异性抑制剂CHIR抑制了GSK3β的活性，并在Opten KD细胞中发现了获救的细胞融合和多核肌管形成事件（图6A）。在用CHIR处理的Opten KD C2C12细胞中恢复了MyoG细胞的数量（图6B）。与形态学改善一致，CHIR处理恢复了Opten KD分化成肌细胞中MYHC和MYOG的下调表达水平（图6C和6D），并挽救了Opten KD C2C12细胞中β-连环蛋白的核水平降低（图6E和6F）。当CHIR在CTX损伤后注射到用AAV-shOptn治疗的TA肌肉中时，受伤后第5天的小尺寸eMYHC再生纤维得到有效挽救（图7A和7B），同时恢复eMYHC，MYOG和核β-连环蛋白水平（图7C-7F）。累积起来，这些数据表明，OPTN通过GSK3β的降解激活了肌肉再生期间介导的规范Wnt信号传导的肌原。++

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图 6. 抑制GSK3β可挽救Opten KD诱导的成肌细胞分化过程中受损的肌生成。

（A）MYHC的代表性免疫荧光染色（左图）和融合指数（具有至少3个细胞核的MYHC细胞）（右图）的定量，在对照（si-对照）和Optn KD（si-Optn）C2C12细胞在分化后4天处理（每组n = 3）。在开始分化之前，将si-对照或si-Optn转染到C2C12细胞中48小时。比例尺：20 μm。（B）MYOG（左图）和MYOG细胞（右图）在对照（si-对照）中的代表性免疫荧光染色，以及在分化后4天用CHIR或DMSO处理的Optn KD（si-Optn）C2C12细胞的百分比（每组n = 3）。在开始分化之前，将si-对照或si-Optn转染到C2C12细胞中48小时。比例尺：50 μm。（C、D）在分化后4天（每组n = 3）用CHIR或DMSO处理的对照（si-对照）和Optn KD（si-Optn）C2C12细胞中MYOG和MYHC的代表性免疫印迹分析（C）和定量（D）。在开始分化之前，将si-对照或si-Optn转染到C2C12细胞中48小时。（五、法）在分化后4天（每组n = 3）从SI对照和si-Optn C2C12细胞中提取的核裂解物中提取的活性β-连环蛋白水平的代表性免疫印迹分析（E）和定量（F）。在开始分化之前，将si-对照或si-Optn转染到C2C12细胞中48小时。数据以均值±SEM表示。*P <0.05与对照组相比。此图的基础数据可在 S1 数据中找到。此图的原始印迹可以在S1 Raw Image中找到。GSK3β，糖原合成酶激酶3β;H3，组蛋白H3;KD，击倒;Optn， optineurin;MYHC，肌球蛋白重链;肌群，肌原蛋白;扫描电镜，均值的标准误差。++

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.g006

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图 7. 抑制GSK3β可挽救由Opten KD诱导的受损骨骼肌再生。

（A）在受伤后5天（每组n = 5只小鼠）中eMYHC纤维的代表性HE染色和免疫荧光分析（在受伤后2.5天肌内注射CHIR或BSA）。比例尺 = 50 μm。（B）损伤后5天再生eMYHC肌纤维的平均CSA（每组n = 5只小鼠）。（C、D）在受伤后5天（每组n = 3只小鼠）中，争先恐后shRNA或shOptn TA肌肉（在受伤后2.5天肌内注射CHIR或BSA）中肌原标志物（eMYHC和MYOG）的代表性免疫印迹分析（C）和定量（D）。（五、法）在受伤后5天（每组n = 3只小鼠）中提取的核裂解物中提取的活性β-连环蛋白水平的代表性免疫印迹分析（E）和定量（F）。数据以均值表示为 SEM ±*P < 0.05 与对照组的关系。此图的基础数据可在 S1 数据中找到。此图的原始印迹可以在S1 Raw Image中找到。AAV，腺相关病毒载体;BSA，牛血清白蛋白;CSA，横截面纤维面积;eMYHC，胚胎肌球蛋白重链;GSK3β，糖原合成酶激酶3β;HE，苏木精-曙红;H3，组蛋白H3;Optn， optineurin;SEM，均值的标准误差;shRNA，短发夹RNA;WGA，小麦胚芽凝集素;TA，胫骨前部。++

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.g007

讨论

骨骼肌的再生能力在某些疾病（如损伤后恢复和肌肉疾病）中具有很高的临床相关性，而肌原分化介导的肌生成是肌肉再生的关键步骤[2，51]。在这里，我们从5个独立的微阵列数据集中鉴定出一种选择性自噬受体OPTN作为肌原发生的潜在调节因子。通过进行一系列体内和体外实验，我们首次表明OPTN通过肌肉再生过程中GSK3β的自噬降解来激活Wnt信号通路介导的肌生成。我们的研究结果扩展了对肌肉再生过程中Wnt信号通路调节机制的理解，并揭示了OPTN是缺陷肌肉再生的潜在治疗靶点。

OPTN通过激活规范Wnt信号通路促进肌原生成。该途径对于肌肉再生过程中的肌生成至关重要[52]，通过MYOG启动子上的β-连环蛋白与转录因子4（TCF4）结合来调节SC分化[53，54]。β-连环蛋白的稳定性受其破坏复合成分的调节。GSK3β是β-连环蛋白破坏复合物的重要组成部分[45]，被Wnts抑制以稳定β-连环蛋白并激活其核易位。关于Wnt介导的GSK3β抑制在不同模型中有几种解释，包括通过构象改变[55]或翻译后修饰[56]将GSK3β与AXIN解离，GSK3抑制蛋白的募集，例如在晚期T细胞淋巴瘤（FRATs）中频繁重排[57]，或AXIN的降解[58]。].此外，据报道，Wnts通过促进GSK3β从细胞质基质中螯合到293T细胞中与溶酶体融合的多泡内体/体来抑制GSK3β活性[59，60]。这些发现为GSK3β的抑制提供了新的依据，并引起了该领域的广泛兴趣[61]。基于多泡内体/体是自噬体降解前的强制性步骤[62，63]，降解可能是Wnt诱导的GSK3β螯合的最终命运。与此一致，我们的数据显示OPTN在肌原发生过程中由自噬体介导的GSK3β降解，证实OPTN涉及Wnt介导的GSK3β抑制。这些发现扩展了对规范Wnt / GSK3β / β - 连环蛋白信号传导的见解，并揭示了GSK3β抑制骨骼肌的新机制。

OPTN是一种自噬受体，在选择性自噬中起核心作用[9]。我们的数据表明，OPTN通过肌肉中GSK3β的自噬降解激活Wnt信号通路，这表明在肌原发生过程中自噬和Wnt信号通路之间存在相互作用。事实上，关于他们关系的相互矛盾的结果已经报道过。在成熟肌管形成和肌肉再生过程中观察到自噬的上调[64-66]，而抑制DVL2自噬降解（Wnt信号通路的积极调节因子）在肌肉再生期间能够促进Wnt信号传导[67]。Gao及其同事也证实了类似的结果，表明自噬通过促进Dvl2降解来抑制Wnt信号通路[68]。这些结果表明，自噬对Wnt信号通路的调节呈阴性。然而，最近有报道称，自噬以GSK3β依赖性方式直接促进β-连环蛋白在C2C12细胞中的核易位[69]。我们的研究结果一致表明，自噬介导的OPTN-GSK3β轴在损伤时的肌源分化过程中对Wnt信号通路产生积极作用。与此相一致，在肝脏祖细胞分化过程中，自噬通过p62和磷酸化GSK3β的相互作用激活Wnt信号通路[70]。在脂肪细胞分化过程中，自噬肿瘤蛋白P53诱导核蛋白2（TP53INP2）的正调节因子通过GSK3β的自噬依赖性螯合激活Wnt信号通路[61]。总之，这些发现表明，自噬和Wnt信号通路之间不确定的相互交流可能受到不同（阴性或阳性）调节因子的影响。

总之，我们的数据确定了OPTN在肌肉再生过程中对肌原的新功能。OPTN通过Wnt信号通路抑制剂GSK3β的自噬降解促进肌肉再生过程中的肌原生成（图8）。这些发现揭示了OPTN / GSK3β / β -连环蛋白轴，该轴在肌肉再生过程中调节肌原。因此，OPTN可能是预防和治疗损伤和其他肌肉疾病（如DMD[71]和衰老）中肌原发育受损的潜在治疗靶点[72]。需要进一步研究以评估先进模型中OPTN的肌源功能，以增加其对转化医学的影响。

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图 8. OPTN在肌肉再生过程中对肌原作用的示意图。

OPTN与GSK3β物理相互作用并靶向GSK3β进行自噬降解，然后促进β-连环蛋白的核易位，导致在肌肉再生过程中介导的Wnt信号通路的激活。APC，腺瘤性息肉病大肠杆菌蛋白;AXIN，轴抑制蛋白;GSK3β，糖原合成酶激酶3β;LEF / TCF，淋巴样增强因子/T细胞因子;LRP，低密度脂蛋白受体相关蛋白，OPTN，光神经素。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.g008

材料和方法

动物研究

从西安交通大学（中国陕西省西安市）动物中心购买的六周龄雄性C57BL / 6J小鼠是根据美国国立卫生研究院（美国马里兰州贝塞斯达）实验室动物护理和使用指南进行的，并经西北农林大学动物伦理与福利委员会（杨玲， 中国陕西）[批准编号：NWAFU-314031143]。所有小鼠被随意与食物和水一起饲养12小时的黑暗/光照循环，并随机分配到指定的组。从Hanbio（中国上海）获得编码对照加扰shRNA序列（加扰;5'-TTCTCCGAAGGTCACGTAA-3'）或短发夹靶向OPTN（shOptn;5'-GCAAATGGCCATTCTTCTA-3'）的AAV血清型9载体，该载体编码U6启动子控制下表达EGFP（由CMV启动子驱动）。单剂量1.1×1012将40μL表达aAV2 / 9的shOptn中的vg /小鼠递送到局部注射到右TA肌肉中的8周龄小鼠，并且注射与AAV-shRNA对照组相同剂量的表达AAV2 / 9的shRNA对照组的左TA肌肉。重组AAV的生产和纯化由Hanbio制造。小鼠在重组AAV注射后治疗4周。为了诱导肌肉损伤，将50μl10μM CTX（HF005，恒飞生物技术，中国上海）注射到TA肌肉中。TA肌肉在受伤后0，3，5和14天收获。为了验证规范Wnt信号在体内的活性，在损伤后1.5天，将扰动的shRNA或shOptn的TA肌肉注射20 μl Wnt3a（100ng / ml，315-20，PeproTech，新泽西州，美国）或PBS（0.1%BSA）[67]。然后在受伤后5天收集受伤的TA肌肉进行蛋白质印迹分析。为了抑制GSK3β在体内的活性，在损伤后2.5天，将炒shRNA或shOptn的TA肌肉注射20 μl CHIR-99021（50ng / ml，HY-13259，MedChemExpress，上海，PRC）或PBS（0.1%BSA）[67]。然后收集受伤的TA肌肉进行血氧菌素 - 曙红（HE）分析和损伤后5天的蛋白质印迹。

组织学分析

用4%多聚甲醛固定TA肌肉超过72小时，然后进行脱水嵌入。最后，获得厚度为2至4μm的肌肉石蜡切片以进行HE染色，并使用Pannoramic DESK扫描仪（P-MIDI，P250，3D HISTECH，匈牙利）收集全载玻片数字图像。

5-乙炔基-2′-脱氧尿苷在体内和体外测定

给予小鼠腹腔内注射5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）（50mg / kg体重，腹膜内注射;HY-118411，MedChemExpress）分析前连续2天。使用Cell-Light Apollo 567染色试剂盒（C10317-1，RiboBio，广州，中国）检测EdU。对来自一只小鼠的每个样品约200个细胞核进行计数。使用ImageJ对EdU和Pax7双阳性细胞核，EdU阳性细胞核和总细胞核进行计数。根据制造商的说明，使用Cell-Light EdU Apollo 567体外试剂盒（C10310-1，RiboBio）测定培养的C2C12成肌细胞的增殖。使用ImageJ计数EdU阳性细胞核和总细胞核。

细胞培养

C2C12细胞从中国细胞系资源基础设施购买，并在由高葡萄糖Dulbecco的改性鹰培养基（DMEM）（H30022.01，HyClone，康涅狄格州，美国）组成的生长培养基中培养，并补充有10%胎牛血清（FBS）（Z7186FBS-500，ZETA LIFE，加利福尼亚州，美国），1%青霉素/链霉素。48小时后，在分化培养基（补充有2%马血清和1%青霉素/链霉素的高葡萄糖DMEM）中培养C2C12细胞。Atg5 和 Atg5+/+?/?HEK293T细胞系维持在补充有10%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM中。Atg5 和 Atg5+/+?/?HEK293T细胞系由崔俊博士（中山大学生命科学学院）提供。

质粒和RNA干扰

为了构建编码HA-OPTN，HA-OPTN-F188A和OPTN-E481G的质粒，在OPTN，OPTN-F188A和OPT-E481G的N端添加了HA标签。WT-OPTN，OPTN-F188A和OPTN-E481G被克隆到pcDNA3.1-HA载体的BamHI和XhoI位点中。为了构建编码FLAG-GSK3β的质粒，在GSK3β的N端添加了FLAG标签。然后将GSK3β克隆到pcDNA3.1-FLAG载体的NotI和XbaI位点中。pcDNA3.1-HA，pcDNA3.1-FLAG和GFP-LC3B质粒由孙庆柱博士（西北农林科技大学动物科学技术学院）提供。TOP flash/FOP闪光和Renilla荧光素酶表达质粒由孟庆勇博士（中国农业大学生物科学学院）提供。由GenePharma（中国上海）合成了si-对照，si-Optn和si-β-连环蛋白。Optn和β-catenin siRNA的序列如下：Optn siRNA1，5'-GCAGACUUACCUGUUUCAATT-3';Optn siRNA2， 5′-GCAAAUGGCCAUUCUUCUATT-3′.

质粒转染和荧光素酶报告检测

使用脂质素3000（L30000001，Invitrogen，加利福尼亚州，美国）转染到C2C12细胞和HEK293T细胞中。为了鉴定规范Wnt信号传导的活性，在分化培养基中培养2天后，转染了具有Renilla荧光素酶表达质粒的TOP flash/FOP快速表达质粒，其中si-对照和si-Optn C2C12细胞或HA载体和HA-Optn。使用双荧光素酶报告分析系统（E1980，Promega，威斯康星州，美国）测量报告活性。

免疫荧光

将肌肉切片和培养的细胞固定在4%甲醛中10分钟，用0.2%Triton X-100在冰上透化20分钟，然后在PBS中阻断3%牛血清白蛋白1小时。将样品在室温下在5%BSA中封闭2小时。将S1表中列出的一抗在封闭缓冲液中在4°C下孵育过夜。随后，用PBS洗涤样品，并在室温下用适当的荧光标记的二抗（荧光素异硫氰酸酯或罗丹明）染色1小时。用PBS洗涤后，使用DAPI（C0060，Solarbio，北京，中国）染色细胞核3分钟。对于肌肉部分的免疫染色，使用Pannoramic DESK扫描仪（P-MIDI，P250，3D HISTECH）收集全玻片数字图像。使用ImageJ在从TA肌肉获得的切片图像上计算新肌纤维的横截面积。对于培养细胞的免疫染色，使用BioTEK Gen 5软件获取图像。使用ImageJ计数肌管内的总细胞核和细胞核。每个肌管的细胞核分布和融合指数（具有至少3个细胞核的MYHC细胞）计算为肌管中的细胞数量除以计数的细胞总数。+

实时逆转录酶 PCR

实时荧光定量PCR按所述进行[73]。使用TRIzol试剂从新鲜的TA肌肉中分离总RNA（9109，Takara，滋贺，日本）。按照制造商的说明，使用cDNA合成试剂盒（R333-01，Vazyme Biotech，南京，中国）从总RNA合成互补DNA（cDNA）。使用CFX 96实时荧光定量PCR检测系统（Bio-Rad，Hercules，加利福尼亚州，美国）进行。每20 mL扩增含有10μlChamQ SYBR qPCR预混液（Q222-01，Vazyme Biotech），7.8mL灭菌双蒸馏水，1mL 1：10稀释cDNA，以及每个正向和反向引物0.6mL。RT-qPCR程序包括在95°C下进行3分钟的初始激活步骤，然后在95°C下循环38次，持续15秒，在60°C下循环30秒，在65°C下循环5秒。 在PCR之后，通过熔融曲线分析确认了这些反应中产生的单一产物。比较Ct法 （2?ΔΔCt），文献[74]中描述的用于计算基因表达值。基因的引物序列列在S2表中。

免疫印迹

用PBS洗涤C2C12细胞和TA肌肉，并在RIPA裂解缓冲液中裂解（P0013C，Beyotime Biotechnology，上海，中国）。接下来，通过10%或12%十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳将200μg总蛋白质分辨，并通过电转印转移到聚偏氟乙烯（PVDF）（IPVH00010，美国马萨诸塞州密利博）膜上。将PVDF膜在室温下在黑色缓冲液（5%脱脂奶粉溶解在TBST中）中阻断2小时。将S1表中列出的一抗在TBST中施用4°C过夜。随后，用TBST洗涤PVDF膜4次（每次5分钟），并在室温下用二抗（山羊抗兔或小鼠）染色2小时。用TBST洗涤后，使用ECL试剂（WBKlS0100，Millipore），并且条带在胶片上。

免疫沉淀

对于免疫沉淀分析，将TA肌肉和培养的细胞用IP裂解缓冲液（含有1M pH 7.4 Tris-HCl 25ml，NP40 25ml，NaCl 4.383g，EDTA 0.146g，甘油50ml和蛋白酶抑制剂混合物）匀浆，并将总蛋白与5 μg兔单克隆抗体一起孵育HA，GSK3β或非特异性兔IgG在室温下2小时，然后用蛋白质A / G磁珠（B23201， 比梅克，上海，中国）在4°C过夜。用TPBS洗涤3次（每次5分钟）后，蛋白质结合的珠子最终重悬于20μl1×SDS-PAGE上样缓冲液中。将样品在95°C下煮沸10分钟，并将上清液上载到凝胶上进行免疫印迹。

在细胞培养中用试剂处理

为了验证规范Wnt信号传导的活性，在分化培养基中2天后用Wnt3a（100ng / ml，315-20，PeproTech）或PBS处理si-对照和si-OPTN C2C12细胞24小时。然后收集细胞样品进行蛋白质印迹分析。为了抑制GSK3β在OPTN KD C2C12细胞中的活性，在分化过程中用CHIR-99021（CHIR;3μM，HY-10182，MedChemExpress）处理OPTN KD C2C12细胞。分化4 d后进行蛋白质印迹和免疫荧光分析。对于CHX追逐测定，用CHX（50μg/ ml）处理细胞并在指定的时间点收集并准备进行蛋白质印迹分析。为了确定哪种降解系统主要控制GSK3β，DMSO，MG132（25μM，HY-13259，MedChemExpress）和3-MA（5mM，HY-19312，MedChemExpress）的降解，将加入C2C12细胞中，培养6小时，使用或不使用Opten OE，通过蛋白质印迹检测GSK3β的蛋白表达。

统计分析

所有实验至少在3个独立实验中进行。数据以均值±标准误差表示，并通过2尾学生t检验进行分析，以便在2组之间进行比较，或将方差（方差分析）与Duncan事后检验进行多重比较。统计学显著性定义为*P<对照组为0.05。所有数据均使用PASW Statistics 20（SPSS，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行分析。

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肌肉再生过程中OPTN和eMYHC免疫印迹分析的定量。

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S1 图 肌肉再生过程中OPTN和eMYHC免疫印迹分析的定量。

（A）WT小鼠在损伤后0，3，5和14天（每组n = 3只小鼠）的TA中OPTN免疫印迹分析的定量。（B）在损伤后0，3，5和14天（每组n = 3只小鼠）的TA中eMYHC免疫印迹分析的定量。*P < 0.05 与对照组相比，以 SEM ±平均值表示。此图的基础数据可在 S1 数据中找到。CTX，心脏毒素;eMYHC，胚胎肌球蛋白重链;OPTN，光神经素;SEM，均值的标准误差;TA，胫骨前部;WT，野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.s001

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S2 图 损伤后5天TA肌中OPTN和eMYHC的代表性免疫荧光分析。

将OPTN、新再生肌峰和细胞核分别用抗OPTN抗体（红色）、抗eMYHC抗体（绿色）和DAPI（蓝色）染色。比例尺：50微米。eMYHC，胚胎肌球蛋白重链;OPTN，光神经素;TA，胫骨前部。

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S3 图 AAV shRNA对小鼠TA肌中OPTN KD的疗效.

（A）具有si对照或si-Optn #1-2转染（每组n = 3）的C2C12成肌细胞中OPTN的代表性免疫印迹分析（左图）和定量（右图）。（B）在注射含有扰动RNA或shOptn的AAV后4周的代表性荧光图像。（C）在注射含有扰动RNA或shOptn的AAV后4周定量TA肌肉中的Opton mRNA表达（每组n = 5只小鼠）。在注射含有扰动RNA或shOptn（每组n = 3只小鼠）的AAV后4周，TA肌肉中OPTN的代表性免疫印迹分析（左图）和定量（右图）。数据以均值表示为 SEM ±*P < 0.05 与对照组的关系。此图的基础数据可在 S1 数据中找到。此图的原始印迹可以在S1 Raw Image中找到。AAV，腺相关病毒载体;KD，击倒;OPTN，光神经素;SEM，均值的标准误差;shRNA，短发夹RNA;TA，胫骨前部。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.s003

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S4 图 OPTN不影响细胞增殖。

（A）损伤后3天在争夺shRNA或shOptn TA肌肉中Pax7（绿色），EdU（红色）和DAPI（蓝色）的代表性免疫荧光染色。比例尺：50 μm。（B）定量损伤后3天（每组n = 5只小鼠）争先恐后shRNA或shOptn TA肌肉中Pax7EdU细胞的百分比。（C）损伤后3天在争夺shRNA或shOptn TA肌肉中Pax7（红色）和DAPI（蓝色）的代表性免疫荧光染色。比例尺：50 μm。（D）定量损伤后3天（每组n = 5只小鼠）时争夺shRNA或shOptn TA肌肉中Pax7细胞的百分比。（E）对照（si-对照）和Optn KD（si-Optn）C2C12细胞中的代表性EdU和DAPI染色分析。在染色分析之前，将si对照或siOptn转染到C2C12细胞中24小时。比例尺：300 μm。（F）定量对照（si-对照）和Optn KD（si-Optn）C2C12细胞（每组n = 5）的EdU阳性细胞/总细胞的百分比。在染色分析之前，将si对照或siOptn转染到C2C12细胞中24小时。（G）具有si对照或siOptn转染的C2C12细胞中细胞增殖相关基因的代表性mRNA表达分析（每组n = 6）。转染24小时后收集细胞。*P < 0.05 与对照组相比，以均值±表示。此图的基础数据可在 S1 数据中找到。AAV，腺相关病毒载体;EdU， 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷;KD，击倒;OPTN，光神经素;Pax7，配对框7;SEM，均值的标准误差;shRNA，短发夹RNA;TA，胫骨前部。+++

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.s004

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S5 图 分化过程中C2C12细胞中OPTN和MYOG免疫印迹分析的定量。

（A）在指定时间点（0，2，4，6和8天）分化过程中C2C12细胞中OPTN免疫印迹分析的定量（每组n = 3）。（B）在指定时间点（0，2，4，6和8天）分化期间在C2C12细胞中MYOG免疫印迹分析的定量（每组n = 3）。*P < 0.05 与对照组相比，以 SEM ±平均值表示。此图的基础数据可在 S1 数据中找到。肌群，肌原蛋白;Optn， optineurin;扫描电镜，均值的标准误差。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.s005

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S6 图 OPTN促进成肌细胞分化介导的肌生成。

（A、 B）在分化后4天（每组n = 3）时，SI对照或si-Optn C2C12细胞中OPTN，MYHC和MYOG的代表性免疫印迹分析（A）和定量（B）。在开始分化之前，将si-对照或si-Optn转染到C2C12细胞中48小时。（C、D）在分化后4天（每组n = 3）对照（空载体）和Opton OE C2C12细胞的OPTN，MYHC和MYOG的代表性免疫印迹分析（C）和定量（D）。在分化开始之前，将空的pcDNA 3.1-HA载体或pcDNA 3.1-HA-Optn载体转染到C2C12细胞中48小时。在分化后4天收集细胞。*P < 0.05 与对照组相比，以 SEM ±平均值表示。此图的基础数据可在 S1 数据中找到。此图的原始印迹可以在S1 Raw Image中找到。肌群，肌原蛋白;MYHC，肌球蛋白重链;OE，过度表达;Optn， optineurin;扫描电镜，均值的标准误差。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.s006

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S7 图 OPTN增强C2C12细胞中的核β-连环蛋白水平。

（A、 B）在分化后4天，Optn OE（A）和Opten KD（B）C2C12细胞中活性β-连环蛋白的代表性免疫荧光分析。比例尺：10 μm。KD，击倒;OE，过度表达;Optn，optineurin。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.s007

（TIF）

S8 图 OPTN通过激活LC3介导的自噬降解GSK3β。

（A）在分化后4天在Opten KD（左图）和Opten OE（右图）C2C12细胞中定量GSK3β免疫印迹分析，然后在指定时间点用50μg/ ml CHX处理（每组n = 3）。（B）在分化后4天对照（空载体）或Opten-OE C2C12细胞中定量GSK3β免疫印迹分析，然后用DMSO，蛋白酶体抑制剂MG132（25μM）或自噬抑制剂3-MA（5mM）处理6小时（每组n = 3）。（C、D）用载体或Opten-OE转染的WT和Atg5 KO HEK293T细胞中GSK3β的代表性免疫印迹分析（C）和定量（D）（每组n = 3）。（E）在分化后4天（每组n = 3）对Opten OE和Opten KD C2C12细胞进行LC3免疫印迹分析的定量分析。（F）在转染有GFP-LC3，HA-OPTN质粒和FLAG-GSK3β质粒的C2C12细胞中GFP-LC3，HA-OPTN和FLAG-GSK3β的代表性免疫荧光分析。比例尺：5 μm。（G）损伤后5天LC3和GSK3β在争夺shRNA或shOptn TA肌肉中的共免疫沉淀分析。免疫沉淀分析在损伤后5 d处在扰动shRNA或shOptn TA肌肉中进行，与抗GSK3β抗体或非特异性兔IgG（对照）一起孵育以拉低内源性LC3。（H）小鼠Opten-F188A和Opten-E481G点突变质粒的结构域组织和分子验证示意图。（I）在发分后4 d（每组n = 3）对空载体，WT-Optn，Optn-F188A和Optn-E481G过表达C2C12细胞中的OPTN，GSK3β，MYHC和MYOG免疫印迹分析进行定量。 *P < 0.05 与对照组相比，以均值±表示。此图的基础数据可在 S1 数据中找到。此图的原始印迹可以在S1 Raw Image中找到。AAV，腺相关病毒载体;CHX， 环己酰亚胺;GSK3β，糖原合成酶激酶3β;KD，击倒;KO，淘汰赛;LIR，LC3相互作用区域;MYHC，肌球蛋白重链;肌群，肌原蛋白;OE，过度表达;OPTN，光神经素;SEM，均值的标准误差;shRNA，短发夹RNA;TA，胫骨前部;UBAN，泛素结合结构域;3-MA，3-甲基腺嘌呤。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.s008

（TIF）

S1 表。 本研究中使用的一抗。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.s009

（文档）

S2 表。 本研究中使用的qRT-PCR引物。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.s010

（文档）

S1 数据。 包含图 1A、1F、1G、1I、1J、2D、2E、2G、2H、2J、2K、2M、2N、3A、3B、3C、3D、3F、4A、4B、4C、4D、4E、5I、6A、6B、6D、6F、7B、7D 和 7F 以及 S1A、S1B、S3A、S3C、S3D、S4B、S4D、S4F、S4G、S5A、S5B、S6B、S6D、S8A、S8B、S8D、S8E 和 S8I Figs 的基础数据。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.s011

（XLSX）

S1 原始图像。 原始印迹包含图1B，1H，2A，2F，2L，3E，3F，4A，4B，4C，4D，4E，5A，5B，5C，5D，5E，5G，6C，6E，7C和7E和S3A，S3D，S6A，S6C，S8C和S8G图。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001619.s012

（英文）

确认

作者要感谢崔俊博士（中国广州中山大学生命科学学院）慷慨提供有价值的Atg5?/?HEK293T 细胞系;孟庆勇博士（中国农业大学生物科学学院，中国北京）慷慨提供TOP闪光/FOP闪光和Renilla荧光素酶表达质粒;西北A&F大学生命科学研究核心服务，用于图像分析。

引用

1.朱迪斯 J， 泰勒 JM.肌肉作为旁分泌和内分泌器官。Curr Opin Pharmacol.2017;34:49–55.Epub 格式 2017/06/13.pmid：28605657;PubMed Central PMCID： PMC5808999.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

2.Chal J，Pourquie O.制造肌肉：体内和体外的骨骼肌生成。发展。2017;144(12):2104–22.Epub 格式 2017/06/22.pmid：28634270.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

3.Sincennes MC， Brun CE， Rudnicki MA.简明综述：健康与疾病中肌原的表观遗传调控。干细胞转载医学 2016;5（3）：282–90.Epub 格式 2016/01/23.pmid：26798058;PubMed Central PMCID： PMC4807671.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

4.Bentzinger CF， Wang YX， Rudnicki MA.构建肌肉：肌生成的分子调节。冷泉预兆生物学. 2012;4（2）.Epub 格式 2012/02/04.pmid：22300977;PubMed Central PMCID： PMC3281568.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

5.Charge SB， Rudnicki MA.肌肉再生的细胞和分子调节。生理学修订版 2004;84（1）：209–38.Epub 格式 2004/01/13.pmid：14715915.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

6.Rezaie T，Sarfarazi M.小鼠光神经素的分子克隆，基因组结构和蛋白质表征。基因组学。2005;85(1):131–8.Epub 格式 2004/12/21.pmid：15607428.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

7.丸山H，森野H，伊藤H，泉Y，加藤H，渡边Y等。肌萎缩性侧索硬化症中视神经素的突变。自然界。2010;465(7295):223–6.Epub 格式 2010/04/30.pmid：20428114.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

8.Wong YC，Holzbaur EL.在受损线粒体线粒体线粒体自噬期间PARK2 / parkin和OPTN / optineurin招募的时间动力学。自 噬。2015;11(2):422–4.Epub 格式 2015/03/25.pmid：25801386;PubMed Central PMCID： PMC4502688.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

9.刘中， 洪总， 胡伟斌， 陈明， 段荣， 李汉， 等.自噬受体OPTN（光神经素）通过清除FABP3来调节衰老过程中间充质干细胞的命运和骨脂平衡。自 噬。2020:1–17.Epub 格式 2020/11/05.pmid：31516068.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

10.邱勇， 王军， 李海， 杨斌， 王军， 何强， 等.OPTN（光神经素）在与疾病相关的自噬过程中起作用的新观点。自 噬。2021:1–13.Epub 格式 2021/03/31.pmid：33783320.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

11.Slowicka K，Vereecke L，van Loo G.光神经素在健康和疾病中的细胞功能。趋势免疫。2016;37(9):621–33.Epub 格式 2016/08/03.pmid：27480243.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

12.Rezaie T， Child A， Hitchings R， Brice G， Miller L， Coca–Prados M， et al.由视神经素突变引起的成人发病原发性开角型青光眼。科学。2002;295(5557):1077–9.Epub 格式 2002/02/09.pmid：11834836.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

13.Ranganathan R，Haque S，Coley K，Shepheard S，Cooper-Knock J，Kirby J.肌萎缩性侧索硬化症 - 额颞叶痴呆中的多方面基因。前神经科学。2020;14:684.Epub 格式 2020/08/01.pmid：32733193;PubMed Central PMCID： PMC7358438.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

14.Girardi F， Le Grand F. Wnt Signaling in Skeletal Muscle Development and Regeneration.2018;153：157–79.Epub 格式 2018/02/02.pmid：29389515.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

15.铃木A，Minamide R，Iwata J. WNT / β-连环蛋白信号传导通过调节发育过程中的肾上腺素表达在成肌细胞融合中起着至关重要的作用。发展。2018;145(23).Epub 格式 2018/11/06.pmid：30389854;PubMed Central PMCID： PMC6288386.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

16.Polesskaya A， Seale P， Rudnicki MA.Wnt信号传导在肌肉再生过程中诱导常驻CD45 +成体干细胞的肌原规格。细胞。2003;113(7):841–52.Epub 格式 2003/07/03.pmid：12837243.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

17.Bilic J， Huang YL， Davidson G， Zimmermann T， Cruciat CM， Bienz M， et al.Wnt诱导LRP6信号体并促进杂乱依赖性LRP6磷酸化。科学。2007;316(5831):1619–22.Epub 格式 2007/06/16.pmid：17569865.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

18.Borello U， Berarducci B， Murphy P， Bajard L， Buffa V， Piccolo S， et al.Wnt/β-连环蛋白通路在造粒过程中调节Gli介导的Myf5表达。发展。2006;133(18):3723–32.Epub 格式 2006/08/29.pmid：16936075.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

19.Kim CH，Neiswender H，Baik EJ，Xiong WC，Mei L. β-catenin与MyoD相互作用并调节其转录活性。分子细胞生物学. 2008;28（9）：2941–51.Epub 格式 2008/03/05.pmid：18316399;PubMed Central PMCID： PMC2293083.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

20.铃木A，百利金RC，岩田J.WNT / β-Catenin信号传导通过调节步骤特异性靶标来调节肌原的多个步骤。分子细胞生物学. 2015;35（10）：1763–76.Epub 格式 2015/03/11.pmid：25755281;PubMed Central PMCID： PMC4405648.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

21.Ridgeway AG， Petropoulos H， Wilton S， Skerjanc IS.Wnt信号传导调节MyoD和肌原蛋白的功能。生物化学学报. 2000;275（42）：32398–405.Epub 格式 2000/08/01.pmid：10915791.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

22.刘超， 李毅， 谢苗诺夫 M， 韩超， 贝格， 谭毅， 等.通过双激酶机制控制β-连环蛋白磷酸化/降解。细胞。2002;108(6):837–47.Epub 格式 2002/04/17.pmid：11955436.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

23.van der Velden JL， Langen RC， Kelders MC， Wouters EF， Janssen-Heininger YM， Schols AM.抑制糖原合酶激酶-3β活性足以刺激肌原分化。Am J 生理学细胞生理学. 2006;290（2）：C453–62.Epub 格式 2005/09/16.pmid：16162663.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

24.Pansters NA， Schols AM， Verhees KJ， de Theije CC， Snepvangers FJ， Kelders MC， et al.肌肉特异性GSK-3β消融术加速了废弃萎缩骨骼肌的再生。生物奇美生物物理学报.2015;1852(3):490–506.Epub 格式 2014/12/17.pmid：25496993.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

25.Lorzadeh S，Kohan L，Ghavami S，Azarpira N. 自噬和Wnt信号通路：专注于Wnt / β-catenin信号传导。Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2021;1868（3）：118926.Epub 格式 2020/12/15.pmid：33316295.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

26.Steinhart Z，Angers S. Wnt在发育和组织稳态中的信号传导。发展。2018;145(11).Epub 格式 2018/06/10.pmid：29884654.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

27.程晓， 马晓， 朱瑶， 宋D， 丁晓， 李丽， 等. Pacer是mTORC1和GSK3-TIP60信号传导在自噬体成熟和脂质代谢调控中的中介。摩尔细胞。2019;73（4）：788–802 e7.Epub 格式 2019/02/02.pmid：30704899.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

28.Shi Y， Reitmaier B， Regenbogen J， Slowey RM， Opalenik SR， Wolf E， et al. CARP是一种心脏抗激蛋白，在伤口愈合过程中上调，并在实验肉芽组织中诱导血管生成。Am J Pathol.2005;166(1):303–12.Epub 格式 2005/01/06.pmid：15632022;PubMed Central PMCID： PMC1602297.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索厦门杂志期刊论文发表=

29.Laure L， Suel L， Roudaut C， Bourg N， Ouali A， Bartoli M， et al.心脏抗强素重复蛋白是骨骼肌病理重塑的标志物。2009;276（3）：669–84.Epub 格式 2009/01/16.pmid：19143834.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

30.小川R，马Y，山口M，伊藤T，渡边Y，大谷T等。双皮质素标志着一个新的短暂扩增的肌肉祖细胞群，是骨骼肌再生期间肌纤维成熟所必需的。发展。2015;142(1):51–61.Epub 格式 2014/12/07.pmid：25480916.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

31.Rancourt A， Dufresne SS， St-Pierre G， Levesque JC， Nakamura H， Kikuchi Y， et al.半乳糖凝集素-3和N-乙酰葡糖胺在杜氏肌营养不良症的mdx模型中促进肌原生成并改善骨骼肌功能。FASEB J. 2018：fj201701151RRR.Epub 格式 2018/06/13.pmid：29894670;PubMed Central PMCID： PMC6219824.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

32.Das S， Morvan F， Morozzi G， Jourde B， Minetti GC， Kahle P， et al. ATP 柠檬酸裂解酶通过改变组蛋白乙酰化来调节肌纤维分化并增加再生。细胞代表 2017;21（11）：3003–11.Epub 格式 2017/12/16.pmid：29241530.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

33.Deng Z， Purtell K， Lachance V， will MS， Chen S， Yue Z. 自噬受体和神经退行性疾病.趋势细胞生物学. 2017;27（7）：491–504.Epub 格式 2017/02/09.pmid：28169082.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

34.Comai G，Tajbakhsh S.骨骼肌生成的分子和细胞调节。Curr Top Dev Biol. 2014;110：1–73.Epub 格式 2014/09/25.pmid：25248473.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

35.大师JR. HeLa细胞50年过去了：好的，坏的和丑陋的。Nat Rev Cancer.2002;2(4):315–9.Epub 格式 2002/05/11.下午：12001993。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

36.Nagaraj N， Wisniewski JR， Geiger T， Cox J， Kircher M， Kelso J， et al.人类癌细胞系的深层蛋白质组和转录组映射。Mol Syst Biol. 2011;7：548.Epub 格式 2011/11/10.pmid：22068331;PubMed Central PMCID： PMC3261714.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

37.He TC， Sparks AB， Rago C， Hermeking H， Zawel L， da Costa LT， et al.将c-MYC鉴定为APC途径的靶标。科学。1998;281(5382):1509–12.Epub 格式 1998/09/04.pmid：9727977.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

38.Shtutman M， Zhurinsky J， Simcha I， Albanese C， D'Amico M， Pestell R， et al.细胞周期蛋白 D1 基因是 β-连环蛋白/LEF-1 通路的靶标。美国国家科学院院刊 1999;96（10）：5522–7.Epub 格式 1999/05/13.pmid：10318916;PubMed Central PMCID： PMC21892.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

39.豪 LR， 渡边 O， 伦纳德 J， 布朗 AM.扭曲响应Wnt1上调并抑制小鼠乳腺细胞分化。癌症研究 2003;63（8）：1906–13.Epub 格式 2003/04/19.pmid：12702582.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

40.十个Berge D，Brugmann SA，Helms JA，Nusse R. Wnt和FGF信号相互作用，以协调生长与肢体发育过程中的细胞命运规范。发展。2008;135(19):3247–57.Epub 格式 2008/09/09.pmid：18776145;PubMed Central PMCID： PMC2756806.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

41.Cadigan KM，Waterman ML. TCF / LEFs和原子核中的Wnt信号传导。冷泉预兆生物学. 2012;4（11）.Epub 格式 2012/10/02.pmid：23024173;PubMed Central PMCID： PMC3536346.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

42.高超， 陈永刚.杂乱无章：Wnt 信号的枢纽。细胞信号。2010;22(5):717–27.Epub 格式 2009/12/17.pmid：20006983.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

43.Lybrand DB， Naiman M， Laumann JM， Boardman M， Petshow S， Hansen K， et al.破坏复合动力学：Wnt/β-连环蛋白信号传导改变体内Axin-GSK3β相互作用。发展。2019;146(13).Epub 格式 2019/06/14.pmid：31189665;PubMed Central PMCID： PMC6633605.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

44.Wu D，Pan W. GSK3：Wnt信号传导中的多方面激酶。趋势生物化学科学. 2010;35（3）：161–8.Epub 格式 2009/11/04.pmid：19884009;PubMed Central PMCID： PMC2834833.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

45.丁大众，陈RH，味好美F.通过胰岛素和Wnt信号传导对糖原合酶激酶3β的差异调节。生物化学学报. 2000;275（42）：32475–81.Epub 格式 2000/07/27.pmid：10913153.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

46.Klionsky DJ， Abdel-Aziz AK， Abdelfatah S， Abdellatif M， Abdoli A， Abel S， et al.自噬监测测定的使用和解释指南（第4版）（1）。自 噬。2021;17(1):1–382.Epub 格式 2021/02/27.pmid：33634751;PubMed Central PMCID： PMC7996087.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

47.Wild P， Farhan H， McEwan DG， Wagner S， Rogov VV， Brady NR， et al.自噬受体光神经素的磷酸化限制了沙门氏菌的生长。科学。2011;333(6039):228–33.Epub 格式 2011/05/28.pmid：21617041;PubMed Central PMCID： PMC3714538.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

48.[6] 李峰， 徐东， 王毅， 周志， 刘军， 胡姗， 等.对OPTN（光神经素）对泛素识别及其通过TBK1介导的磷酸化调节的结构见解。自 噬。2018;14(1):66–79.Epub 格式 2018/02/03.pmid：29394115;PubMed Central PMCID： PMC5846504.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

49.Padman BS，Nguyen TN，Uoselis L，Skulsuppaisarn M，Nguyen LK，Lazarou M. LC3 / GABARAPs驱动泛素非依赖性招募Optineurin和NDP52以扩增线粒体自噬。纳特公社。2019;10(1):408.Epub 格式 2019/01/27.pmid：30679426;PubMed Central PMCID： PMC6345886.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

50.Wong YC， Holzbaur EL. Optineurin 是帕金介导的线粒体自噬中受损线粒体的自噬受体，该线粒体被 ALS 连锁突变破坏。美国国家科学院院刊 2014;111（42）：E4439–48.Epub 格式 2014/10/09.pmid：25294927;PubMed Central PMCID： PMC4210283.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

51.Demonbreun AR， McNally EM.肌肉细胞在发育和修复中的沟通。Curr Opin Pharmacol.2017;34:7–14.Epub 格式 2017/04/19.pmid：28419894;PubMed Central PMCID： PMC5641474.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

52.von Maltzahn J， Chang NC， Bentzinger CF， Rudnicki MA.在肌生成中发出信号。趋势细胞生物学. 2012;22（11）：602–9.Epub 格式 2012/09/05.pmid：22944199;PubMed Central PMCID： PMC3479319.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

53.Yu Y， Qi L， Wu J， Wang Y， Fang W， Zhang H. Kindlin 2 通过规范 Wnt 信号传导在肌原分化中调节肌原相关因子肌原蛋白。普洛斯一号。2013;8(5）：e63490.Epub 格式 2013/05/30.pmid：23717433;PubMed Central PMCID： PMC3661532.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

54.Meadows E， Cho JH， Flynn JM， Klein WH. Myogenin调节成体肌肉干细胞中独特的遗传程序。生物发展 2008;322（2）：406–14.Epub 格式 2008/08/30.pmid：18721801.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

55.He X，Semenov M，Tamai K，Zeng X.LDL受体相关蛋白5和6在Wnt / β-catenin信号传导中：箭头指明方向。发展。2004;131(8):1663–77.Epub 格式 2004/04/16.pmid：15084453.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

56.Liu X，Rubin JS，Kimmel AR.快速，Wnt诱导的GSK3β关联的变化调节β-连环蛋白稳定由Galpha蛋白介导。生物学报. 2005;15（22）：1989–97.Epub 格式 2005/11/24.pmid：16303557.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

57.Hagen T， Cross DA， Culbert AA， West A， Frame S， Morrice N， et al. FRAT1，糖原合成酶激酶-3活性的底物特异性调节剂，是蛋白激酶A. J Biol Chem. 2006;281（46）：35021–9的细胞底物。Epub 格式 2006/09/20.pmid：16982607.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

58.斯特罗维尔ET，吴D，苏斯曼DJ。蛋白质磷酸酶2Calpha去磷酸化肌苷并激活LEF-1依赖性转录。生物化学学报. 2000;275（4）：2399–403.Epub 格式 2000/01/25.pmid：10644691.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

59.Taelman VF， Dobrowolski R， Plouhinec JL， Fuentealba LC， Vorwald PP， Gumper I， et al.Wnt 信号传导需要在多泡内体内隔离糖原合成酶激酶 3。细胞。2010;143(7):1136–48.Epub 格式 2010/12/25.pmid：21183076;PubMed Central PMCID： PMC3022472.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

60.Vinyoles M， Del Valle-Perez B， Curto J， Vinas-Castells R， Alba-Castellon L， Garcia de Herreros A， et al.Wnt 信号传导时的多泡 GSK3 封存由 p120-连环蛋白/钙粘蛋白与 LRP5/6 相互作用控制。摩尔细胞。2014;53(3):444–57.Epub 格式 2014/01/15.pmid：24412065.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

61.Romero M， Sabate-Perez A， Francis VA， Castrillon-Rodriguez I， Diaz-Ramos A， Sanchez-Feutrie M， et al. TP53INP2通过GSK3β的自噬依赖性螯合激活β-连环蛋白来调节肥胖。Nat 细胞生物学. 2018;20（4）：443–54.Epub 格式 2018/03/30.pmid：29593329.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

62.Berg TO， Fengsrud M， Stromhaug PE， Berg T， Seglen PO.大鼠肝脏两栖体的分离和表征。自噬体与早期和晚期内体融合的证据。生物化学学报. 1998;273（34）：21883–92.Epub 格式 1998/08/15.pmid：9705327.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

63.Katzmann DJ，Odorizzi G，Emr SD.受体下调和多泡体分类。Nat Rev Mol Cell Biol. 2002;3（12）：893–905.Epub 格式 2002/12/04.pmid：12461556.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

64.Fortini P， Ferretti C， Iorio E， Cagnin M， Garribba L， Pietraforte D， et al.体外肌生成过程中代谢，自噬和分化的微调。细胞死亡 Dis. 2016;7：e2168.Epub 格式 2016/04/01.pmid：27031965;PubMed Central PMCID： PMC4823951.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

65.Sin J， Andres AM， Taylor DJ， Weston T， Hiraumi Y， Stotland A， et al.线粒体自噬是C2C12成肌细胞的线粒体生物发生和肌原分化所必需的。自 噬。2016;12(2):369–80.Epub 格式 2015/11/15.pmid：26566717;PubMed Central PMCID： PMC4836019.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

66.Fiacco E， Castagnetti F， Bianconi V， Madaro L， De Bardi M， Nazio F， et al.自噬调节卫星细胞再生正常和营养不良肌肉的能力。细胞死亡不同。2016;23(11):1839–49.Epub 格式 2016/10/19.pmid：27447110;PubMed Central PMCID： PMC5071573.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

67.张坤， 张勇， 顾磊， 蓝敏， 刘超， 王明， 等.Islr通过稳定Discelled-2和防止自噬来调节规范的Wnt信号介导的骨骼肌再生。纳特公社。2018;9(1):5129.Epub 格式 2018/12/05.pmid：30510196;PubMed Central PMCID： PMC6277414.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

68.高超， 曹文， 鲍磊， 左文， 谢国， 蔡婷， 等.自噬通过促进凌乱降解来消极调节Wnt信号传导。国家细胞生物学. 2010;12（8）：781–90.Epub 格式 2010/07/20.pmid：20639871.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

69.张志， 张磊， 周勇， 李磊， 赵军， 秦伟， 等.HDAC9的增加通过缺氧中自噬的表观遗传学调节抑制成肌细胞分化。细胞死亡 2019;10（8）：552.Epub 格式 2019/07/20.pmid：31320610;PubMed Central PMCID： PMC6639330.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

70.马泽， 李峰， 陈磊， 顾婷， 张强， 曲燕， 等.自噬通过调节Wnt/β-连环蛋白信号通路促进肝祖细胞的肝脏分化。J Mol Histol.2019;50(1):75–90.Epub 格式 2019/01/04.pmid：30604254;PubMed Central PMCID： PMC6323068.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

71.常NC，骑士FP，鲁德尼基MA。肌肉萎缩症中的卫星细胞- 迷失在极性中。趋势分子医学. 2016;22（6）：479–96.Epub 格式 2016/05/11.pmid：27161598;PubMed Central PMCID： PMC4885782.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

72.Belli R， Bonato A， De Angelis L， Mirabilii S， Ricciardi MR， Tafuri A， et al. 代谢重编程促进衰老过程中的肌生成。前生理学. 2019;10：897.Epub 格式 2019/07/30.pmid：31354530;PubMed Central PMCID： PMC6636331.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

73.石旭春， 金A， 孙军， 田建， 姬华， 陈立强， 等.α-硫辛酸对幼鱼、栉水母的蛋白质保留作用：对脂肪分解、脂肪酸β-氧化和蛋白质合成的影响。Br J Nutr.2018;120(9):977–87.Epub 格式 2018/09/11.pmid：30198455.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

74.利瓦克 KJ， 施密特根 TD.使用实时定量PCR和2（-Delta Delta C（T））方法分析相对基因表达数据。方法。2001;25(4):402–8.Epub 格式 2002/02/16.pmid：11846609.

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