厦门医学论文发表投稿-单价和治疗性多价抗蛇毒血清的交叉反应性和副特异性中和比较研究

瓦达拉古迪萨卢 D. 桑德沙，巴斯卡尔?达尔尚，钱德拉谢卡·特哈斯，凯斯图鲁·吉里什 ，肯帕拉朱·肯帕亚

出版日期： 2022年03月28日

抽象

驼峰蝮蛇（Hypnale hypnale hypnale）的毒液引起了人们的关注，因为它在印度的西高止山脉和邻近的岛国斯里兰卡造成了严重的衰弱和死亡。在印度，它的医学意义直到2007年才实现，因为它被误认为是Ekos carinatus，有时被误认为是Daboia russelii。最近，几份病例报告强调了针对H的现有多价抗蛇毒血清疗法的无能性。催眠毒液。目前，H.由于缺乏中和抗蛇毒血清疗法，催眠咬伤在印度仍然很可怕。因此，进行这项研究是为了建立斯里兰卡H的系统比较，生化，病理和免疫学特性。催眠毒液与印度E。Carinatus和D。毒液。3种毒液在蛋白水解、脱氧核糖核酸酶、L-氨基酸氧化酶、5'-核苷酸酶、透明质酸酶和间接溶血活性等生化活性程度上均存在显著差异。毒液的病理性质也存在显著差异，如水肿、出血、肌毒性、心脏毒性和凝血活性。毒液在蛋白质条带模式上显示出明显的差异。引人注目的是，亲和纯化的兔单价抗蛇毒血清制备了针对H.催眠， E.Carinatus和D。毒液很容易反应并中和其各自毒液的生化和病理特性，但它们与另外两种毒液的任何作用的交叉反应不显着，因此未能显示出对其他两种毒液的任何作用的副特异性中和，这表明这些毒液之间的很大差异。此外，来自VINS Bioproducts的印度治疗性多价抗蛇毒血清和Bharath血清和疫苗未能保护H。催眠毒液诱导的小鼠致命作用。

作者简介

在印度，"四大"蛇，即Naja naja，Bungarus cearuleus，Daboia russelii和Echis carinatus被认为具有医学意义。因此，制备治疗性多价抗蛇毒血清来对抗所述蛇的毒液混合物。在印度，催眠催眠叮咬的可怕影响直到2007年才被发现，因为它被误认为是Echis carinatus和/或Dabonia russelii咬伤。来自印度和斯里兰卡的几份病例报告强调了印度治疗性抗蛇毒血清对H的无能。催眠毒液。作为H。催眠毒液不在印度销售，斯里兰卡H。将催眠毒液与印度E进行比较。Carinatus和D。毒液的生化，病理和免疫特性。毒液在上述性质上有很大不同。兔单价抗蛇毒血清H.催眠， E.Carinatus和D。russelii毒液中和了各自毒液的活动，但它们与其他两种毒液的影响发生了显着的交叉反应，并且未能显示出副特异性中和作用。此外，来自VINS的治疗性多价抗蛇毒血清，而Bharat未能中和H。催眠毒液诱导的小鼠致命毒性。因此，这项研究迫切需要合适的抗蛇毒血清来治疗可怕的H。印度的催眠叮咬。

引文： Sandesha VD，Darshan B，Tejas C，Girish KS，Kempaiah K （2022）关于Hypnale催眠，Echis carinatus和Daboia russelii单价和治疗性多价抗蛇毒血清的比较交叉反应性和副特异性中和研究。PLoS Negl Trop Dis 16（3）：e0010292。https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292

编辑 器： Nicholas R. Casewell，利物浦热带医学院，英国

收到： 七月 28， 2021;接受： 三月 1， 2022;发表： 三月 28， 2022

版权所有： ? 2022 Sandesha et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

资金： 作者没有为这项工作获得任何具体资金。

相互竞争的利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。

介绍

尽管世界卫生组织（WHO）宣布蛇咬伤是一种被忽视的热带病，但蛇咬伤仍然是一个被忽视的公共卫生危机。在全球范围内，蛇咬伤每年导致约81000至138000人死亡，大约三分之一的受害者患有永久性身体残疾和毁容[1]。亚洲、非洲和拉丁美洲的贫困农村人口受到严重影响[2，3]。基本上，印度是一个农业国家，因为超过一半的人口通过农业和农业谋生。因此，预计蛇与人之间的冲突会很高。印度的年死亡率约为58，000人，残疾率约为140，000人，是全球蛇咬伤的热点[1]。截至目前，所谓的四大蛇，常见的眼镜眼镜蛇（Naja naja），普通krait（Bungarus caeruleus），罗素的毒蛇（Daboia russelii）和锯鳞蝰蛇（Echis carinatus）是该国医学上关注的物种。这是基于它们在广阔的地理区域内相对密集的分布。因此，治疗性抗蛇毒血清是针对上述四种毒液的混合物制成的。虽然有多价抗蛇毒血清疗法可用，但印度的高伤亡率可能是由于难以获得，或者抗蛇毒血清治疗的成功率低，或者被其他医学上重要但被忽视的毒蛇毒液毒害。顺便说一句，在最近的一项研究中，Senji Laxme等人[4]描述了来自四大物种的被忽视的亲戚的毒液的组成，生化和病理效应以及毒性特征的高度可变性。它们是Naja kaouthia（阿鲁纳恰尔邦和西孟加拉邦），Bungarus fasciatus（西孟加拉邦），Bungarus sindanus和Echis carinatus sochureki（拉贾斯坦邦）。该研究强调，四种商业印度抗蛇毒血清对上述被忽视的蛇毒的交叉中和能力显着降低[4]。同样，毒蛇驼峰鼻蝮蛇（Hypnale hypnale）凭借其丰富的生物多样性和区域特定的生态系统，在印度西高止山脉地区（喀拉拉邦）以及邻近的岛国斯里兰卡也密集分布[5，6]。已知催眠管咬伤会引起危及生命的全身性并发症，例如出血、凝血功能障碍、纤维蛋白溶解、血小板减少症、严重出血和急性肾功能衰竭。此外，它会导致咬伤部位的衰弱组织坏死[7，8]。直到最近，它可怕的毒咬还被误认为是E。carinatus，或有时作为D。Russelii咬人，因为这三条毒蛇在身体上非常相似[5]。考虑到其相当广泛的分布和咬伤的严重程度，世卫组织在2010年安排了H.催眠作为具有医学意义的I类蛇[9]。斯里兰卡医务人员强烈强调进口的印度多价抗蛇毒血清（来自哈夫金研究所）的药物治疗无效，特别是针对H.催眠毒液。然而，最近，印度医务人员也意识到了这种不适应[5，10，11]。目前，正在真诚地努力整合H。在斯里兰卡，将毒液催眠到抗蛇毒血清制造方案中[12]。不幸的是，印度同行尚未意识到特异性抗蛇毒血清治疗H的重要性。催眠咬。因此，在没有有效的抗蛇毒血清治疗的情况下，H.催眠毒液仍然是灾难性的，并受到人类痛苦的困扰。因此，迫切需要适当的治疗性抗蛇毒血清。因此，在目前的研究中，已经进行了更系统和比较的调查，以证明斯里兰卡H的交叉反应性和副特异性中和的程度。催眠毒液与印度E。Carinatus和D。罗素毒液针对各自的单价抗蛇毒血清和商业治疗性多价抗蛇毒血清。

材料和方法

道德声明

所有实验均由迈索尔大学迈索尔大学迈索尔分校的机构人类伦理委员会（IHEC-UOM No. 70/Res/2020-21）批准，并根据伦理准则进行。

所有动物实验均由迈索尔大学动物学研究系机构动物伦理委员会（UOM/IAEC/04/2020）批准，并符合动物实验控制和监督委员会（CPCSEA）的指导方针。

化学品和试剂

蛋白-A琼脂糖，山羊抗兔IgG，3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB），immobilon-P PVDF膜，鲁米诺，对香豆酸，弗氏完全和不完全佐剂，睾丸透明质酸酶，透明质酸，邻二茴香苷，辣根过氧化物酶（HRP）250U，所有化学品均来自美国圣路易斯的Sigma。氯化钠，牛血清白蛋白，Folin-Ciocalteu试剂，盐酸三酯，酪蛋白，明胶，三氯乙酸，碳酸钠，氯化钙，氯化镁，丙烯酰胺和双丙烯酰胺，十二烷基硫酸钠（SDS），过硫酸铵，四甲基乙二胺（TEMED），甲酸钠，triton X-100，阿尔西安蓝，乙酸，三乙醇胺，L-亮氨酸，甲醇和所有其他化学品均从印度孟买的Sisco Research Laboratories（SRL）购买。HRP偶联山羊抗马IgG（H + L）从KINESISDx，South Paseo Dr，Brea，CA 90603，USA购买。分子量标记来自Genetix Biotech。亚洲私人有限公司 印度班加罗尔。LDH，CK和CK-MB试剂盒是从印度喀拉拉邦的AGAPPE Diagnostics Ltd.购买的。Liquicelin-E和Uniplastin试剂从TULIP Diagnostics （P） Ltd. India购买。

蛇毒和抗蛇毒血清

卡纳塔克邦政府卡纳塔克邦森林部（野生动物）首席首席保护员和首席野生动物管理员（野生动物许可号。PCCF （WL）/E2/CR-08/2019-20），以许可采购和利用毒液用于研究目的。催眠催眠毒液（Hhv）是从Latoxan实验室购买的，（Lot.No. 317.081 & Product ID;L1602）法国，因为它不在印度销售。毒液是一个水池，从斯里兰卡收集的几个标本中获得。Daboia russelii venom（Drv）和Echis carinatus venom（Ecv）是从印度孟买的Haffkine研究所购买的，毒液是从印度马哈拉施特拉邦不同地区收集的几个标本中获得的。使用了以下多特异性抗蛇毒血清：（a）VINS生物制品有限公司的蛇毒抗蛇毒血清（印度）（批号01AS14075，有效期：04/21用于所有中和研究，因为抗蛇毒血清已经耗尽，新一批抗蛇毒血清，批号01AS21057，有效期：07/25被采购用于按照审稿人建议在手稿修订期间重复蛋白质印迹实验）;（b） 来自巴拉特血清和疫苗的蛇毒抗蛇毒血清（印度）（批号：A05320019，有效期：05/24）。

采集人体血液

根据迈索尔大学（UOM）迈苏鲁机构人类伦理委员会（IHEC）的指导方针，从健康成年志愿者的前静脉收集人类血液，这些志愿者获得了书面知情同意。

蛋白质估计和毒液和抗蛇毒血清的稀释

蛋白质含量是根据Lowry等人的方法估计的。使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准[13]。亲和纯化的单价抗蛇毒血清H.催眠抗蛇毒血清（HhAV），E。Carinatus anti-venom （EcAV） 和 D.将罗塞利抗蛇毒血清（DrAV）在磷酸盐缓冲盐水（10mM PBS pH 7.4）中独立稀释至10mg / ml储备液。根据制造商的说明，将治疗性多价抗蛇毒血清溶解在无菌水中，BhAV的估计产量为10 mg / ml，ViAV的估计产量为7.5 mg / ml。将冻干的Hhv，Ecv和Drv样品制成PBS中的10mg / ml储备液。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

根据Laemmli的方法，将毒液样品置于SDS-PAGE（10%和12.5%，在非还原和还原条件下），以使用Bio-Rad（Mini-PROTEAN Tetra Cell）单元获得Hhv，Ecv和Drv（各25μg）的蛋白质条带模式[14]。电泳后，用0.25%考马斯亮蓝R-250染色凝胶，脱色后观察蛋白质。此外，使用HP Scanjet（型号-G2410）扫描了图像。

底物-凝胶检测

酪蛋白，明胶和透明质酸酶谱测定通过将0.2%酪蛋白和明胶以及0.017%透明质酸分别掺入10%聚丙烯酰胺凝胶中独立进行。在非还原条件下，将毒液，Hhv，Ecv和Drv，酪蛋白溶解和糊解活性各5-30μg，透明质酸酶活性各50μg加载到SDS-PAGE上。电泳后，用含有2.5%Triton X-100的10mM磷酸钠缓冲液（pH 7.6）洗涤酪蛋白/明胶酶图约一小时，间隔20分钟洗涤三次，然后水洗以除去Triton X-100。然后将凝胶与含有10mM CaCl的50mM Tris-HCl缓冲液pH 7.6孵育过夜2和150 mM NaCl在37°C。 最后，用考马斯亮蓝R-250染色凝胶。对于透明质酸酶活性，将凝胶连续浸泡3次于50ml含有0.15M NaCl，2.5%Triton X-100的0.1M磷酸钠缓冲液pH 5.8中1小时。随后在含有0.15M NaCl的0.1M甲酸钠缓冲液pH 5.0中平衡凝胶，在37°C下持续搅拌20小时。将凝胶在0.015 M Tris-HCl缓冲液pH 7.9中洗涤，并置于Alcian蓝色染色溶液中。在所有三种情况下，未消化的相应底物的蓝色背景上的透明区域表明毒液的酶活性[15，16]。此外，使用HP Scanjet（型号-G2410）扫描了图像。

蛋白水解活性

蛋白水解活性如Satake等人所述确定。简而言之，将50μg/ml的Hhv，Ecv和Drv与0.4ml酪蛋白（2%）在0.2M Tris-HCl缓冲液pH 8.5中独立孵育，最终反应体积为1ml在37°C下2.5小时。通过加入1.5ml 0.44M三氯乙酸停止反应，保持30分钟，并在90×g下离心15分钟。进一步将1ml上清液与2.5ml 0.4M碳酸钠溶液和0.5ml Folin-Ciocalteau试剂（1：2，v / v）混合，在室温下静置30分钟，并在660nm处测量吸光度。活性以单位表示，其中一个单位被定义为在37°C下以660nm / min时将吸光度增加0.01 OD所需的毒液量。 对于体外中和研究，将Hhv（50μg/ ml），Ecv（50μg/ ml）和Drv（100μg/ ml）在室温下独立预孵育各种剂量（250-5000μg/ ml）的抗蛇毒血清（HhAV / EcAV / DrAV / BhAV / ViAV）15分钟。然后，如上所述，通过加入1ml缓冲底物溶液来测定蛋白水解活性。单独的毒液作为对照实验。

脱氧核糖核酸酶活性

通过进行琼脂糖凝胶电泳测定脱氧核糖核酸酶（DNase）活性。简而言之，将50μgHhv，Ecv和Drv与250ng小牛胸腺DNA独立孵育60分钟，在37°C下以30μl（PBS）的最终体积孵育。将反应混合物在TAE缓冲液（40mM Tris-base和1mM EDTA，pH 8.0）中以50 V在1.2%琼脂糖凝胶上电泳1小时。DNase 1（10 U）作为阳性对照。电泳后，凝胶被可视化并在紫外线透射仪上拍摄（联盟2.7，Uvitech）[18]。

溶血活性

根据Boman&Kaletta的方法测定溶血活性[19]，并使用洗涤的人红细胞进行微小的修改。简而言之，对于间接溶血活性，使用悬浮在10 mM PBS pH 7.4（比例1：1：8; v / v）中的包装人红细胞和蛋黄。对于直接溶血活性，取1ml填充的红细胞并在PBS中制成高达10mL。在任何一种情况下，将1ml悬浮液与10μg/ ml Hhv，Ecv和Drv分别独立孵育1小时，在370C.通过加入9mL冰冷PBS并在4处以1000×g离心10分钟来停止反应0C.在540nm处测量上清液中释放的血红蛋白量。活性表示为溶血与水100%细胞裂解的百分比。对于体外中和研究，Hhv，Ecv和Drv各20μg/ ml在室温下独立预孵育各种剂量（100-2000μg/ ml）的抗蛇毒血清（HhAV / EcAV / DrAV / BhAV / ViAV）15分钟。然后，如上所述，通过加入1ml各自的红细胞悬浮液来独立测定各自的溶血活性。单独的毒液被用作对照实验。

L-氨基酸氧化酶活性

L-氨基酸氧化酶活性通过Tan和Tan[20]的方法测定，几乎没有修饰。反应体积1ml含有50μl过氧化物酶（0.007%，510 NIH单位/ mg），0.1%L-亮氨酸和0.0065%邻二亚尼西定在0.2 M三乙醇胺缓冲液pH 7.6中，并在室温下孵育3分钟。然后，独立加入Hhv，Ecv和Drv各50μg/ ml，并在440nm处监测吸光度的增加。一个单位的活性被定义为在440nm / min下导致外径增加0.001所需的酶量。对于体外中和研究，将100μg/ ml的Hhv，Ecv和Drv分别用各种剂量（500-10000μg/ ml）的抗蛇毒血清（HhAV / EcAV / DrAV / BhAV / ViAV）在室温下独立预孵育15分钟。然后，如上所述，通过加入1ml反应混合物来测定L-氨基酸氧化酶活性。单独的毒液作为对照实验。

5'-核苷酸酶活性

5'-核苷酸酶活性通过Avruch和Wallach[21]的方法通过微小的修改来确定。反应体积为1毫升，含有10mM MgCl2将 50 mM NaCl、10 mM KCl、50 mM Tris-HCl 缓冲液 pH 7.4 和 10 mM AMP 独立孵育，分别与 Hhv （15 μg/ml）、Ecv （30 μg/ml） 和 Drv （40 μg/ml） 在 37 分钟孵育 30 分钟0C.使用抗坏血酸法[22]测定释放的无机磷酸盐。测定1ml抗坏血酸试剂，在1N硫酸中含有等量的0.42%钼酸铵，并向反应混合物中加入10%抗坏血酸和水。然后，将反应混合物在室温下保持30分钟，并在660nm处监测吸光度。通过与使用KH建立的参考曲线进行比较来量化2采购订单4.一个单位的5'-核苷酸酶活性以μmoles/min/μg为单位的无机磷释放来表示。对于体外中和研究，将Hhv（15μg/ ml），Ecv（30μg/ ml）和Drv（40μg/ ml）在室温下独立预孵育各种剂量（75-1500μg/ ml）的抗蛇毒血清（HhAV / EcAV / DrAV / BhAV / ViAV）15分钟。然后，如上所述，通过加入1ml反应混合物来测定5'-核苷酸酶活性。单独的毒液作为对照实验。

血浆再钙化时间

根据Condrea等人的方法测定血浆凝血剂活性。简而言之，新鲜的健康人血液与3.2%柠檬酸三钠以9：1（v / v）的比例混合。将血液在500×g下离心15分钟。将获得的上清液用作贫血小板血浆（PPP），预热至370C 使用前。PPP，将0.2ml与10μlTris-HCl缓冲液（10mM，pH 7.4）混合并在37处孵育0C为1分钟，Hhv，Ecv和Drv，分别独立地将10μg/ ml加入PPP中，然后快速加入20μL0.25M CaCl2.凝血时间以秒为单位记录在光源上。通过加入20μlCaCl来记录PPP的正常凝血时间2.对于体外中和研究，Hhv，Ecv和Drv，在室温下将20μg/ ml与各种剂量（100-2000μg/ ml）的抗蛇毒血清（HhAV / EcAV / DrAV / BhAV / ViAV）预育15分钟。然后，如上所述通过添加PPP来确定凝血剂活性。单独的毒液被用作对照实验。

活化部分凝血活酶时间和凝血酶原时间

将Hhv，Ecv和Drv（5μg/ ml）与PPP（100μl）独立预孵育1分钟，在370C.对于活化部分凝血活酶时间（APTT）测定，加入100μl试剂（LIQUICELIN-E，来自兔脑的磷脂制剂与鞣花酸）并在37处孵育3分钟0C.通过添加100μl0.02M CaCl开始凝固2凝血时间以秒为单位记录。对于凝血酶原时间（PT）测定，通过添加200μlPT试剂（UNIPLASTIN，兔脑凝血活酶）开始凝血。形成可见凝块所需的时间以秒为单位记录。根据与缓冲液孵育相同周期的对照血浆值计算每个点PT的APTT比值和国际归一化比（INR）。对于体外中和研究，Hhv，Ecv和Drv各20μg/ ml在室温下独立预孵育各种剂量（100-2000μg/ ml）的抗蛇毒血清（HhAV / EcAV / DrAV / BhAV / ViAV）15分钟。然后，通过添加PPP进行如上所述的APTT和PT测定。单独使用各自的毒液作为对照实验[24]。

凝血酶样活性

凝血酶样活性根据Denson描述的方法测定，并进行微小的修改[25]。简而言之，使用100μl含有人纤维蛋白原（3mg / mL），10mM NaCl在10mM Tris-HCl缓冲液pH 7.6中的反应混合物。通过添加10μg/ ml的Hhv，Ecv和Drv独立地开始凝块形成。凝血时间以秒为单位记录。Tris-HCl缓冲液中单独使用纤维蛋白原作为阴性对照，凝血酶的10U作为阳性对照。对于体外中和研究，Hhv，Ecv和Drv各20μg/ ml在室温下独立预孵育各种剂量（100-2000μg/ ml）的抗蛇毒血清（HhAV / EcAV / DrAV / BhAV / ViAV）15分钟。然后，通过如上所述加入反应混合物来测量凝血酶样活性。单独的毒液被用作对照实验。

纤维蛋白原溶解活性

纤维蛋白原溶解活性是按照欧阳等人描述的方法进行的。简而言之，将各种量的Hhv，Ecv和Drv与纤维蛋白原（50μg）在37处独立孵育60分钟。0C在含有10 mM NaCl和10μl（10mM）Tris-HCl缓冲液pH 7.6的40μl反应混合物中。然后，加入20μl变性缓冲液（0.5M Tris-HCl，pH 6.8，1M尿素，4%SDS和4%β-巯基乙醇）并在10%SDS-PAGE上进行分析。通过用考马斯亮蓝R-250染色来观察条带图案[27]。此外，使用HP Scanjet（型号-G2410）扫描了图像。

纤维蛋白溶解活性

将正常人柠檬酸盐血液在500×g下离心15分钟以分离PPP。然后，将100μlPPP与等体积的0.025M氯化物混合237时30分钟0C得到软纤维蛋白凝块。将纤维蛋白凝块用10 mM PBS pH 7.6彻底洗涤5-6次。将洗涤的纤维蛋白凝块与5和10μgHhv，Ecv和Drv在含有10mMTris-HCl缓冲液pH 7.6的40μl反应混合物的最终体积中独立孵育0C 5小时。通过加入含有4%SDS，1M尿素和4%β-巯基乙醇的20μL样品缓冲液停止反应。将样品煮沸3分钟并离心以沉降血浆凝块的碎片。在7.5%SDS-PAGE中分析了3μl上清液的等分试样中纤维蛋白降解产物[27]。此外，使用HP Scanjet（型号-G2410）扫描了图像。

实验动物

瑞士白化病小鼠（20-25g）从大学中央动物设施收集，并饲养在特定的无病原体条件下，用水和食物。新西兰白母兔，6个月大，体重1.5-2.0公斤，从印度班加罗尔兽医学院畜牧生产和管理系获得，并在特定的无病原体条件下饲养，在大学中央动物设施中用水和食物。

水肿诱导活性的小鼠模型

根据Yamakawa等人的方法测定水肿诱导活性。简而言之，将小鼠组（n = 3）独立地将不同剂量的Hhv，Ecv和Drv以20μlPBS注射到右脚垫中，将左脚垫注射20μlPBS作为阴性对照。一小时后，使用过量（5-10mg / kg ip）的西拉嗪对小鼠实施安乐死，在踝关节处解剖腿部并称重。由于水肿引起的体重增加计算为水肿比，其等于水肿腿的重量×阴性对照腿的100 /重量。最小水肿剂量（MED）定义为引起120%水肿比所需的毒液量。对于体内中和研究，在如上所述的给药前，将Hhv（5μg），Ecv（5μg）和Drv（10μg）与各种剂量（50-500μg）的抗蛇毒血清（HhAV / EcAV / DrAV / BhAV / ViAV）独立预孵育15分钟。此外，老鼠腿的照片是使用iPhone 11 Pro（Model-A2215）拍摄的。

出血活动小鼠模型

出血活性的分析如近藤等人所述。将30μlPBS中不同剂量的Hhv，Ecv和Drv独立地皮内注射到小鼠皮肤中（n = 3）。单独接受PBS的小鼠组作为阴性对照。3小时后，使用过量剂量（5-10mg / kg ip）的木氮嗪对小鼠实施安乐死，并小心地去除皮肤的背侧斑块并观察皮肤内表面的出血与PBS注射的对照小鼠皮肤。皮肤内表面出血斑点的直径以毫米为单位测量2.MHD（最小出血剂量）被定义为产生10毫米所需的最小毒液剂量2出血性斑点直径。对于体内中和研究，在如上所述的给药前，将5μgHhv，Ecv和Drv与各种剂量（50-500μg）的抗蛇毒血清（HhAV / EcAV / DrAV / BhAV / ViAV）在室温下独立预孵育15分钟。此外，老鼠皮肤的照片是使用iPhone 11 Pro（型号-A2215）拍摄的。

使用小鼠模型测定毒液的致死率

50%的试验动物死亡的毒液的平均致死剂量（LD50）使用一组重20-25g的10只小鼠测定。毒液通过腹膜内（ip）途径注射，相应的剂量范围为1至10mg / kg体重，在0.1mlPBS中。观察毒性的症状和体征，记录每只动物的存活时间24小时。最后，LD50值是根据迈尔和西克斯顿的数学方案确定的[30]。对Hhv，Ecv和Drv进行了独立实验。

毒液诱导尾部组织破坏的小鼠模型

将小鼠组（n = 3）皮下注射LD50Hhv（3.5mg / kg），Ecv（2.5mg / kg）和Drv（3.0mg / kg）的剂量在50μlPBS pH 7.4中进入距离尾尖3cm的小鼠尾巴。注射50μlPBS的小鼠作为对照组。通过视觉判断尾部损伤的严重程度，并根据10分制进行评分;0 = 无损伤，1 = 水肿，2 = 水肿伴轻微出血，4 = 水肿伴出血导致尾部变色小于 25%，6 = 水肿，大出血或伤口导致 25-50% 尾部变色，8 = 水肿，以及大出血或伤口引起 50-75% 尾部变色，10 = 水肿，以及大出血或伤口导致 75% 以上的尾部变色。尾部损伤观察记录为毒液注射后2 d[18]。此外，老鼠尾巴的照片是使用iPhone 11 Pro（Model-A2215）拍摄的。

肌毒性和心脏毒性的小鼠模型

根据Gutierrez等人的方法测定肌毒性。在小鼠血清中测定细胞质标记酶，乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）水平。将小鼠组（n = 4）独立肌内注射（i.m）到大腿肌肉中，LD50每种毒液的剂量，Hhv（3.5mg / kg），Ecv（2.5mg / kg）和Drv（3.0mg / kg）在50μlPBS中。单独接受50μlPBS的小鼠组作为对照实验。24小时后，使用木肼（1-4mg / kg ip）麻醉小鼠，并通过心脏穿刺抽血。使用AGAPPE诊断试剂盒测定获得的血清的LDH，CK和CK-MB活性。活动以单位/L表示。对于体内中和研究，在10分钟毒液注射后，ED50的HhAV（140mg / kg）和EcAV，DrAV，BhAV和ViAV，700mg / kg静脉注射（i.v.）到小鼠尾巴中。24小时后麻醉小鼠，抽血制备血清。然后，如上所述进行测定。

兔免疫、抗蛇毒血清制备、IgG级分的亲和纯化

兔子的免疫和抗体的纯化按照Shashidharamurthy等人的描述进行。简而言之，将100μgHhv，Ecv和Drv独立溶解在100μlPBS（10mM，pH 7.4）中，与等体积的Freund完全佐剂充分混合，并在雌性兔背部的不同部位（40-50μl在4-5个部位）皮内注射（i.d.）。以相同剂量施用三种加强剂量的毒液，但每周间隔使用相同体积的Freund不完全佐剂。从9的边缘耳静脉抽取约15ml血液千第三次加强剂量后的第二天，并在8-10下凝固24小时0C获得抗血清。在每种情况下，对约10ml抗血清进行硫酸铵沉淀以获得粗免疫球蛋白G级分，其经蛋白质-A琼脂糖亲和柱色谱法。将柱与PBS平衡，并在2mlPBS中加载5mg粗免疫球蛋白G级分。使用0.2M甘氨酸-HCl缓冲液，pH 2.9进行洗脱。在读取280nm处的光密度后，收集1ml等分试样并汇集，然后使用1M Tris-HCl缓冲液pH 8.0中和。进一步将样品使用3.4 kDa膜对PBS透析24小时，在40因此，获得的单价抗蛇毒血清被指定为H。催眠抗蛇毒血清（HhAV），E。Carinatus anti-venom （EcAV） 和 D.罗素抗蛇毒血清（DrAV）并用于中和研究。

蛋白质印迹

简而言之，根据Laemmli的方法，25μg的Hhv，Ecv，Drv和BSA分别独立地进行SDS-PAGE（10%，非还原性）[14]。电泳后，使用含有0.12 M Tris-甘氨酸转移缓冲液pH 8.3的转移单元（Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell）将蛋白质转移到PVDF膜上。在100 V下在4下进行印迹90分钟0C.为了检查蛋白质转移到PVDF膜的程度，使用Ponceau-S可逆染色剂。用TBST（10mM Tris-HCl缓冲液pH 8.0，含有150mM NaCl和0.05%吐温-20）封闭膜，其中含有5%脱脂奶粉+ 1%BSA1小时。阻断后，用洗涤缓冲液（TBST）洗涤印迹（3-4次），然后用一抗HhAV / EcAV / DrAV / BhAV / ViAV / ViAV / 预免疫兔血清（稀释; 1：20，000）在室温下孵育3小时。用TBST洗涤（3-4次）后，将印迹与辣根过氧化物酶（HRP）偶联二抗（1：10，000稀释液;山羊抗兔/山羊抗马）在室温下孵育1小时。然后用洗涤缓冲液（TBST）洗涤印迹（3-4次），并使用增强型化学发光方法进行开发，并使用化学发光系统（Bio-Rad ChemiDoc-MP，美国）进行可视化。

酶联免疫吸附测定 （ELISA）

简而言之，将96孔滴度板独立涂覆100ng的Hhv，Ecv和Drv（毒液/缓冲液，w / v），用0.2M碳酸盐 - 碳酸氢盐缓冲液pH 9.6制备，并在4下孵育过夜0C.对于空白，用100μl封闭缓冲液（0.2M碳酸盐 - 碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6含有5%脱脂牛奶+ 1%BSA）包衣孔。在每个阶段之后，使用5-6次洗涤缓冲液-PBST（10 mM PBS，pH 7.4含有0.2%吐温-20）洗涤板。然后将板与封闭缓冲液在室温下孵育1小时以阻断非特异性反应性。在PBS中以1mg / ml的初始浓度服用抗血清/抗蛇毒血清（HhAV / EcAV / DrAV / BhAV / ViAV），随后以1：5的初始稀释度加入随后的稀释液，然后在PBS中以1：5的连续稀释度递增。用PBST洗涤孔，然后向每个孔中加入100μl稀释的抗蛇毒血清，并在4处孵育过夜0C.然后，洗涤板并与二抗（PBS中的1：10，000稀释液，v / v）在室温下与辣根过氧化物酶偶联1小时孵育。然后，洗涤板并将100μl未稀释的显色底物TMB加入到每个孔中并在室温下孵育30分钟。通过加入50μl1N H停止反应2所以4.使用Biotek ELx 800-ELISA读板仪在405nm处读取开发的颜色，随后计算抗血清/抗蛇毒血清（HhAV/EcAV/DrAV/BhAV/ViAV）的滴度值[33，34]。

中位有效剂量（ED）的测定50）使用小鼠模型的抗蛇毒血清

在H10分钟后，通过尾静脉（i.v.）独立注射七组小鼠（n = 6）不同剂量（70-700mg / kg）的HhAV / EcAV / DrAV / BhAV / ViAV。催眠毒液 （2 LD50;7毫克/千克）注射液（IP）。将小鼠置于观察状态下24小时，并记录死亡时间。通过注射2个LD独立进行实验50的Ecv（5毫克/千克）和Drv（6毫克/千克）。注射2 LD的独立小鼠组50Hhv，Ecv和Drv单独，以及一组单独接受PBS的小鼠作为对照实验。通过构建Kaplan-Meier生存曲线对小鼠进行生存率分析，使用对数秩（Mantel-Cox）测试计算p值[18]。抗蛇毒血清的中和能力表示为中位有效剂量（ED50），即毒液/抗蛇毒血清比率，其中一半的注射小鼠种群受到保护。毒液通过腹膜内（ip）途径注射。如果通过静脉注射（i.v.）途径注射，动物会在注射救生抗蛇毒血清之前死亡。腹腔内（ip.）毒液注射途径已在我们的实验室/部门以及其他实验室实施[35，36]。

统计分析

结果表示为三个独立实验的平均±SEM。使用单因素/双向方差分析确定统计学意义，然后根据需要进行Bonferroni后检验。在 p>0.05 （ns）、p< 0.05 （*）、p < 0.01 （**）、p< 0.001 （***） 和 p < 0.0001 （****） 时均可接受显著性。使用统计包GraphPad Prism（GraphPad Software 8.0，美国）分析数据。使用Microsoft Excel（Ver. 2019，USA）计算抗蛇毒血清有效剂量（ED）的置信区间（95%）。

结果和讨论

H.催眠， E.Carinatus和D。毒液

蝮蛇的毒液，H。催眠和其他毒蛇（如E）的毒液一样严重。Carinatus和D。印度次大陆的russelii[5，37，38]。H. hypnale是印度西高止山脉和斯里兰卡岛国的特有种，而E。Carinatus 和 D.罗塞利是次大陆的特有种[39]。这三种毒蛇的毒液主要扰乱止血系统，导致致命的出血并发症。此外，它们还已知会在咬伤部位造成毁灭性的组织坏死。因此，在本研究中，H.催眠毒液与其E毒液的生化，病理学和免疫学特性进行了比较研究。Carinatus和D。Russelii.由于后两个物种的毒液在许多实验室中进行了深入研究[12，40-43]，因此在本研究中，仅在必要时才比较它们的特性。在非还原条件下，所有三种毒液在SDS-PAGE（10%）中都显示出独特的蛋白质条带模式。中低分子量蛋白条带在H中可见。催眠毒液与E相比。Carinatus 和 D.罗素毒液显示出大范围、大、中、小分子量的蛋白质条带（图1A）。图中提供了对每种毒液的蛋白质条带的相应密度扫描分析（S1图）。此外，当毒液在10%和12.5%凝胶（SDS-PAGE在还原和非还原条件下）中溶解时，三种毒液中没有一个显示出分子量范围小于10 kDa的显眼蛋白条带（S1C和S1D图）。崩解素（5-8 kDa）在毒蛇毒液中含量丰富[44]，然而，在我们的研究中，SDS-PAGE没有揭示它们的存在。详细的LC-MS / MS研究将揭示它们在这三种毒液中的存在。然而，最近的蛋白质组学研究使用从单个印度H收集的毒液样本。Vanuopadath等人的催眠[45]揭示了属于九种不同的酶和非酶蛋白家族的37种蛋白质。它们包括丝氨酸蛋白酶，金属蛋白酶，磷脂酶A2、凝血酶样酶、磷脂酶 B、C 型凝集素/镰刀、崩解剂、富含半胱氨酸的秘书蛋白和神经生长因子。此外，对斯里兰卡H的广泛蛋白质组学研究。催眠毒液显示含有或多或少相似的蛋白质家族，但还含有激肽释放酶和L-氨基酸氧化酶[46-48]。在我们的研究中，H.催眠， E.Carinatus和D。在酶谱中，毒液在酪蛋白溶解（图1B-1D）和明胶溶解（图1E-1G）活性条带模式上存在显着差异。图中给出了这些毒液的酪蛋白溶解和明胶溶解酶图以及阴性对照BSA和阳性对照胰蛋白酶（S2图）。H. hypnale毒液揭示了高含量的蛋白水解活性，这可以从各自凝胶中其他两个毒液上强烈的半透明酪蛋白溶解和凝胶溶解活性条带来证明。H. hypnale毒液在酪蛋白上容易水解明胶，这与酪蛋白酶图相比，明胶酶图中的活性带相对强烈。然而，估计H的酪蛋白溶解活性。催眠毒液被发现更高，分别比E高3倍和50倍。Carinatus和D。罗素毒液（表1）。这支持了在H中观察到的强烈的蛋白水解活性条带。催眠毒液与E.Carinatus 和 D.酪蛋白和明胶酶合谱中的毒液。因此，这些毒液的估计酪蛋白溶解活性随H而变化。催眠 > E.carinatus > D.毒液。几项研究报告了这三种毒液的广泛蛋白水解活性（丝氨酸和金属）[9，49，50]。催眠毒液在酶学中其透明质酸酶活性条带模式不同，因为它在大约70 kDa和20 kDa区域中显示出不同的活性带，而E.Carinatus 和 D.罗素毒液揭示了70 kDa及以上区域的活动带（S3图）。因此，这两种毒液可能具有相似的透明质酸酶活性。作为一种"传播因子"，发现透明质酸酶活性强烈参与蛇毒的局部和全身毒性[51]。此外，H.催眠毒液表现出较强的5'-核苷酸酶活性，活性随H而变化。催眠>D.罗素>E.肉毒。该酶被发现与抗凝血活性有关[22]。所有三种毒液似乎都具有几乎相似的间接溶血活性，对应于磷脂酶A2（解放军2）蛇毒的活性。解放军2酶是蛇毒酶毒的主要家族之一。有趣的是，大多数解放军2酶本质上是多功能的，它们以诱导多种病理特性（模仿整个毒液病理学）以及催化活性而闻名。因此，它们是特别关注的分子，并进行了广泛的结构-功能关系研究[52-54]。它们被分离出来，并广泛地从蛇毒中表征，包括H。催眠， E.Carinatus和D。毒液[55-57]。同样，H.催眠， E.Carinatus和D。毒液揭示了几乎相似的L-氨基酸氧化酶活性。已知L-氨基酸氧化酶具有各种生物学和病理作用，例如血小板聚集、出血和细胞毒性，以及诱导细胞凋亡[58]。定量蛋白水解、间接溶血、5'-核苷酸酶和L-氨基酸氧化酶活性汇总于表1。引人注目的是，所有三种毒液都没有降解小牛胸腺DNA（S4图），因此由于缺乏脱氧核糖核酸酶（DNase）活性而表现出高度的相似性。然而，在最近的一项研究中，Senji Laxme等人[59]在D的毒液样本中显示出异常高的DNA酶活性。来自旁遮普地区的russelii，而来自印度其他地理区域的毒液样本记录了低至可忽略不计的DNA酶活性。发现DNA酶活性与蛇毒的全身和局部毒性密切相关。抑制N的DNA酶活性。naja毒液显着增加了小鼠的存活时间，同时将DNase-I添加到E中。蛭蛆虫毒液大大增强了致死效力，并降低了毒液局部毒性的程度[18]。因此，探索H可能的DNA酶活性是有趣和重要的。催眠和E.来自不同地理来源的肉毒[60]。

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图 1. SDS-PAGE模式和H的酶学。催眠， E.Carinatus和D. russelii venoms。

（A） SDS-PAGE（10%）毒液的条带模式;使用Hhv，Ecv和Drv（各25μg）并在非还原条件下进行分析。对于酶谱分析，独立研究了毒液Hhv，Ecv和Drv在底物凝胶测定中的蛋白水解活性条带模式。B-D和E-G分别代表三种毒液的酪蛋白溶解活性和明胶溶解活性。将底物，酪蛋白和明胶（0.2%）掺入各自的凝胶（10%）中。SDS-PAGE是在非还原条件下进行的。在各自凝胶中的泳道1-4中，使用不同剂量的5，10，20和30μg毒液。M表示以kDa为单位的分子量标记。蓝色背景上的透明半透明区域表示凝胶中的相应活性。这些图像是使用HP Scanjet（型号-G2410）捕获的。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.g001

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表 1. 蛋白酶活性;一个单位的活性被定义为在660nm / min（a）下导致外径增加0.01所需的酶量。

间接溶血活性;它表示为溶血的百分比（b）。直接溶血活性;它表示为溶血的百分比（c）。L-氨基酸氧化酶活性;一个单位的活性被定义为在440nm / min（d）下使外径增加0.001所需的酶量。5'-核苷酸酶活性;一个单位的活性表示为μ摩尔/分钟/μg蛋白质（e）中无机磷的释放。数据显示为均值± SEM （n = 3）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.t001

H. 的比较病理特性催眠， E.Carinatus和D。毒液

H. 催眠咬伤被发现会引起严重的毒性作用，包括全身和局部影响。局部影响包括水肿，出血，剧烈疼痛，水疱，最后导致咬部位坏死。全身性影响包括致命的止血功能障碍，导致弥散性血管内凝血功能障碍，导致自发性出血、肺出血和急性肾损伤[5，39，61–63]。在本研究中，H.催眠毒液容易诱发瑞士白化病小鼠脚垫中的剂量依赖性出血性水肿（图2）和皮肤出血（图3）。H的最低水肿剂量（MED）和最小出血剂量（MHD）。发现催眠毒液分别为1μg（95%置信限：0.84-4.12μg）和2μg（95%CL：0.8-3.58μg）。E. carinatus 和 D.毒液诱发水肿和出血，MED分别为0.8μg（95%CL：0.6-3.3μg）和1μg（95%CL：0.49-3.42μg）和MHD分别为1μg（95%CL：1.53-5.46μg）和3μg（95%CL：1.83-6.91μg）。但是，E.Carinatus毒液类似于H。通过诱发出血性水肿来催眠毒液。水肿和出血诱导性质随E而变化。carinatus > H.催眠> D.罗素毒液。蛇毒解放军2s是由于血管活性类二十烷酸的产生而导致的水肿的主要致病因子。然而，出血性水肿可能是由于肌坏死活动或由于PLA的出血加剧活动2酶[64]，或出血性蛇毒金属蛋白酶（SVMPs）的作用[65]。H.催眠毒液在小鼠尾部模型中容易引起注射部位组织的坏死;同样，E.Carinatus 和 D.毒液也导致组织坏死。有趣的是，与D相反。Russelii毒液在注射部位没有显示出任何出血的迹象，两者都是H。催眠和E.蛭蛆虫毒液在注射部位引起长期出血。出血在大约2小时内开始，并在毒液注射后持续约8小时。所有三种毒液都导致各自尾部组织的坏死，其程度几乎相似，因为受影响的尾部区域逐渐变脆，并在毒液注射后两天内显示出脱臼的迹象（S5图）。虽然我们早期的研究试图剖析组织坏死的机制，但考虑到E处的大面积NETosis。角膜毒液注射部位，机理看起来复杂得多，而肌坏死PLA的作用2s、基质降解SVMPs和透明质酸酶不容忽视[18，65，66]。催眠毒液被发现会干扰枸橼表示的人血浆的凝血时间[9，63]。在我们的研究中，毒液也强烈干扰凝血过程，它剂量依赖性地降低了血浆再钙化时间（图4A-4C），活化部分凝血活酶时间（APTT），凝血酶原时间（PT）（图4D）和凝血酶凝血时间（TCT）（图4E），表明其强大的促凝血性质。有趣的是，即使在没有添加CaCl的情况下，它也干扰了柠檬酸盐人血浆的凝固。2，其中它显示出双相效应。在低剂量下，它显示出抗凝血活性，增加了凝血时间，而在较高剂量下，它是促凝血剂，并减少了凝血时间（图4B）。E. carinatus 毒液也在没有 CaCl 的情况下诱导了枸橼的人血浆的凝固2.因此，钙离子与促凝剂的活性无关。催眠毒液可能与E相似。肉毒。Ecarin，一种来自E的金属蛋白酶。角膜毒液，它是一种凝血酶原激活剂，催化凝血酶的形成，而不需要任何辅助因子，如Ca2+、磷脂和因子 V [67，68]。因此，促凝血活性为H.催眠毒液可能是由于Ecarin样凝血酶原激活剂引起的。但是，E.角膜毒液还含有钙离子依赖性凝血酶原激活剂Carinactivase[69]。然而，观察到的对H的凝血剂活性的双相作用。催眠毒液似乎很有趣，令人兴奋。有趣的是，在这项研究中，D.毒液在TCT中显着不同，因为它没有引起纤维蛋白原的凝血（图4E），表明毒液中缺乏凝血酶原激活和/或凝血酶样活性。然而，一种凝血酶样丝氨酸蛋白酶Russelobin是从巴基斯坦的D中分离出来的。Russelii russelii venom [70].此外，从D中分离并研究了因子X激活剂，RVV-X[71]和凝血酶原活化金属蛋白酶，Rusviprotease[72]。毒液。H. hypnale毒液容易水解纤维蛋白原，在较低剂量下，Aα链优先于Bβ链水解，Υ链出现耐药性（图5Aa）。然而，在较高剂量下，Υ链也被毒液水解（图5Ba）。E也观察到类似的趋势。Carinatus（图5Ab和5Bb）和D。毒液（图5Ac和5Bc）。相应的密度图提供了每种情况下不同纤维蛋白原链降解的定量测量。因此，H的影响。血浆凝血过程中的催眠毒液可能是由于强烈的凝血酶样活性。然而，考虑到D的抗凝血性质。在TCT（Haffkine毒液）中，毒液可能已经从其c端水解了纤维蛋白原，切割了在聚合过程中与中心E结构域结合所需的D结构域[73]。H.催眠毒液也有效地水解了纤维蛋白凝块，α聚合物，ΥΥ二聚体，α链和β链被水解。然而，α聚合物的水解优先于其他链。相比之下，两者都是E.Carinatus和D。毒液很容易水解α链和α聚合物，但不β链和ΥΥ二聚体。相应的密度图提供了相应链的定量降解的测量值（图5C）。因此，H.催眠毒液有效地水解了E上的纤维蛋白凝块。Carinatus 和 D.毒液。从H中分离和详细表征纤维蛋白（原）奥解酶/ s。催眠毒液似乎很有趣，并可能导致发展出具有临床意义的分子[74]。因此，本研究系统地探讨了H的纤维蛋白（ogen）溶解活性。催眠毒液。然而，这种活性对于其他各种蛇毒进行了很好的研究[75-77]。H.催眠毒液容易诱导肌毒性，它损害肌肉组织，如实验小鼠血清中细胞质标记酶，乳酸脱氢酶（LDH）（图6A），肌酸激酶（CK）（图6B）和肌酸激酶-MB（CK-MB）（图6C）酶水平升高所证明的那样。所有三种毒液都诱导了几乎相似的程度的肌毒性。E的肌毒性。Carinatus 和 D.罗塞利毒液在一些病例中得到了很好的解决[78，79]。但是，E.发现三种毒液中的carinatus毒液具有更高的心脏毒性，因为它记录了最高的CK-MB活性（图6C）。然而，心脏肌钙蛋白和利钠肽是更好的标志物。催眠毒液被发现富含PLA2然而，酶，蛇毒PLA的细胞溶解/肌坏死2s接受了深入研究[45，46，57，62，80，81]。虽然信息不足，但很少有研究试图评估H的肌毒性。催眠毒液[9，38，82]。此外，发现毒液可引起急性肾损伤，并影响心脏、肺、肝和胃肠道的功能[9，38，61，62]。

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图 2. H水肿诱导活性的小鼠模型。催眠， E.Carinatus和D。毒液。

（A）Hhv，Ecv和Drv的剂量依赖性水肿诱导活性。将20μlPBS中不同剂量的毒液（1-5μg）注射到小鼠右脚垫的内侧表面。单独接受PBS的左脚垫作为阴性对照。注射1小时后，使用木拉嗪对小鼠实施安乐死;两条腿在踝关节处被移除并称重。由于水肿引起的体重增加计算为水肿比，其等于水肿腿的重量×阴性对照腿的100 /重量。数据显示为均值± SEM （n = 3）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.g002

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图 3. H出血活性小鼠模型。催眠， E.Carinatus和D。毒液。

（A）将小鼠组独立地皮内注射不同剂量，1-5μgHhv，Ecv和Drv各5μg分别在30μlPBS中。将注射PBS的小鼠组作为阴性对照。注射3小时后，使用木拉嗪对小鼠实施安乐死，并在注射毒液点取出皮肤，以mm为单位测量皮肤内表面出现的出血斑点面积2.（B）皮肤组织的内表面出现出血性斑点。数据以均值± SEM（n = 3）表示，并使用单因素/双向方差分析进行分析，然后使用Bonferroni后测试，'**** p <0.0001，*** p <0.001，** p <0.01，* p <0.05和ns（不显着）>.05。与对照组（PBS）相比，"*"显著。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.g003

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图 4. H.催眠， E.Carinatus和D。罗素毒液对凝血活性的影响。

（一）等离子体重钙化时间;在37处用1-20μg/ ml毒液处理200μl柠檬酸盐人血浆1分钟0C，通过加入20μl0.25M氯化钙开始凝血2.（B）Hhv在没有CaCl的情况下诱导血浆凝固2;通过将1-20μg/ ml的Hhv加入200μl柠檬酸盐人血浆中来开始凝血。（三）Hhv、Ecv和Drv的血浆再钙化时间比较;用每种毒液10μg/ ml独立处理200μl柠檬酸盐人血浆以启动凝血。对于Drv，通过加入20μl0.25M氯化钙单独开始凝血2.（D）活化部分凝血活酶时间（APTT）;将100μl柠檬酸盐人血浆独立处理，Hhv，Ecv和Drv各5μg/ ml在37处1分钟0C，然后加入100μl试剂（LIQUICELIN-E磷脂制备来自兔脑的鞣花酸）并在37处孵育3分钟0C.通过加入100μl0.02M CaCl开始凝血2.凝血酶原时间（PT）;将100μl柠檬酸盐人血浆独立处理，Hhv，Ecv和Drv各5μg/ ml在37处1分钟0C.通过加入100μlPT试剂（UNIPLASTIN-兔脑凝血活酶）开始凝血。在所有情况下，没有毒液的血浆都被用作对照实验。（E） 凝血酶凝血时间;在10mM Tris-HCl缓冲液pH 7.6中独立处理100μl纤维蛋白原（3mg / ml）与Hhv，Ecv和Drv各10μg/ ml独立处理以启动凝血。凝血酶，10 U被用作阳性对照，单独使用纤维蛋白原作为阴性对照。在上述所有实验中，可见凝块形成所需的时间以秒为单位记录。在所有情况下，数据都表示为均值±SEM（n = 4），并使用单向/双向方差分析进行分析，然后是Bonferroni后检验，'**** p <0.0001，*** p <0.001，** p <0.01，* p <0.05和ns（不显着）>.05。与对照组（PBS）相比，"*"显著。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.g004

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图 5. H. 的纤维蛋白原溶解活性和纤维蛋白溶解活性。催眠， E.Carinatus和D。毒液。

（A）毒液的纤维蛋白原溶解活性（时间依赖性）;将50μg纤维蛋白原与Hhv，Ecv和Drv各1μg独立孵育，在37处具有不同的时间间隔0C. 泳道I纤维蛋白原（50μg）单独，泳道2-6，其中50μg纤维蛋白原分别与Hhv（Aa），Ecv（Ab）和Drv（Ac）孵育5，10，15，30和60分钟。（B）毒液的纤维蛋白原溶解活性（剂量依赖性）;纤维蛋白原，50μg与不同剂量的Hhv，Ecv和Drv独立孵育60分钟，在370C. 泳道I纤维蛋白原（50μg）单独，泳道2-6，其中50μg纤维蛋白原分别用1，2.5，5，7.5和10μgHhv（Ba），Ecv（Bb）和Drv（Bc）处理。（C）毒液的纤维蛋白溶解活性;在37处独立孵育100μl洗涤的血浆凝块16小时0C分别含有5和10μg的Hhv（泳道2和3），Ecv（泳道4和5）和Drv（泳道6和7）以及单独的纤维蛋白凝块（泳道1）。在所有情况下，M代表以kDa为单位的分子量蛋白质标记物，并在降低条件下在SDS PAGE上进行分析（纤维蛋白原溶解活性为10%，纤维蛋白溶解活性为7.5%）。这些图像是使用HP Scanjet（型号-G2410）捕获的。在各自情况下，通过相应的密度图图像（ImageJ Software Ver. 1.53k，USA）表示由Hhv，Ecv和Drv对纤维蛋白原和纤维蛋白的定量降解模式。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.g005

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图 6. H的肌毒性和心脏毒性小鼠模型。催眠， E.Carinatus和D。毒液。

将小鼠组（n = 4）独立肌内注射（i.m）与LD50Hhv（3.5 mg / kg），Ecv（2.5 mg / kg）和Drv（3.0 mg / kg）的剂量以50μlPBS进入大腿肌肉。单独接受PBS的小鼠组作为对照实验。24小时后，使用木肼麻醉小鼠;通过心脏穿刺抽血。在小鼠血清中测定标记酶，LDH（A），CK（B）和CK-MB（C）活性（单位/ L）。数据以均值±SEM（n = 4）表示，并使用单向/双向方差分析进行分析，然后是Bonferroni后检验，'**** p <0.0001，*** p <0.001，** p <0.01，* p <0.05和ns（不显着）>0.05。与对照组（PBS）相比，"*"显著。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.g006

H的反应性/交叉反应性。催眠， E.Carinatus和D。具有单价和治疗性多价抗蛇毒血清的罗塞利毒液

在实验室中制备了亲和纯化的兔单价抗蛇毒血清HhAV，EcAV和DrAV对抗H.催眠， E.Carinatus和D。分别是毒液。马多价治疗性抗蛇毒血清BhAV和ViAV是针对"四大"物种的毒液制造的，并在印度销售。对上述一价和多价抗蛇毒血清进行了反应性/交叉反应性测试，以检测其对相同三种毒液的反应性/交叉反应性。在蛋白质印迹研究中，单价抗蛇毒血清HhAV，EcAV和DrAV很容易与各自的毒液反应（图7B和S6）。在各自的凝胶中分辨的蛋白质条带的整个光谱中都看到了反应活性。呵呵与EcAV和DrAV相比，AV与其低分子量蛋白质条带发生强烈反应，其强度仅显示边缘强度（图7Ba）。每种抗蛇毒血清与其他两种毒液表现出边缘或微不足道的交叉反应性/旁特异性反应性。有趣的是，HhAV没有显示出与D的任何交叉反应迹象。毒液，同时它与E表现出轻微的交叉反应性。蛭蛇毒液中，在中低分子量范围内出现不太明显的交叉反应带（图7Bb和7Bc）。电子商务AV没有显示出与H交叉反应的任何迹象。催眠毒液，同时显示出与D的高分子质量范围蛋白条带的微弱交叉反应迹象。毒液（图7Bb）。相比之下，DrAV与E表现出显着的交叉反应性。肉毒血清，同时与H表现出边缘交叉反应。催眠毒液（图7Bc）。正如预期的那样，BhAV和ViAV都显示出与E的显着反应性/交叉反应性。Carinatus（图7Bd）和D。Russelii（图7Be）毒液由强烈的反应蛋白条带所暗示。免疫前兔血清对H无交叉反应。催眠， E.Carinatus和D。毒液（图7Bf）。抗蛇毒血清容易与高分子量蛋白质条带反应，而中低分子量蛋白质条带的反应性不显著。BhAV和ViAV都显示出与H的边际交叉反应。催眠毒液，其中交叉反应性仅与高分子量蛋白质条带一起看到。然而，总体而言，ViAV在BhAV上显示出强烈的反应性/交叉反应性带，并且两个E。Carinatus 和 D.毒液。为了确保用于电泳并最终转移到PVDF膜上进行蛋白质印迹的毒液量，在封闭进行进一步分析之前对膜进行Ponceau-S染色（图7C）。为了量化反应性/交叉反应性的程度，进行了间接ELISA。井中独立涂覆等量的H。催眠， E.Carinatus和D。毒液并与各种稀释的抗蛇毒血清（HhAV / EcAV / DrAV / BhAV / ViAV）一起孵育。使用与HRP偶联的相应二抗（抗兔或抗马）对抗一抗，并通过测量与抗蛇毒血清结合效率直接相关的吸光度进行定量。将量化值（n = 4）与抗蛇毒血清的稀释因子绘制。结果显示，HhAV很容易与H反应。催眠毒液的滴度值为1：78125，而EcAV，DrAV，BhAV和ViAV即使在滴度值为1：5时也无法识别（图7Da）。正如预期的那样，EcAV，BhAV和ViAV表现出对E的结合效率。肉毒液的滴度值分别为1：953125、1：78125和1：390625（图7Db）。然而，DrAV揭示了其毒液的反应活性，滴度值为1：390625而BhAV和ViAV的反应/交叉反应，滴度值为1：78125（图7Dc）。因此，在HhAV，EcAV和DrAV单价抗蛇毒血清中，EcAV表现出相对较高的滴度值，因此与各自毒液的反应能力随着EcAV>HhAV>DrAV而变化。在我们基于滴度值的研究中，这三种蛇毒的抗原性/免疫原性变化为E。肉毒>毒液催眠毒液 > D.毒液。然而，不同的滴度值看起来很复杂，并且可能因物种或用于提高抗体的动物物种内而异。此外，所使用的佐剂和乳化时间也可能影响抗体滴度值。在间接ELISA中观察到的滴度值与蛋白质印迹中条带强度之间的细微差异可能是由于在各自情况下的非特异性结合。因此，了解蛇毒的抗原性/免疫原性的更精细的细节是非常具有挑战性的。

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图 7. H. 的交叉反应性。催眠， E.Carinatus和D。毒液与抗蛇毒血清。

（A）Hhv、Ecv和Drv的SDS-PAGE蛋白条带模式，M代表以kDa为单位的分子量蛋白标记物。（B）显示HhAV（Ba），EcAV（Bb），DrAV（Bc），BhAV（Bd），ViAV（Be）和免疫前兔血清（Bf）与Hhv，Ecv和Drv.BSA的反应性/交叉反应性的蛋白质印迹，25μg用作阴性对照。（C）相应的Ponceau-S染色图像，在用蛋白质印迹中的相应抗蛇毒血清处理之前，显示各自膜中的蛋白质条带。在所有情况下，电泳都是在相同的，非还原的条件下在10%凝胶中进行的。（D）Hhv，Ecv和Drv的间接ELISA滴度与抗蛇毒血清。（哒）Hhv，（Db）Ecv和（Dc）Drv. Venoms，0.1μg/ 100μl用HhAV，EcAV，DrAV，BhAV和ViAV的各种稀释液独立处理。数据显示为均值± SEM （n = 4）。（调整抗血清，1mg / ml，并用于在ELISA中稀释）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.g007

H.催眠， E.Carinatus和D。单价和治疗性多价抗蛇毒血清

亲和纯化的兔单价抗蛇毒血清（EcAV和DrAV）和马多价治疗性抗蛇毒血清（BhAV和ViAV）未能中和H。催眠毒液，而HhAV有效地中和了其毒液的所有特性。电子商务AV、DrAV、BhAV和ViAV没有中和H的蛋白水解、间接溶血、L-氨基酸氧化酶和5'-核苷酸酶活性等生化性质。即使在10000μg/ ml的抗蛇毒血清剂量下也能催眠毒液（图8）。相比之下，HhAV在2000μg/ ml的剂量下有效地中和了其毒液的活性。在hhAV剂量为<500μg/ml（95%置信限：80.45-373.83μg/ml）（图8B和8D）下，间接溶血和5'-核苷酸酶活性被有效中和，而蛋白水解和LAAO活性在2000μg/ml（95%CL：454.11-1974.45μg/ml）的较高剂量下被中和（图8A和8C）。此外，HhAV以<200μg（95%CL：37.67-157.32μg）（图9）的剂量有效地中和了其毒液的水肿诱导和出血活性，而血浆再钙化时间，APTT，PT和TCT等凝血活性在<600μg/ml（95%CL：88.58-602.84μg/ml）的剂量下中和（表2）。电子商务AV，DrAV，BhAV和ViAV没有中和H的病理特性，例如水肿诱导，出血和凝血活性，肌毒性和心脏毒性。催眠毒液。正如预期的那样，EcAV，DrAV，BhAV和ViAV对E的生化和病理特性以及致命毒性表现出几乎相似的中和效力。Carinatus 和 D.毒液。电子商务AV，BhAV和ViAV中和了E的蛋白水解和LAAO活性。剂量为<3000μg/ ml（95%CL：384.17-2078.75μg/ ml）的carinatus毒液，而间接溶血和5'-核苷酸酶活性在<800μg/ ml（95%CL：63.17-736.67μg/ ml）的剂量下中和（S7图）。然而，在较小剂量的<250μg（95%CL：24.55-212.13μg）下，水肿诱导和出血活性被有效地中和（S9A和S9C图）。同样，DrAV，BhAV和ViAV中和了D的蛋白水解和LAAO活性。<3000μg/ml（95%CL：425.28-2492.21μg/ml）的剂量下，而间接溶血和5'-核苷酸酶活性在<800μg/ml（95%CL：62.5-737.44μg/ml）的剂量下被中和（S8图）。然而，在<300μg（95%CL：12.09-249.22μg）的低剂量下有效地中和了水肿诱导和出血活性（S9B和S9D图）。因此，无论在哪里实现中和，抗蛇毒血清HhAV / EcAV / DrAV / BhAV / ViAV中和了H的生化和病理特性。催眠， E.Carinatus和D。毒液与抗蛇毒血清的比例为1：30-60（w / w）。最后，了解抗蛇毒血清（单价/多价）的中和功效至关重要，因为为了拯救实验小鼠，非常需要中和毒液的致命毒性。将小鼠组（n = 6）独立腹膜内（ip.）注射2LD50H的剂量。催眠/E.Carinatus/D.罗塞利毒液和10分钟后，静脉注射不同剂量的抗蛇毒血清HhAV / EcAV / DrAV / BhAV / ViAV（i.v.），并构建Kaplan-Meier生存曲线以确定ED50抗蛇毒血清的剂量。使用 ED50剂量为140mg / kg（95%CL：52.7-308.95mg / kg）重量，HhAV有效地保护小鼠免于死亡，而EcAV，DrAV，BhAV和ViAV即使在700mg / kg重量的剂量下（图10和S10）也没有保护小鼠对抗H。催眠毒液致死率（抗蛇毒血清，ED的增量）50以1小时的间隔施用以达到700mg / kg体重）。同样，EcAV揭示了ED。50剂量为75毫克/千克（95%CL：31.09-185.57毫克/千克）体重对E。Carinatus毒液致死性，而DrAV揭示了ED50剂量为90毫克/千克（95%CL：41.4-258.6毫克/千克）体重对D。毒液致死性。相比之下，BhAV和ViAV显示了ED。50剂量为200毫克/千克（95%CL：63.17-336.82毫克/千克）重量和150毫克/千克（95%CL：48.02-280.55毫克/千克）体重对E.角膜毒液的致死率分别为肉毒。同样，BhAV和ViAV显示了ED。50剂量为210毫克/千克（95%CL：81.59-328.41毫克/千克）重量和180毫克/千克（95%CL：57.7-372.31毫克/千克）体重对D。Russelii毒液的杀伤力分别为（S11图）。因此，在单价抗蛇毒血清中，HhAV在中和各自毒液的致死效力方面比EcAV和DrAV表现出相对较低的中和功效。此外，在BhAV和ViAV之间，后者对E的致命效力显示出更好的中和功效。Carinatus 和 D.毒液。此外，LD诱导的肌毒性和心脏毒性50剂量（3.5毫克/千克）的H。催眠毒液被ED有效中和50（140毫克/千克）剂量的HhAV（图11）。几位作者报告了BhAV和ViAV多价抗蛇毒血清对H的临床无效性。催眠毒液[5，39，83]。然而，针对马来亚蝮蛇Calloselasma rhodostoma制备的单价抗蛇毒血清和泰国治疗性血吸多价抗蛇毒血清均被发现可以中和出血，促凝血和坏死活性，以及H的致死性。啮齿动物模型中的催眠毒液[9，46，47，83-86]。蛇毒被进化成影响类似的生理目标，止血或神经肌肉，或两者兼而有之，以固定，杀死和消化猎物动物。因此，不同的蛇毒攻击相似的目标，可能具有不同程度的亲和力和特异性，因此在功能上密切相关。一般来说，形状互补性是相互作用剂的标志，即蛋白酶的酪蛋白降解性质，PLA的磷脂降解性质2s，崩解剂的血小板受体结合性质等等。因此，来自不同蛇毒的相似毒素（酶或非酶）预计具有一定程度的相似性，至少在它们的相互作用/结合位点上，因此在它们的抗原性方面也是如此。因此，矛盾的是，交叉反应抗体的边缘或缺乏形成强调了同源蛇毒的免疫学差异性。因此，了解这些毒液/毒素的免疫学独特性似乎非常有趣和复杂，因此提出了一个令人兴奋的学术挑战。

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图 8. 中和H的生化活性。通过抗蛇毒血清催眠毒液。

（A）蛋白水解，（B）间接溶血，（C）L-氨基酸氧化酶和（D）5'-核苷酸酶活性。将Hhv在室温下独立预孵育各种剂量（50-10000μg/ ml）的HhAV，EcAV，DrAV，BhAV和ViAV15分钟。蛋白酶活性;单独50μg/ ml的Hhv被认为是100%活性，溶血活性;单独20μg/ ml的Hhv被认为是100%活性，L-氨基酸氧化酶活性;单独100μg/ ml的Hhv被认为是100%活性和5'-核苷酸酶活性;单独15μg/ml的Hhv被认为是100%活性。数据显示为均值± SEM （n = 3）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.g008

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图 9. 中和水肿诱导活性和出血活性的H。使用小鼠模型通过抗蛇毒血清催眠毒液。

（A）水肿诱导活性，和（B）出血性Hhv;在这两种情况下，Hhv在室温下独立预孵育各种剂量（50-500μg）的HhAV，EcAV，DrAV，BhAV和ViAV15分钟。Hhv，单独5μg被认为是200%的水肿诱导活性，单独5μgHhv被认为是100%出血活性。数据显示为均值± SEM （n = 3）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.g009

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图 10. H.使用鼠模型通过抗蛇毒血清催眠毒液致死性。

组（n = 6）小鼠独立腹膜内注射（ip.），2 LD50（7毫克/千克）剂量的Hhv在50μlPBS中。毒液注射10分钟后，小鼠用ED给药50（140毫克/千克）和2次ED50（280 mg/kg）剂量的HhAV，以及700 mg/kg体重的EcAV，DrAV，BhAV和ViAV通过尾静脉（i.v.）独立进行。单独接受毒液和PBS的小鼠组作为对照实验。将小鼠置于观察状态下24小时，并记录死亡时间。通过构建Kaplan-Meier生存曲线来完成小鼠的生存率分析，使用对数秩（Mantel-Cox）测试计算p值，***p<0.001，**** p<0.0001。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.g010

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图 11. H.使用小鼠模型通过抗蛇毒血清催眠毒液诱导的肌毒性和心脏毒性。

组（n = 4）小鼠独立肌内注射（i.m）与LD5050μlPBS中的Hhv剂量（3.5mg / kg）。毒液注射10分钟后，小鼠用ED给药50（140 mg/ kg）剂量的HhAV和700 mg / kg剂量的EcAV，DrAV，BhAV和ViAV通过尾静脉（i.v.）独立。单独接受PBS的小鼠组作为对照实验。24小时后，使用木肼麻醉小鼠;通过心脏穿刺抽血。在血清中测定标记酶，LDH（A），CK（B）和CK-MB（C）活性（单位/L）。数据以均值±SEM（n = 4）表示，并使用单因子方差分析，然后是Bonferroni后检验，'**** p <0.0001，ns（不显著）p >0.05。与Hhv + HhAV相比，"*"显著。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.g011

总之，作为H。催眠毒液没有在印度销售，这为其详细的表征提供了严重的挫折。此外，H.在印度，催眠咬伤持续存在，没有抗蛇毒血清治疗。因此，本研究真诚地尝试系统地比较斯里兰卡H的生化，病理和免疫特性。用印度E的毒液催眠毒液。Carinatus和D。罗素蛇。该研究严重暴露了印度治疗性马多价（BhAV和ViAV）和兔单价（EcAV和DrAV）抗H的副特异性中和能力不足。催眠毒液致命毒性。然而，考虑到关键限制之一，即在大多数情况下缺乏有关被冒犯蛇的信息，因此使用多价抗蛇毒血清进行治疗是合适的。合并 H.将毒液催眠到西高止山脉地区的抗蛇毒血清生产方案中将是一个很大的缓解。因此，现在是印度根据地理位置重新审视"四大"概念的时候了。印度和斯里兰卡的西高止山脉是H的中心。催眠毒液，重要的是要探索区域中毒液组成的可能变异性。此外，值得赞扬斯里兰卡佩拉德尼亚大学正在进行的努力。他们与国际动物毒液研究（AVRI）建立了一个成功的网络，以生产适当的多特异性中和抗蛇毒血清来治疗蛇毒，包括H。催眠咬伤[87，88]。令人遗憾的是，除了诅咒他们的不幸命运外，印度受害者别无选择，只能忍受H的可怕影响。催眠咬。

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表 2. 中和凝血剂活性（血浆再钙化时间，APTT和PT测定）和H的凝血酶样活性。通过抗蛇毒血清催眠毒液：Hhv在室温下独立预孵育各种剂量（100-2000μg/ ml）的HhAV，EcAV，DrAV，BhAV和ViAV15分钟。

在所有情况下，单独20μg/ ml的Hhv被认为是100%凝血剂活性和凝血酶样活性。数据以均值±SEM（n = 4）表示，并使用单因子方差分析，然后使用Bonferroni后检验，'**** p <0.0001，*** p <0.001，** p <0.01，* p <0.05和ns（不显着）p >0.05。与对照组（PBS）相比，"*"显著。与Hhv + HhAV相比，"*"显着。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.t002

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SDS-PAGE条带模式的H. hypnale，E. carinatus和D. russelii毒液。

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S1 图 SDS-PAGE条带模式的H. hypnale，E. carinatus和D. russelii毒液。

（a） 在非还原条件下，用10%SDS-PAGE对SDS-PAGE、Hhv、Ecv和Drv进行了分析。（b） 凝胶的相应密度测定法（ImageJ软件版本1.53k，美国）。（c） 在非减少和减少条件下的Drv、Ecv和Hhv的SDS-PAGE（10%）。（d） 在非还原和减少条件下的Drv、Ecv和Hhv的SDS-PAGE（12.5%）。在所有情况下，每个毒液加载25μg，M代表分子量标记。凝胶被0.25%的考马斯亮蓝（R-250）染色和可视化。去污后，这些图像由 HP Scanjet（型号-G2410）捕获。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.s001

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S2 图 H. hypnale，E. carinatus和D. russelii毒液的酪蛋白溶解和明胶溶解酶图。

（A）酪蛋白溶解活性和（B）糊解活性，在非还原条件下，在10%SDS-PAGE中分别解决了Hhv，Ecv和Drv的不同剂量（5，10，20和30μg）。酪蛋白和明胶（0.2%）作为底物掺入各自的凝胶中。在所有情况下，20μgBSA被用作阴性对照，0.1μg胰蛋白酶被用作阳性对照。用0.25%的考马斯亮蓝（R-250）染色凝胶。去污后，使用 HP Scanjet（型号-G2410）捕获图像。蓝色背景上的透明区域表明相应凝胶中毒液的酪蛋白溶解和明胶溶解活性。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.s002

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S3 图 透明质酸酶活性的H. hypnale，E. carinatus和D. russelii venoms。

（a）透明质酸酶活性，将0.017%的透明质酸作为底物掺入10%SDS-PAGE中，并在非还原条件下分析Hhv，Ecv和Drv各50μg。M.表示以kDa为单位的分子量蛋白质标记物。（b）毒液透明质酸酶活性的相应密度测定（ImageJ软件版本1.53k，美国）分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.s003

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S4 图 脱氧核糖核酸酶（DNase）活性为催眠杆菌，E. carinatus和D. russelii毒液。

将小牛胸腺DNA（2 kb），250ng与毒液（50μg）独立处理60分钟，在37°C下以30μlPBS的最终体积进行分析，并在1.2%琼脂糖凝胶电泳中进行分析。单独加载通道1 DNA，通道2 DNase 1（10个单位），通道3 Hhv，通道4 Ecv和通道5 Drv。电泳后，凝胶被可视化并在紫外线透射仪上拍摄（联盟2.7，Uvitech）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.s004

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S5 图 催眠杆菌，E. carinatus和D. russelii毒液的小鼠模型诱导尾部组织破坏。

（A）显示各自毒液尾部组织损伤评分的半定量表示的图表。将小鼠组（n = 3）独立皮下注射LD50剂量的每种毒液进入小鼠尾巴，距尾巴尖端3厘米。（B） Hhv，（C）Ecv和（D）Drv。单独注射50μlPBS的小鼠作为对照实验。数据显示为均值± SEM （n = 3）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.s005

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S6 图 H. hypnale，E. carinatus，D. russelii和N. naja毒液与抗蛇毒血清的反应性/交叉反应性。

（A）显示HhAV（Aa），EcAV（Ab），DrAV（Ac），BhAV（Ad）和ViAV（Ae）的反应性/交叉反应性的蛋白质印迹与Hhv，Ecv，Drv和Nnv. （B）相应的PVDF膜显示各自蛋白质印迹的未编辑/未裁剪图像。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.s006

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S7 图 通过抗蛇毒血清中和刺五加的生化活性。

（A）蛋白水解活性，（B）间接溶血活性，（C）L-氨基酸氧化酶活性，和（D）5'-核苷酸酶活性。对于中和研究，将Ecv在室温下独立预孵育各种量（100-3000μg/ ml）的抗蛇毒血清（EcAV / BhAV / ViAV）15分钟。蛋白酶活性为50μg/ ml Ecv被认为是100%活性。由20μg/ ml Ecv引起的间接溶血活性被认为是100%活性。由于100μg/ ml的Ecv引起的LAAO被认为是100%活性。由40μg/ ml Ecv引起的5'-核苷酸酶活性被认为是100%活性。数据显示为均值± SEM （n = 3）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.s007

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S8 图 通过抗蛇毒血清中和D. russelii毒液的生化活性。

（A）蛋白水解活性，（B）间接溶血活性，（C）L-氨基酸氧化酶活性，和（D）5'-核苷酸酶活性。对于中和研究，Drv在室温下独立预孵育各种剂量（100-3000μg/ ml）的抗蛇毒血清（DrAV / BhAV / ViAV）15分钟。蛋白酶活性为100μg/ ml Drv被认为是100%活性。由20μg/ ml Drv引起的间接溶血活性被认为是100%活性。由于100μg/ ml Drv的LAAO被认为是100%活性。由30μg/ ml Drv引起的5'-核苷酸酶活性被认为是100%活性。数据显示为均值± SEM （n = 3）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.s008

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S9 图 使用小鼠模型通过抗蛇毒血清中和桔梗和D. russelii毒液诱导的水肿和出血活性。

（A）将Ecv与各种剂量（25-200μg）的抗蛇毒血清（EcAV / BhAV / ViAV）在室温下独立预孵育15分钟，单独5μgEcv被认为是200%水肿诱导活性。（B）Drv在室温下独立地用各种剂量的抗蛇毒血清（DrAV / BhAV / ViAV）预孵育15分钟，单独10μgDrv被认为是200%的水肿诱导活性。（C）将Ecv与各种剂量的抗蛇毒血清（EcAV / BhAV / ViAV）在室温下独立预孵育15分钟，单独5μg毒液被认为是100%出血活性。（D）Drv在室温下独立预孵育各种剂量（50-300μg）的抗蛇毒血清（DrAV / BhAV / ViAV）15分钟，单独5μgDrv被认为是100%出血活性。数据显示为均值± SEM （n = 3）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.s009

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S10 图 使用小鼠模型通过HhAV中和催眠毒液的致死性。

组（n = 6）小鼠独立腹膜内注射（ip.），2 LD5050μlPBS中的Hhv剂量。在10 min毒液注射后，通过小鼠尾静脉（i.v.）独立给药70，140，210，280和350mg / kg体重的HhAV。将小鼠置于观察状态下24小时，并记录死亡时间。单独接受毒液和单独接受PBS的小鼠组作为对照实验。通过构建Kaplan-Meier生存曲线来完成小鼠的生存率分析，使用对数秩（Mantel-Cox）测试计算p值，***p<0.001，**** p<0.0001。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.s010

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S11 图 使用小鼠模型通过抗蛇毒血清中和Carinatus和D. russelii毒液的致死性。

（A）小鼠组（n = 6）独立腹膜内注射（ip.），具有2个LD50（5毫克/公斤体重）剂量的Ecv在50μlPBS。在10 min毒液注射后，通过小鼠尾静脉（i.v）分别独立给药50，75，150，200，300和400mg / kg的EcAV，BhAV和ViAV。有效剂量（ED50）确定EcAV 75 mg / kg，BhAV 200 mg / kg和ViAV 150 mg / kg的值。（B）小鼠组（n = 6）独立腹膜内注射（ip.），具有2 LD50（5毫克/公斤体重）剂量的Drv在50μlPBS。在10 min毒液注射后，分别通过小鼠尾静脉（i.v.）独立给药60，90，120，180，210，360和420mg / kg DrAV，BhAV和ViAV。测定DrAV 90 mg / kg，BhAV 240 mg / kg和ViAV 180 mg / kg的有效剂量值。在所有情况下，单独接受相应毒液和单独PBS的小鼠组作为对照实验。将小鼠置于观察状态下24小时，并记录死亡时间。通过构建Kaplan-Meier生存曲线来完成小鼠的生存率分析，使用对数秩（Mantel-Cox）测试计算p值，***p<0.001，**** p<0.0001。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010292.s011

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VDS感谢CSIR（JRF-NET）（文件编号：09/119（0214）/2019-EMR-I）的研究奖学金。作者感谢志愿者献血。作者感谢Prashanth K S先生，Karthik K V先生，Bhargava C S先生，Naveen P先生和Manikanta K先生在研究期间提供的善意帮助。作者感谢迈索尔大学卓越研究所（IOE）提供中央仪器设施。作者感谢Sourabh Kemparaju先生对本文编辑的支持。

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