厦门杂志期刊论文发表-评估埃塞俄比亚吉马镇学校大院、家庭和露天市场土壤传播蠕虫生命阶段的环境污染

巴姆拉库·塔德格 ，泽莱克?梅科宁，丹尼尔·达纳，比祖瓦雷克·沙鲁，伊甸园，艾斯金迪尔·洛哈，雅科·韦尔韦，斯蒂恩·卡萨尔特，约翰尼?弗拉明克，米奥阿雅娜，布鲁诺·莱维克

出版日期： 2022年04月04日

抽象

背景

目前尚不清楚土壤传播蠕虫（STH;发生蛔虫，Trichuris，Necator和Ancylostoma）。因此，我们的目标是通过评估STH流行地区的环境污染来确定可能的感染源。

方法

我们首先进行了一系列实验室实验，旨在优化土壤应变浮选法，以检测和量化土壤中的蛔虫和三蛔虫卵，并在显微镜检查和qPCR检查后验证优化方法的诊断性能。在第二阶段，我们应用这种方法评估了从吉马镇（埃塞俄比亚）的10个学校大院、50个家庭和9个开放市场收集的399个环境样本中的STH污染水平。随后，我们在学校和家庭特征层面探索了环境污染与相应的STH流行病学之间的关联。最后，我们评估了学龄儿童对STH的知识，态度和实践（KAP）。

主要调查结果

我们的土壤应变浮法的分析灵敏度为每100克土壤50个卵，卵的回收率为36.0%（蛔虫）和8.0%（Trichuris）。用显微镜和qPCR对野外样品的分析揭示了8种具有医学重要性的不同蠕虫物种，包括但不限于人类STH。仅在学校一级，环境污染与任何STH感染的流行率之间存在显着关联。KAP表示对STH缺乏了解和认识。

结论/意义

我们优化的应变浮选方法具有适度的诊断性能，并显示蠕虫的生命阶段在环境中无处不在，这可能是由于学校和家庭的卫生设施较差，以及STH的KAP水平较差。需要进一步的研究才能更深入地了解这些生命阶段对传播的贡献。

作者简介

最近控制肠道蠕虫引起的发病率的策略主要集中在大规模的驱虫计划上，在此期间，药物被施用于高危人群。虽然这些大规模的驱虫计划成功地减轻了疾病负担，但在没有其他干预措施的情况下再次感染是不可避免的。尽管对于肠道蠕虫感染的传播方式已达成共识，但尚不清楚在流行社区中哪里可以找到传染性生命阶段的热点，这反过来又阻碍了预防（再）感染的干预措施的设计和验证。我们优化了一种实验室方法，以检测土壤样本中的生命阶段，并应用该方法检查吉马镇（埃塞俄比亚）学校大院、家庭和开放市场的土壤污染情况。最后，我们评估了学龄儿童的家庭特征，以及对肠道蠕虫的知识，态度和实践。一般而言，我们的研究结果表明（i）我们的实验室方法表现适中，（ii）环境中无处不在的生命阶段，（iii）学校和家庭的卫生设施水平差，以及（iv）对肠道蠕虫的知识，态度和实践水平较差。

引文： Tadege B，Mekonnen Z，Dana D，Sharew B，Dereje E，Loha E等人（2022）评估埃塞俄比亚吉马镇学校大院，家庭和开放市场土壤传播蠕虫生命阶段的环境污染。PLoS Negl Trop Dis 16（4）：e0010307。https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307

编辑 器： 迈克尔·邓普顿，伦敦帝国理工学院，英国

收到： 十月 27， 2021;接受： 三月 7， 2022;发表： 四月 4， 2022

版权所有： ? 2022 Tadege等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据均在稿件及其支持信息文件中。

资金： 该研究得到了VLIR-UOS网络大学网络（https://www.vliruos.be/en）的支持。BT在同一VLIR-UOS网络大学网络（https://www.vliruos.be/en）内获得了奖学金。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

相互竞争的利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。

介绍

土源蠕虫（STHs）是一组多样化的肠道蠕虫，包括巨型蛔虫（Ascaris lumbricoides），鞭虫（Trichuris trichiura）和钩虫（Necator americanus，Ancylostoma duodenale和Ancylostoma ceylanicum）[1]。尽管这些蠕虫物种之间存在明显的生物学差异[2];其传播的特征是相同的事件序列：（i）受感染的个体通过粪便将蠕虫卵排泄到土壤中;（ii）在最佳湿度和温度条件下，排出的卵子将发育成传染性蠕虫卵（A.腰椎和 T.崔基乌拉）/幼虫（钩虫）;（iii）最终通过口腔摄取（卵）或皮肤渗透（幼虫）发生，这些存在于土壤中的感染阶段[3]。

据估计，全球超过五分之一的世界人口感染了至少一种STH物种，导致估计总疾病负担为340万残疾调整生命年（DALYs）[4，5]。然而，STHs的传播和相关疾病负担主要发生在亚热带和热带国家，这些国家的气候最适合感染阶段的发展[6]，并且保持适当的个人卫生和缺乏卫生设施的挑战促进了传播。STH归因的发病率主要与中度至重度感染有关，并且不成比例地影响儿童和育龄妇女[7，8]，导致生长和认知发育受损、营养不良、贫血和缺课[9-12]。为了抗击STH可归因的疾病负担，世界卫生组织（世卫组织）推动了大规模的驱虫计划，其中定期向高危人群（例如学龄前儿童、学龄儿童、育龄妇女和STH感染风险较高的工人，如采茶者和矿工）施用驱虫药物（阿苯达唑和甲苯咪唑），最终目标是将中度至重度感染的患病率降至2%以下。 到2030年[13]。

尽管这些运动在降低全球STH可归因发病率方面取得了成功[14，15]，但在没有改善水、环境卫生、环境和个人卫生以及健康教育的情况下，再感染会持续存在[16-18]。特别是当蛔虫和Trichuris卵在环境中长时间保持活力时[19]。更一般地说，对STH卵/幼虫的环境污染知之甚少。虽然对如何传播性传播卫生存在共识，但目前尚不清楚在社区中哪里可以找到性传播感染的热点，这反过来又阻碍了水环境卫生和个人卫生以及健康教育干预措施的设计和验证。

事实上，报告环境污染的研究主要集中在动物性STH（例如弓形虫）上，最终目标是评估人畜共患STH传播的风险。这些研究是在人类STH并不总是对公共卫生构成威胁的国家进行的，如意大利[20]，土耳其[21]，波兰[22]和葡萄牙[23]。只有少数研究旨在深入了解人类性传播感染在流行环境中的潜在热点，如喀麦隆[24]、肯尼亚[25]、巴西[26]、尼泊尔[27]、印度尼西亚[28]和泰国[29]。在这些研究中，样本采集在家庭[25，29]、学校操场[24，30]、厕所[24，31]和市场[30]周围，每项研究都强调了STH卵/幼虫的存在（蛔虫：高达27%[27]，Trichuris：高达77.0%[29]，钩虫：高达27.5%的样本[30]]).此外，在这些研究中，已经应用了大量方法收集和分析土壤样本，这使得比较研究结果变得困难。例如，在不同深度（0-10 cm [32–34，37]）和不同时间点（旱季与雨季[28，29，33，34，42]）采集了不同量的土壤（30-500克[27，28，38，32-37]）和土壤类型（粘土与沙质和壤土[38，29，33，34，42]）。]).一般来说，土壤中STH卵/幼虫的检测和定量基于一系列步骤，这些步骤允许将STH卵/幼虫与土壤颗粒分离，例如土壤的应变和卵/幼虫的浮选。然而，在预处理（添加表面活性剂[25，44]或NaOH [45]），网孔尺寸（50-250μm;[21，33，35，46]），浮选液类型和密度（FS;氯化钠 [33]，锌4 [30]，蔗糖 [46]，钠3 [47] 和镁溶钙4 [48]），离心浮选液的离心力（1，000-2，500转[30，49，50]）和允许种蛋漂浮的时间（5-30分钟[37，44，47，51，52]）。一旦纯化，卵/幼虫大多通过显微镜检查进行检测和定量。仅在极少数情况下，才提取DNA并进行STH物种特异性核酸扩增试验（例如，PCR [53–55]和qPCR [56，57]）。这些基于DNA的测定不仅被认为更敏感，而且还允许区分不同的动物和人类钩虫物种[55]。除了这些方法上的明显差异之外，整个样本分析过程的诊断性能大多是未知的[58]，这进一步使结果的解释复杂化。

在本研究中，我们首先进行了一系列实验室实验，旨在优化内部土壤应变浮法，以检测和量化土壤中的蛔虫和Trichuris卵，并在显微镜和qPCR之后验证优化方法的诊断性能。在第二阶段，我们应用该方法评估了从埃塞俄比亚吉马镇（STH特有地区）的学校大院、家庭和开放市场收集的环境样本中的STH污染水平[59，60]。随后，我们在学校和家庭特征层面探索了环境污染与相应的STH流行病学之间的关联。最后，我们评估了学龄儿童对STH的知识，态度和实践（KAP）。

方法

道德声明

埃塞俄比亚吉马大学机构审查委员会批准了评估环境STH污染，儿童STH感染，家庭特征和KAP的方案（参考编号IHRPGD / 680和IHRPGD / 466 / 2020）。根据知情同意书，学校当局、教师、家长和儿童被告知研究的目的和程序，并给予足够的时间作出知情同意。已获得父母/监护人的书面知情同意。还获得了12岁以上儿童的额外书面同意。用英语编写了同意书，翻译成两种常用的当地语言（Afaan Oromo语和Amharic），并将一份副本交给了孩子的父母/监护人。只有那些愿意参加的儿童及其父母或监护人签署了书面知情同意书的儿童才被纳入研究。在文盲的情况下，拇指印被视为签名。

一种内部土壤过滤浮选方法的优化

在本研究中，我们选择优化和验证我们自己的土壤过滤浮选方法，基于已知的一般实验室程序，这些程序可以提高环境样品中STH生命阶段的纯化和浓度。图1提供了应用我们内部优化的应变浮选法检测和定量土壤样品中STH蛋的不同连续步骤的示意图。为了优化这种方法，我们分别进行了5个实验，在此期间我们通过显微镜测量了卵子的回收率，每个实验都建立在先前实验的结果之上。我们首先确定了FS和漂浮期，使蛔虫卵和Trichuris卵的回收率最大化（浮选实验）。随后，我们验证了是否可以通过改变离心力（离心力实验）和添加去垢剂（吐温实验）来进一步提高卵子的回收率，或者筛分土壤的量是否对卵子的回收率有影响（体积土壤实验）。最后，我们验证了是否可以在不影响卵子回收率的情况下进一步简化从浮选试管中回收鸡蛋的过程（过滤器实验）。对于这些尖峰实验中的每一个，我们都使用培养的猪蛔虫和Trichuris suis卵。这些卵是从成年A收集的。suum 和 T.苏伊斯，并在2%K中培养2铬2O7在室温下至少1.5个月发展到感染阶段。培养物在室温下储存在寄生虫学实验室（根特大学）。先前的使用通过在60°C下孵育1小时来中和它们。通过检查10倍20μL确定两种培养物的卵子浓度。实验中使用的土壤来自吉马镇，在150°C下灭菌30分钟。

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图 1. 优化的应变浮法检测和定量土壤中STH卵/幼虫的不同步骤。

优化的过滤浮选方法包括9个连续步骤，包括土壤样品的均质化（步骤1），筛分样品（步骤2），将筛分的土壤转移到50 mL管中（步骤3），将该试管在2，000g下离心5分钟（步骤4），弃去上清液，加水将沉淀液悬浮， 将悬浮液均匀地分成两个15 mL管，然后重复离心步骤（步骤5），丢弃上清液并向每个试管中加入浮选溶液（步骤6），将管以2，000g离心2分钟（步骤7）并将上清液放在PuriStrainer筛子上（步骤8），将鸡蛋从PuriStrainer筛转移到显微镜载玻片或2 mL管中进行显微镜或分子分析， 分别（步骤 9）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307.g001

浮选实验。

共24个15 mL试管填充不同的FS，包括8个10 mL NaCl（比重= 1.2）的试管，8个10 mL MgSO的试管4（比重，1.28）和8个10 mL锌溶胶管4（比重 = 1.35）。试管（重复）的数量不是基于正式的样本量计算，而是基于务实的考虑。共200个猪A养殖蛋。suum（100个鸡蛋）和T。将suis（100个卵子）加入每个试管中，然后涡旋管并随后以2，000g离心两分钟。随后，添加更多的FS以形成半月板，并在半月板顶部放置盖玻片，使卵漂浮。为了评估允许这些卵子漂浮在试管中的时间段的影响，我们在不同的时间点（5，10，15和30分钟）移除了盖玻片。对于每个时间点，我们执行了六次复制（每个FS两次复制）。此外，我们还评估了连续浮选的影响。为此，我们在取下第一个盖板后放置了第二个盖玻片，在取下第二个盖玻片后放置了第三个盖玻片。在放置下一个盖玻片之前，我们添加了FS以形成新的半月板。这2个额外的盖玻片中的每一个都放置了15分钟。将所有盖玻片放在显微镜载玻片上，并使用复合显微镜（100倍放大倍率）进行检查。记录了每个盖玻片的蛔虫和Trichuris卵的数量，导致每个STH物种总共有72个（= 3 FSs x 8管x 3个盖玻片）卵数。

离心力实验。

为了评估离心力对卵子回收的影响，我们确定了将浮选试管离心到1，000和2，000 g时卵子的回收率。为此，16个试管中装满了10 mL的ZnSO4（浮选实验得出的最佳FS）。共向ZnSO中添加了100只猪蛔虫和100个Trichuris卵4，然后将试管在1，000g（八管）或2，000g（八管）下离心两分钟。随后，更多的ZnSO4加入以形成半月板，并将第一个盖玻片放置在半月板上，使卵漂浮。30分钟后，立即将该盖玻片放在显微载玻片上。放置第二个和第三个盖玻片，并以15分钟的间隔移除（从浮选实验中得出的最佳检查策略）。将所有盖玻片放在显微载玻片上，并使用复合显微镜进行检查。记录了每个盖玻片的蛔虫和Trichuris卵的数量，导致每个STH物种总共有48个（= 1 FS x 2 x 离心力x 8管x 3个盖玻片）卵计数。

吐温实验的浓度。

为了评估洗涤剂对从土壤中回收鸡蛋的影响，我们确定了当ZnSO时鸡蛋的回收率。4确实包括洗涤剂。为此，16个试管中装满了10 mL的ZnSO4，带（八管）或不带（八管）吐温80（0.05%）。ZnSO中共添加了100个蛔虫和100个Trichuris卵4并混合，然后将试管在2，000g下离心两分钟（从离心力实验中得出的最佳检查策略）。随后，更多的ZnSO4加入以形成半月板，并将第一个盖玻片放置在半月板上，使卵漂浮。与离心实验一样，每个管检查三个盖玻片，总共产生48个卵子计数（2浓度的洗涤剂x 1 FS x 1 x 离心力x 8管x 3个盖玻片）。

土壤体积实验。

到目前为止，我们没有向管子中添加任何土壤。为了评估土壤体积对鸡蛋恢复的影响，我们评估了1 mL和3 mL应变土壤的鸡蛋回收率。首选体积而不是土壤质量，因为预计增加体积会影响ZnSO的密度4.选择三mL作为最大可能体积是基于三个方面，即100克土壤对应于6 mL的末端体积，进一步处理该体积将导致ZnSO比重的降低4（从1.35到1.21;对于三毫升，这是1.28）并且需要将处理过的土壤样品分成两个子样本（一个用于显微镜检查，一个用于qPCR）。共16个试管中装满了10 mL的ZnSO4并用一毫升（12管）或三毫升灭菌土壤（12管）。ZnSO共加入100只猪蛔虫和100枚Trichuris卵4并混合，之后将试管在2，000g下离心两分钟。随后，更多的ZnSO4加入以形成半月板，并将第一个盖玻片放置在半月板上，使卵漂浮。同样，与之前的实验一样，每个管检查了三个盖玻片（1圣30分钟盖玻片;2nd盖玻片在15分钟;和 3第三盖玻片在15分钟），导致总共72个卵子计数（2体积的土壤x 1 FS x 1 x 离心力x 12管x 3个盖玻片）。

过滤器实验。

从浮选实验中注意到，需要连续浮选才能最大限度地提高卵子回收率。由于这成为一个耗时的过程，因此我们验证了当内容（ZnSO）时是否获得了类似的恢复率4和鸡蛋）的离心试管在小筛子上过滤，之后滤液被转移到微观载玻片上。应用此策略将消除在一小时内对盖玻片的重复检查 （1圣30分钟后取出盖玻片，2nd45 分钟 = （30 分钟 + 15 分钟）和 3 分钟时的盖玻片第三在一小时（30 分钟 + 15 分钟 + 15 分钟））。为此，16个试管中装满了10 mL的ZnSO4总共加入100个蛔虫和100个Trichuris卵并混合。将所有试管在2，000g下离心两分钟。一半的管子按照先前实验中所述进行处理（以30分钟，15分钟和15分钟的间隔进行三次盖玻片）。管的另一半的内容物通过pluriStrainer（网孔尺寸20μm）过滤。用自来水洗涤筛子，然后使用微量移液器吸出滤液并转移到显微载玻片上。最后，在载玻片上放置四个盖玻片（这是覆盖整个吸气口所必需的），并计算了蛔虫和Trichuris的数量。

优化应变-浮选法的诊断性能.

在广泛的鸡蛋浓度范围内（每100克土壤10，25，50和100个鸡蛋）评估了优化方法的诊断性能（检测至少一个鸡蛋并估计100克土壤中鸡蛋浓度/污染的能力）。将100克灭菌土壤与1L自来水和5 mL 0.05%吐温80混合。然后，加入100个猪蛔虫卵和100个Trichuris卵。将悬浮液进一步均质化15分钟，使用磁力搅拌器板以50rpm的速度匀浆。随后，将悬浮液在由四个筛子组成的塔上应变，该筛子具有不同的网孔尺寸（250μm，125μm，50μm和25μm），从上到下排序（顶部最大网孔尺寸）。这些筛子被整合到Retsch GmbH机器的振动筛振动器中，以0.56毫米的振幅洗涤和摇动20分钟。将50μm和25μm筛上的滤液洗涤并转移到50mL试管中。然后将这些管在2，000g下离心5分钟。然后除去上清液，将沉淀的土壤平均分成两个15mL试管。两个试管均使用ZnSO进行处理4作为不含吐温80的FS，施加2，000g的离心力两分钟，并使用pluriStrainer（网孔尺寸20μm）来简化卵子计数过程。来自一个管子的卵子被显微镜计数，而另一个管子的卵子被保存在-20°C并运送到寄生虫学实验室（比利时根特大学兽医学院），在那里开始样品DNA提取。在荷兰蒂尔堡伊丽莎白-特威斯特丁医院医学微生物学和免疫学实验室的Microvida，DNA提取完成，并如前所述使用qPCR检测蛔虫和曲楚里斯DNA[61-63]。对于每个鸡蛋浓度，该过程重复八次。从20μm过滤器（图1中的步骤8）收集的材料中只有一半是用qPCR处理的。如果样品过程失败，处理一半的材料是一种战略选择，即有备份。

优化的应变浮法在现场样品中的应用

总共进行了三项调查，以评估吉马镇（埃塞俄比亚西南部）STH卵/幼虫的环境污染情况，其中一项涉及10个学校大院，一项包括50户家庭，另一项是在九个公开市场进行的。先前的研究强调，STH在吉马镇非常普遍，任何STH在学校中的患病率范围为8.3%至55.0%[59，60]。在以下段落中，我们将更详细地讨论每个调查。

学校大院。

本次调查共包括吉马镇的10所公立学校。这些学校的选择基于他们参与先前的STH流行病学调查[59，60]和药物疗效试验[59，64]。在每所学校，从操场、厕所周围和教室里收集土壤样本。从游乐场中，我们选择了六个最常用的游乐场地点，并收集了6个土壤样本（每个300克）。将每个样品转移到聚乙烯袋中，并标有学校名称和样品收集地点。在厕所周围，我们收集了五个土壤样本（每个300克），一个来自男孩的入口，一个来自女孩的入口，一个在厕所前面，一个在厕所后面，一个来自厕所的后院。最后，确定了六间教室（六个年级各一间教室）。在每个教室里，整个空间都被扫荡，300克灰尘/土壤被转移到聚乙烯袋中。在此基础上，共收集了170个土壤样本（= 10所学校x（6个操场样本+ 5个厕所区域样本+ 6个教室样本）。

家庭。

对50户家庭的STH卵/幼虫的环境污染进行了评估。这些家庭代表了50名学龄儿童的房屋，这些儿童是根据其感染状况随机选择的（27名儿童没有排泄STH卵，23名儿童根据单个Kato-Katz厚涂片排泄STH卵），来自上述10所学校中的5所学校。这五所学校是根据以下因素选出的：（一）学校之间的距离（每个kebele只包括一所学校（最小的政府行政单位），（二）他们所服务的社区（为农村和城市社区服务的学校被排除在外），以及（三）他们参加研究的机会（不包括学生在抽样过程中必须参加考试的学校）。对学龄儿童进行筛查是一项更大规模研究的一部分，该研究旨在通过粪便显微镜检查（Kato-Katz厚涂片）和血清学检查来评估大规模药物给药的影响[60]。对选定学童家中的四个地点进行了抽样，包括房屋入口和厕所、厨房和后院，共抽取了200个样本（50户住户×4个样本）。

公开市场。

对随机选择的50名儿童的母亲进行了采访，以确定他们在哪里购买蔬菜，水果和谷物。根据这些访谈，确定了九个开放市场。在每个公开市场，从向客户展示产品（蔬菜，水果和谷物）的每个地区收集三个土壤样本。在一个大型公开市场，收集了6个土壤样品，产生了30个土壤样品（= 8个市场x 3个样品+ 1个市场x 6个样品）。

收集土壤样本。

我们用铲子收集顶层土壤（0-3厘米）。我们将土壤的收集限制在表层土壤中;因为我们假设儿童只会与这些层相互作用，并且先前的研究也表明，感染性蛔虫卵和Trichuris卵在此深度之外并不常见[65，66]。在每个地点，从没有草的地区收集了大约300克表土。在旱季和雨季都收集了样本，因此水与土壤的比例会因季节而异（预计雨季的300克土壤含有更多的水）。为避免样品现场的污染，在每个采样地点之间用扫帚清洁铲子以除去灰尘。在教室的情况下，首先用扫帚扫过整个教室，然后收集整个教室的灰尘。所有样本均装在聚乙烯袋中，并清楚标明收集日期、地点和地点。所有样本都收集在一个盒子里，并运往吉马大学被忽视的热带病实验室。

检查土壤样品。

在样品处理之前，我们将所有样品在室温下过夜。随后，对样品进行均质化，以确保卵/幼虫分布更均匀。最后，对100克土壤进行子样品处理。我们应用优化和验证的应变浮法处理了所有样品（见图1）。简而言之，将100克土壤与一L自来水和5mL 0.5%吐温80混合。将悬浮液在磁力搅拌器板上以50rpm进一步均质化15分钟。然后，将悬浮液过滤在具有不同网孔尺寸（250μm，125μm 50μm和25μm）的四个筛子的塔上，从上到下排序（筛子顶部具有最大网孔尺寸）。这些筛子被整合到Retsch GmbH机器的振动筛振动器中，并以0.56毫米的振幅洗涤和摇动20分钟。将50μm和25μm上的滤液洗涤并转移到50mL试管中。然后将这些管在2，000g下离心五分钟。然后除去上清液，将剩余的土壤平均分配并转移到两个15mL试管中，其中一个用于显微镜检查，另一个用于分子分析。两个试管均使用ZnSO进行处理4作为FS，不含吐温80，施加2，000g的离心力两分钟。然后，将试管的上清液分别过滤到pluriStrainer（网孔尺寸20μm）上。用自来水清洗筛子，然后使用微量移液管吸入滤液。对于第一管，将滤液转移到显微镜载玻片上，并计数蛔虫，Trichuris和钩虫样卵/幼虫的数量。对于第二个管，上清液被转移到一个两mL管中，该管保存在-20°C并运送到寄生虫学实验室（比利时根特大学兽医学院）。在寄生虫学实验室，为DNA提取准备了样品。在荷兰蒂尔堡伊丽莎白-特威斯特登医院医学微生物学和免疫学实验室 Microvida，共完成了 432 次 DNA 提取，并检测了不同 STH（将 Necator 与 Ancylostoma 区分开来）、类圆线虫、绦虫（鉴别 T.萨吉纳塔和T.进行猪带），禾本肠和膜翅目应用qPCR。qPCR测定的实验方案在别处有描述[61-63]。

问卷。

编制了两份单独的调查问卷，一份是获取关于家庭特征的信息，另一份是关于学龄儿童对STH的知识、态度和实践。为了获得有关家庭特征的信息，我们采访了家庭的母亲。如果母亲不在场，我们采访了父亲或其他户主。通过这份调查问卷，我们获得了有关最小孩子的年龄，家中有水，大院中动物的存在，厕所的存在和类型（墙壁，门和屋顶的存在），厕所的卫生状况（厕所中的水，在厕所内/周围观察到的苍蝇，在厕所地板上观察到的可见排泄物）以及厕所外不同家庭成员的排便习惯的信息。对于KAP，我们采访了10所学校中5所学校的422名学龄儿童（12至18岁）。完整的问卷可以在S1信息（家庭特征）和S2信息（KAP）中找到。

统计数据分析

优化应变浮选法浮选程序。

对于每个实验，我们计算了不同变量中位卵子的恢复率（=100个蛔虫和100个Trichuris卵的比例（%））。此外，还评估了卵子回收率的任何显着差异。鉴于样本量较小，我们仅使用非参数检验（Wilcoxon 秩和检验）。在多次成对比较的情况下，在显著性水平上应用了Bonferroni校正。在卵子回收率没有明显显着差异的情况下，将最便宜或劳动密集型最不高的程序纳入最终程序。如果成本/人工没有明显差异，则纳入具有最高卵子回收率的程序。

优化应变-浮选法的诊断性能.

我们分别计算了每个鸡蛋污染水平（10个鸡蛋/ 100克土壤，25个鸡蛋/ 100克土壤，50个鸡蛋/ 100克土壤和100个鸡蛋/ 100克土壤）和两种诊断方法（显微镜和qPCR）的敏感性（=正确分类为阳性的样品的比例（%）。为了探索优化的应变浮选方法的性能并量化鸡蛋污染水平，我们确定了不同水平鸡蛋污染的鸡蛋回收率。

优化的应变浮法在野外样品中的应用.

受污染样本的比例和卵/幼虫污染的中位数分别针对每个集群（学校大院，家庭，公开市场）和样本位置（学校大院：操场，厕所和教室;住户：房屋入口，入口厕所，厨房和后院;市场：蔬菜，水果和谷物）确定。当显微镜检查或qPCR显示存在STH卵/幼虫或DNA时，样品被认为是受污染的。

为了探索环境污染与STH感染之间的关联，我们首先在学校层面确定了环境污染与相应的STH流行病学之间的相关性。为此，我们确定了含有STH卵/幼虫/DNA的土壤样品比例与学校水平STH患病率之间的Spearman相关系数。有关STH流行病学的数据是通过一项研究获得的，该研究旨在比较显微镜和两种内部血清学检测[60]，该研究是在环境污染评估前4-8个月完成的（2018年10月至12月与12月）。2019年3月至6月）。

最后，我们比较了显微镜和qPCR之间的测试结果。在没有金标准（灵敏度和特异性为100%的方法）的情况下，我们考虑了复合参考标准（CRS;[67，68]）作为黄金标准的代理，用于计算不同诊断方法的灵敏度。如果至少使用其中一种诊断方法发现卵子或DNA，则CRS方法将样本分类为阳性，如果所有方法均未发现卵子或DNA，则为阴性。确定在土壤样品中检测到的所有人类蠕虫的敏感性，假设每种方法的特异性为100%，如卵的形态或qPCR测定中使用的物种特异性引物/探针所示，钩虫和类圆线虫除外。对于这些蠕虫，检测仅基于qPCR（仅根据其形态很难将它们与其他自由生活/植物寄生虫区分开来）。

问卷。

对于两份问卷（家庭特征和KAP），我们应用标准描述性统计（类别变量的比例;连续/整数变量的中位数和范围）总结了结果。我们评估了受感染儿童居住的家庭样本是否更有可能含有STH卵/幼虫。为此，我们使用 Chi2-测试以评估家庭层面STH存在的差异，以及Wilcoxon秩和测试（两个水平变量）/Kruskall Wallis（具有两个以上水平的变量），以评估家庭层面STH卵子平均数量的差异。

结果

优化内部应变浮法程序

表1和图2提供了旨在优化我们的应变浮选方法的实验摘要。使用锌索4与NaCl（W = 6.5，p = 0.009）和MgSO相比，导致显着（p ≤0.05 / 3对比较）更高的卵子回收率4（W = 3.5，p = 0.003）对于蛔虫，但对于Trichuris则不然。对于此 STH，没有一个成对比较表明不同 FS 之间存在显著差异（p >0.05 /6 对比较）。当盖玻片在试管上保持更长时间时，蛔虫卵和Trichuris卵的恢复增加。虽然基于第一个盖玻片的成对比较没有发现卵子回收率的任何显着差异（p >0.05 / 6对比较），但30分钟的浮选期并未导致两个STH物种的卵计数为零（图2）。这与其他浮选期形成鲜明对比，其中观察到零蛋计数，特别是对于蛔虫。对于这个STH，在6个重复中的3个，1个和2个中分别观察到5个，10个和15分钟的浮选期为零蛋计数。对于Trichuris，在五分钟的浮选期间，仅在一次重复中观察到零蛋计数。

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图 2. 蛔虫卵和三疣蛔虫卵连续浮选后的回收率。

意大利面条图说明了应用连续浮选时累积的卵子回收率。颜色代码区分了从浮选管中取出第一个盖玻片的时间。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307.g002

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表 1. 五个实验中蛔虫和Trichuris的卵子回收率。

p 值基于非参数检验（Wilcoxon 秩和检验）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307.t001

对样品的连续浮选检查结果表明，重复浮选过程提高了蛔虫和Trichuris的最终卵回收率，而这与第一次盖玻片的浮选期无关。在连续浮选35分钟（= 5 + 15 + 15），40分钟（= 10 + 15 + 15），45分钟（= 15 + 15 + 15）和60分钟（= 30 + 15 + 15）之间，在连续浮选的卵子总数中没有显着（p >0.05 / 6成对比较）的差异。

其余实验室实验中的中位卵子回收率并未显示卵子回收率的主要差异。在蛔虫的离心力（2，000克：48.0%对1，000克：28.0%），阿斯蛔虫的吐温80浓度（吐温：37.0%对没有吐温：48.0%）和Trichuris（吐温：39.5%对没有吐温：24.0%）之间观察到超过10点的中位卵子回收率的差异，当连续浮选步骤被Trichuris的额外应变步骤取代时 （无应变：33.5%，而应变：21.0%）。非参数测试证实，添加吐温可显著提高Trichuris的卵子回收率（W = 8，p = 0.010）。在所有其他比较中，该测试未显示卵子回收率的任何显着差异（p >0.05）。

根据实验结果，我们决定使用ZnSO4作为FS，以2，000g离心管，并用额外的应变步骤替换重复的浮选步骤。关于吐温，我们决定不将吐温添加到FS中，而是在土壤中添加0.5%吐温80，以促进卵/幼虫在过筛前的均质化。图1提供了我们优化的内部应变浮选方法的示意图。

优化应变-浮选法的诊断性能

结合显微镜和qPCR，蛔虫的总体灵敏度为81.3%，Trichuris为87.5%。图3以图形方式总结了不同实验的结果。S1 表提供了诊断性能的数字摘要。对于显微镜检查，当浓度为每100克土壤50个卵时，两种STH的灵敏度为100%。对于每100克土壤25个鸡蛋的浓度，蛔虫的敏感性为75.0%（95%CI：45.0;100），蛔虫的敏感性为62.5%（95CI：29.9;96.0），而对于10个鸡蛋/ 100克土壤的敏感性分别为25.0%（95%CI：0.0;55.5）和12.5%（95%CI：0.0;35.4）。鉴于在旨在优化过滤浮选方法的实验中观察到的回收率，估计的鸡蛋浓度低估了真正的潜在鸡蛋污染也就不足为奇了。然而，重要的是要注意，在蛔虫卵污染的不同水平下，卵子回收率并没有保持不变，而是随着卵子污染的增加而增加。对于Trichuris来说，卵子回收率基本保持不变。一般来说，qPCR对蛔虫的敏感性低于显微镜检查（75.0%对59.4%）。对于Trichuris，当浓度较低时，qPCR在较高的检测率方面更敏感（10个鸡蛋：50.0%对12.5%;25个鸡蛋：87.5%对62.5%），但在浓度高时导致较低的检测率（50个鸡蛋：87.5%对100%;100个鸡蛋：87.5%对100%）。

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图 3. 优化了应变浮选法检测和定量土壤中蛔虫卵和三鳞蔷薇的诊断性能。

这些小组分别描述了显微镜和qPCR（顶行面板）的灵敏度，显微镜检查（中间行面板）的卵子回收率以及蛔虫（左柱面板）和Trichuris（右列面板）的qPCR（底排面板）的Ct值。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307.g003

优化的应变浮法在现场样品中的应用

使用显微镜和qPCR对399个野外样本（学校：170;家庭：199;市场：30）的分析显示，存在8种不同的具有医学重要性的蠕虫物种，包括但不限于人类STH。最普遍的蠕虫是蛔虫（65.7%）和绦虫（52.4%），其次是Trichuris（21.6%）。其他蠕虫仅在少数病例中观察到（Enterobius：5.8%;膜翅目： 5.3%;类圆线虫： 1.5%;死角： 0.8%;血吸虫病：0.8%）。S2-S4表格提供了不同学校大院，家庭和开放市场的所有蠕虫物种的环境污染的数字概述。在以下段落中，我们将仅关注STH的环境污染。

学校大院的环境STH污染。

图4说明了学校大院中人类STH的环境污染。总体而言，在显微镜和qPCR检查的170个（66.5%）样本中，有113个观察到人类STH。蛔虫是观察到最多的STH物种（61.2%），其次是Trichuris（17.1%）。在两种人类钩虫中 N.仅在2个样本中观察到americanus（1.2%）。在所有十所学校中都发现了蛔虫和Trichuris，蛔虫的样本患病率从35.3%到94.1%不等，在6号学校从5.9%到41.2%不等。美洲猪笼草仅在1号学校（11.8%）被观察到（图4A）。

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图 4. 吉马镇（埃塞俄比亚）10所学校大院的环境STH污染。

这一数字说明了埃塞俄比亚吉马镇10所政府学校（A组）在学校内不同地点（教室、厕所和操场、厕所和操场）的环境STH污染情况。小组B），在学校厕所周围的不同地方（小组C），以及儿童STH感染率与学校一级被STH污染的样本比例之间的关系（小组D）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307.g004

当关注学校大院内的不同采样点时（图4B），教室中任何人类STH的样本患病率最高（81.6%），其次是厕所（62.0%）和操场（55.0%）。三种STH中每种的样本患病率都遵循类似的模式，教室的样本患病率最高，其次是厕所和操场（蛔虫：73.3%对60.0%对50.0%;特里丘里斯： 26.7% vs.12.0% 与.11.7%;美洲猪笼草： 3.3% vs.0.0% 与.0.0%).在厕所周围（图4C），任何人类STH的样本患病率至少为50%，并且在不同的采样地点之间没有变化（厕所后面：50.0%;厕所的后院：50.0%，厕所前面：70.0%;女孩的入口：70.0%;男孩的入口：70.0%）。虽然对于蛔虫，样本患病率在采样点之间没有显着差异（50.0%至70.0%），但在厕所后面和前面的样本中均未观察到Trichuris的存在。女孩入口和厕所后院的样本流行率均为10.0%，在男性入口处的Trichuris患病率为40.0%。图4D说明了儿童STH感染患病率与学校一级被STH污染的样本比例之间的关系，强调学龄儿童中任何感染的患病率与含有任何STH生命阶段的环境样本的比例显着相关（Rs = 0.42，p = 0.02）。S5表概述了埃塞俄比亚吉马镇10所学校中学童的STH感染情况。

家庭的环境STH污染。

图5说明了家庭中人类STH的环境污染。总体而言，在通过显微镜和qPCR检查的199个（73.9%）样本中，有147个观察到人类STH。同样，至于学校化合物，蛔虫是观察到最多的STH物种（71.4%），其次是Trichuris（23.6%）。在1个样本中再次观察到美洲猪笼草（0.5%）。除一个家庭外，在所有家庭中都发现了蛔虫，在60.0%的家庭中都发现了Trichuris（图5A）。Necator只在一个家庭中被观察到。不同采样点的污染各不相同（图5B）。一般来说，在厕所入口处收集的样本受污染最严重（任何STH：84.0%;蛔虫： 82.9%;Trichuris：30.0%）。在厨房中观察到的污染最少（任何STH：65.3%;蛔虫： 59.2%;Trichuris：18.4%）。

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图 5. 人类STH的环境污染在家庭和开放市场。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307.g005

表2总结了不同家庭的特征以及通过样品中平均STH卵计数测量的相应环境污染。平均而言，有5.5人住在这些家庭中。在50个家庭中的12个家庭中，至少有一个<3岁的儿童报告，在40个家庭（80.0%）中观察到动物（如狗，猫，鸡和牛）。除了少数例外（n = 2;4.0%），所有家庭都有厕所。大多数厕所是开放式的（n = 34;68.0%），所有其他厕所都是坑式厕所（n = 14;28.0%）。一半的厕所没有墙壁（n = 26; 52.0%）或屋顶（n = 25，50.0%）。在三分之一的病例中，没有门（n = 15;30.0%）。在34户家庭（68.0%）的厕所周围观察到苍蝇，在六户家庭中可以看到排泄物（12.0%）。20%的户主报告说，他们的孩子在露天排便。几乎所有到访的家庭（98.0%）的厕所里没有水，46.0%的家庭大院没有任何供水。大多数厨房（n = 36，72.0%）有墙壁和土壤地板，11个家庭有一个开放空间厨房（n = 11，22.0%）。仅在少数情况下（n = 3; 6.0%），我们观察到一个有墙壁和混凝土地板的厨房。从厕所入口到房屋入口的平均距离为16.7米（范围从4米到35米）。鉴于家庭中STH的高患病率（在49个家庭中的43个家庭中，至少有2个样本观察到STH卵子/DNA的存在），我们没有探索家庭层面的环境污染与家庭特征和儿童感染状况之间存在的任何关联。没有家庭特征可以解释100克土壤中鸡蛋的差异（p值>0.05）。STH感染儿童家庭中环境污染的中位数（最小;最大）等于每100克土壤10.5个卵子（0.5;1，153.0），与没有STH感染的儿童的家庭（6.5（0.0;441.5））没有显着差异（p = 0.453）。

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表 2. 埃塞俄比亚吉马镇50户家庭的特征和相应的环境污染。

通过平均土壤传播的蠕虫蛋测量的环境污染在整个样品中计数。p值基于两级变量情况下的Wilcoxon秩和检验，而对于具有两个以上能级的变量，则基于Kruskal Wallis检验。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307.t002

在公开市场上与人类STH的环境污染。

在公开市场上，人类STH的环境污染如图5C和5D所示。总体而言，在通过显微镜和qPCR检查的30个样本中，有20个观察到人类STH。在这里，蛔虫也是观察到最多的STH物种（53.3%），其次是Trichuris（33.3%）。Necator在任何市场都没有被观察到。在九个开放市场中的七个检测到蛔虫，在六个开放市场检测到Trichuris。在大多数公开市场，三个（八个市场）或六个土壤样本（一个大型公开市场）中至少有两个被任何STH（九个市场中的七个）和蛔虫（九个市场中的六个）污染。对于Trichuris，大多数市场（n = 5）的受污染样品少于两个。在出售水果（60.0%），谷物（70.0%）和蔬菜（70.0%）的地点，任何STH的污染几乎没有变化。然而，在出售蔬菜的地区，主要是观察到蛔虫（70.0%），其次是（Trichuris）。在其他地区，两种STH的发现速度相似。

显微镜和qPCR的比较。

当优化方法应用于田间样品时，分别在262个和86个田间样品中检测到蛔虫和Trichuris的卵和/或DNA。假设显微镜和qPCR均具有完美的特异性，显微镜对蛔虫的敏感性为77.9%，对Trichuris的灵敏度为38.4%。与显微镜检查相比，qPCR对蛔虫的敏感性较低（61.0%），对Trichuris的敏感性更高（74.4%）。如S1图所示，Ct值下降是显微镜对蛔虫计数的卵子数量的增加的函数，而对于Trichuris则在较小程度上下降。对于其他具有医学重要性的蠕虫，qPCR优于显微镜。例如，根据显微镜和qPCR的结果，在209个样本中观察到绦虫联合，其中99.5%通过qPCR检测，6.2%通过显微镜检测。Enterobius也观察到类似的发现（23例，其中91.3%通过qPCR，8.7%通过显微镜检查）。对于膜子膜，显微镜检查的敏感性更高（22例，其中qPCR占40.9%，显微镜检查占59.1%）。对于剩余的蠕虫物种，比较是困难的，因为形态分化不是直接的（类圆线虫和钩虫）或由于病例数少（血吸虫）。

KAP向STH迈进

共有422名学童参加了这份调查问卷。儿童的年龄从12岁到18岁不等（中位数=14），男孩与女孩的比例等于1：1.21。一半的孩子是穆斯林（51.9%），另一半是基督徒（48.1%）。在大多数情况下，父母的教育很差。超过一半的父亲没有完成高中学业（文盲：13.7%;小学：25.8%;初中：18.0%），一半的母亲没有完成初中（文盲：28.0%;小学：30.6%）。大多数父亲要么是农民（n = 125;29.6%）要么是政府雇员（n = 122;28.9%），而母亲主要是家庭主妇或清洁工（n = 287;68.0%）。

一般来说，大多数儿童都知道STH，372名（88.2%）儿童确认他们之前听过与STH相关的单词，例如"肠虫"，"蛔虫"，"Trichuris"和"钩虫"。这与其他主要疾病（艾滋病毒：98.3%;疟疾：91.0%和结核病：82.0%）大致一致。然而，观察到这些词之间的重要差异。例如，大约90%的儿童都知道"肠道蠕虫"和"蛔虫"。"钩虫"和"Trichuris"这两个词分别只有12.6%和0.9%的儿童知道。教师是主要的信息来源（88.9%），其次是电视（73.7%）和广播（63.3%）。儿童还通过护士和医生（26.8%）以及卫生推广人员（25.8%）听到了上述单词。关于STH对人体的影响，大多数人证实STH会引起胃痛（n = 384; 91.0%），并且它们确实共享宿主的食物（n = 315，74.6%）。大约一半的学生（47.2%）不知道STH（钩虫）也吸血。少数儿童谎称性传播感染会导致尿液中的血液（19.7%）和失明（10.4%）。许多学生（82.9%）知道成人STH居住在肠道中，但也有少数儿童认为成人STH可以在人体的其他部位找到（皮肤：15.2%，肺：13.0%，心脏：7.1%，头部：5.9%，眼睛：4.0%）。只有少数学生（n = 26，6.2%）不知道医生和护士可以提供针对STH感染的药物。此外，相当一部分学生（n = 114，27.0%）错误地回答了有针对STH感染的疫苗。虽然大多数学生都知道STH不是通过空气传播的（n = 95，22.5%），昆虫叮咬（n = 58，13.7%），血液（n = 64，15.2%）和唾液（n = 27，6.4%），但只有173名儿童（41.0%）证实STH是通过粪便传播的。许多儿童，327（77.5%）报告说，STH是通过吃生肉传播的。儿童通常在家中的厕所排便率为64.0%（n = 270），其次是大院中的厕所（村庄普通厕所; n = 145; 34.4%）。只有少数学生在学校的厕所（0.7%）和灌木丛（0.9%）排便。大多数儿童报告说，他们在吃食物前（n = 400; 94.8%）和使用厕所/厕所后（n = 361; 85.5%）总是洗手。虽然经常使用洗涤肥皂（n = 255; 60.4%）。在所有接受采访的学生中，18.5%（n = 78）没有修剪指甲。大多数儿童（n = 292; 69.2%）每周修剪一次指甲，11.1%（n = 47）每两周修剪一次，1.7%（n = 7）每月少于一次。几乎所有的学生（n = 419; 99.3%）都穿鞋，但其中21.8%（n = 92）并不总是这样做。在所有研究参与者中，33.1%（n = 135）不担心感染STH的风险，11.9%（n = 49）如果他们感染肠道蠕虫，他们不会焦虑。

讨论

大规模的驱虫计划成功地减轻了STH感染造成的疾病负担，但在没有其他干预措施的情况下，再次感染是不可避免的。今天，目前尚不清楚（再次）感染发生在何处以及如何发生，这进一步阻碍了有针对性的，也许更具成本效益的控制策略的发展。在本研究中，我们旨在通过评估学校大院，家庭和开放市场的环境污染来确定可能的感染源。为此，我们首先进行了一系列实验室实验，旨在优化内部应变浮选方法，以检测和量化土壤中的蛔虫和Trichuris卵，并在进行显微镜检查和qPCR时验证优化方法的诊断性能。在第二阶段，我们应用这种方法来评估从学校大院、家庭和开放市场收集的环境样本中的STH污染水平，这些样本是STH特有的。随后，我们在学校和家庭特征层面探索了环境污染与相应的STH流行病学之间的关联。最后，我们评估了学龄儿童中STH的KAP。

我们的土壤过滤浮选方法具有中等诊断性能

我们的实验旨在优化我们的内部土壤过滤浮选方法，表明（i）ZnSO4（比密度= 1.35），（ii）浮选30分钟，（ii）增加离心力和（iii）重复浮选后检查多个盖玻片显着改善了蛔虫卵和Trichuris卵的回收率。这些发现并不出乎意料，并且与先前评估FS比密度和性质影响的研究一致[69，70]，以及重复浮选[25]。在我们的最终标准操作程序（SOP;图1），我们用额外的应变步骤代替了重复的浮选步骤，以便在显微镜检查样品时将样品处理时间减少到每个样品30分钟。一般来说，文献中报告的中位时间等于2.0小时（范围从<1小时到2天）[58]，这突出表明我们的方法允许适度高的样品通量。

对于显微镜检查，我们最终SOP的分析灵敏度（=在至少95%的重复中获得阳性测试结果的鸡蛋的浓度）对于STH（蛔虫和Trichuris）每100克土壤（或2克土壤中的1个鸡蛋）50个鸡蛋。蛔虫每克土壤100个卵的中位采卵率为36.0%，Trichuris为8.0%。对于qPCR，蛔虫的分析灵敏度为每100克土壤100个卵，而对于Trichuris，这是每100克土壤>100个卵。分析灵敏度的这种差异可能是由于通过显微镜和qPCR分析的土壤量的差异。虽然我们用显微镜分析了从20μm过滤器收集的所有土壤（图1中的步骤9），但只有一半是用qPCR分析的。如果样品过程失败，处理一半的材料是一种战略选择，即有备份。

尽管由于SOP和不同蠕虫物种的多样性，与其他研究进行头对头比较是困难的，但可以注意到两个重要的方面。首先，我们在一系列很少检查的鸡蛋数量（每克土壤0.1至1个鸡蛋）和土壤质量（100克）中对我们的方法进行了压力测试。事实上，根据对文献的综述，蛔虫的中位卵浓度为每克土壤20.0个卵（范围从4到32，393）[58]。对于Trichuris，Trichuris的卵浓度范围为每克土壤1至32，393个卵（本综述仅报告了两项研究;与少数可用的研究相比，我们的方法显示出较低的分析灵敏度。例如，将Toxocara犬卵（1，10，25，50，100和200）刺入1克土壤[69]的峰值实验显示，在具有10个卵的重复中，至少一个卵被显微镜检测，导致分析灵敏度不低于每克土壤10个卵（与本研究中每克土壤0.5个卵相比）。其次，我们的方法的回收率显示在蛔虫报告的范围内（[58]报告的中位卵回收率等于25.0%，范围从9.5到82%），但Trichuris的恢复率较低（本综述仅报告了两项研究;80.0%和96.4%;虽然不能排除土壤类型或SOP的变化，但Trichuris的这种较差的卵回收率也可以用我们用于过滤土壤样品的网状尺寸（25μm）来解释。Trichuris卵的尺寸为50-55μm x 20-25μm[71]，因此它们可能通过筛子，导致观察到的卵子回收率差。包括一个网孔尺寸为20μm的筛子将是对我们SOP的明显修改。

尽管上述段落强调了我们的方法允许适度的高通量并具有适度的诊断性能，但购买"振动筛"（带有相应的筛子）是一项重大投资（8，000欧元，包括17%的增值税）。除此之外，获得相对大量水的恒定流量也被认为是一个重要的障碍。

医疗重要蠕虫的蠕虫的生命阶段在环境中无处不在

我们的研究结果强调，存在8种不同的蠕虫物种，具有医学重要性，包括但不限于人类STH。最普遍的蠕虫是蛔虫（65.7%）和绦虫（52.4%），其次是Trichuris（21.6%）。其他蠕虫仅在少数病例中观察到（Enterobius：5.8%;膜翅目： 5.3%;类圆线虫： 1.5%;死角： 0.8%;血吸虫病：0.8%）。一般来说，这些蠕虫在环境中的存在和患病率都反映了学龄儿童[59，60]和成人[60]的感染率，但绦虫除外。对于这种蠕虫，埃塞俄比亚（包括我们的研究区域）的感染率为2.3%[72-73]，低于基于环境污染的预期。这可能是由于用于诊断感染的方法的敏感性差（Kato-Katz厚涂片：52%（95%可信间隔[7-94]）与qPCR敏感性94%（95%可信间隔[88-98]）[74]，以及一旦妊娠前叶主动离开宿主（一个妊娠前叶可能含有多达2，000个卵子[75]），在环境中排泄的卵子数量。

所有主要样本地点的环境STH污染都很高，家庭污染最严重（73.9%，而开放市场和学校大院的污染率约为66%）。学校大院的污染水平超过了先前报告的水平（尼日利亚：53.6%[76]和32.0%[77];喀麦隆： 17% [78];埃塞俄比亚：11.3%[79]）。家庭的污染与孟加拉国的一项研究（78.0%[24]）相当，但高于肯尼亚的26.8%[25]。本研究中的污染水平高于先前报告的水平（Cameron为15%[80]）。

虽然正面比较仍然非常困难，但在我们的调查中，这种较高的STH患病率可能是由于土壤量较高（100克土壤）以及在样品过程中结合显微镜和qPCR。后一种方法允许更敏感（尽管不是针对所有蠕虫物种）、特异性（例如，钩虫和绦虫物种的物种形成）并同时检测多种蠕虫物种[55，56]。虽然这些结果表明蠕虫在环境中无处不在，但我们没有评估不同生命阶段的生存能力。活性可以通过特定染料来评估[81，82]。因此，我们无法准确估计感染风险。

学校是儿童STH感染源还是儿童污染学校？

儿童STH感染的患病率与学校一级被STH污染的样本比例之间存在关联（见图5D）。然而，目前尚不清楚学校是否是STH感染的来源，或者儿童是否助长了学校污染。无论哪种方式，教室里的污染程度都高于厕所周围的污染，这是值得注意的，但并不出乎意料。这是因为，厕所的内部被人类的粪便严重污染。因此，儿童在使用厕所时踩到人凳子上，穿着被粪便污染的鞋子进入教室的可能性不大。此外，虽然厕所周围的生活阶段可能会在下雨期间被冲走，但这不太可能发生在屋顶教室里。研究参与者对STH传播途径和预防方法缺乏认识，进一步凸显了在学校进行健康教育和改进WASH干预的必要性，以尽量减少环境污染和STH的传播。

研究的其他局限性

这项研究还有许多其他局限性。首先，虽然环境样品是在旱季和雨季收集的，但我们在使用内部应变浮法处理样品之前没有干燥样品。这对于未来旨在评估环境污染的季节性差异的研究可能很重要。其次，为了更深入地了解儿童在学校污染学校中的作用，重要的是要验证在学校排便的儿童与学校发现的环境污染之间以及在学校排便与STH感染状态之间的关联。虽然我们确实在KAP调查中捕捉到了排便行为，但由于时间限制（调查是在学校放假前不久进行的），因此仅在十分之五的学校中对其进行了评估。此外，在进行KAP调查期间，作为国家STH控制计划的一部分，这些儿童意外地驱虫，因此我们无法验证他们的KAP与STH的关联及其感染状态。最后，我们内部应变浮选方法的验证仅限于蛔虫和Trichuris。对于其他蠕虫物种来说，评估这一点也很重要。

结论

我们优化的应变浮选方法具有适度的诊断性能，并揭示了蠕虫的生命阶段在环境中无处不在，既反映了家庭和学校的卫生设施较差，也反映了对STH缺乏认识。需要进一步的研究才能更深入地了解这些生命阶段对传播的贡献。

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通过显微镜和qPCR测量的环境样品中污染的关联。

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S1 图 通过显微镜和qPCR测量的环境样品中污染的关联。

这些散点图表示通过显微镜（每100克土壤中的鸡蛋）和qPCR（以Ct为单位）测量的蛔虫和Trichuris污染的关联。Ct 值为零表示缺少 DNA。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307.s001

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S1 表。 优化的应变浮选法检测和定量土壤中STH蛋的能力。

根据检查的样品量调整卵子计数。本表中总结的Ct值仅反映了仅在qPCR阳性样品中观察到的Ct值。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307.s002

（文档）

S2 表。 在埃塞俄比亚吉马镇的10所学校大院中采集的土壤样本的蠕虫污染。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307.s003

（文档）

S3 表。 从埃塞俄比亚吉马镇50户家庭采集的土壤样本的蠕虫污染。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307.s004

（文档）

S4 表。 从埃塞俄比亚吉马镇的9个市场收集的土壤样本的蠕虫污染。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307.s005

（文档）

S5 表。 土源蠕虫。埃塞俄比亚吉马镇10所学校的感染。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307.s006

（文档）

S1 信息 该问卷旨在深入了解家庭的特征。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307.s007

（文档）

S2 信息 关于对土源蠕虫的知识、态度和实践的问卷。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010307.s008

（文档）

S1 数据。 土壤应变浮选法的优化及诊断性能.

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确认

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