厦门杂志期刊论文发表-使用 FRET-IBRA 工具包快速灵活地处理大型 FRET 图像堆栈

高塔姆·蒙格拉尼 ，汉内斯·沃格勒，韦利·格罗斯尼克劳斯

出版日期： 2022年04月04日

抽象

比例式延时FRET分析需要一个强大而准确的处理管道，以消除荧光图像强度测量中的偏差，然后才能进行进一步的定量分析。这种级别的稳健性只能通过为自动化工具补充内置的灵活性来实现，以便进行手动临时调整。FRET-IBRA是一个用Python编写的模块化和完全并行化的基于配置文件的工具。它简化了 FRET 处理管道，以实现准确、注册和统一的比率图像堆栈。该工具具有处理具有定制配置参数的不连续图像帧序列的灵活性，进一步简化了原始显微镜图像中异常值和时变效应的处理。FRET-IBRA 在一体化解决方案中提供基于集群的通道背景减法、光漂白校正和比例图像构建，无需多个应用程序、图像格式转换和/或插件。该软件包接受各种输入格式，并输出TIFF图像堆栈以及性能测量，以检测每帧背景减法算法的质量和失败。此外，与现有的背景减法解决方案相比，FRET-IBRA输出的图像具有出色的信噪比和精度，同时保持快速的运行时间。我们广泛使用FRET-IBRA包来量化机械约束下花粉管生长过程中钙离子的空间分布。针对现有工具的基准清楚地表明，需要FRET-IBRA从FRET显微镜图像中提取可靠的见解，这些图像具有高空间和时间分辨率的动态生理过程。Linux 和 Mac 操作系统的源代码在 BSD 许可证下发布，并且与安装说明、测试映像、示例配置文件和分步教程一起，可在 github.com/gmunglani/fret-ibra 免费获取。

作者简介

FRET是一种基本的成像技术，用于产生对分子构象和相互作用敏感的荧光信号。尽管它被广泛使用，并且有大量关于处理从该过程生成的图像所需的理论步骤的文献，但我们无法找到包含整个处理工作流程的工具，同时允许用户灵活地调整参数以获得最大的准确性和运行时效率。因此，FRET-IBRA被创建为一个多合一的，开源的，并行的解决方案来处理FRET图像，同时消除了重复图像格式转换引起的复杂性。除了增强FRET图像的背景减法算法外，还为用户实现了几个额外的选项，以提高其特定用例的信号质量。FRET-IBRA主要是为了在处理大型图像堆栈时的灵活性而构建的，它支持独立处理的图像帧序列，大大减少了拆分和连接图像堆栈所花费的时间。在针对更通用的背景减法包的精度和速度基准测试中，FRET-IBRA能够以快速的运行时间提供最干净的结果，从而实现可靠的分析，而无需额外的调整。

引文： Munglani G，Vogler H，Grossniklaus U （2022）使用FRET-IBRA工具包快速灵活地处理大型FRET图像堆栈。PLoS Comput Biol 18（4）：e1009242。https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009242

编辑 器： Dina Schneidman-Duhovny，耶路撒冷希伯来大学，以色列

收到： 六月 25， 2021;接受： 二月 16， 2022;发表： 四月 4， 2022

版权所有： ? 2022 Munglani et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。

数据可用性： Linux 和 Mac 操作系统的源代码在 BSD 许可证下发布，并且连同安装说明、测试映像、示例配置文件和分步教程，可在 github.com/gmunglani/fret-ibra 免费获取。

资金： 这项工作得到了苏黎世大学（UG），SystemsX.ch 研究和技术开发项目MecanX，瑞士系统生物学倡议（到UG）的支持，部分得到了瑞士国家科学基金会CR22I2_166110（UG）的支持。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

相互竞争的利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。

这是一篇PLOS计算生物学软件论文。

介绍

基于FRET（F?rster共振能量转移）的比例生物传感器通常用于量化亚细胞分辨率下生理过程的动力学。已经开发了几种方法来优化这些协议的校准[1，2]，但生成的数据量仍然需要快速，可扩展和灵活的软件工具才能进行高效和强大的分析。

准确的回顾性背景减法和光漂白校正算法对于从延时图像中提取精确的时空像素强度分布至关重要。对于依赖于与细胞运动学相关的离子浓度的时间序列分析的研究尤其如此[3]。单个实验在较长时间尺度上的固有可变性需要使用启发式定义的过程参数，这些参数可以应用于特定的数据分割而不是整个图像堆栈，以应对时间漂移[4]。

几种算法已经作为独立的软件包或在现有工具（ImageJ，CellProfiler和qTfy）中实现，以促进各种微观成像模式的高效处理。传统方法通常非常可靠且广泛适用，但通常使用静态工艺参数集，这对于针对特殊应用进行定制并非易事[5-7]。已经开发了许多高性能算法，用于光学显微镜图像中的回顾性背景减法，使用聚类和约束最小化方法，以提高精度。然而，它们已被证明通常不适合通过延时图像来表征生长细胞，这些图像表现出高度的时间相关性[4，8-10]。

在这项工作中，我们描述了FRET-IBRA（图像背景减去比率分析），这是一种完全并行化的，基于配置文件的工具，旨在简化FRET图像堆栈的比例分析[11]。FRET-IBRA接受具有不同位深度（8、12和16位）的多图像TIFF堆栈作为输入，并输出多图像TIFF和HDF5堆栈以进行进一步的下游分析。为了提供最大的灵活性，该工具结合了对图像堆栈中不连续帧的处理以及使用最佳参数校正单个帧，以确保将时间噪声降至最低。应该注意的是，这里描述的比率方法仅限于保持像素化学计量的荧光蛋白的链接构建体。为了展示该工具的性能，对生长中的拟南芥花粉管的FRET图像进行了处理，以创建比率堆栈，以评估驱动生长的钙离子的空间分布。

设计与实施

描述

FRET-IBRA由三个模块组成，分别负责（i）受体和供体延时图像的背景减法，（ii）在使用双视图设置生成比例图像的情况下，这些处理后的图像堆栈的可选配准和对齐，以及（iii）分别进行光漂白校正（图1A）。此外，该工具还输出多个指标来衡量背景减法算法在单个帧上的性能，从而可以快速检测和重新处理欠优化处理的帧。还提供日志记录和HDF5存储功能，以帮助提高可重复性。

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图 1. FRET-IBRA 工作流程。

A） 图像从原始图像演变为背景校正图像和最终比例图像。B） 原始图像和校正图像的像素强度的等值线图。C） 示例背景和前景切片的像素强度分布（如 B 所示），以及显示中位数、偏度和方差的缩小要素空间，每个点代表一个切片。蓝色簇表示背景磁贴，而红色簇表示前景磁贴。D） 前景像素的百分比可用于控制每个通道的背景减法质量。E）供体和受体通道的中位信号强度允许分析和校正漂白效应，并作为背景减法的附加质量指标。

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模块

背景减法模块将图像帧拼接成设置维度的正方形，并使用带有欧几里得度量的 DBSCAN 聚类算法将图块标识为前景或背景（图 1B 和 1C）。该算法改编自Schwarzfischer及其同事（2011）[8]，使用扩展的特征空间，其中包括图块像素强度分布的中位数和较高矩（标准偏差，偏度和峰度）以及其强度加权质心的位置（图1C）。背景切片强度用于对整个格网进行二次插值，以估计由着色效果引起的空间变化背景强度。然后从原始图像中减去产生的背景强度（图1B）。对于 DBSCAN 算法，此方法要求在配置文件中提供ε的优化参数。ε定义为要素空间中要分类为同一聚类的两个切片之间的最大距离。该算法可有效校正空间阴影和消除局部噪声，同时为目标对象较少的图像提供准确的背景减法，但针对单单元格图像进行了优化。当处理信号强度非常低的图像时，用户在继续操作之前应仔细检查校正后的图像，因为非常低的信号会产生伪影（brachypodium_roots FRET-IBRA存储库中的示例）。此模块输出用于视觉检查的算法性能逐帧指标的动画，以及过滤后的 HDF5 数据集和 TIFF 图像堆栈。

在生成比率图像之前，比率处理模块包含几个可选的预处理步骤。供体和受体堆栈之间的图像配准首先通过刚性线性变换进行，然后应用小核双边平滑滤波器。然后使用Otsu的阈值来二值化图像，之后图像边界处的奇点被删除。供体和受体堆栈每帧非零（前景）像素的百分比（图1D）以及中位数强度与位深度的比率（图1E）作为算法在整个图像堆栈上性能的定量指标提供。顺序帧之间的这些指标的明显不连续性可能表明特定帧需要使用不同的ε进行重新处理。表示受体和供体图像堆栈比率的比例图像保存为 HDF5 数据集和 TIFF 图像堆栈。

然后，可以选择在受体和/或供体堆栈的帧上执行光漂白校正，使用中值帧强度上的正则化线性或指数拟合（图1E）。用于拟合的帧范围在配置文件中指定，并应用于从光漂白开始的所有帧，定义为所提供帧范围的下限。校正后的比率图像将另存为输出 TIFF 图像堆栈，而漂白校正因子则存储在 HDF5 数据集中，以便在需要时进行进一步分析。

FRET-IBRA旨在处理具有少量密集堆积的感兴趣物体的图像，从而实现准确的背景估计。由于背景减法算法仅将切片分类为前景或背景，因此由于背景信号的估计不佳，可能无法正确处理具有宽空间均匀分布的单元格或其他感兴趣对象的图像。

结果

为了展示FRET-IBRA的功效，使用工具包校正了显示生长中的拟南芥花粉管中钙分布的FRET图像，并将结果与现有的背景减法工具（如BaSiC [10]）和Mosaic图像处理包的背景减法器模块[12]进行了比较（图2A).对于此图像堆栈，FRET-IBRA 中的最佳背景窗口大小参数（确定图像宽度应划分为多少个方形图块）确定为 40。此参数需要根据图像特征尺寸进行调整，以确保在不占用过多计算资源的情况下准确提取前景。此外，需要强调的是，切片数量越多，切片大小越小，背景减法算法的运行时间越长。

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图 2. FRET-IBRA与ImageJ的现有背景减法插件的比较（BaSiC [10]和Mosaic套件的背景减法器模块[12]）。

A） 背景减法后供体 （CFP） 通道的第 1 帧。虚线表示在 B 中分析的像素行）。B） 背景减法后的像素强度。顶部和底部面板分别对应于第 1 行和第 2 行。C） 1000 帧的背景减法的运行时。所有测试均在英特尔酷睿i7（双核，2.8GHz，16GB RAM）计算机的4个内核上运行。

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从图2B中图像像素强度的两个线样本可以看出，FRET-IBRA是减去背景像素强度，同时保持花粉管峰值强度值的最有效包。此外，除了这种背景减法之外，FRET-IBRA还通过减少背景噪声分布的标准偏差来平滑由此产生的背景像素强度。FRET-IBRA 的运行时间为 4 个内核，介于 BaSiC 和 Mosaic 之间（图 2C）。但是，与其他软件包不同，FRET-IBRA 的并行实现允许进一步减少运行时，从而随着内核数量的增加而线性扩展。

与原始图像相比，BaSiC工具在图像的阴影校正方面是有效的;然而，平均背景像素强度基本保持不变（图3）。相比之下，Mosaic的背景减法器模块成功地减去了背景像素的强度，尽管产生的背景噪声的标准偏差仍然相对较高（表1）。虽然 Mosaic 的窗口大小设置为 35，但应该注意的是，此参数似乎不会对此工具的精度产生重大影响。

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表 1. 运行具有可变窗口大小的背景减法算法后的像素强度统计信息。

FRET-IBRA 中的窗口大小定义了图像宽度应划分为的图块数，即对于 640x480 像素的图像，设置为 40 的窗口大小将沿宽度生成 40 个窗口，沿高度生成 30 个窗口（1200 个窗口，磁贴大小为 16x16 像素）。无法为 BaSiC 设置窗口大小。用于比较的参数标记为黄色。

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图 3. 背景减法比较。

背景电平根据图2中的虚线2，在用FRET-IBRA，BaSiC和Mosaic进行背景减法后与原始图像进行比较。BaSiC插件仅更正了阴影，而Mosaic和FRET-IBRA更正了阴影并减去了背景。总体而言，使用FRET-IBRA处理图像会导致背景具有最低的像素强度和标准偏差。

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然后从处理的受体和供体堆栈中为FRET-IBRA，BaSiC和Mosaic生产比例图像堆栈（图4）。将生成的比率图像缩放以显示完整的8位范围，并且每个工具处理的第一帧用于比较目的（图4A）。BaSiC处理的比率图像中的背景信号均匀较高，这通常允许前景和背景信号之间具有良好的辨别力，但花粉管轮廓周围有较低强度的光晕（图4A，顶图）。从视觉上看，前景的动态（信号频谱）可以看到受到高背景值的影响，这使得任何定量分析都非常困难。由于输入图像的高信噪比，Mosaic生成的图像比率明显更好（图4A，中间图）。然而，可接受的背景强度因不规则的噪声而降低，偶尔会出现高强度峰值，而这些峰值无法通过额外的过滤完全消除，并且花粉管轮廓周围继续存在光晕。与BaSiC和Mosaic相比，FRET-IBRA背景减法后产生的比率图像显示出低均匀的背景信号，从而产生了出色的信噪比，没有强烈的伪影和极端异常值（图4A，底板）。

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图 4. 比例图像处理。

A）对BaSiC，Mosaic和FRET-IBRA产生的比率图像的背景减去受体和供体图像进行了处理和比较。根据比率图像创建的表面图可以更好地概述每个软件的背景减法质量和信噪比（顶部：BaSiC，中间：Mosaic，底部：FRET-IBRA）。B） FRET-IBRA 通过稳健的重新缩放功能自动注册并重新缩放比率图像，以显示信号频谱的整个范围。

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从图4A中的FRET-IBRA处理图像中可以明显看出，映射完整的8位信号强度范围对于直观地表示所显示的钙水平的动态并不理想。原因是，即使是具有意外高值的单个异常值也会决定整个图像的比例因子。等效项也发生在前景信号范围的下端，导致相对狭窄的强度直方图和平坦的图像。因此，FRET-IBRA 对图像强度值的比率使用稳健的重新缩放（第 10—90 百分位）来揭示信号强度的隐藏动态。该比率图像的注册和重新缩放版本清楚地显示了尖端处钙离子的高分布，并且在尖端区域之外急剧下降。正如预期的那样，比率图像的信息质量在很大程度上取决于从输入堆栈中实现强大的信噪比，这反过来又高度依赖于背景减法算法。

FRET-IBRA是一款完全并行化、模块化且灵活的工具，为对FRET图像进行比率分析提供了完整的工作流程解决方案。该软件包已被证明可以校正阴影，有效地减去背景像素强度，并且比具有很少感兴趣对象的图像的同类软件包更有效地平滑背景噪点。此外，FRET-IBRA以模块化方式创建比率图像并执行光漂白校正，从而允许对大型图像堆栈进行有效的参数调整。应该注意的是，必须谨慎使用漂白校正，因为它可能导致伪影，例如掩盖真实信号强度变化或过度校正，如果提供的去趋势方法不合适，则会导致信号强度的错误增加。因此，有时可能建议接受所产生比率信号的整体衰减，以检测短期波动。或者，漂白校正可以使用FRET-IBRA以外的其他去趋势算法进行。由FRET-IBRA在生长中的花粉管的FRET图像上产生的图像已被证明具有高信噪比并且没有明显的伪影，从而可以进行准确的进一步定量或定性下游分析。此外，FRET-IBRA的灵活性使得不连续的框架能够轻松单独处理和校正，从而节省大量时间。FRET-IBRA在测试的各种荧光团中表现良好，包括生物传感器蛋白和荧光染料。也可以使用单个堆栈执行背景减法。

未来方向

虽然FRET-IBRA主要构建为使用基于配置文件的参数的命令行工具，但在Python3中实现的类是模块化的，可以轻松集成到更大的分析管道中。目前正在进一步开发中，以定位高比率强度的区域并跟踪其时变动态。

引用

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