厦门杂志期刊论文发表=逆转录仪直接结合ESCPE-1，在内体循环过程中转移货物蛋白

鲍里斯·西蒙内蒂 ，郭倩，曼努埃尔·希门尼斯-安德烈斯 ，陈凯恩，埃德蒙·穆迪，阿什利?埃文斯，明图钱德拉，克里斯?丹森，汤姆·威廉姆斯，布雷特·柯林斯 ，彼得·卡伦

出版日期： 2022年04月13日

抽象

涂层复合物通过货物适配器协调货物识别，并在整体膜蛋白运输过程中运输载体的生物发生。在这里，我们将生化、结构和细胞分析结合起来，建立一个机制基础，通过该机制，SNX27-Retromer（一种主要的内体货物适配器）与膜重塑内体 SNX-BAR 分类复合物耦合，以促进出口 1 （ESCPE-1）。在表明SNX27 FERM（4.1 / ezrin / radixin / moesin）结构域直接结合ESCPE-1的SNX1 / SNX2亚基中的酸性Asp-Leu-Phe（aDLF）基序时，我们提出了一种切换模型，其中SNX27-Retromer捕获的货物蛋白被转移到ESCPE-1运输载体中，以促进内体到质膜的再循环。通过揭示SNX27：Retromer：ESCPE-1涂层的组装在早期后生动物进化过程中以逐步的方式进化，可能反映了从祖先opisthokont到现代动物的内体到质膜回收的复杂性日益增加，我们进一步证明了酵母五聚体逆转录蛋白在后生动物中数百个整体膜蛋白的回收中的功能多样化。

引文： Simonetti B， Guo Q， Giménez-Andrés M， Chen K-E， Moody ERR， Evans AJ， et al. （2022） SNX27–Retromer直接结合ESCPE-1，在内体循环过程中转移货物蛋白。PLoS Biol 20（4）：e3001601。https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001601

学术编辑： Maya Schuldiner，魏茨曼科学研究所，美国

收到： 九月 22， 2021;接受： 三月 11， 2022;发表： 四月 13， 2022

版权所有： ? 2022 西蒙内蒂等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

资金： Cullen实验室的工作得到了Wellcome Trust（104568/ Z / 14 / Z和220260 / Z / 20 / Z），医学研究委员会（MR / L007363 / 1和MR / P018807 / 1），李斯特预防医学研究所以及皇家学会Noreen Murray研究教授职位授予P.J.C（RSRP / R1 / 211004）的支持。B.M.C.由国家卫生和医学研究委员会（APP1136021和APP1156493）的高级研究奖学金和项目资助支持。E.R.R.M得到了T.A.W（RGF\EA\180199）研究员增强奖的支持。T.A.W.由英国皇家学会大学奖学金（URF\R\201024）提供支持。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

相互竞争的利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。

缩写： aDLF， acidic-Asp-Leu-Phe;β-ME， β-巯基乙醇;BAR， Bim/Amphiphysin/Rvs;BIC，贝叶斯信息准则;ESCPE-1，内体SNX-BAR分类复合物，用于促进出口1;ITC，等温滴定量热法;LIC，非连接克隆;MGP，Mnemiopsis基因组计划门户;NTA，腈基三乙酸;PDZbm，PDZ结合基序;RNAi，RNA干扰;SEC，尺寸排阻色谱;SNX1，排序连接蛋白-1;SNX3，排序连接蛋白-3;SNX27， 排序连接蛋白-27;WASH、威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白和 SCAR 同系物

介绍

内体-溶酶体网络的核心作用是确定2种命运之间整体蛋白质及其相关蛋白质和脂质（统称为“货物”）的分类，无论是在溶酶体内降解，还是从这种命运中检索以促进回收到包括细胞表面在内的各种细胞器[1].高效和选择性的内体-溶酶体货物分选对所有真核细胞的功能至关重要，越来越多的证据表明，内体检索和再循环中的缺陷是各种人类疾病的核心，尤其是与神经变性相关的疾病[2]。因此，建立内体货物检索和再循环的分子机制和功能意义是理解真核细胞生物学的基础。

考虑了两个一般概念来解释内体货物检索和再循环的机制。与序列无关的分选假设分选可以在不需要任何序列信息的情况下在整体膜货物的细胞内细胞质结构域内进行[3]。另一方面，序列依赖性分选由货物细胞质结构域中的特定信号控制。这些信号通常是短的线性肽基序，通过与古代和进化保守的涂层复合物偶联物耦合来指导分选过程[1，4，5]。在将分拣图案识别与膜重塑相结合时，这些涂层协调货物检索过程与形成富含货物的运输载体以进行后续回收。在哺乳动物中，这些外套包括分选连接蛋白-3（SNX3）-逆转录蛋白[6-10]，SNX27-逆转录蛋白[11-14]，SNX17-猎犬[15]，CCC（CCDC22 / CCDC93 / COMMD）[16，17]和内体SNX-BAR分选复合物，用于促进出口1（ESCPE-1）复合物[18，19]和各种辅助蛋白，包括肌动蛋白聚合Wiskott-Aldrich综合征蛋白和SCAR同系物（WASH）复合物[20，21].

分选连接蛋白-27（SNX27）是一种内体相关的货物适配器，由中央PX（phox同源）结构域组成，两侧是氨基末端PDZ（PSD95，磁盘大，带状闭塞）结构域和羧基末端FERM（4.1 / ezrin/radixin / moesin）结构域[22，23]。PDZ结构域识别特定的分选基序，称为PDZ结合基序（PDZbm），存在于400多种货物蛋白的羧基末端，包括受体，转运蛋白，通道，酶和粘附分子[11-13，23-31]。在识别这些内化货物时，SNX27调节它们从溶酶体降解中检索并促进其再循环回质膜[11-13]。

为了便于检索过程，SNX27 PDZ结构域与VPS26（在人类中表达的A和B亚型[32]）、VPS35和VPS29的稳定异质体Retromer相关联，形成SNX27-Retromer[12-14]。逆向聚合物本身组装形成二聚体拱门，该二聚体弓可以聚集SNX27捕获的货物[9，10，33]并与WASH复合物结合，以允许支链丝状肌动蛋白的局部Arp2 / 3依赖性聚合[34，35]。在一个知之甚少的过程中，这些组装体和肌动蛋白动力学被提出在内体膜上产生一个检索子域，该子域富集于用于回收的货物中[35-39]。正是从这些子结构域中，进一步的膜重塑随之而来，以驱动富含货物的管状轮廓和管状载体的生物发生，这些载体将货物物理地运输回细胞表面。重要的是，SNX27-逆转录因子功能缺陷与人类疾病的病因有关，最显著的神经系统疾病和神经退行性疾病[40]。

与SNX27-Retromer管状谱相关的膜管状Bim/Amphiphysin/Rvs（BAR）结构域蛋白正在分选连接蛋白-1（SNX1）[12]。SNX1及其功能性同源物SNX2是ESCPE-1复合物[18，19，41]的一部分，ESCPE-1复合物是一种膜管复合物，在体外可以重建膜小管的形成，其直径与在纤维素中观察到的直径相似[42]。为了具有功能性，ESCPE-1形成SNX1或SNX2的稳定异源二聚体，与SNX5或SNX6相关联，另外2个含有BAR结构域的同源体[43]。重要的是，SNX27-Retromer如何将货物输送到形成ESCPE-1管状轮廓和管状载体中的机制基础仍然是一个尚未解答的主要问题。

在这里，我们确定SNX27的FERM结构域中的保守表面直接与ESCPE-1的SNX1和SNX2亚基的无序氨基末端中存在的酸性Asp-Leu-Phe（aDLF）序列基序结合。我们表明，这种相互作用是将含有SNX27-Retromer从溶酶体降解中检索到的货物蛋白的PDZbm转换为ESCPE-1管状图所必需的，该管状图促进货物回收，以便随后在细胞表面重新聚集。通过对组装SNX27：Retromer：ESCPE-1涂层复合物的蛋白质 - 蛋白质相互作用的进化分析，我们揭示了这种分选轴如何进化以适应在动物中观察到的日益复杂的内体分选。

结果

SNX27 的 FERM 域促进了 SNX27 –逆行者–介导的溶酶体降解检索之后的货物回收

此前，我们已经确定，Retromer与SNX27的PDZ结构域的相互作用是防止内化货物进入溶酶体降解途径的关键步骤[13，14]。为了确定促进后续货物回收到质膜所需的SNX27区域，我们使用CRISPR基因编辑来生成SNX27敲除HeLa细胞（图1A）。与在细胞表面富集内源性GLUT1的对照细胞相比，在SNX27敲除细胞中，GLUT1显示出LAMP1阳性溶酶体的稳态富集，这种表型也在VPS35敲除HeLa细胞系中观察到（图1B）。重要的是，GFP-SNX27在SNX27敲除细胞中的再表达挽救了从溶酶体分布中检索GLUT1并促进其在细胞表面的再聚集（图1C）。这些数据反映了先前发表的使用RNA干扰（RNAi）介导的SNX27抑制[13]的数据，并确认SNX27敲除HeLa细胞系是一个合适的筛选平台，通过该平台可以剖析SNX27的特征，以促进GLUT1内体到质膜的再循环。

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图 1. SNX27 的 FERM 域在 SNX27 – Retromer – 介导的溶酶体检索之后促进货物回收。

（A）蛋白质印迹证实VPS35 KO和SNX27 KO细胞中不存在感兴趣的蛋白质。（B）亲本Hela细胞，VPS35 KO HeLa克隆系和SNX27 KO HeLa细胞的代表性图像。通过对具有GLUT1的固定细胞以及内体和溶酶体标志物VPS35和LAMP1进行免疫荧光染色，分析了GLUT1的稳态分布。在n = 4个独立实验中，在每种条件下共分析了70个细胞，用于GLUT1和LAMP1之间的共定位。使用单因子方差分析和邓内特检验将LAMP1共定位的Pearson系数值与亲本HeLa的值进行比较：P <0.0001（HeLa vs VPS35 KO），<0.0001（HeLa vs SNX27 KO）。使用不成对的2尾t检验比较VPS35共定位的Pearson系数值：P <0.0001（HeLa与SNX27 KO）。（C）用GFP-SNX27 WT，GFP-SNX27 Δ67-77和GFP-SNX27 ΔFERM瞬时转染的SNX27 KO HeLa细胞的代表性图像。此外，转染后48小时，细胞固定并免疫染色。通过对具有GLUT1的固定细胞以及内体和溶酶体标志物VPS35和LAMP1进行免疫荧光染色，分析了GLUT1的稳态分布。在n = 4个独立实验中，在每种条件下共分析了70个细胞的GLUT1和LAMP1以及GLUT1和VPS35之间的共定位。将Pearson系数值与使用GFP-SNX27 WT使用单因子方差分析和Dunnett检验挽救的SNX27 KO细胞的值进行比较。LAMP1共定位值为P<0.0001（+WT vs +Δ67–77），0.3559（+WT vs +ΔFERM）。VPS35 共定位值为 P < 0.0001 （+WT vs Δ67–77），0.001 （+WT vs +ΔFERM）。条形图、误差线和符号分别表示平均值、SEM 和单个数据点。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，ns = 不显著。比例尺，25 μm（显微照片）和5 μm（放大图像）。图中所示图形的基础数据可以在 S1 数据中找到。KO，淘汰赛;SNX27， 排序连接蛋白-27;WT，野生型。

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与野生型SNX27相比，SNX27突变体的表达缺乏对逆转录蛋白关联（GFP-SNX27Δ67-77）至关重要的环区[13，14]未能从溶酶体共定位中挽救检索，也未能促进GLUT1细胞表面回收（图1C）。这些数据进一步证实，SNX27与Retromer的关联是将序列依赖性货物识别与溶酶体降解命运中的货物检索相结合的关键步骤[13，14]。与此一致，缺乏FERM结构域的SNX27缺失突变体（GFP-SNX27ΔFERM）的表达保留了SNX27与Retromer的关联，保留了从溶酶体中检索GLUT1的能力，如GLUT1和LAMP1之间减少的共定位所定义（图1C）。然而，GFP-SNX27ΔFERM突变体未能促进GLUT1循环到细胞表面，而是在逆转录体阳性内体室中富集GLUT1（图1C）。与亲本细胞相比，在KO和救援条件下，GLUT1的总体水平没有降低（S1图）。总之，这些数据与一个模型一致，其中SNX27与Retromer的耦合对于从溶酶体降解命运中检索是必要的，而SNX27 FERM结构域是促进随后的GLUT1的内体到细胞表面回收所必需的。

SNX1 和 SNX2 将 ESCPE-1 耦合到 SNX27 的 FERM 域

ESCPE-1调节几种货物的管状内体回收，其中许多货物也依赖于SNX27-Retromer[13，18，19]。ESCPE-1是功能冗余SNX1或SNX2与功能冗余SNX5或SNX6相关的异源二聚体组件（图2A）[18，19]，而SNX27-Retromer是SNX27与VPS26A / B：VPS35：VPS29异三聚体逆向复合物的组件（图2B）[13]。为了确定SNX27和ESCPE-1之间可能存在的联系，我们首先对SNX27和HEK-293T细胞中表达的各种SNX27突变体进行了一系列GFP-nanotrap免疫异构化，并探测了相关内源性ESCPE-1的存在。在全长GFP-SNX27和ESCPE-1的所有组分之间观察到鲁棒的关联（图2C-2E）。这种关联独立于SNX27 PDZ结构域，因为结合保留在PDZ缺失突变突变体GFP-SNX27ΔPDZ中，并且当在HEK-293T细胞中仅表达PDZ结构域时未观察到（图2C和2D）。ESCPE-1结合不需要与SNX27的逆转录蛋白结合，因为GFP-SNX27Δ67-77和GFP-SNX27（L67A/ L77A），2个突变体无法与Retromer结合[14]，每个突变体都保留了与ESCPE-1的关联（图2E）。但是，在删除 SNX27 FERM 域 （SNX27ΔFERM） 或将 SNX27 的 FERM 域从 SNX17 切换到相应的 FERM 域时，ESCPE-1 关联丢失（图 2C）。此外，当在HEK-293T细胞中表达时，SNX27的分离的FERM结构域就能够与ESCPE-1结合（图2D）。最后，在反向免疫同位异化中，GFP标记的SNX1，SNX2，SNX5或SNX6显示，当在HEK-293T细胞中表达时，只有SNX1和SNX2与内源性SNX27显示出显着的关联（图2F）。此外，这种关联不需要SNX1或SNX2 BAR域的存在，因为删除这些域不会影响与SNX27的绑定（图2G）。总之，这些数据与SNX27的FERM域一致，与ESCPE-1的SNX1和SNX2组件相关联。

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图 2. SNX27 的 FERM 域与 SNX1 和 SNX2 交互。

（A） 由 SNX-BAR 蛋白 SNX1 或 SXN2 与 SNX5 或 SNX6 的异源二聚体组成的 ESCPE-1 组件的示意图。这些SNX具有分别负责二聚体形成和膜靶向的BAR和PX结构域。SNX1和SNX2还具有扩展的氨基端非结构化扩展（NT）。（B） SNX27–Retromer组件的原理图。Retromer 是 VPS35、VPS26 和 VPS29 的稳定异质三聚体。Retromer通过PDZ结构域（残基67至79）内的β发夹插入直接与SNX27相互作用，该结构域在氨基末端和羧基末端子结构域之间接合VPS26蛋白的裂隙。（C）GFP标记的SNX27 FL，SNX27 ΔPDZ，SNX27 ΔFERM和由SNX27基因组成的嵌合体的共同免疫沉淀，其中其FERM结构域被交换为SNX17的嵌合。在HEK-293T细胞中瞬时转染构建体，对细胞裂解物进行基于GFP陷阱的免疫沉淀，并通过定量荧光的蛋白质印迹分析免疫沉淀物。VPS35、VPS26A、VPS29、SNX1 和 GFP 的波段强度是使用 Odyssey 软件从 n = 3 个独立实验中测量的。归一化为GFP表达的条带强度表示为FL的平均分数。（D）在HEK-293T细胞中表达的GFP标记的SNX27 FL，分离的SNX27 PDZ，PX和FERM结构域的共免疫沉淀。将细胞裂解物置于基于GFP陷阱的免疫沉淀中，并将免疫沉淀物用于VPS35，SNX1，SNX2，SNX5，SNX6和GFP。印迹代表了3个独立的GFP陷阱。（E）GFP标记的SNX27 FL和SNX27突变体Δ67-77和L67A-L74A在HEK-293T细胞中表达的共免疫沉淀。将细胞裂解物置于基于GFP陷阱的免疫沉淀中，并将免疫沉淀物用于VPS35，SNX1，SNX2，SNX5，SNX6和GFP。印迹代表了3个独立的GFP陷阱。（F）在HEK-293T细胞中表达的GFP标记的SNX1，SNX2，SNX5和SNX6的共免疫沉淀。对细胞裂解物进行基于GFP陷阱的免疫沉淀，并将免疫沉淀物用于SNX27和GFP。印迹代表了3个独立的GFP陷阱。（G）GFP标记的SNX1，SNX2和SNX5的共免疫沉淀缺乏HEK-293T细胞中表达的BAR结构域（ΔBAR）。对细胞裂解物进行基于GFP陷阱的免疫沉淀，并将免疫沉淀物用于SNX27和GFP。印迹代表了3个独立的GFP陷阱。分子质量以千道尔顿为单位。条形图、误差线和符号分别表示平均值、SEM 和单个数据点。图中所示图形的基础数据可以在 S1 数据中找到。ESCPE-1，内体SNX-BAR分类复合物，用于促进出口1;FL，全长;SNX1，排序连接蛋白-1;SNX2，排序连接蛋白-2;SNX5，排序连接蛋白-5;SNX6，排序连接蛋白-6;SNX27，排序连接蛋白-27。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001601.g002

SNX1 和 SNX2 的氨基末端呈现与 SNX27 FERM 域相关的串联酸性-Asp-Leu-Phe 基序

与SNX5和SNX6相比，人类SNX1和SNX2分别含有142个和139个氨基酸的氨基末端延伸，预计这些氨基酸是非结构化的。GFP-SNX1（1-279）的HEK-293T细胞中的表达，GFP-SNX1（1-279）是氨基末端扩展和SNX1 PX结构域的构建编码，GFP-SNX1（1-138）是仅针对SNX1的氨基末端扩展的构建编码，确定SNX1的氨基末端扩展足以与内源性SNX27关联（图3A）。同样，SNX2的氨基末端与SNX27相互作用，而SNX5和SNX6的氨基末端未能做到这一点（S2A图）。为了建立关联的直接性质，我们重组表达和纯化了全长小鼠SNX1和人类SNX27的分离FERM结构域;小鼠和人类SNX1的相同率为94.2%。等温滴定量热法 （ITC） 确定 SNX1 直接结合到 SNX27 的 FERM 域，具有亲和力 （Kd）为41.0μM（图3B和S1表）。与小鼠SNX1的氨基末端延伸相对应的重组蛋白观察到类似的结合亲和力（39.1μM）（与人SNX1的85.9%序列同一性）（图3B）。为了绘制SNX27结合所需的SNX1和SNX2的特征，我们对人类SNX1的氨基末端扩展进行了删除诱变筛选（图3C）。从残基 1 到 138 编码的最小结合区域上游行走，确定最大 SNX27 结合需要 2 个区域。残基79至100的缺失导致结合的显着减少，随后残基41至54的缺失消除了相互作用。SNX1的这些区域的比对揭示了2个相似的基序，其DIF或DLF序列两侧是上游酸性残基。与SNX2的氨基末端进行比较，SNX2也结合SNX27（S2A图），表明它在其无序的氨基末端结构域中也有2个相似的序列，并且总共定义了一个保守序列D / E-x-x-D-I / L-F，这里称为adLF基序（图3D和3E）。

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图 3. SNX1 和 SNX2 的氨基末端通过串联的 aDLF 基序直接与 SNX27 FERM 域相互作用。

（A）GFP标记的SNX1 FL或截断突变体的共同免疫沉淀对应于HEK-293T细胞中表达的残基1至279和1至138。对细胞裂解物进行基于GFP陷阱的免疫沉淀，并将免疫沉淀物用于SNX27和GFP。使用Odyssey软件从n = 3个独立实验中测量SNX27的能带强度，并归一化为GFP表达。使用单因子方差分析和邓内特检验将SNX1结构的相对结合与SNX1 FL进行比较。（B） mSNX1 的绑定佛罗里达州（橙色）和 mSNX11-139（蓝色）带 hSNX27费姆由贸易中心提供。（C）GFP标记的SNX1氨基末端（1至138）的共免疫沉淀和对应于SNX1氨基末端的连续截断的一组结构。在HEK-293T细胞中瞬时转染构建体，对细胞裂解物进行基于GFP陷阱的免疫沉淀，并通过定量荧光的蛋白质印迹分析免疫沉淀物。使用Odyssey软件从n = 4个独立实验中测量SNX27和GFP的能带强度，并归一化为GFP表达。使用单因子方差分析和邓内特检验将SNX1截断突变体的相对结合与SNX1氨基末端（1-138）进行比较。（D） SNX27 结合中涉及的 SNX1 区域与 SNX2 氨基末端的相应序列的对准。SNX1和SNX2之间的保守残基解释了酸性残基的共识基序，然后是DI / LF（aDLF基序）。（E） FL SNX1的α折叠结构预测[44]。SNX1的氨基末端以其完全延伸显示，SNX27结合中涉及的残基以红色和绿色着色。（F）GFP标记的SNX1 WT的共免疫沉淀和SNX1的adLF基序上的一组氨基酸交换突变体。在HEK293T细胞中瞬时转染构建体，对细胞裂解物进行基于GFP陷阱的免疫沉淀，并通过定量荧光的蛋白质印迹分析免疫沉淀物。SNX27、SNX6 和 GFP 的波段强度是使用 Odyssey 软件从 n = 4 个独立实验中测量得出的。归一化为GFP表达的条带强度表示为SNX1 WT的平均分数。使用单因子方差分析和邓内特检验将SNX1点突变体与SNX27和SNX6的结合与SNX1 WT进行了比较。（G） mSNX27 的绑定佛罗里达州和ITC的hSNX1肽。断续器135-51（D45K）： 绿色;断续器135-51：橙色;断续器175-92：淡紫色;ND*：未检测到绑定。（H） mSNX27的结合佛罗里达州和ITC的hsNX2肽。断续器16-33（低频/不锈钢）： 蓝色;断续器16-33： 绿色;断续器62-82：淡紫色;ND*：未检测到绑定。ITC 图表示具有 1：1 比率绑定的集成和规范化数据拟合。绑定亲和力 （Kd） 作为至少 2 个独立实验的平均值给出。绑定的热力学参数在 S1 表中提供。分子质量以千道尔顿为单位。条形图、误差线和符号分别表示平均值、SEM 和单个数据点。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。图中所示图形的基础数据可以在 S1 数据中找到。aDLF， 酸性-阿斯普-列伊-菲;FL，全长;ITC，等温滴定量热法;SNX1，排序连接蛋白-1;SNX2，排序连接蛋白-2;SNX27， 排序连接蛋白-27;WT，野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001601.g003

靶向SNX1的第一个ADLF基序的位点导向诱变确定，全长GFP-SNX1（E42K），GFP-SNX1（E44K），GFP-SNX1（D45K），GFP-SNX1（I46K）和GFP-SNX1（F47K）都显示出与SNX27的结合减少约50%（图3F）。当靶向SNX1的第二个ADLF基序时，也观察到类似的结合减少，如GFP-SNX1（E84K），GFP-SNX1（D87K）和GFP-SNX1（F89D）突变体所观察到的那样（图3F）。在同时靶向两个ADLF基序SNX27中的关键残基的双GFP-SNX1（D45K，D87K）突变体中，结合降低到接近检测不到的水平（图3F）。重要的是，所有突变体都保留了与SNX6结合的能力，确定ESCPE-1仍然能够组装。此外，靶向SNX2，GFP-SNX2（D26K，D72K）中两种ADLF基序的突变体也将SNX27结合降低到接近检测不到的水平（S2B图）。接下来，我们使用ITC来量化从SNX1和SNX2到全长小鼠SNX27的adLF肽的结合。对应于残基35至51和75至92的肽分别包含人SNX1的第一和第二个ADLF基序，与SNX27结合，分别具有33.4μM和13.3μM的亲和力（图3G和S1表）。为了确定与SNX27相互作用的冗余性质，我们设计了对应于SNX2的第一和第二个ADLF基序的肽，即残基16至33和62至82。这些也结合到全长小鼠SNX27，亲和力分别为37.8μM和22.6μM（图3H）。进一步定义SNX1和SNX2之间的冗余，在SNX1 35-51肽SNX1（D45K）中引入电荷交换突变，以及SNX2 16-33肽SNX2（DLF-SSS）中的三重突变，导致突变肽与SNX27没有可检测的结合（图3G和3H）。最后，使用全长SNX27预孵育过量SNX1 75-92肽的竞争性ITC测定确定它竞争SNX2 16-33肽的结合，与SNX27 FERM结构域内同一表面结合的两个序列一致（S2C图）。总体而言，这些数据表明，通过其非结构化氨基末端扩展中存在的串联adLF基序，SNX1和SNX2直接与SNX27的FERM域相关联。

SNX1/SNX2 结合需要 SNX27 FERM 域中的基本表面

SNX27和SNX17是相关的内体相关货物适配器[23，45]。虽然它们在序列依赖性内体货物分类中显示出完全不同的功能角色[13，15]，但它们在结构上具有相似的PX和FERM结构域[45，46]（图4A）。来自HEK-293T细胞的GFP-SNX17和GFP-SNX27的比较免疫隔离确定SNX17不与ESCPE-1结合（图4B），与ESCPE-1与含有SNX17 FERM结构域的SNX27嵌合体结合的损失一致（图2C）。为了确定adLF基序与SNX27 FERM结构域结合的潜在区域，我们最初对SNX17 FERM域的X射线结构[45]和SNX27 FERM结构域的同源模型[46]进行了比较结构分析。特别是，我们专注于互补碱性氨基酸的分布和聚类。这表明SNX27的FERM结构域具有部分由R437，R438，K495，K496，R498和K501定义的基本表面，这些残基在SNX17中通常对应于不带电的残基或带负电的氨基酸（图4A和4C）。事实上，这些残基的电荷交换位点导向诱变产生了全长GFP-SNX27突变体，当从HEK-293T细胞表达和免疫异化时，缺乏与ESCPE-1结合的能力;然而，所有突变体都保留了与Retromer结合的能力（图4D）。在直接ITC定量的结合测定中，人SNX27（K495D），SNX27（R498D）和SNX27（K501D）都显示出与人SNX1 75-92肽的可检测结合，而SNX27（R496D）突变体的结合亲和力降低，而野生型SNX27观察到的结合亲和力为12.7μM（图4E）。

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图 4. SNX1 和 SNX2 氨基末端结合 SNX27-FERM 域的独特基本表面。

（A） SNX27 FERM 结构域与 SNX17 FERM 结构域的序列比对。构成SNX27独有的基本表面的带正电的残留物被装箱并用蓝色标记。（B）GFP标记的SNX27和SNX17的共免疫沉淀。在HEK-293T细胞中瞬时转染构建体，对细胞裂解物进行基于GFP陷阱的免疫沉淀，并对免疫沉淀物进行VPS35，SNX1，SNX2，SNX5，SNX6和GFP的印迹。印迹代表了3个独立的GFP陷阱。（C） SNX27 FERM 域的同源模型 [46]。标记了 SNX27 FERM 域独有的残留物以及可能解释与 ESCPE-1 相互作用的残留物。（D）GFP标记的SNX27 WT和一组跨FERM结构域的氨基酸交换突变体的共免疫沉淀。在HEK293T细胞中瞬时转染构建体，对细胞裂解物进行基于GFP陷阱的免疫沉淀，并对免疫沉淀物进行VPS35，SNX1，SNX2，SNX5和SNX6的印迹。使用Odyssey软件从n = 3个独立实验中测量波段强度。归一化为GFP表达的条带强度表示为WT的平均分数。使用2分方差分析和邓内特检验将SNX27点突变体与VPS35，SNX1，SNX2，SNX5和SNX6的结合与SNX27 WT进行比较。（E） SNX1 的绑定75-92肽到 hSNX27佛罗里达州ITC的蛋白质（hSNX27 R498D：深蓝色; hSNX27 K501D：橙色; hSNX27 K495D：淡紫色; hSNX27 K496D：天蓝色; hSNX27 WT：红橙色;ND*：未检测到绑定）。ITC 图表示具有 1：1 比率绑定的集成和规范化数据拟合。绑定亲和力 （Kd） 作为至少 2 个独立实验的平均值给出。绑定的热力学参数在 S1 表中提供。（F） 左面板显示了与具有相同结合方向的 SNX1 和 SNX2 的核心 aDLF 序列（黄色棒）绑定的 SNX27 FERM 域（粉红色条带）的 AlphaFold2 生成的模型。为清楚起见，仅显示一个 SNX27 模型，上面覆盖着 8 个 aDLF 肽（SNX1 和 SNX2 的 4 个序列各有 2 个肽模型）。指示了 SNX27 FERM 域 F1、F2 和 F3 的 3 个子域。中间面板显示建模的 SNX1 aDLF 内核序列的特写视图44埃迪夫特加50.aDLF 序列的严格守恒 Phe 侧链编号为 F0以供参考，其他残留物对此进行了编号。（G）GFP标记的SNX27的共免疫沉淀和一组疏水性氨基酸突变，预计介导SNX27 FERM-ESCPE1结合。在HEK-293T细胞中瞬时转染构建体，对细胞裂解物进行基于GFP陷阱的免疫沉淀，并将免疫沉淀物用于VPS35，SNX1，SNX5，SNX6和GFP。该印迹代表了3个独立的GFP陷阱，相对于条形图中定量的GFP标记蛋白的表达，SNX27关联的归一化富集。分子质量以千道尔顿为单位。条形图、误差线和符号分别表示平均值、SEM 和单个数据点。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。图中所示图形的基础数据可以在 S1 数据中找到。aDLF， 酸性-阿斯普-列伊-菲;ESCPE-1，内体SNX-BAR分类复合物，用于促进出口1;ITC，等温滴定量热法;SNX1，排序连接蛋白-1;SNX2，排序连接蛋白-2;SNX5，排序连接蛋白-5;SNX6，排序连接蛋白-6;SNX27， 排序连接蛋白-27;WT，野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001601.g004

最后，我们使用AlphaFold2机器学习算法对SNX1和SNX2的adLF序列与SNX27的结合进行了建模[47，48]。我们总共生成了12个模型，在4个单独的adLF肽存在下，SNX27各有3个模型（图4F和S3A-S3C）。除了SNX27和肽序列之外，没有任何先前的输入，AlphaFold2产生了非常高的SNX27 FERM结构域置信度模型。值得注意的是，在所有12种模型中，aDLF肽与SNX27 F3亚结构域特异性相关，靠近通过诱变鉴定的基本表面（图4F）。仔细观察发现，在8个模型中，核心D[L/I]F残基采用基本相同的结合结构，疏水性[L/I]F侧链插入疏水袋中并与SNX27 I467、F469、Y490和V500相互作用，酸性Asp侧链被互补的基本SNX27残基R437包围， R438、K439 和 R498（图 4F）。为了进一步验证模型，我们将I467，Y490和V500突变为Lys，所有这些都破坏了SNX27与ESCPE-1的相互作用（图4G）。总之，这些模型是完全一致的，并且强烈支持SNX27-肽相互作用的诱变数据。

SNX27与ESCPE-1的关联将货物检索与促进细胞表面回收相结合

为了确定SNX27与ESCPE-1关联的功能意义，我们首先转染了SNX27敲除HeLa细胞系，其构建体编码为GFP标记的野生型SNX27或ESCPE-1结合有缺陷的突变体GFP-SNX27（R498D）（图5A）。对它们的相对亚细胞分布的分析确定它们各自与EEA1和SNX6阳性内体相关（图5B）。以前，我们确定，通过与GLUT1的细胞质面向尾部的PDZbm结合，SNX27-Retromer复合物用于从溶酶体介导的降解中检索内化的GLUT1（[13]，见图1A）。因此，我们进行了一系列救援实验，以量化SNX27依赖性从溶酶体介导的降解中检索内化GLUT1，使用SNX17-检索的α-5整合素作为阴性对照（图5C）[15]。在SNX27敲除HeLa细胞中，GLUT1在用环己酰亚胺处理8小时后显示出增强的降解速率，这些数据与SNX27表达的丧失一致，导致从溶酶体降解命运中检索转运蛋白的能力降低（图5C）。该表型通过重新表达野生型GFP标记的SNX27获救（图5C）。有趣的是，GFP-SNX27（R498D）的表达，一种未能与ESCPE-1结合但保留与逆转录蛋白结合的突变体（图4D和4E），也完全挽救了从溶酶体降解中检索GLUT1（图5C）。因此，SNX27-Retromer与ESCPE-1复合物的偶联对于从溶酶体降解中检索GLUT1不是必需的。

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图 5. SNX27：SNX27 货物的内体-质膜回收需要 ESCPE-1 相互作用。

（A） 代表性免疫印迹显示瞬时表达的 GFP-SNX27 和 GFP-SNX27（R498D） 之间的相似表达水平。（B）用GFP-SNX27或GFP-SNX27（R498D）瞬时转染的SNX27 KO HeLa细胞的代表性图像。此外，转染后48小时，细胞被固定并免疫染色内体标志物EEA1和SNX6。放大视图的白色框显示为框内。在n = 3个独立实验中，用于共定位分析的细胞数为60 GFP-SNX27和60 GFP-SNX27 R498D细胞。使用双尾不成对t检验比较皮尔逊系数值;对于 EEA1 P = 0.2971，SNX6 P = 0.0506。（C）用GFP-SNX27或GFP-SNX27（R498D）突变体瞬时转染的亲本HeLa细胞或SNX27 KO HeLa细胞中的降解测定。此外，转染后48小时，将细胞与10μg/ ml环己酰亚胺孵育，并按照指示在不同的时间点裂解。使用Odyssey软件从n = 3个独立实验中测量内源性GLUT1和ITGA5的能带强度。将8小时时的GLUT1和ITGA5水平与0小时时的相应水平进行比较。分析是使用双向方差分析和 Sidak 检验完成的。GLUT1： P = 0.0735 （HeLa）， 0.0068 （KO）， 0.9997 （+GFP-SNX27）， 0.9975 （+GFP-R498D）.ITGA5：P = 0.1151（HeLa），0.9820（KO），0.9999（+GFP-SNX27）和0.6899（+GFP-R498D）。（D）分析用GFP-SNX27或GFP-SNX27（R498D）突变体瞬时转染的亲本HeLa细胞或SNX27 KO HeLa细胞中GLUT1和ITGA5的表面水平。此外，转染后48小时，对细胞进行表面生物素化，然后进行基于链霉亲和素的免疫异构化。免疫异构体被印迹GLUT1，并使用Odyssey软件从n = 4个独立实验中测量条带强度，并使用单因子方差分析和Dunnett检验与亲本HeLa的水平进行比较。GLUT1：P = 0.0134（KO 对 HeLa），0.9587（+GFP-SNX27 对 HeLa），0.0163（+GFP-SNX27 R498D 对 HeLa）。对ITGA5的免疫异构体进行了印迹，并使用Odyssey软件从n = 3个独立实验中测量了条带强度，并使用单因素方差分析和Dunnett检验与亲本HeLa的水平进行了比较。ITGA5：P = 0.5616（KO 对 HeLa），0.0733（+GFP-SNX27 对 HeLa），0.2354（+GFP-SNX27 R498D 对 HeLa）。（E）亲本Hela细胞的代表性图像，SNX27 KO HeLa细胞瞬时转染GFP-SNX27或GFP-SNX27（R498D）。此外，在转染后48小时，对细胞进行固定和免疫染色，以检测货物GLUT1，内体标志物VPS35和晚期内体/溶酶体标志物LAMP1。在n = 4中，每种条件总共定量了60个细胞。使用单因子方差分析和邓内特检验将皮尔逊系数值与亲本HeLa的值进行比较。LAMP1 共定位的值为 P < 0.0001（亲本对 KO）、0.0001（亲本对 +WT）、0.1084（亲本对 +R498D）、<0.0001（+WT 对 KO）和 0.0692（+WT 对 +R498D）。VPS35 共定位的值为 P < 0.0001（亲本对 KO）、0.0029（亲本对 +WT）、0.0001（亲本对 +R498D）、<0.0001（+WT 对 KO）和 0.6346（+WT 对 +R498D）。比例尺，25 μm（显微照片）和5 μm（放大图像）。分子质量以千道尔顿为单位。条形图、误差线和符号分别表示平均值、SEM 和单个数据点。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，ns = 不显著。图中所示图形的基础数据可以在 S1 数据中找到。ESCPE-1，内体SNX-BAR分类复合物，用于促进出口1;KO，淘汰赛;SNX6，排序连接蛋白-6;SNX27， 排序连接蛋白-27;WT，野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001601.g005

接下来，我们转向研究GLUT1回收回细胞表面的推广。在这里，我们利用受限细胞表面生物素化来量化细胞表面GLUT1的量[13]。与对照HeLa细胞相比，SNX27敲除HeLa细胞显示出GLUT1细胞表面丰度降低，这是内化GLUT1在溶酶体降解中分类错误的结果（图5D）。同样，该表型通过GFP-SNX27的表达获救（图5D）[13]。相反，GFP-SNX27（R498D）的表达未能挽救GLUT1的细胞表面水平（图5D），这与SNX27与ESCPE-1的关联一致，需要促进内化GLUT1的细胞表面回收。重要的是，GFP-SNX27（R498D）表现出与野生型SNX27无法区分的内体定位（图5B），与无法促进GLUT1的内体到质膜的再循环一致，不是由于内体定位的丧失引起的。此外，对GFP-SNX27（R498D）救援细胞中GLUT1稳态分布的共聚焦分析证实，GLUT1是从溶酶体降解命运中检索到的，如与LAMP1标记的溶酶体的共定位减少所示（图5E）。然而，与野生型GFP-SNX27的救援不同，其中GLUT1在细胞表面富集，GFP-SNX27（R498D）救援中的GLUT1显示出细胞内点的水平增加，并且未能重新填充细胞表面，暗示转运蛋白被困在内体隔室中（图5E），其精确性质需要进一步研究。总之，这些数据与SNX27通过其PDZ域介导的与货物和Retromer的关联从退化命运中协调货物检索一致，而SNX27 FERM域介导与ESCPE-1的关联以促进基于管状的质膜回收。

ESCPE-1与SNX27的关联将货物检索与促进细胞表面回收相结合

为了完成SNX27偶联与ESCPE-1的机理解剖，我们使用先前表征的双SNX1和SNX2敲除HeLa细胞系[49]来生成表达GFP-SNX1或GFP-SNX1（D45K，D87K）的慢病毒转导稳定系（图6A）。当在接近内源性水平表达时，每个嵌合体都显示出与EEA1和SNX6标记的内体的不可区分的关联（图6B）。与从溶酶体降解中检索GLUT1不需要ESCPE-1一致，用环己酰亚胺处理8小时后，亲本HeLa细胞，SNX1 / SNX2敲除细胞以及GFP-SNX1和GFP-SNX1（D45K，D87K）救援线之间的内化GLUT1降解速率相同（图6C）。相比之下，限制细胞表面生物素化的定量确定，与亲本HeLa细胞相比，SNX1 / SNX2双敲除HeLa细胞显示出GLUT1的细胞表面丰度降低，这与内化GLUT1的回收缺陷一致（图6D）。虽然GFP-SNX1的再表达挽救了GLUT1的细胞表面水平，但GFP-SNX1（D45K，D87K）突变体的表达，在SNX27关联中存在缺陷（图3F），未能挽救GLUT1的细胞表面回收（图6D）。最后，对GLUT1稳态分布的共聚焦分析表明，与亲本细胞相比，葡萄糖转运蛋白在SNX1 / SNX2双敲除HeLa细胞中的Retromer修饰内体中富集（图6E），与GFP-SNX27ΔFERM救援一致（见图1C）。GFP-SNX1的再表达部分挽救了该区室中GLUT1的细胞表面递送，而GFP-SNX1（D45K，D87K）的表达显示GLUT1与Retromer修饰的内体的共定位增加（图6E）。综上所述，这些数据提供了一个独立的验证，即ESCPE-1与SNX27的FERM结构域的关联是促进从溶酶体降解中回收的货物的基于管状的内体出口和细胞表面回收所必需的。

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图 6. ESCPE-1 与 SNX27 的相互作用是 GLUT1 的内体到质膜回收所必需的。

（A）代表性蛋白质印迹显示SNX1 / 2KO细胞中稳定转染的GFP-SNX1和GFP-SNX1（KK）之间的相似表达水平。SNX1条带强度从n = 3开始测量并归一化为肌动蛋白。使用双尾不成对 t 检验进行分析。（B）SNX1/2 KO HeLa细胞系的代表性图像稳定地转染GFP-SNX1或GFP-SNX1（KK）。细胞固定并免疫染色内体标志物EEA1和SNX6。放大视图的白色框显示为框内。在n = 3个独立实验中，用于共定位分析的细胞数为50个GFP-SNX1和50个GFP-SNX1（KK）细胞。使用双尾不成对t检验比较皮尔逊系数值;对于 EEA1 P = 0.5971，SNX6 P = 0.6459。（C）亲本HeLa细胞或SNX1 / 2 KO HeLa细胞中的降解测定，这些细胞被GFP-SNX1或GFP-SNX1（KK）突变体稳定地转染。将细胞与10μg/ ml环己酰亚胺孵育，并按照指示在不同的时间点裂解。使用Odyssey软件从n = 3个独立实验中测量内源性GLUT1和ITGA5的能带强度。将8小时时的GLUT1和ITGA5水平与0小时时的相应水平进行比较。分析是使用双向方差分析和 Sidak 检验完成的。GLUT1：P = 0.6796（HeLa），0.9768（KO），0.8430（+GFP-SNX1）和0.2665（+GFP-KK）。ITGA5：P = 0.2247（HeLa），0.7892（KO），0.9196（+GFP-SNX1）和0.9930（+GFP-KK）。（D）分析用GFP-SNX1或GFP-SNX1（KK）突变体稳定转染的亲本HeLa细胞或SNX1 / 2 KO HeLa细胞中GLUT1和ITGA5的表面水平。对细胞进行表面生物素化，然后进行基于链霉亲和素的免疫分离。免疫异构体被印迹GLUT1，并使用Odyssey软件从n = 3个独立实验中测量条带强度，并使用单因子方差分析和Dunnett检验与亲本HeLa的水平进行比较。GLUT1：P = <0.0001（KO 对 HeLa），0.0878（+GFP-SNX1 对 HeLa），<0.0001（+GFP-KK 对 HeLa）。对ITGA5的免疫异构体进行了印迹，并使用Odyssey软件从n = 3个独立实验中测量了条带强度，并使用单因素方差分析和Dunnett检验与亲本HeLa的水平进行了比较。ITGA5：P = 0.2592（KO 对 HeLa），0.7185（+GFP-SNX1 对 HeLa），0.0653（+GFP-KK 对 HeLa）。（E）亲本Hela细胞的代表性图像，SNX1 / 2 KO HeLa细胞稳定地转染GFP-SNX1或GFP-SNX1（KK）。对货物GLUT1，内体标志物VPS35和晚期内体/溶酶体标志物LAMP1的细胞进行固定和免疫染色。在n = 3中，每种条件下总共定量了50个细胞。使用单因子方差分析和邓内特检验将皮尔逊系数值与亲本HeLa的值进行比较。LAMP1 共定位的值为 P = 0.0002（亲本对 KO）、0.7919（亲本对 +WT）、0.2225（亲本对 +KK）、0.0028（+WT 对 KO）和 0.6677（+WT 对 +KK）。VPS35 共定位的值为 <0.0001（亲本对 KO）、0.0020（亲本对 WT）、<0.0001（亲本对 +KK）、<0.0001（+WT 对 KO）和 0.2073（+WT 对 +KK）。比例尺，25 μm（显微照片）和5 μm（放大图像）。分子质量以千道尔顿为单位。条形图、误差线和符号分别表示平均值、SEM 和单个数据点。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，ns = 不显著。图中所示图形的基础数据可以在 S1 数据中找到。ESCPE-1，内体SNX-BAR分类复合物，用于促进出口1;KO，淘汰赛;SNX1，排序连接蛋白-1;SNX6，排序连接蛋白-6;SNX27， 排序连接蛋白-27;WT，野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001601.g006

SNX27的进化组件：反转器：ESCPE-1分选轴

我们使用系统发育分析来研究SNX27与Retromer和ESCPE-1复合物的结合的进化。SNX27的推断系统发育表明该基因祖先存在于丝状动物（即由纤维动物，鞭毛虫和后生动物组成的组）中（S4A图）。在SNX27中，SNX27 PDZ域中暴露的?发夹，由人类SNX27中的残基67至79编码，在Retromer的VPS26A（和VPS26B）亚基[14]中接合凹槽（图7A）。SNX27中存在等效序列，包括?发夹的关键残基Leu-67和Leu-74，存在于所有香肠动物（这是由后生动物和鞭毛虫组成的组;图7B和S4A）。SNX27结合所需的VPS26A中的关键残留物包括D44和L154，VPS26B中的等效残留物为D42和L152 [14]。VPS26A和VPS26B的推断系统发育表明，VPS26B祖先存在于真核生物中，脊椎动物中VPS26B的重复导致VPS26A的出现（图7B和S4B）。有趣的是，在VPS26B中，D44残基祖先存在于丝虫中，而L154残基在香肠中进化（图7B）。总之，这些分析表明，SNX27-Retromer关联首先出现在胆藻类和后生动物的最后一个共同祖先中。

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图 7. SNX27-逆转录因子和SNX27-ESCPE-1相互作用的分子演化。

（A） FL人SNX27的Alphafold2结构预测[44]。SNX27 PDZ域中暴露的?发夹环（67至79）的残留物（解释与Retromer的相互作用）以青色突出显示。那些解释与ESCPE-1（带正电荷的表面）相互作用的FERM域残留物以粉红色突出显示。我们的数据支持一个模型，其中SNX27和Retromer之间的相互作用是将PDZ货物从退化命运中检索所必需的。随后，SNX27和ESCPE-1之间的相互作用是PDZ货物的出口和内体到质膜回收所必需的。（B）包含多种系统发育分析结果的卡通表示，包括VPS5 / SNX1 / SNX2，SNX27和VPS26A / VPS26B（参见S4A-S4C图以获取详细的系统发育）。包含VPS5 / SNX1 / SNX2和VPS26A / VPS26B的基因家族存在于真核生物中：SNX1和SNX2以及VPS26A和VPS26B，由脊椎动物共同祖先的基因复制产生。SNX27存在于后生动物，鞭毛虫和丝状囊孢子虫中，但不存在于更远的亲缘关系的opisthokonts中，例如鱼孢子虫或真菌;因此，它可能出现在丝状体的共同祖先中。VPS26中的残留物D44（VPS26B，智人）在Filazoa中被发现，为VPS26和SNX27之间的结合相互作用奠定了基础。L154 （VPS26B， H.智人）可能与PDZ环和关键相互作用残基（67至97 L67，L74，SNX27，H）一起出现在祖先的香肠动物中。智人），这表明SNX27-Retromer相互作用已经存在于后生动物和鞭毛虫的共同祖先中。FERM 域的关键残留物：R437、R498 和 K501 （SNX27， H.智人）在祖先的后生动物中是可识别的。第一个adLF基序（SNX1）是在cnidarians和bilaterians的共同祖先中获得的，以及构成SNX27中FERM结构域一部分的残基K495和K496，可能表明SNX27：ESCPE-1结合已经进化到这个时候，如果不是更早的话在后生动物进化期间。有趣的是，第一个adLF基序似乎不存在于placazoan或ctenophoran序列中（尽管存在R437，R498和K501残基），这可能反映了这些组中基序的继发性损失。第二个adLF基序仅存在于脊椎动物中。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001601.g007

SNX27 和 ESCPE-1 之间的关联取决于 SNX1 和 SXN2 中结合基序的存在以及 SNX27 的 FERM 域。SNX1存在于真核生物中;从脊椎动物的共同祖先（图7B和S4C）中发生的单个祖先蛋白产生SNX1和SNX2的基因复制。H 的 FERM 域中需要几个基序。智人用于与ESCPE-1结合的SNX27似乎在后生动物的共同祖先中或在辐射早期进化（图7B）;许多关键残基（R437，R498和K501）存在于最后一个后生动物的共同祖先或桫椤和双侧动物（K495和K496）分化之前。对于SNX1，第一个adLF基序可能已经存在于最后一个后生动物的共同祖先中：它存在于双侧和Porifera（海绵）的序列中，但在cnidarians，placazoans和ctenophorans中不存在，这可能代表基序的次要损失。至于第二个adLF基序，这存在于所有脊椎动物中。因此，该分析表明，SNX27：ESCPE-1相互作用是在早期后生动物进化过程中SNX27-Retromer链接之后进化而来的。

讨论

在这里，结合生化、结构和细胞分析，我们已经确定ESCPE-1冗余SNX1和SNX2亚基中的ADLF基序与SNX27-Retromer组件中SNX27的FERM域直接相关。对内体货物分选的研究表明，这种关联对于促进ESCPE-1依赖性肾小管卵泡细胞表面内化跨膜蛋白的再循环是必要的。我们的数据表明，ESCPE-1介导的再循环随后发生或与SNX27-逆转录体依赖性从溶酶体降解中检索同时发生。基于先前的研究[12-14]，这些数据共同将SNX27：Retromer：ESCPE-1组件识别确定为动态内体涂层复合物，它将序列依赖性货物识别与膜重塑相结合，以促进形成货物浓缩运输载体以进行货物回收。此外，我们已经开始描述Retromer的功能多样化，因为它已经从与最初在酵母[50]中发现的SNX-BAR同系物Vps5和Vps17的紧密关联发展到ESCPE-1在后动物及其亲戚中的更短暂的参与，至少部分通过SNX27货物适配器介导。

目前，我们提出以下模型来描述SNX27：Retromer：ESCPE-1涂层复合物在货物检索和回收环境中的功能连接。SNX27认可了含有功能性SNX27 PDZbm的新内细胞载体，与PI（3）P富集的早期内小体相关，这些相互作用共同可以稳定SNX27的内体居住[45]。随着内体的成熟，SNX27通过VPS26A（或VPS26B）与SNX27 PDZ结构域的直接关联与Retromer结合。这些相互作用是相互稳定的，从而锁定了货物关联（[14，29]）：这种组合对于从溶酶体退化命运中取回货物至关重要[13]。逆向体二聚体化和逆向体弓的形成[9，10，33]可能有助于SNX27和货物聚集，从而形成检索子域并引发弱膜曲率[51]。这些事件通过逆转录体介导的WASH复合物招募和支链丝状肌动蛋白的局部生产得到支持[34，35]。另一种辅助蛋白ANKRD50可能有助于稳定SNX27：Retromer：WASH组装的形成[52]。对于这个新兴的“芽”，ESCPE-1通过识别3-磷酸肌醇和膜曲率[41，53，54]以及本研究中描述的与SNX27的直接结合来招募。ESCPE-1停留和局部浓度的定时增加提供了移交机制，以确保捕获和浓缩的货物进入成型管状轮廓和随后的运输承运人。持续的局部WASH介导的肌动蛋白聚合和运动蛋白的募集促进了肾小管成熟和裂变[55-57]（图8）。额外的货物进入可以通过ESCPE-1的直接识别来实现，但机制尚待描述[18，19]。与其他涂层复合物的组装[58]一样，SNX27：Retromer：ESCPE-1涂层的关联是由一系列低亲和力相互作用驱动的，这些相互作用唤起了对检查点的考虑，以监测通路进展的保真度。重要的是要指出，这种模式肯定是过度简化的，许多关键问题仍未得到解答。尤其是，在ANKRD50存在的情况下，这种涂层复合物是否可以通过与膜相关的重构SNX27：Retromer：ESCPE-1的冷冻电子断层扫描来可视化。

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图 8. 用于 SNX27 货物内体分拣的 2 步模型。

（A）PDZ货物内体分选示意图。SNX27通过其PDZ域识别具有进入内体系统的PDZbm的货物。（B） SNX27与Retromer的结合有助于从溶酶体降解路径中检索货物。（C） 一旦货物被取回，SNX27 FERM就会接合SNX1和SNX2的氨基末端，介意将SNX27货物纳入ESCPE-1小管状载体。（D）这种机制导致SNX27货物进入离开内体并直接或间接运输到细胞表面的载体。ESCPE-1，内体SNX-BAR分类复合物，用于促进出口1;PDZbm，PDZ结合基序;SNX1，排序连接蛋白-1;SNX2，排序连接蛋白-2;SNX27， 排序连接蛋白-27;WASH，Wiskott-Aldrich综合征蛋白和SCAR同系物。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001601.g008

SNX1和SNX2的氨基端扩展的重要性以前没有被考虑过。虽然我们已经确定它们构成了与SNX27相互作用的主要位点，但很容易推测它们可以协调更广泛的蛋白质 - 蛋白质相互作用。有趣的是，这些非结构化的氨基末端可能延伸到超过30nm的长度，并且可以允许ESCPE-1低聚组件捕获外围因子，以微调调节管成熟和切割。这类似于内吞细胞环状细胞皮层的组织，其中几种辅助蛋白从核心的clathrin晶格突出到细胞质中，以便在内吞细胞囊泡形成期间使内吞膜的调节功能[59]。

除了介导辅助蛋白的募集外，有证据表明这些氨基末端延伸可能在SNX-BAR二聚体的组装和膜靶向中发挥作用。事实上，除了SNX1和SNX2之外，SNX4、SNX7、SNX8和SNX30都具有不同长度和未知功能的非结构化氨基端扩展。SNX8同系物Mvp1的低复杂度区域似乎以胞质四聚体形式稳定可溶性Mvp1，其中PX和BAR结构域被掩盖并且无法靶向膜[60]。氨基末端的释放释放了Mvp1的功能性二聚体，促进了它们的膜关联和功能[60]。探索类似的机制是否也调节ESCPE-1在内体循环期间靶向哺乳动物细胞中的内体网络将是很有趣的。

SNX27货物分拣的一个重要方面是通过翻译后修改进行调节。核心羧基末端PDZbm内残基的磷酸化会对SNX27的关联产生负面影响，但极小PDZbm之前的残基磷酸化可以显着增强对SNX27 PDZ结构域的亲和力[29]。β2AR是货物尾部磷酸化调节SNX27亲和力和随后的内体分选的一个特征鲜明的例子[29，61]。此外，Ser-51中SNX27的磷酸化改变了其PDZbm结合口袋的构象，降低了对货物蛋白的亲和力，从而抑制了内体分选[62]，VPS26B中的Ser-302和Ser-304磷酸化可以调节SNX27关联[63]。同样，ESCPE-1功能可以通过磷酸化来调节;在这种情况下，SNX5的Ser-226经历磷酸化，这减少了SNX1和SNX2的二聚化并减少了内体循环[64]。因此，一个有趣的问题涉及SNX27：ESCPE-1交互是否可以通过翻译后修改来编排。我们在这里已经表明，SNX1和SNX2氨基末端DLF基序上游的一系列酸性残基有助于与SNX27的结合（图3F）。有趣的是，SNX1的adLF序列中的几个磷酸化位点已被注释，包括Ser-39，Ser-41和Ser-72，以及Thr-72[65-67]。人们很容易推测，ESCPE-1氨基末端的多次磷酸化可能调节其与SNX27-Retromer的关联，从而决定内体回收途径的时间和动力学。

最后，一个有趣的问题与Retromer的分子进化有关[68]。在酵母中，Retromer可以形成2个子复合物的稳定五聚体组装，即所谓的“货物选择性”Vps26：Vps35p：Vps29p异质体和膜重塑Vps5p和Vps17p异源二聚体[50]，后者被认为类似于ESCPE-1。因此，两个功能过程，序列依赖性货物识别和微管卵形运输载体的生物发生，被整合到一个单一的五聚体组件中[69]。在后生动物中，VPS26：VPS35：VPS29 Retromer和ESCPE-1似乎不再形成稳定的五聚体组件[70];相反，它们已经分化为2个独立的复合物，并因此扩大了它们的功能作用[18，19，49，70，71]。我们的系统发育分析表明，在后生动物中观察到的SNX27：Retromer：ESCPE-1组装以逐步的方式进化，SNX27-Retromer相互作用在后生动物起源之前进化，在后生动物和鞭毛虫的共同祖先中 - 单细胞和结肠鞭毛虫群是动物最接近的亲戚。SNX27：ESCPE-1相互作用进化较晚，在早期后生动物进化期间，可能在桫椤人和双侧动物分化之前。因此，在SNX27：Retromer：ESCPE-1途径中，从降解命运中检索货物似乎已经进化到直接耦合到ESCPE-1以促进基于小管卵泡的回收到细胞表面。因此，祖先五聚体逆转录体涂层复合物的分化似乎已经发生，以适应后生动物中内膜系统不断扩大的复杂性[72]。后生动物逆转录蛋白与SNX27结合的能力以及ESCPE-1通过螺旋环螺旋区域直接结合货物的能力[18，19]，这些特征在酵母中未观察到，极大地扩展了后生动物中序列依赖性内体检索和再循环的能力。事实上，人们很容易推测，SNX27：Retromer：ESCPE-1轴的可塑性增加，以及存在额外的与Retromer无关的途径[1]，使后动物内体网络能够适应不断发展的多样性和数量进行序列依赖性分选，导致货物可以参与与不同膜室接口的回收行程数量的增加。剖析这些分选复合物和途径如何被整合和调节，例如，通过翻译后修饰，在后生动物内体网络内形成序列依赖性货物分拣将是一个重大挑战。

总体而言，在定义SNX27-Retromer与ESCPE-1关联的机制基础时，我们为数百种内化含PDZbm的受体，通道，转运蛋白，酶和粘附分子的内体分类提供了新的功能见解，用于细胞表面的再填充[13]。这种增加的分子理解为序列依赖性内体分选在细胞过程中的作用提供了新的见解，从极性的建立和营养物质的吸收到突触功能和癌细胞转移在健康和疾病中[40]。

材料和方法

抗体

本研究中使用的抗体是小鼠单克隆抗体GFP（克隆7.1和13.1;11814460001;罗氏）（WB为1：2，000），LAMP1（克隆H4A3，AB2296838;DSHB） （IF 1：200）， SNX1 （克隆 51/SNX1; 611482;BD） （WB 为 1：1，000，IF 为 1：200），SNX2（克隆 13/SNX2;5345661;BD） （WB 为 1：1，000，IF 为 1：200），SNX6（克隆 d-5，365965;圣克鲁斯生物技术）（WB为1：1，000，IF为1：200），SNX27（ab77799，Abcam）（WB为1：1，000，IF为1：200），β肌动蛋白（A1978;Sigma-Aldrich） （WB为1：2，000），ITGA5（610633，BD）（WB为1：1，000），VPS29（克隆d-1，398874;圣克鲁斯生物技术）（WB为1：200）;兔单克隆抗体： EEA1 （C45B10;Cell Signaling Technology） （IF 1：200）， VPS35 （EPR11501（B）; 157220;Abcam） （WB 为 1：1，000），GLUT1 （ab115730，Abcam） （WB 为 1：1，000，IF 为 1：200）;兔多克隆抗体： GFP （GTX20290;GeneTex） （WB 1：2，000）， VPS26A （23892;Abcam） （WB 为 1：1，000），VPS35 （97545;Abcam） （WB 为 1：1，000，IF 为 1：200），VPS29 （98929;Abcam） （WB为1：100）;和山羊多克隆抗体VPS35（10099;Abcam） （IF 为 1：200）。

细胞培养和转染

HeLa和HEK-293T细胞系来自ATCC。身份验证来自 ATCC。细胞在补充有10%（v / v）FCS（Sigma-Aldrich）和青霉素/链霉素（Gibco）的DMEM（Sigma-Aldrich）中生长并在标准条件下生长。FuGENE HD（Promega）根据制造商的说明用于DNA的瞬时转染。环己酰亚胺用于防止蛋白质合成的上调。在这种情况下，环己酰亚胺（C7698;Sigma-Aldrich）在FuGENE转染后48小时以10μg/ ml加入细胞中，以指示的时间点。为了产生CRISPR-Cas9 SNX27敲除HeLa细胞，将HeLa细胞转染为pX330质粒，编码gRNA对抗目的基因以及表达嘌呤霉素的质粒。然后将细胞置于嘌呤霉素选择24小时。对合并的细胞群进行裂解和蛋白质印迹以确认敲除。本研究中使用的VPS35敲除克隆细胞系之前已对其进行表征[71]。对于基于GFP的免疫沉淀，使用聚乙烯亚胺（Sigma-Aldrich）转染GFP构建体HEK293T细胞，并允许表达48小时。

免疫沉淀和定量免疫印迹分析

对于蛋白质印迹，用1%（v / v）Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物在PBS中裂解细胞。使用BCA测定试剂盒（赛默飞世尔科技）测定蛋白质浓度，并在NuPAGE 4%至12%预制凝胶（Invitrogen）上分辨等量。在聚偏二氟乙烯膜上进行印迹（Immobilon-FL;EMD Millipore），然后使用Odyssey红外扫描系统（LI-COR Biosciences）进行检测。对于基于GFP的免疫沉淀，在转染后48小时在免疫沉淀缓冲液（50mM Tris-HCl，0.5%（v / v）NP-40和罗氏蛋白酶抑制剂混合物）中裂解HEK-293T细胞并进行GFP陷阱（ChromoTek）。免疫印迹使用标准程序进行。使用荧光标记的二抗在奥德赛红外扫描系统（LI-COR Biosciences）上进行检测。在使用Odyssey时，我们常规地进行蛋白质印迹分析，其中单个印迹同时与针对2种目标蛋白质（不同抗体种类）的抗体一起探测，然后可视化相应的二抗与不同的光谱染料偶联。

细胞表面蛋白的生物素化

对于表面生物素化实验，新鲜的Sulfo-NHS-SS生物素（Thermo Scientifics，#21217）以pH 7.8的pH溶解在冰冷的PBS中，终浓度为0.2mg / ml。在冰冷的PBS中洗涤细胞两次，并放置在冰上以减慢内吞途径。接下来，将细胞与生物素化试剂在4°C下孵育30分钟，然后在TBS中孵育10分钟以淬灭未结合的生物素。然后将细胞在裂解缓冲液中裂解，并进行基于链霉亲和素珠的亲和分离（GE Healthcare）。

免疫荧光染色

将细胞固定在4%（v / v）PFA中20分钟，并在PBS中洗涤3次，并用0.1%（v / v）Triton X-100透化。对于LAMP1染色，细胞通过浸没在液氮中20秒来透化。固定细胞在1%（w / v）BSA中阻断，并在一抗和相应的二抗（Alexa Fluor;赛默飞世尔科技）在1%（w / v）BSA。

图像采集和图像分析

用共聚焦激光扫描显微镜（SP5 AOBS;徕卡显微系统）连接到倒置落射荧光显微镜（DMI6000;赛默飞世尔科技）。A 63×1.4 NA油浸物镜（计划消色差BL;使用徕卡病理系统公司）和标准SP5系统采集软件和检测器。在室温下用光电倍增管探测器和由砷化镓制成的光阴极（徕卡显微系统）收集z堆叠的图像，用于收集光发射。使用Application Suite AF软件（版本2.7.3.9723;徕卡显微系统公司），然后使用Volocity 6.3软件（PerkinElmer）进行分析。

统计数据和再现性

所有定量的蛋白质印迹均为至少3个独立实验的平均值。使用Prism 7（GraphPad软件）进行统计分析。图形表示均值和 SEM 对于所有统计检验，P < 0.05 被认为是显著的，并用星号表示。

用于重组蛋白生产的分子生物学和克隆

对于细菌表达，全长小鼠SNX1与氨基末端His-tag（mSNX1佛罗里达州此后）被克隆到pMW172Kan载体[73]中，并且将含有残基1至139的截断的mSNX1构建体克隆到pGEX4T-2载体中，作为凝血酶可切割的氨基末端GST融合蛋白进行表达。编码全长小鼠 SNX27 （mSNX27） 的 DNA佛罗里达州以下）通过结扎非依赖性克隆（LIC）方法插入pMCSG7载体[74]。人体 SNX27 结构，hSNX27佛罗里达州， hSNX27费姆和 hSNX27佛罗里达州将单位点突变体R437D、K495D、K496D、R498D和K501D通过GenScript和密码子克隆到pET-28a载体中，该载体针对细菌蛋白表达进行了优化。在氨基末端His-tag和hSNX27编码序列之间插入另一个TEV切割位点。

蛋白表达和纯化

mSNX27和mSNX1的DNA构建体使用大肠杆菌BL21 CodonPlus（DE3）感受态细胞表达，而hSNX27构建体使用E表达。大肠杆菌BL21 （DE3） 感受态细胞。将细胞在37°C，180rpm的Ultra Yield烧瓶中培养，直到细胞密度达到OD600大约 0.8。然后用1mM IPTG诱导蛋白表达，并将细胞在18°C下孵育16至18小时。 对于SNX27，添加0.5mM IPTG用于诱导，以获得最佳的蛋白表达得率。为了收集细胞沉淀，通过10分钟离心（JLA 8.1转子）在6，000rpm，4°C下收获细胞。

对于SNX1纯化，将细胞沉淀重悬于含有50mM HEPES pH 7.5，200mM NaCl，5%甘油，1mM β-巯基乙醇（β-ME），1mM苯甲脒和10μg/ mL DNase I的裂解缓冲液中，溶解在含有10%甘油的PBS中。对于SNX27蛋白，将细胞沉淀重悬于含有20mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl，5%甘油，1mM β-ME，1%Triton X-100，1mM苯甲脒和10μg/ mL DNase I溶解在含有10%甘油的PBS中的裂解缓冲液中。通过高压均质（35 Kpsi）裂解细胞。使用JA 25.50转子（转速为19，000 rpm）在4°C下离心30分钟匀浆。将His标记的蛋白质匀浆的上清液加载到预先交换的TALON金属亲和树脂（Clontech）或Ni-Ni-nitrilotriacetic acid（NTA）树脂上，而GST融合蛋白质匀浆的上清液被加载到预先交换的谷胱甘肽琼脂糖珠（GE Healthcare）上，并在冷室中的轨道旋转器上孵育一小时。

将具有结合融合蛋白的亲和基质加载到空的玻璃色谱柱（Bio-Rad）中，用含有50 mM HEPES pH 7.5，200 mM NaCl，5%甘油，1mM β-ME或20mM Tris-HCl pH 8.0，200 mM NaCl，5%甘油，1mM β-ME的洗涤缓冲液洗涤。对于His标记的蛋白质纯化，分别加入10mM和300mM咪唑到洗涤和洗脱缓冲液中。为了收集GST标记的mSNX1构建体，在洗脱缓冲液中应用50mM还原谷胱甘肽进行洗脱。将不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂加入到洗脱的SNX1样品中，以减少其无序氨基末端区域的蛋白水解降解。

将含有洗脱蛋白质的馏分通过Amicon cc超滤装置（10 kDa或30 kDa分子质量截止值）（Millipore）浓缩至约5ml，并在台式离心机中以最大速度离心10分钟以除去任何沉淀材料，然后进行尺寸排除色谱（SEC）。对于 SEC，HiLoad 16/600 Superdex 200 （GE Healthcare） 色谱柱与在 SEC 缓冲液中洗脱的蛋白质一起使用，该缓冲液含有 50 mM HEPES pH 7.5、200 mM NaCl、5% 甘油、1 mM β-ME 或 20 mM Tris-HCl pH 8.0、100 mM NaCl、5% 甘油和 1 mM β-ME。为了检查纯化馏分的纯化和完整性，使用Bolt 12%双三凝胶和1x MES电泳缓冲液在190V下施加十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）25分钟。在SDS-PAGE之后，用Coomassie亮蓝R250溶液染色凝胶以进行可视化。适用于 hSNX27费姆使用与IEX缓冲液A预先平衡的单Q阴离子交换色谱柱应用额外的阴离子交换色谱（IEX）：20 mM Tris-HCl pH 8.0，100 mM NaCl，5%甘油，1 mM β-ME。进行从0%至40%IEX缓冲液B（20 mM Tris-HCl pH 8.0，500 mM NaCl，5%甘油，1 mM β-ME）的线性盐梯度。通常在含有200mM NaCl的缓冲液中洗脱的蛋白质，并通过SDS-PAGE分析收集的馏分。

等温滴定量热法

人类SNX1和SNX2肽序列由Genscript（美国）合成。为了获得中性pH，100mM Tris-HCl，pH 10.6的肽储备溶液用于将肽溶解至8mM的终浓度。肽为SNX135-51EAGDSDTEGEDIFTGAA， SNX135-51（D45K）EAGDSDTEGEKIFTGAA， SNX175-92NGIHEEQDQEPQDLFADA， SNX216-33TDFEDLEDGEDLFTSTVS， SNX216-33（低频/不锈钢）TDFEDLEDGESSSTSTVS 和 SNX262-82TEVVLDDDREDLFAEATEEVS.

所有微量热实验均在25°C下使用PEAQ ITC（Malvern）在50 mM HEPES（pH 7.5），200 mM NaCl，5%甘油和1mM β-ME（ITC缓冲液）中进行。在ITC实验之前，SEC使用相同的缓冲液纯化所有蛋白质，以避免缓冲液不匹配。为了测量SNX27与SNX1蛋白的结合，800μM的hsNX27费姆滴定至 20 μM GST-mSNX11-139或 His-SNX1佛罗里达州.为了将SNX1和SNX2肽与SNX27结合，将肽在ITC缓冲肽中稀释10倍至800μM，并滴定成20μM SNX27佛罗里达州含有相同1：10比例的肽缓冲液（100mM Tris-HCl，pH 10.6）的蛋白质。通过滴定800μM SNX1进行竞争性ITC实验75-92肽转化为20μM蛋白，具有2倍摩尔过量的SNX216-33肽与SNX27在冰上预孵育一小时。对于使用 SNX1 的 ITC 实验75-92针对 hSNX27 野生型和单位点突变体，600 μM SNX175-92将肽滴定成20μM hSNX27蛋白。

ITC实验用1次0.4μL的进样进行，然后进行一系列12次3.2μL的注射，每次注射180秒，搅拌速度为850rpm。通过积分观察到的峰值和通过减去稀释热的背景校正来获得相互作用的热交换。使用Malvern软件包将数据拟合和归一化到单位点绑定模型中来分析数据，得到热力学参数Kd、ΔH、ΔG 和 ?TΔS 用于所有结合实验。化学计量学最初经过改进，如果该值接近 1，则 N 正好设置为 1.0 进行计算。所有实验至少进行两次，以确保数据的可重复性。

AlphaFold预测肽与SNX27的结合

为了生成与SNX27 FERM结构域相关的SNX1和SNX2氨基末端肽的预测模型，我们使用在可自由访问的ColabFold管道中实现的AlphaFold2神经网络[47]。对于每个肽建模实验，人类SNX27a FERM结构域的序列（残基269至531;Q96L92）使用SNX1和SNX2的4个独立氨基端ADLF序列进行建模。我们模拟的特定肽是来自人SNX1（Q13596）的33至56和75至98的残基以及来自人SNX2（O60749）的14至37和60至83的残基。ColabFold使用默认设置执行，其中使用MMseqs2 [75]生成多个序列比对，并使用Amber [76]执行最终肽几何的结构松弛以生成每个肽3个模型。序列守恒被映射到带有Consurf的建模SNX27 FERM结构域结构上[77]。结构对齐和图像是用Pymol（美国薛定谔）生成的。

系统发育分析

使用NCBI蛋白 - 蛋白BLAST（具有默认参数）与所有非冗余GenBank CDS翻译+ PDB + SwissProt + PIR + PRF（不包括来自WGS项目的环境样品）鉴定同源蛋白，用于更广泛的物种（未对齐的序列数据与加入编号在S4图中可用）。对于ctenophore数据，我们使用Mnemiopsis基因组计划门户（MGP）门户[78-80]中的BLAST（具有默认参数）。使用MAFFT v7.480 [81]L-INS-I模式对齐序列，然后用于推断初始探索树以识别特定的重复项（使用LG + F + G模型的IQtree 2.1.4 [82]和1，000个超快引导）。在一系列分类群中鉴定出该基因的每个拷贝的直系物后，我们进行迭代树推断以确认paralogues并识别物种特异性重复事件。使用IQtree 2.1.4进行后续最大似然系统发育分析，并使用贝叶斯信息准则（BIC）选择最佳拟合模型，包括考虑位点速率异质性的模型（LG + C10 ...C60） [83]，经验氨基酸频率（+F），并使用伽马分布（+G）[84]或自由率模型（+R）[85，86]（具有10，000次超快速自举复制）来解释跨站点速率变化。根据BIC，最适合的模型是最终SNX1和SNX2树的LG + C30 + F + G（见S4图）和SNX27和VPS26的LG + C20 + F + G（S4图中的对齐和最大似然树）。

支持信息

Western blot showing the levels of GLUT1 in parental HeLa, VPS35 KO, and SNX27KO not transfected or transiently transfected with GFP-SNX27 WT, GFP-SNX27 Δ67–77, and GFP-SNX27 ΔFERM.

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S1 图 蛋白质印迹显示亲本HeLa、VPS35 KO和SNX27KO中GLUT1的水平，未转染或短暂转染GFP-SNX27 WT、GFP-SNX27 Δ67–77和GFP-SNX27 ΔFERM。

印迹代表了3种独立测定。分子质量以千道尔顿为单位。条形图、误差线和符号分别表示平均值、SEM 和单个数据点。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，ns = 不显著。图中所示图形的基础数据可以在 S1 数据中找到。KO，淘汰赛;SNX27， 排序连接蛋白-27;WT，野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001601.s001

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S2 图

(A）SNX1和SNX2的GFP标记的扩展氨基末端区域（NT）与HEK293T细胞中表达的SNX5和SNX6的GFP标记的短氨基末端区域的共免疫沉淀。将细胞裂解物置于基于GFP陷阱的免疫沉淀中，并将免疫沉淀物用于SNX27和GFP。印迹代表了3个独立的GFP陷阱。（B）在HEK293T细胞中表达的GFP标记的SNX2 WT或SNX2 KK（D27K，D72K）的共免疫沉淀。将细胞裂解物置于基于GFP陷阱的免疫沉淀中，并将免疫沉淀物用于SNX27，SNX6和GFP。印迹代表了4个独立的GFP陷阱。（C） 具有竞争力的 ITC SNX2 检测16-33和 mSNX27佛罗里达州预孕 SNX1 的 2 倍摩尔过量75-92肽显示结合被竞争的SNX1阻断75-92肽。分子质量以千道尔顿为单位。条形图、误差线和符号分别表示平均值、SEM 和单个数据点。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，ns = 不显著。图中所示图形的基础数据可以在 S1 数据中找到。SNX1，排序连接蛋白-1;SNX5，排序连接蛋白-5;SNX6，排序连接蛋白-6;SNX27， 排序连接蛋白-27;WT，野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001601.s002

（TIF）

S3 图

(A） SNX27表面按序列守恒着色。预计这些肽将与SNX27中高度保守的口袋结合。（二、三）如方法中所述，总共生成了12个SNX27模型，每个模型由SNX27的3个模型组成，每个模型与来自人类SNX1和SNX2的4个adLF序列相关联。B 以 Cα 迹线表示形式显示所有 12 个模型的叠加，并用 pLDDT 评分着色。pLDDT 是介于 0（最低置信度）和 100（最高置信度）之间的每残留置信度分数。大多数SNX27结构显示出非常高的pLDDT分数和具有非常高精度的叠加。C仅显示了核心adLF序列具有相同结合构象的最佳8个模型。aDLF， 酸性-阿斯普-列伊-菲;pLDDT，预测本地距离差测试;SNX1，排序连接蛋白-1;SNX2，排序连接蛋白-2;SNX27，排序连接蛋白-27。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001601.s003

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S4 图

（A） SNX27、（B） VPS26A/B 和 （C） VPS5/SNX1/SNX2 的最大似然系统发育。（A） SNX27（绿色）与 SNX17（红色）用作外组，代表跨越 Filozoa。与位于437，495，496，498和501位置的智人一致的氨基酸写在物种名称旁边。（B） VPS26A、VPS26B 和 VPS26C，VPS26C 为红色，VPS26B 为绿色;在祖先脊椎动物中发生的重复事件是蓝色的。有趣的是，我们还在拟南芥和栎树的植物中发现了VPS26B的另一种独立重复。（C）SNX1序列横跨丘动物，脊椎动物的重复为蓝色。氨基末端的adLF基序数量写在物种名称旁边。在BIC确定的最佳拟合模型下推断系统发育。分支支持值是基于 10，000 个超快引导的百分比。aDLF， 酸性-阿斯普-列伊-菲;BIC，贝叶斯信息准则;SNX1，排序连接蛋白-1;SNX27，排序连接蛋白-27。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001601.s004

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S1 表。 ITC 绑定参数摘要。

ITC，等温滴定量热法。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001601.s005

（英文）

S1 原始图像。 纸张中所示印迹的未处理图像。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001601.s006

（英文）

S1 数据。 图1B，1C，2C，3A，3C，3F，4D，4G，5A，5B，5C，5D，5E，6A，6B，6C，6D和6E以及S1A和S2B的数值数据。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001601.s007

（XLSX）

确认

我们感谢布里斯托尔大学沃尔夫森生物成像设施的支持。

引用

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