厦门杂志期刊论文发表 -使用Cygnus的智能手机多重微毛细血管诊断：使用登革热患者样本开发和评估快速血清型特异性NS1检测

莎拉

·海伦需要 ，西林特拉·西里维索特 ，苏菲·耶古伊奇，塔纳潘·普罗穆尔，普拉西特卢安加拉姆，查察万斯里萨瓦特，卡诺克万·斯里拉克萨，万尼·林皮蒂库尔，杜姆隆·迈里昂，普里达·马拉西特，帕尼萨迪阿维鲁特南 ，春亚·普提亨特 ，亚历山大·丹尼尔·爱德华兹

出版日期： 2022年04月07日

抽象

登革热病毒 （DENV） 感染（包括 DENV 血清分型）的实验室诊断需要熟练的劳动力和设备精良的环境。DENV NS1 侧流快速检测 （LFT） 简单，但缺乏识别血清型的能力。仍然需要一种简单、经济、护理点的血清分型设备。我们提出了一种重力驱动的，与智能手机兼容的微流体装置，该装置使用微毛细管膜（MCF）对登革热病毒NS1进行多重血清型特异性免疫测定检测。一种名为Cygnus的新型设备具有可堆叠设计，可在40分钟内并行分析1至12个样品。开发了一种三明治酶免疫测定法，用于特异性检测一个60μl血浆样品中所有四种DENV血清型的NS1。该测试旨在弥合快速LFT和实验室微孔板ELISA在灵敏度，可用性，可访问性和速度方面的差距。Cygnus NS1测定使用来自205名DENV感染患者的回顾性未稀释血浆样本以及50名发热性疾病阴性对照进行评估。与金标准RT-PCR相比，Cygnus的临床敏感性总体为82%（DENV1-4分别为78%，78%，80%和76%），与内部血清分型NS1微孔板ELISA相当（82%对83%），但优于商业NS1-LFT（82%对74%）。天鹅座装置的特异性为86%，低于NS1-微孔板ELISA和NS1-LFT（分别为100%和98%）。对于天鹅座阳性样本，DENV血清型DENV2-4的鉴定与RT-PCR的鉴定结果匹配100%，但对于DENV1毛细血管，观察到假阳性，这表明需要改进DENV1捕获抗体以提高特异性。Cygnus的总体性能与NS1-微孔板ELISA（κ = 0.68，95%CI 0.58–0.77）和NS1-LFT（κ = 0.71，95%CI 0.63–0.80）基本一致。虽然需要进一步改进DENV-1 NS1检测，但多路复用和快速处理时间的优势，该Cygnus设备可以提供床旁NS1抗原检测，包括血清分型，以便及时诊断DENV，以进行流行病监测和爆发预测。

作者简介

诊断重要的蚊媒登革热病毒（DENV）需要实验室检测以检测病毒基因组（RT-PCR），病毒NS1蛋白（免疫测定）或DENV特异性抗体。目前的床旁 NS1 检测无法鉴别血清型，因此实验室检查对于确定存在 4 种 DENV 血清型中的哪一种仍然至关重要。在这里，我们以便携式微流体形式提供快速血清型特异性NS1测试。扁平塑料带内的十个平行 0.2 mm 管执行多重 NS1 免疫测定。一个简单的盒通过重力顺序通过微毛细管输送样品和试剂。通过堆叠盒式磁带，可以在40分钟内执行12次测试，结果由智能手机记录。当用205名患者和50个对照样本进行评估时，与传统的RT-PCR相比，DENV1至4的敏感性分别为78%，78%，80%和76%，DENV2-4的特异性为100%。DENV1由于捕获抗体的交叉反应性而显示出一些假阳性。使用MCF-Cygnus器件的血清分型性能显示出与血清分型-NS1微孔板ELISA的实质性一致性。因此，这些简单便携的微毛细血管免疫测定设备可以支持登革热NS1血清分型，对患者附近的诊断、实时流行病监测和疫情绘图具有潜在益处。

引文： 需要SH，Sirivisoot S，Jegouic S，Prommool T，Luangaram P，Srisawat C等人（2022）使用Cygnus的智能手机多路复用微毛细血管诊断：开发和评估登革热患者样本的快速血清型特异性NS1检测。PLoS Negl Trop Dis 16（4）：e0010266。https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010266

编辑 器： Brett M. Forshey，美国国土安全部，美国

收到： 四月 9， 2021;接受： 二月 18， 2022;发表： 四月 7， 2022

版权所有： ? 2022 需求等。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据均在稿件及其支持信息文件中。

资金： 本研究由牛顿基金，英国文化协会机构链接IL35237556（ADE，PA和SS），惠康信托基金会，探路者奖204388 / Z / 16 / Z（ADE）和EPSRC EP / L013983 / 1（ADE）和EP / R022410 / 1（ADE和SHN）以及EP / S010807 / 1（ADE）资助。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

相互竞争的利益： 我已阅读该期刊的政策，本手稿的作者有以下竞争利益：ADE是专利申请保护本研究中测试的新型微流体装置方面的发明者之一，并且是Capillary Film Technology Ltd的董事和股东，该公司持有该专利申请的商业许可： WO2016012778“具有内部亲水涂层的毛细管测定装置”AD爱德华兹，NM Reis。

介绍

登革热病毒（DENV）是黄病毒属的成员，它与西尼罗河病毒，寨卡病毒，黄热病病毒和日本脑炎病毒共享一些典型的RNA基因组。据估计，每年有近4亿例登革热病例，在热带和亚热带国家流行，由蚊子有效传播，主要是伊蚊属[1]。DENV基因组包含三种结构蛋白（衣壳（C），前膜蛋白（prM）和包膜（E））和七种非结构蛋白（NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4b和NS5）[2]。在病毒在感染宿主中复制期间，可溶性NS1蛋白以高浓度分泌到循环中，并在较小程度上分泌唾液和尿液[3，4，5]。来自4种血清型DENV的NS1被用作急性原发性和继发性感染的常见诊断标志物（发病后长达9天）[6]。基于快速免疫层析（在护理点使用的侧流快速检测）和微孔板ELISA（在诊断实验室中），例如Panbio，Standard Diagnostics和Bio-Rad，许多商业DENV NS1测试可用。其总体敏感性和特异性分别为45%~80%和93-100%[7，8，9，10]。两种方法仅使用少量样品（血液/血清/血浆）（50-100μL）。在比较处理时间时，一步法夹层式酶标ELISA可以在120分钟内提供结果，而快速测试则需要不到30分钟。尽管快速检测速度更快，但与微孔板ELISA相比，侧流免疫测定具有更高的检测限，因此只能检测更高水平的病毒蛋白。在抗原水平接近检测极限时，侧流快速检测的视觉解释可能含糊不清。然而，侧流测试读数仪越来越多地用于改善结果解释[11]。微孔板ELISA避免了视觉解释，因为这是用酶标仪常规测量的，但需要实验室操作。因此，需要使用最少的实验室设备进行更高灵敏度的快速测试。

目前临床使用的DENV NS1免疫测定中的抗体对可检测所有四种血清型的NS1，具有不同的分析灵敏度。然而，通过仔细选择与保守表位结合的抗体克隆，已经开发出血清型选择性免疫测定，包括微孔板ELISA[12，13，14]。原型侧流免疫测定可以区分每种DENV血清型，并且还可以区分DENV和寨卡病毒，而无需交叉反应性[15]，为登革热血清分型快速检测提供了潜力，尽管发现来自寨卡病毒的NS1的血浆浓度要低得多，使得侧流不太可能对寨卡病毒的诊断足够敏感。该快速检测小组显示对每种DENV NS1血清型的敏感性和特异性范围为76-100%，说明了血清型特异性抗体对确定血浆NS1血清型的潜力。

当患者出现由不同DENV血清型引起的继发感染时，由于抗体依赖性增强（ADE），他们可能更容易发生更严重的疾病形式——登革出血热（DHF）和登革热休克综合征（DSS）[16]。如果重度登革热患者没有得到适当的治疗或立即住院治疗，则可能会死亡。血清型感染对患者结局的影响尚不完全清楚，因为血清分型主要用于监测。然而，继发感染的血清型可能提示疾病结局[17]。如果可以准确地绘制出这一点，则血清型特异性快速检测有可能预后为重症疾病，但是，对并发或继发感染的了解目前可以更好地预测严重疾病[18]。快速了解感染DENV血清型对早期干预、疾病监测和流行病控制具有潜在价值。为了鉴定DENV的4种血清型，目前进行了常规病毒分离和表征以及RT-PCR方法[19，20，21]。在过去10年中，微孔板DENV血清分型-NS1 ELISA也被开发为内部检测，但对某些血清型的预测仍然不准确[12，13，14]。与RT-PCR相比，我们最近改进的血清分型-NS1微孔板ELISA（plus）在登革热患者标本的四种血清型鉴定中显示出完美的一致性[22]，这表明免疫测定方法能够进行准确的血清分型。理想的DENV诊断工具需要尽可能敏感和特异性，能够实时解释，无需投资实验室仪器即可轻松执行，制造成本低廉，并且能够对DENV血清型进行分类。实时监测登革热血清型感染也有助于流行病学、疾病监测和公共卫生战略，以控制地方性感染，并将干预措施（例如蚊虫控制）针对流行病暴发[23]。

如果能够实现经济、稳健和可重复的制造，微流体技术可以制造微型紧凑型生物测定设备，为世界各地的医疗保健系统带来许多好处。微流控和芯片实验室设备已被开发用于筛选，检测或监测肿瘤细胞，并测量和检测人类生物样品中的各种蛋白质和核酸生物标志物[24，25，26]。微毛细管膜（MCF）已被证明可用于小型化三明治ELISA以检测临床样本中的生物标志物[27，28，29，30，31]。MCF由氟化乙烯丙烯（FEP）熔融挤出生产，由包含十个平行微毛细管的扁平带组成。这种含氟聚合物塑料薄膜具有折射率匹配的光学清晰度，允许在智能手机相机上轻松观察和简单地量化生物测定输出（颜色或荧光）[29，32]。在之前的研究中，MCF设备已经开发，使用基于ELISA的测定格式，在单重和多重测定条中，这些试纸条由压力驱动（使用注射器递送样品和试剂），并由平板扫描仪[27，28]或智能手机相机解释[29]。对于只需要样品加单一试剂的更简单的测定，MCF试纸条使用毛细管作用，通过用亲水聚合物涂覆内表面来实现[33];该亲水性聚合物包衣与用于免疫测定的抗体包衣相容[31，32，33]。最近，我们通过使用重力将样品流动，然后通过微毛细管依次洗涤和检测试剂，进一步降低了MCF免疫测定设备的复杂性[34]。

先前关于蛋白质生物标志物检测的工作已经确定，使用MCF装置的免疫测定与微孔板ELISA一样进行[30，31]，但仅限于加刺模拟样品。在这里，我们开发了病毒抗原的多重MCF免疫测定法，并首次用人类临床患者样本评估了测试的分析性能。我们描述了三明治免疫测定从微孔板ELISA转移到MCF试纸，以开发一种用于检测血清型特异性DENV NS1的简单快速测定方法。我们使用重力驱动的MCF设备来检测和区分205个未稀释的患者血浆样本中的多重血清型特异性DENV NS1蛋白以及50种其他发热性疾病对照组。MCF测定使用称为Cygnus的新型支架进行，该支架简化了MCF的样品和试剂添加。Cygnus设备可以堆叠在微孔板兼容的间距中，以测试多达12个样品（即120个单独的免疫测定），并且显示堆叠的Cygnus装置允许在MCF中使用易于使用和灵活的快速多重免疫测定。

方法

道德声明

这项研究得到了泰国玛希隆大学西里拉医院医学院Siriraj机构审查委员会伦理委员会的批准（EC 593/2561）。在每位患者入组之前，已获得父母或监护人的书面正式同意。

临床样本

本研究使用了2002年至2012年期间在泰国孔敬和宋卡医院从两个登革热临床队列的儿科患者（2-14岁）中收集的回顾性临床标本。从发烧开始到退热和出院，每天在不同时间点连续收集来自个体入组患者的标本，以及2周，2个月和6个月的随访。为了确定登革热免疫状态，通过IgM/IgG捕获微孔板ELISA[35]对每位患者的配对标本（包括入院日的急性发热期和2周恢复期样本）进行抗DENV IgM和IgG抗体分析，并进行了一些修改。在恢复期样本中给予IgM升高滴度（血清转换）和IgM /IgG滴度比高于1.8的患者中，对原发感染进行了解释。相反，在达到IgG滴度升高且IgM / IgG滴度比小于1.8的患者中发现继发感染。在入院急性标本中，通过多重RT-PCR确定DENV感染血清型[36]。RT-PCR阴性且成对标本无血清转换的患者被确定为其他发热性疾病或非登革热病例（S1A图）。根据WHO 1997指南，登革热感染的临床严重程度分为轻度登革热（DF）至重度登革出血热（DHF）[37]。DF的特征是发热的临床症状，以及至少两个其他临床表现，如出血表现和血小板减少症。DHF包括血浆渗漏的证据，如果不能及时干预，则会导致休克和死亡。本研究中使用的样本量基于85%的预期敏感性和特异性计算，可接受的误差幅度为±10%。置信水平设置为95%（即alpha = 0.05）[38]。从登革热临床库中随机选取25例回顾性DENV感染急性血浆，包括4种血清型。它们包括50个DENV1样品，55个DENV2样品，50个DENV3样品和50个DENV4样品。大多数样本被确定为继发感染（98%;4个原发性和201个继发性）。DF / DHF患者的数量为84/121（S1B图）。来自其他发热性疾病患者的另外50个样本也作为非登革热标本纳入本研究。对样品进行回顾性处理，并储存在-70°C直至使用。

用于DENV血清分型的多重RT-PCR

DENV血清分型如前所述[36]。简而言之，从患者样本中分离出的DENV RNA被反向转录以产生第一链cDNA。使用泛登革热引物和四对血清型特异性引物通过PCR扩增。DENV血清型基于通过琼脂糖凝胶电泳分离时的RT-PCR产物分子大小。将DENV血清型与DENV 1、2、3和4标准进行比较（分别为506、346、196和143 bp）。

DENV 血清分型-NS1 微孔板酶联免疫吸附测定

血清分型NS1微孔板ELISA是按照所述开发的[22]。简而言之，将每个血浆样品（1：5稀释）加入到预先包被泛血清型捕获抗体（2E11）的四个孔中。将生物素化的血清型特异性抗体分别添加到每个孔中。在某些情况下，使用抗体对2E11 / 5F3（对于DENV1和DENV3亚复合物）的额外测定用于提高测定的灵敏度[22]。当测定OD读数超过阴性血浆对照值的两倍时，对阳性样品进行分类。DENV血清型预测基于给予最高OD读数的抗体对。

登革热NS1银快速检测

SD BIOLINE登革热银快速测试（美国佛罗里达州阿博特）被用作具有代表性的快速侧流测试（LFT）。样品按照制造商的说明进行处理。简而言之，将100μL血浆加入样品孔中并孵育15-30分钟。阳性病例通过眼睛进行评估，并通过测试和对照线的外观进行解释。

基于 MCF 的天鹅座装置 ELISA

用表1中描述的血清型特异性捕获抗体（图1A和1B）包被MCF材料的重复毛细血管。示例处理步骤和详细方法在支持信息（S1 文本）中进行了描述。简而言之，所有步骤都使用60μL体积的样品，试剂和洗涤缓冲液。将未稀释的患者血浆加入孔中。将Cygnus装置中的MCF试纸浸入孔中（图1C-1E）并孵育10分钟。进行测试的研究人员不知道患者血浆的血清型。随后洗涤，生物素化的泛血清型检测抗体，链霉亲和素碱性磷酸酶和AttoPhos被添加到新鲜孔中，随后将MCF浸入每种试剂中（图1F）。虹吸管设计通过重力使试剂通过毛细管膜移动。患者样品一次分批处理6-12个样品（图1D）。

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图 1. 使用可堆叠的 Cygnus 设备进行多重血清型特异性 NS1 微毛细血管免疫测定。

（A）0.5公里微毛细管胶卷。（B）单个毛细管在切割成47毫米试纸条之前可以批量涂覆。重复的毛细血管涂有血清型特异性抗体。阴性毛细血管未涂覆，阳性毛细血管涂覆NS1抗原。（C）单重力驱动盒，MCF充满血液。（D）一块12个天鹅座盒夹在一起，MCF的末端位于条形井中。（E）一块天鹅座盒式磁带与定制条形井连接。（F）测定步骤的流程图。（G）将单个抗原（25 ng / mL）加入未稀释的肝素化血浆中。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010266.g001

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表 1. 天鹅座测试中使用的DENV NS1抗体。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010266.t001

表面等离子体共振 （SPR）

使用Biacore X100（美国GE Healthcare）使用表面等离子体共振技术分析了NS1蛋白与抗NS1抗体之间的亲和力和动力学结合[22]。传感器图和亲和常数 （KD） 由 Biacore X100 软件计算得出。从每种DENV血清型进行三次复制。

图像和数据分析

转换后的底物的荧光被智能手机或数码相机捕获，以前发现同样适合量化测定信号[39]。图像由ImageJ软件（NIH，MD，USA）分为红色，绿色和蓝色（RGB）通道。仅分析绿色通道强度，其中荧光信号最大，记录每个毛细管的最大强度，然后归一化为5 mM参考条的平均强度，并报告为相对荧光强度（RFI）。因此，RFI值为1表示测试样品的酶荧光信号强度等于5 mM荧光素。检测限（LOD）使用Y截距/斜率的3.3 x Std.误差计算，而定量限（LOQ）使用Y截距/斜率的10 x Std误差值。用于检测这些测定中NS1靶标的LOD和LOQ是从重组NS1的五个复制校准曲线计算的，这些序列在已知浓度范围内飙升到纯负血浆中，使用Prism版本8.0计算测定性能值（Graph Pad软件，CA，USA）。

涂层MCF试纸的重复毛细管显示平均RFI高于临界值，则标记为DENV阳性血清型。在一种以上的血清型强度大于阈值的情况下，报告了信号最强的血清型。通过接收器工作特性（ROC）分析计算每种DENV血清型的截止值，并使用最高Youden指数进行选择，该指数具有敏感性和特异性（图2）。使用标准RT-PCR方法评估已开发的测试性能。用于 RT-PCR 的 DENV 血清型、血清分型 NS1 微孔板 ELISA、天鹅座设备和快速 LFT 的样本分类详见支持信息（S1 数据）。使用棱镜计算灵敏度和特异性，如本文所述[40]。使用棱镜计算置信区间[41]。2种测定之间的评分者之间的一致性或协议由Cohen's kappa（Graph Pad Software，Inc.https://www.graphpad.com/quickcalcs/kappa1/）评估。通过使用Mc Nemar的确切测试（Graphpad Software，Inc.https://www.graphpad.com/quickcalcs/McNemar1.cfm）成对比较NS1测试的性能。

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图 2. 通过Cygnus设备检测登革热NS1的标准曲线，以及登革热患者样本的示例。

将指示血清型的重组NS1的连续稀释液加入（A）4%BSA或（B）血浆中，并在Cygnus设备中用多重MCF测试，n = 4，误差条表示±SEM。通过RT-PCR测定的登革热血清型，常规微孔板ELISA和天鹅座显示在每个样品下方。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010266.g002

结果

开发用于快速DENV NS1微毛细管免疫测定的可堆叠设备

在这里，我们开发了一种新的可堆叠盒系统- 称为Cygnus，因为毛细管试纸条类似于天鹅的脖子“啜饮”试剂 - 用于保存MCF试纸，通过驱动顺序样品，洗涤和检测试剂纯粹通过重力流过毛细血管来简化操作。相比之下，以前的研究使用注射器来吸出样品/洗涤/试剂。S2图中提供了完整的逐步操作图，流体力学描述见[34]。

使用Cygnus设备针对MCF免疫测定优化了血清型特异性抗体组合和测定条件。为了允许血清型特异性多重检测，捕获抗体必须是血清型特异性的，然后用泛血清型检测抗体检测靶标。所选血清型特异性单克隆抗体（表1）对DENV NS1具有高度特异性，对其他黄病毒无交叉反应性，对NS1分子具有很强的亲和力（S1表）。我们使用这些抗体的血清分型-NS1微孔板ELISA先前已被证明适用于微孔板中的血清型特异性NS1检测[13，22]，但具有不同的配置，使用泛血清型抗体克隆进行捕获。因此，我们预计Cygnus MCF设备和微孔板ELISA之间的分析和临床性能存在一些差异，这是由于不同的三明治测定抗体配置引起的。

优化后，通过使用不同浓度的NS1对每种血清型进行标准曲线，并加入缓冲液和肝素化血浆（图2A和2B）。分析了测定的LOD和LOQ。将NS1掺入缓冲液或阴性肝素化血浆样本的LOD均低于3ng / mL（表2）。测试使用佳能S120 Powershot数码相机（约200英镑）进行成像，并与两款代表不同价位的智能手机索尼Xperia L1（约150英镑）和iPhone 6S（约400英镑）并行成像。同样，患者样本的测定均由数码相机和智能手机成像，但为了在后续分析中保持一致，选择了使用佳能S120 Powershot数码相机拍摄的图像。每张图像从一批中捕获多达12个MCF试纸的结果，在一张数码照片中记录120个免疫测定数据点。

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表 2. 通过天鹅座装置中MCF检测和定量DENV NS1的限值。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010266.t002

天鹅座在登革热NS1检测中的性能

在Cygnus设备中评估了所有205个DENV样本和对照组，并捕获了图像。分析了每个样品获得的四种DENV血清型的平均RFI值。通过ROC分析和Youden指数，鉴定了每种血清型的临界值，以保持高敏感性和特异性（图3）。最终获得了每种血清型的阳性和阴性病例数。

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图 3. 通过MCF在天鹅座设备中检测DENV1-4 NS1的ROC曲线分析。

根据整组样品与对照组的PCR测定，绘制了每对NS1毛细管的接收器操作员特征图。下表概述了具有该临床样本集的快速多重免疫测定设备的关键性能指标。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010266.g003

与标准RT-PCR方法相比，使用255个临床样本（DENV为205个，非DENV为50个）评估了Cygnus设备的性能。通过选择截止值，Cygnus设备实现了82%的灵敏度，86%的特异性和82.7%的准确率。天鹅座装置和RT-PCR之间的一致性很弱（κ = 0.55）（表3）。此外，本研究中还包括另外两种不同的NS1测试形式，DENV血清分型-NS1微孔板ELISA和商业NS1侧流快速测试（NS1-LFT），以使用相同的临床样本组将其性能与Cygnus设备进行比较（表3）。发现Cygnus平台的临床敏感性与NS1微孔板ELISA没有差异（82%对83%，P = 0.839），但明显高于NS1-LFT敏感性（82%对73.7%，P<0.001）。相比之下，Cygnus装置的特异性（86%）明显低于NS1-微孔板ELISA的特异性（86%对100%，P = 0.016），但对NS1-LFT不显着（86%对98%，P = 0.070）（图4）。结果表明，与LFT相比，微孔板ELISA和天鹅座具有同等的高灵敏度。相比之下，与微孔板ELISA和LFT相比，Cygnus的特异性较低。这是由于50个非DENV样本中有7个通过Cygnus设备对DENV1给出了假阳性。从高到低，微孔板ELISA，Cygnus和LFT的标准RT-PCR的准确率分别为86.3%，82.7%和78.4%，表明Cygnus的性能低于NS1-微孔板ELISA，但优于NS1-LFT。NS1-Cygnus和NS1-ELISA（κ = 0.68，95%CI 0.58–0.77）或NS1-LTF（κ = 0.71，95%CI 0.63–0.80）之间的kappa值分析表明，这些NS1测定结果中度一致（表4）。与NS1测试的比较不同，当比较RT-PCR时，在NS1-Cygnus（κ = 0.55）或NS1-微孔板ELISA（κ = 0.66）或NS1-LFT（κ = 0.51）中发现低水平的一致性。

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图 4. 三种NS1检测方法的检测性能比较。

比较MCF（天鹅座），ELISA（5对）和LFT的敏感性（A）和特异性（B）。误差线显示每种测定的灵敏度和特异性的95%置信区间。性能的差异是使用McNemar的确切测试成对比较的。由于多重比较，统计显著性的阈值根据 Bonferroni 校正调整为 < 0.017。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010266.g004

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表 3. 与标准 RT-PCR 相比，NS1 Cygnus、NS1-微孔板 ELISA 和 NS1-LFT 的 DENV 诊断的总体表现。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010266.t003

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表 4. NS1-Cygnus性能与NS1-ELISA或NS1-LFT在临床标本中检测NS1的相关性。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010266.t004

天鹅座在DENV血清分型中的性能

除了检测DENV NS1之外，快速NS1-Cygnus设备还设计用于区分DENV血清型，这是商业NS1快速测试无法实现的。将NS1-Cygnus对205个DENV和50个非DENV样品的血清型鉴定与标准RT-PCR的血清型鉴定进行比较（表5）。天鹅座检测DENV1-4 NS1的敏感性分别为78%、78%、80%和76%。对于那些被天鹅座阳性的患者，血清型的鉴定与DENV2-4中的RT-PCR方法100%一致。DENV1阳性样本与RT-PCR的血清型一致性为84.78%（39/46），而另外8份样本（DENV2的3份，DENV3的3份和DENV4的2份）分类不正确（表5）。此外，天鹅座测试给出了DENV1的7个假阳性结果，导致MCF-Cygnus的特异性降低（86%）（表3和表5）。这些结果表明，DENV1特异性测定需要以天鹅座形式进一步优化。使用不同抗体构型的NS1微孔板ELISA显示与RT-PCR结果100%血清型一致（表6）。NS1微孔板ELISA对DENV1（92%对78%）和DENV3（88%对80%）的敏感性也高于Cygnus器件。然而，与NS1-ELISA相比，Cygnus对DENV2的敏感性更高（78.18%对76.36%），对DENV4的敏感性（76%）相同。这可能是由于与DENV1和DENV3交叉反应的额外抗体对的结果，结合以增强微孔板ELISA测定灵敏度，由于毛细管数量的限制，Cygnus装置中未包括该抗体。微孔板中使用的这种额外的抗体对将所需的测定板数量从4个增加到5个。结果表明，尽管Cygnus设备可以检测NS1抗原并鉴定多重试纸中的DENV血清型，但在医院或公共卫生部门进行现场评估之前，它仍然需要进一步开发以优化其性能。

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表 5. NS1-Cygnus在255个临床样本中与RT-PCR的血清分型性能进行比较。

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表 6. NS1-微孔板ELISA在255个临床样本中与RT-PCR相比的血清分型性能。

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讨论

在这项研究中，Cygnus设备被开发用于通过病毒NS1抗原检测以及DENV血清型鉴定同时检测血浆中的DENV感染，而无需使用复杂的实验室设备并且获得结果的时间很短。Cygnus设备的性能是用登革热临床样品与内部血清分型-NS1微孔板ELISA进行比较的，后者为DENV NS1检测和血清分型提供了类似的特征。与标准RT-PCR方法相比，无论血清型如何，两种测定对NS1检测的敏感性相似，NS1微孔板ELISA和NS1-Cygnus分别为83%和82%。与 NS1-Cygnus 检测到的 RT-PCR 相比，对 DENV1-4 血清型的敏感性为 76% 至 80%，其中 DENV3 最敏感。虽然微孔板NS1-ELISA的灵敏度范围从76%到92%，其中DENV1最敏感。（表 6）。总体而言，NS1-微孔板ELISA的特异性高于NS1-Cygnus设备，为100%对86%。

针对每种血清型的抗 NS1 单克隆抗体以及泛血清型单克隆抗体是基于微毛细管的测定开发的关键试剂，并且基于对直接 NS1 包被的 ELISA 和低 K 的高反应性进行选择。D从表面等离子体共振（S1表）。Cygnus试验的低特异性是分配给DENV1的假阳性样本的结果，尽管使用了相同的血清型特异性单克隆抗体，但在NS1微孔板ELISA中没有发现假阳性样本。这可以通过抗体对的不同配置来解释，这些配置设计用于在两种测定之间捕获和检测。在微孔板ELISA中，抗体配对的灵活性更高，但代价是每种血清型测定都需要单独的板和样品添加。泛血清型抗体（克隆2E11）可用作捕获或检测抗体，但用作捕获抗体具有更好的性能，可能是因为它可以更有效地与所有血清型的NS1之间共享的表位结合[22]。相比之下，Cygnus平台，血清型特异性mAb必须用作捕获抗体，以便在每个微毛细管试纸条内进行多重检测，而需要泛血清型mAb（克隆1F11）来检测所有血清型。这可能会导致非特异性绑定来解释这些误报情况。此外，在测定优化以产生最灵敏的测定后，使用比其他血清型（40μg/ ml）更高浓度的DENV1抗体（60μg/ ml）来涂覆微毛细管条，这也可能会增加背景信号导致假阳性的可能性。在NS1微孔板ELISA中注意到，仅该克隆（84B）对DENV1的敏感性也较差（31/50;62%），但是通过使用DENV1/3亚复合抗体对（克隆5F3）进一步添加微孔板测定，灵敏度提高到92%（表6和S1数据）。从这些证据线中，我们认为天鹅座检测DENV NS1和血清分型的概念是有希望的，尽管DENV1特异性测定需要改进。

目前有许多商业检测试剂盒可以通过微孔板ELISA或快速免疫层析LFT来诊断DENV NS1，例如SD Bioline登革热二重奏（美国阿莱尔），Platelia NS1 Ag（法国Bio-Rad）或Panbio登革热早期ELISA（Alere）。其敏感性和特异性差异很大（70-99%）[42，43]。然而，对于登革热流行地区出现的虫媒病毒（包括寨卡病毒）之间的血清学交叉反应性仍存在一些担忧。一项研究在65例寨卡病毒感染患者中使用了SD Bioline登革热Duo和Platelia Dengue NS1 Ag试剂盒，但没有一项研究显示阳性结果[44]，这表明登革热NS1测定的特异性很高。然而，市售的登革热NS1检测试剂盒都无法区分DENV血清型。除了常规病毒分离和RT-PCR外，内部NS1微孔板ELISA还可用于鉴别血清型[12，13，14，22，45]。最近仅开发了一种用于DENV血清分型的NS1试纸快速试验原型，DENV1-4的灵敏度分别为76%、89%、100%和100%，DENV1-4的特异性分别为89%、98%、100%和96%[15]。

几项研究表明，NS1检测在原发感染中的敏感性高于发现更多假阴性样本的继发感染病例[46，47，48，49]。因此，在继发感染频繁的DENV流行地区，NS1检测性能往往较低。这可能是由于循环NS1产生的NS1免疫复合物（IC）和现有的抗NS1抗体[50，51，52]减少了游离NS1蛋白的量。在先前的研究[53，54，55]中探索的通过热或酸/碱方法解离NS1 IC可提高测定灵敏度。然而，我们的NS1-Cygnus设备和NS1微孔板ELISA的敏感性超过82%，尽管本研究中使用的患者血浆主要来自继发感染（98%）。这可能表明在两种测定中使用的所选抗NS1抗体对具有高结合能力，或者对两种免疫测定平台（微孔板和微毛细管）均具有高分析灵敏度。

关于Cygnus器件的开发过程，与先前研究中的扁平塑料毛细管膜ELISA不同[27，29，31]，Cygnus器件代表了一种改进且更易于获得的微流体免疫测定形式，通过涂覆亲水聚合物（PVOH），允许流体流动完全由重力驱动，而无需通过多注射器吸气器进行机械操作[31].如前所述，氟化乙烯丙烯（FEP）具有出色的光学透明度，其折射率等于水，使其适用于简单的荧光基板检测和智能手机相机直接记录结果[29]。所使用的不同相机在分析性能方面没有显着差异，证实了先前对相机进行微流控免疫测定检测的系统比较[39]。NS1 水平定量的成像处理目前是手动执行的。为了更好地接受天鹅座测试，这种分析应该是自动化的，类似于横向流动读数器。在这里，我们证明了这种概念验证测试可以使用简单且低成本的光学器件与智能手机摄像头进行成像，从而可以让智能手机嵌入式应用程序进行自动数字图像分析，同时对测试进行评分并以电子方式报告结果。

总之，我们证明了我们的Cygnus原型设备可能是一种有前途的工具，用于快速血清型特异性检测NS1，以诊断和监测临床样本中的登革热感染。由于其廉价的批量生产，便携性，速度和操作简单性，以及灵敏度，特异性和准确性与DENV2-4的微孔板ELISA非常接近，我们相信这些设备可用于全球范围内的监测和常规诊断，特别是在实验室基础设施（例如，微孔板ELISA读数器）有限的偏远地区。该设备可作为医院诊断实验室或现场的RT-PCR辅助测试。此外，它还提供了DENV血清分型信息和快速结果，这对实时登革热流行病学很有价值。

支持信息

用于验证的临床标本。

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S1 图 用于验证的临床标本。

（A）所选临床标本面板的示意图。（B）.登革热临床标本的特征。

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S2 图 逐步演示重力驱动的MCF免疫测定。

（A） 测定成分。（B）液体试剂可以通过滴管瓶添加。（C）多个天鹅座盒可以作为一个块移动，并且（D）微毛细管薄膜与定制的条带孔接口。（E）一旦孔中没有试剂，就可以取出盒，并且（F-G）用新的去条孔替换条形孔，并且（H）可以添加下一个试剂。

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S1 表。 本研究中使用的单克隆抗体的表面等离子体共振结果。

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（文档）

S2 表。 将255个样品的内部微孔板ELISA [22]的DENV NS1血清分型结果与RT-PCR进行比较。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010266.s004

（文档）

S1 数据。 通过天鹅座、微孔板 ELISA、RT-PCR 和 SD Bioline 侧流测量的 205 名患者的 NS1 和血清学结果。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010266.s005

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S1 文本。 天鹅座装置的制备和操作的详细方法。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010266.s006

（英文）

S1 STARD. STARD 清单。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010266.s007

（英文）

确认

临床队列由泰国NSTDA国家研究型大学倡议和研究主席赠款下的玛希隆大学高等教育委员会办公室提供支持。

我们衷心感谢Nattaya Tangthawornchaikul（国家科学技术发展局），Adisak Songjaeng，Arunee Mapralub，Supansa Pakdee，Chotika Kaewpuenk，Dararat Prayongkul和Oranicha Khamprapa（玛希隆大学Siriraj医院医学院）对登革热医院队列的贡献，其中登革热临床标本和数据库的收集用于本研究。我们同样非常感谢Watchara Kasinrerk（清迈大学）在生成登革热蛋白小鼠单克隆抗体面板方面的开创性贡献。

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