厦门杂志期刊论文发表-石壁阻止异位基因在卵巢中的表达，并在D的绝缘体元件处积聚。黑腹股

丹尼尔·津什泰恩，丹尼尔·巴巴什

出版日期： 2022年03月24日

抽象

种系干细胞（GSC）是动物一生中种系的祖细胞。在果蝇中，这些细胞位于维持（自我更新）和分化（不对称分裂导致子细胞与GSC不同）所需的细胞龛中。干细胞-子细胞的过渡受到许多过程的严格调节，包括基因组稳定性所需的一系列蛋白质。种系干细胞维持因子Stonewall（Stwl）与异染色质相关，但其分子功能知之甚少。我们对突变卵巢进行了RNA-Seq，发现许多转座子家族的显着抑制，但没有异色基因。我们还发现了多类基因的不适当表达。最突出的是富含睾丸的基因，包括雄性种系性别决定开关Phf7，分化因子bgcn和2号染色体上的大睾丸特异性基因簇，在突变卵巢中上调或异位表达。令人惊讶的是，我们还发现，体细胞S2细胞中stwl的RNAi敲低导致这些睾丸基因的异位表达。在S2细胞中使用平行的ChIP-Seq和RNA-Seq实验，我们发现Stwl定位在转录起始位点的上游和异色序列上，包括与端粒相关的重复序列。Stwl在bgcn处也富集，表明它直接调节这种重要的分化因子。最后，我们确定了与已知绝缘体结合蛋白共享的Stwl结合基序。我们认为，Stwl通过结合绝缘子和建立染色质边界来影响基因调控，包括抑制雌性种系中的雄性转录本。

作者简介

干细胞的定义是它们不对称分裂的能力，从而产生分化的细胞和干细胞子体。在果蝇中，精子和卵子的产生始于种系干细胞（GSC）。GSC区分或自我更新的能力受到无数因素的严格监管。其中一些是转录因子，它们负责激活或抑制其他基因，以促进一种状态有利于另一种状态。Stonewall是GSC自我更新所需的卵巢核蛋白，其分子功能知之甚少。在这里，我们表明Stonewall负责阻止果蝇卵巢中"雄性"分子编程的激活。当卵巢中没有石壁时，卵子产生终止，睾丸特异性基因变得高度表达，包括Phf7的雄性转录本，其诱导雌性生殖细胞中的雄性性别认同。我们还表明，Stonewall可能定位于基因组绝缘体，这些绝缘体是基因组中保护基因免受附近调节因子侵害的区域。我们的研究结果表明，Stonewall有助于组织卵巢生殖细胞中的基因组并阻止男性基因的表达。

引文： Zinshteyn D，Barbash DA（2022）石壁阻止卵巢中异位基因的表达，并在D中的绝缘体元件上积累。黑腹股蓝。PLoS Genet 18（3）：e1010110。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110

编辑 器： Gregory P. Copenhaver，北卡罗来纳大学教堂山分校，美国

收到： 五月 24， 2021;接受： 二月 18， 2022;发表： 三月 24， 2022

版权所有： ? 2022 Zinshteyn，Barbash。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。

数据可用性： 为本手稿生成的所有原始序列数据文件均已以.fastq格式上传到NCBI序列读取档案（SRA），其编号为BioProject ID PRJNA788954。

资金： 研究得到了NIH R01-GM074737至D.A.B.和NIH R01-GM095793至D.A.B.和Charles Aquadro的支持。共聚焦显微镜图像是在康奈尔生物技术研究所的显微镜和成像设施中获得的，由NIH拨款S10RR025502支持。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

相互竞争的利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。

介绍

成体干细胞存在于细胞不断更新的组织中，例如配子不断产生和释放的性腺。生殖系干细胞（GSC）是居住在卵巢和睾丸中的几种成体干细胞群之一。在果蝇的雌性卵巢中，它们存在于维持它们的利基环境中[1，2]。干细胞经历不对称的细胞分裂，导致一个分化的子细胞和一个与亲本相同的子细胞，从而进行自我更新。对于卵巢GSCs，分化的子细胞是膀胱母细胞，然后经历四轮不完全有丝分裂形成16细胞囊肿。完成这四轮后，16个细胞囊肿中的一个囊细胞进入减数分裂，而其他15个细胞进行重复内切。减数分裂细胞将分化成一个卵母细胞，而其他15个细胞将成为为卵母细胞提供母体因子的护士细胞。

卵巢的整个生殖细胞群来自每个胚芽中的2-3个GSC。果蝇具有正常GSC功能所需的复杂调节因子网络[3]，可大致归类为膀胱母细胞产生所需的自我更新或分化因子所需的维持因子。许多参与GSC调节的基因对卵巢内外的其他功能具有多效性。例如，Piwi是GSC维持和分化[4，5]以及通过piRNA途径沉默可转座元件所必需的[6]。众所周知的分化因子包括平移抑制因子 Bam、Bgcn 和 Sxl。这些蛋白质形成抑制与GSC更新相关的mRNA的复合物，包括维持基因纳米[7]。缺乏任何这些分化因子的卵巢表现出肿瘤卵巢表型，表现为过量的GSC样细胞无法成为膀胱母细胞。Sxl对于生殖细胞的细胞自主性别测定至关重要[8]。

该突变基因在用于女性不育的P元素诱变筛选中被发现，随后在增强子陷阱筛选中被鉴定为种系表达基因[9，10]。它主要在卵巢生殖系细胞中表达，GSC表达较弱，GSC祖细胞（膀胱母细胞）及以上细胞表达增加[11]。stwl突变卵室包含16个多倍体护士细胞，表明不会发生囊细胞到卵母细胞的转变，并且需要该卵母细胞测定。卵室生长在stwl零卵巢中在第4阶段和第7阶段之间停滞，生殖细胞经历凋亡。GSC维持也需要stwl：突变卵巢通常缺乏GSCs，特别是在老年蝇中[12]。stwl突变GSC克隆通过分化成膀胱母细胞从卵巢迅速耗尽，并且来自这些克隆的卵室表现出卵母细胞测定缺陷，如在stwl突变动物中所见[13]。与bam或bgcn单突变体不同，具有stwl和bam或bgcn的双突变体可产生分化的卵巢生殖细胞囊肿，这表明stwl功能位于bam和bgcn的下游[13，14]。

Stwl还参与异染色质维持。异色区域在转录上基本上是沉默的，并且由基因组寄生虫填充，包括转座子。stwl突变是位置效应变异的主要抑制因子，提示需要Stwl来促进异染色质的扩散[13]。Stwl与异染色质结合蛋白HP1a和S2细胞核仁处致密的异染色质样结构共定位，在体外实验中充当转录抑制因子，并促进异色组蛋白标记物H3K9me3和H3K27me3在幼虫中的扩散[15]。

尽管在D中具有丝杠的本质功能。黑腹膜，该基因是果蝇属的新基因，是MADF-BESS结构域基因谱系特异性扩增的一部分[16，17]。此外，该基因座在该属中至少经历过一次反复的正选择，并且相对于密切相关的基因具有更高的总体替代率[18-20]。这种进化特征的驱动因素尚未确定，但一些人推测，Stwl在异染色质维持中的作用可能涉及与转座子的相互作用[18，19]。有趣的是，狭窄的系统发育分布和stwl的阳性选择与其他必需的生殖系干细胞调控基因（包括bam和bgcn）共享[19，21]。

在卵巢末端丝状细胞中，与绝缘子结合蛋白CP190共定位，并在核层处表现为点状[22]。绝缘体是基因组区域，当与绝缘体蛋白适当结合时，可以防止增强子与其靶启动子之间的相互作用，或调节染色质修饰的扩散[23]。我们在这里进行了一系列基因组实验，以确定由Stwl及其可能的分子功能调节的基因。我们报告了来自突变卵巢和S2细胞中ChIP-Seq的转录分析数据，这表明Stwl的丢失导致男性特异性遗传编程的激活和可转座元件的错误调节，并且Stwl定位于绝缘子。

结果

卵巢缺陷表现出 TE 抑制

根据qRT-PCR确定的卵巢中RNAi诱导的敲低（KD）导致TE错误表达的基因的筛选发现，stwl的种系KD导致3个TE转录本（Het-A，血液和牛蒡）的中度抑制[24]。我们进行了自己的qRT-PCR实验，以测试LTR反转录转座子Copia和非LTR反转录转座子Het-A，412和I元素的错误表达。Het-A、Copia和I元素受种系限制，而412在种系和卵巢卵泡细胞中均有表达[25，26]。我们测试了从2日龄经杂合子空（stwl）解剖的卵巢中这些TE的错误表达。j6c3/Df（3L）Exel6122），半子（stwl/Df（3L）Exel6122）和野生型（stwl/stwl）苍蝇。我们发现，相对于半合子型和野生型卵巢，这些TE中的每一个在经杂合子空卵巢中均受到抑制（图1A）。+++

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图 1. stwl的丧失导致转座子和睾丸富集基因的上调。

（A）来自2日龄卵巢的TE的qRT-PCR，缩放至野生型。叽叽喳喳零是突变等位基因（stwlj6c3），stwl是一种缺乏性等位基因（Df（3L）Exel6122）。（B）TE在0天和2天大的卵巢中均有上调。来自 stwl null （stwl） 的 TEs 的 qRT-PCR-j6c3/叽叽喳喳j6c3） 卵巢，缩放至 stwl/Df（3L）Exel6122。（A-B）均值和 SE 由 3 个生物重复绘制，每个重复有 3 个技术重复。（C） STWL null （stwl） 中 TE 的褶皱变化+j6c3/叽叽喳喳j6c3）相对于来自 RNA-Seq 测定的 0 天和 2 天大卵巢的野生型。黑色箭头指向图1A和/或1B中用qRT-PCR数据验证的TE."G"，"S"，"B"表示TE是否通常分别以种系，卵巢体或两者表达[26]。（四）日志2相对于野生型，TEs的折叠变化（LFC）与来自stwl，bam，Sxl和piwi突变或缺陷卵巢的所有基因的比较。横杆显示所有 TE 的平均 LFC。（E）相对于野生型，stwl null卵巢中前14个和后14个受影响最大的注释基因（基于FlyBase注释）的折叠变化。男性和女性符号分别标记具有睾丸和卵巢富集的野生型表达的基因;"*"标记属于图2中描述的59C4-59D睾丸特异性簇的基因。（F）在stwl，bam，Sxl和piwi突变或缺陷卵巢中错误调节基因的顶部和底部1%中的富集组织类别。对于相对于野生型，在粗壮，bam，Sxl和piwi突变体或缺陷卵巢中富集的每组组织富集基因绘制平均LFC。仅绘制了FDR <0.05的基因集。

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突变表型对转录本丰度的解读提出了挑战。由于GSC缺失和卵母细胞测定缺陷（S1和S2 Figs）的结果，突变卵巢在很大程度上是非游戏性的[11-13]。D. 护士细胞黑色素胃卵巢是多倍体，产生大量的mRNA，这些mRNA由发育中的卵母细胞遗传。因此，非游戏突变体和野生型卵巢之间的差异表达可能反映了卵巢细胞构成的广泛差异，而不是由于粗斜引起的转录本丰度的变化。为了解释组织组成的差异，我们选择了先前研究使用的方法，即测定来自极年轻卵巢的转录本[27，28]。这些作者推断，从新近关闭的个体中解剖卵巢（在关闭后24小时内解剖）将限制晚期卵室和卵子的数量。我们的分析证实，来自新近关闭的stwl突变体的卵巢在形态上比旧的卵巢更接近野生型（S2-S4 Figs）。

我们测定了来自两个鼻涕的新闭合卵巢的TE转录本。j6c3/Df（3L）Exel6122 和 stwl/Df（3L）Exel6122，如上所述。我们发现，在新近关闭和2日龄的卵巢中，相对于半合子，反式杂合零点中Het-A的倍数增加相似（分别增加5倍和6倍）（图1B）。在新近闭合的经杂合子空卵巢中，Copia转录本也受到抑制（半合子增加8倍），尽管这种减压表型不如在2日龄卵巢中观察到的表型大（比半合子增加23倍）。我们得出结论，我们和其他人[24]观察到的TE抑制表型可能是由于stwl活性的丧失，而不是生殖细胞的普遍损失。+

为了确定stwl丢失的全基因组后果，我们对从新近关闭和2天龄的野生型（y w）和stwl null（y w;stwl）解剖的卵巢进行了RNA-Seqj6c3/stwlj6c3） 个人。该实验的目的是鉴定和分类在突变体中一致差异表达的基因和TE。因此，我们使用DESeq2将所有四种样本类型（新近关闭的野生型，新关闭的突变体，两天前的野生型，两天前的突变体）整合到广义线性模型中[29]。只有当一个基因的转录计数在两个零样本中相对于野生型显着变化时，该基因才被认为是在stwl nulls中差异表达的;也就是说，如果基因在两种基因型之间差异表达，则无论年龄大小。

在考虑了潜在的批次效应和GC含量偏倚（参见方法）后，所得计数矩阵的样品到样品的距离证实了每种样品类型的生物重复聚集在一起（S5图）。计数数据的主成分分析（PCA）表明，样品主要根据卵巢成熟度进行分层（S6图）。主成分1（PC1）占计数矩阵方差的58%，该矩阵将成熟卵巢（2天大的stwl/stwl wild型）与未成熟的卵巢（2天大的粗壮型）分开++j6c3/stwlj6c3空，0 天 stwlj6c3/stwlj6c3空，和0天大的stwl/stwl wild-type）。PCA中的这些趋势支持了我们实验设计背后的基本原理，因为在两个时间点比较null和WT卵巢可以更准确地识别由于基因型而差异表达的基因。我们发现，分别分析0天和2天大的卵巢在TE和睾丸基因的上调方面产生了与组合方法相似的结果（S1表，S7图）。虽然2日龄卵巢的鼻音缺乏导致大量受影响的基因（正如预期的那样，卵巢转录本特别下调），但将这些数据纳入具有0日龄卵巢的GLM中增加了识别性变性基因的可能性。++

我们发现4，839个基因（在所有卵巢样本中，平均读取计数>10的10，165个基因中）是差异表达的，其中2，147个基因在stwl null中上调，2，692个基因在stwl null中下调（48%，21%和26%的表达基因）（S1表，S8图）。我们还发现，P元素转录本在粗大的零卵巢中增加了约4倍;这可以通过P元素插入到产生stwl的stwl位点来解释j6c3等位基因，并作为存在 stwl 的内部验证j6c3等位基因。RNA-Seq数据显示，重复元素受到stwl损失的强烈影响（图1C）。这些重复序列包括我们通过qRT-PCR鉴定的Copia，Het-A，412和I元素元素。

失去 stwl、bam 和 piwi，但不是 Sxl，导致 TE 抑制

虽然stwl在卵巢的体细胞中表达，但我们发现RNAi介导的使用卵泡细胞驱动敲低的stwl对生育能力没有影响，而种系特异性敲低强烈降低或消除生育能力（S9图）。这些结果与先前的发现一致，即stwl突变卵巢的末端表型是由种系干细胞的丧失和分化生殖细胞凋亡引起的不育（S1和S2 Figs）[11-13]。DNA损伤在这些无菌卵巢中也很明显，可能是由于stwl需要维持异染色质[15]。也有可能TE抑制是这些缺陷的结果，而不是反映Stwl在TE沉默中的直接作用。为了帮助区分这些可能性，我们分析了从卵巢生成的已发表的RNA-seq数据，以了解影响GSC维持或分化的各种基因的突变。这些包括区分因子弹珠袋（bam），性别决定主调节因子Sex-Lethal（Sxl），以及GSC维持因子和piRNA靶向蛋白piwi（piwi）。bam和Sxl卵巢缺陷表现出"一袋弹珠"表型，其特征是分化因子破坏的特征，导致GSC样细胞过度增殖[27，30，31]。piwi突变体表现出与stwl突变体相似的GSC维持缺陷[4，6，32，33]。我们发现，bam和piwi的缺失，而不是Sxl，导致TE的上调，特别是LTR反转座子和种系表达的TE（图1D和S10，S2表）。据我们所知，TE抑制以前从未在bam突变体中观察到过。这些结果表明，stwl TE减压表型并不是GSCs丧失的间接反映，因为它也发生在bam突变体中，其具有GSC过度增殖的相反表型。同样值得注意的是，stwl突变体的影响程度远低于piwi突变体，这表明stwl可能不是像piwi那样直接抑制TE。相反，我们认为，通过其在下文所述绝缘体功能中的作用，stwl的丧失可能导致TE的广泛但中度抑制。

富含睾丸的基因子集在无卵巢中高度上调

卵巢中需要其他GSC调节基因，包括Sxl，以沉默睾丸特异性转录本[27]。我们测试了突变卵巢是否也表现出睾丸特异性基因的异常抑制。我们利用来自modENCODE解剖学RNA-Seq数据集的RPKM值，根据组织偏倚表达对所有基因进行分类[34]。我们发现，富含睾丸的基因是粗卵巢中上调最多的基因之一，而卵巢富集基因是下调最多的基因之一（图1E和1F）。在stwl，bam，Sxl和piwi缺陷卵巢中持续上调的基因在任何组织中均未偏倚表达（S2和S3表，S11图）。

虽然睾丸偏倚的转录本是无卵巢中上调最多的转录本之一，但基因集富集分析（GSEA）发现，总体而言，它们在无卵巢中下调（S12图）。这反映了先前在尝试对大型且可能复杂的基因集进行分析时注意到的GSEA性能的局限性[35，36]。根本问题是，这些集合包括双向错误调节的基因，可能是因为同一途径的成员可能因上游激活剂或抑制剂的错误表达而下调或上调。因此，我们对每个RNA-Seq实验中表达基因的顶部和底部1%的富集基因进行了过度代表性测试，以确定差异表达最强基因的极端情况的强偏倚（图1F）。我们的上/下百分位数过度代表性测试证实，睾丸富集基因在非游戏卵巢中大多数高度上调基因的前1%中过度代表，但它们在stwl和Sxl空或缺陷卵巢中更为普遍，相对于bam或piwi突变卵巢。我们还发现，在成年头部以及芫荽和幼虫阶段中枢神经系统（CNS）中富集的转录本在粗卵巢中上调（图1F）。

stwl 的丧失导致睾丸特异性基因簇的异位表达

为了测试基因组的特定区域是否被错误调节，我们通过基因组位置绘制了LFC（图2A）。我们在2R染色体59C4-59D处发现了一个惊人的表达模式，其中聚集在227.5 Kb内的11个基因在粗卵巢中强烈上调。该簇中的四个基因是无卵巢中最强的上调基因之一（图1E）。共表达的基因簇在许多物种中很常见，通过允许同时调节相邻基因组，为基因组增加了组织维度。睾丸特异性基因簇在D中特别常见。黑色素胃，其中59C4-59D最大，它们的表达受到严格调节以防止体细胞表达[37]。我们证实，Shevelyov等人描述的59C4-59D簇[37]主要由富含睾丸的基因组成（总基因28/34），其中大部分在野生型卵巢转录组中不存在（S4表）。

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图 2. 一簇睾丸特异性基因在无卵巢中减压。

（A）卵巢中基因的差异表达（DE）（stwl null / WT）沿着2号染色体。仅绘制DE基因（FDR <0.01）。富含睾丸的基因是红色的（见方法）。橙色阴影区域标记周发色异染色质;箭头指向 59C4-59D 处的睾丸富集簇。（B）在野生型和无性腺中59C4-59D簇中基因的每百万映射读取（RPKM）的每千碱基转录本读取（RPKM）。不会绘制低计数异常值。（三）日志2相对于野生型，59C4-59D簇的折叠变化（LFC）与来自stwl，bam，Sxl和piwi突变或缺陷卵巢的所有基因。横条显示平均聚类 LFC。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.g002

H3K9me3通路成分的缺失导致富含睾丸的基因异位表达[27，31]。同样，我们发现59C4-59D簇的基因在卵巢中是转录惰性的，并且在无卵巢中变得异位表达（图2B，S4表）。我们还发现，该簇在bam，Sxl和piwi突变体或缺陷卵巢中上调（图2C），使其成为性别特异性基因沉默丧失的潜在有用转录报告程序。

Stwl 的丧失导致 S2 细胞和卵巢中富含睾丸的基因的抑制

即使当测定的突变组织在形态上看起来与野生型相似时，Stwl的多效性功能仍然使得确定哪些基因由于Stwl丢失而特别失调变得具有挑战性。为了进一步解决这一问题，我们使用用stwl dsRNA处理的S2细胞在均质组织上进行RNA-seq（参见方法）。针对Stwl蛋白的免疫印迹显示，stwl dsRNA处理使Stwl蛋白水平降低了至少80%，RNA-Seq证实stwl转录本减少了约85%（图3A和3B）。

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图 3. RNAi敲低S2细胞中的stwl导致富含睾丸的基因的抑制。

（A）用抗Stwl抗体对S2细胞进行蛋白质印迹，用对照dsRNA（lacZ）或dsRNA靶向stwl转录本处理。每个泳道的估计细胞数（乘以1000）显示在印迹下方。（B）相对于lacZ对照，stwl KD S2细胞中13个受影响最严重的注释基因的折叠变化。男性和女性符号表示基因在野生型中是睾丸富集还是卵巢富集。"*"标记属于59C4-59D睾丸特异性簇的基因。（C） FDR、计数和平均对数2折叠变化（LFC）是为每组组织富集基因绘制的，这些基因在粗大的零卵巢和粗大的dsRNA处理的S2细胞中的异位表达基因中过度代表。还通过LFC对stwl null卵巢中的异位基因以及对stwl null ova和stwl dsRNA处理的S2细胞的异位基因的前1%进行了过度代表性测试（对于该交叉组，绘制了stwl null ova中的平均LFC值）。仅绘制了FDR <0.05的基因集。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.g003

相对于卵巢中秸秆的丧失，S2细胞的秸秆dsRNA处理对转录本丰度的影响更为微妙，对TE的影响较小（S13图）。S2细胞是雄性和造血来源的，并且表达的基因少于卵巢[38，39]。尽管如此，正如在粗大的零卵巢中一样，我们发现富含睾丸的基因是stwl dsRNA处理的S2细胞中上调最高度的基因之一，包括59C4-59D簇的成员（图3B）。由于S2细胞中该簇的平均转录本丰度非常低，因此大多数这些基因从DESeq2进行的差异表达分析中移除[29]（S1表）。我们对不受低平均计数限制的异位表达基因的进一步分析发现，在无缺陷卵巢中上调的59C4-59D基因中，有5/12在stwl dsRNA处理的S2细胞中异位表达（S4表）。在 stwl dsRNA 处理的 S2 细胞中，富含睾丸的基因在前 1% 的异位表达基因中占比过高（图 3C）。

为了进行比较，我们将相同的方法应用于我们的卵巢数据，发现3，777个基因在无卵巢中异位表达。在这些异位富集基因中，富含头部和中枢神经系统的基因被高度过度代表，富含睾丸的基因也是如此，尽管程度较轻（图3C）。然而，富含睾丸的基因是LFC前1%的异位表达基因中唯一上调的组织类别（图3C）。我们发现，在stwl-dsRNA处理的S2细胞中，49%（129/262）的异位表达基因也在stwl null卵巢中异位表达。该基因亚群高度富集用于睾丸，头部和CNS转录本（图3C）。我们得出结论，stwl功能是抑制具有男性富集表达的基因，包括在体细胞组织培养细胞和卵巢中。

Stwl调节关键的性别决定和分化转录本

据报道，女性性腺异位表达和非卵巢基因上调的表型相似，用于女性性别决定基因Sxl、H3K9me3通路成员卵、wde和hp1a以及分化因子bam[27，31，40]。卵巢中需要Sxl用于女性性别确定;其关键功能之一是沉默（通过H3K9me3途径）确定蛋白PHF7的雄性种系，PHF7是一种组蛋白读数器，其表达对于诱导种系中的精子发生是必要且足够的[41，42]。女性生殖细胞中的PHF7诱导对于诱导Sxl缺陷卵巢的肿瘤生殖细胞表型也是必需的[27]。在野生型雌性生殖细胞中，Phf7的转录从第二个外显子中的TSS开始，这导致女性特异性转录本的5'UTR截断和卵巢中Phf7蛋白的缺失（图4A）。我们发现，无论年龄大小，男性特异性5' UTR在stwl null卵巢中均一致且异位表达，但在stwl-dsRNA处理的S2细胞中不表达（图4A）。因此，需要将卵巢中男性特异性编程静音。

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图 4. Phf7和bgcn由Stwl调节。

（A）Phf7的男性特异性5' UTR（由橙色阴影表示）在缺乏Sxl的卵巢和S2细胞中表达，以及缺乏Sxl的卵巢及其下游靶卵，wde（未显示）和hp1a（未显示）[31]。读取被归一化为1x覆盖深度，并在IGV中可视化，Phf7以3'至5'的方向显示。标明了外显子1，2和3;外显子 1 和部分外显子 2 是男性特异性的。（B）bgcn与ChIP-Seq中的Stwl结合两种不同的抗Stwl抗体（76和77）。显示了每个条件的两个独立重复。对读取进行GC偏倚校正，缩放至RPKM，并在IGV中可视化。（C）在stwl null ovary和stwl-dsRNA处理的S2细胞（包括bgcn，红色）中异位表达的基因在卵巢突变体中也上调或缺乏其他GSC基因。

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由于在卵巢缺陷和S2细胞中异位表达的基因重叠是如此引人注目，我们预测这些基因的上调在表现出种系缺陷的卵巢中可能是一致的。事实上，我们发现这些基因通常在bam，piwi和Sxl突变或缺陷卵巢以及卵子，wde和hp1a种系敲低（GLKD）卵巢中上调（图4C）。值得注意的是，我们发现bgcn转录本在我们检查的每个突变体和GLKD卵巢数据集中都高度上调。Bgcn与Bam结合并抑制与种系干细胞更新相关的mRNA，并且需要这两种蛋白质来促进发育中的膀胱母细胞的分化。

多效性和卵巢组成的实质性变化给解释缺乏GSC维持和分化基因的卵巢产生的数据带来了挑战。在bam和Sxl突变或缺陷卵巢中，GSC样细胞过度增殖，形成具有肿瘤样和干细胞样品质以及基因表达模式的结构[43，44]。它们还表达了与两种野生型性别的早期配子发生相关的转录本，其中许多是睾丸丰富的。对于由于粗大、Sxl或bam突变而导致卵巢的"男性化"，一种可能的解释是，它反映了GSC样细胞的过量，因此反映了通常在野生型配子发生的早期阶段表达的转录本[27]。单细胞数据使得解决这些问题成为可能[45]。我们发现，一些最显着上调的转录本，包括bgcn，在GSCs中表达（S20图）。然而，富含睾丸的转录本和GSC转录本的重叠非常小，并且不能解释我们在无卵巢中观察到的大多数异位表达的睾丸转录本。此外，我们发现stwl-dsRNA处理的S2细胞异位表达许多与我们在stwl null卵巢中发现的相同的富含睾丸的基因。S2细胞是男性来源的，但我们的分析发现，受影响的基因在对照S2细胞中几乎完全沉默。

为了确定Stwl对我们发现的基因表达的影响是直接或间接的，我们开发了两种针对该蛋白质的ChIP级抗体，并在S2细胞上进行了ChIP-Seq实验。两种 Stwl 抗体均符合我们的抗体验证标准，包括在免疫印迹（S14 图）和免疫荧光（S15 和 S16 图）实验中识别靶蛋白，成功免疫沉淀靶蛋白（S17 图），以及 S2 细胞免疫印迹的低背景（图 S17 和 3A）。与输入和模拟样本相比，我们的ChIP-Seq实验产生了一组强大的峰值（S18图）。我们鉴定了3，265个基因，其转录起始位点（TSS）在Stwl峰的1 Kb范围内，因此可以被认为是由Stwl结合的（S2表）。

虽然我们在Phf7位点发现了一些Stwl富集的证据（输入端的1.7倍，IDR = 0.048），但我们在bgcn启动子处发现了非常强的Stwl富集（输入端的4.1倍，IDR = 1.3e-5) (图4B）。bgcn的峰值是Stwl峰值的前1%，当根据褶皱富集度进行排名时。bgcn转录本在果蝇卵巢中以非常低的水平表达;其表达主要限于GSCs，对于促进不对称分裂为囊母细胞子体至关重要[46]。bgcn的丧失导致肿瘤性卵巢表型，因为GSCs增殖而不分化成膀胱母细胞子。虽然Bgcn的结合伙伴Bam的过表达会导致GSC维持缺陷，但当Bgcn在早期生殖细胞中过表达时，未观察到该缺陷[46，47]。我们得出结论，Stwl直接调节卵巢中bgcn的表达，并假设由Stwl丢失引起的bgcn异常表达导致雌性种系中雄性特异性编程的激活。这一发现与基于先前对双突变体的分析的bgcn（和bam）下游的简单模型不一致[13，14]。因此，我们还检查了bgcn stwl双突变体，并证实了先前的结果，即它们能够产生分化的种系囊肿（S19图）。我们还发现双突变体是完全无菌的，这并不奇怪，因为两个单突变体都是无菌的。

Stwl结合峰谱类似于已知的绝缘子结合蛋白

我们使用ChIPseeker注释了整个基因组中的2，143个Stwl结合位点[48]。Stwl在启动子处高度富集，以转录起始位点上游~150 bp为中心（图5A）。为了更深入地理解这种模式，我们将我们的Stwl ChIP-Seq图谱与ModERN联盟的数据进行了比较，该数据涉及D中Gfp标记的DNA和染色质结合蛋白的475个ChIP-Seq实验。使用基因组协会测试仪（GAT）程序的黑色素胃胚胎和幼虫[49][50]。简而言之，GAT 根据每个峰集的大小模拟峰的零分布，然后估计偶然预期的重叠数，并将其与观察到的重叠数进行比较。我们根据褶皱富集和重叠百分比检查了最相似的结合曲线。令人放心的是，根据折叠富集（S5表），来自ModERN的ChIP-Seq与Stwl峰集具有最相似的结合曲线。我们还发现，Stwl ChIP-Seq谱与许多已建立的和假定的绝缘子结合蛋白高度相似，包括BEAF-32，CTCF，Su（Hw），Hmr和Lhr（图5B）。

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图 5. Stwl结合位点与绝缘体 - 蛋白质结合位点重叠。

（A）由Stwl和模拟抗体结合的启动子的峰密度。每个条件的频率由显示的 4 kb 空间中存在的峰值数加权。（B）由Stwl结合的启动子的峰密度与已知的绝缘子结合蛋白。每个蛋白质的频率缩放到最大值为1。（C）使用Meme Suite在狭窄的Stwl峰中鉴定出丰富的图案[51]。（D）对于（C）中的每个基序，我们包括与基序最匹配的转录因子以及包含给定基序的Stwl峰的数量（#匹配）。%匹配度标识在 1379 个狭窄的 Stwl 峰中发现的给定图案的百分比。并集列（例如，1|2）描述与 1 个或多个指示基序匹配的窄 Stwl 峰的数量和百分比。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.g005

我们利用模因套件来鉴定S2细胞Stwl ChIP-Seq中富集的结合基序[51]。我们发现，对于BEAF-32，Dref和bab常见的DNA序列基序，Stwl峰被富集（图5C）。Dref是一种绝缘体结合蛋白，是端粒维持所必需的[52]。我们鉴定出在stwl null和stwl-dsRNA处理的细胞中异位表达的bab在女性性别分化中起重要作用[53]。Stwl ChIP-Seq中绝缘子基序的出现与上述结合曲线相结合，为Stwl与绝缘体结合提供了强有力的证据。

Stwl 定位于重复 DNA，包括端粒重复序列、4 号染色体和周发丝体异染色质

先前的研究表明，Stwl是维持异染色质所必需的，并且与HP1在核外围的异染色质样结构中共定位[13，15]。我们发现Stwl在点染色体（4号染色体）上高度富集，这是高度重复的，并且主要是异色的[54]（图6A）。Stwl在2号染色体上的发色周围异染色质处也富集，特别是在异染色质 - 乙染色质边界处。最后，我们看到2L染色体上细胞学区域31的覆盖率显着增加。这些区域中的每一个也富集在S2细胞的Hmr ChIP-Seq中[55]。Hmr在2号染色体的定位也已通过免疫荧光被鉴定[56]。

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图 6. Stwl与重复的DNA结合。

（A） 每 100 kb 基因组（X 轴）的 Stwl 峰（Y 轴）覆盖率百分比 （%）。橙色阴影区域代表组成性异染色质（发色周围区域和4号染色体）。2L号染色体上的细胞学区域31也被突出显示。（B）重复元素的读取计数丰度的折叠变化，用于IP/模拟比较。Y 轴采用 log2 尺度。绘制了所有显著富集的元素（调整 p < .01）。红色元素在粗大的零卵巢中上调。所有卫星和非LTR反转座子序列（DOC6除外）都是端粒性的。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.g006

接下来，我们询问重复的DNA，包括卫星和可转座元素序列，是否在Stwl峰之间富集。由于峰值调用方法对重复DNA不可靠，因此我们重新分析了ChIP-Seq数据，而是计算了IP样本中相对于模拟读取的差异富集（参见方法）。这种差异富集分析确定了在Stwl IP样品中富集的重复DNA（图6B）。所有这些重复都超过了0.05的FDR阈值，但显着富集重复的折叠变化都小于2。然而，我们注意到，峰值调用算法可以可靠地识别IP/mock的折叠变化非常低的DNA富集区域。在我们自己的峰集中，Stwl结合的位点通过了IDR阈值，并在两种抗体中复制，尽管折叠变化值低至1.2;所有 Stwl 束缚峰中富集的中位折叠变化为 2.0。因此，我们相信我们的Stwl ChIP-Seq已经确定了与重复DNA的结合。

我们发现Stwl ChIP-Seq富含LTR反转录转座子，特别是copia，gypsy和bel超家族的成员（图6B）。Copia元素是stwl null卵巢中上调最高度的转录本之一，Stwl在Copia LTR和内部序列上都富集。然而，对于其他LTR反转录转座子，如Bel和吉普赛，这种富集仅沿着LTR成分发生，而不是内部区域。我们注意到，在我们的基序富集分析中，我们没有检测到表明吉普赛绝缘体结合的基序。这些结果表明，Stwl可能通过其LTR区域参与调节这些逆转录转座子。或者，Stwl可能与异色片段结合，而不是调节全长活性元件。

我们惊讶地发现端粒相关序列在Stwl IP中持续富集（图6B）。除了Jockey家族元件Doc6之外，所有富集卫星和非LTR反转座子都是端粒的。这些包括端粒卫星序列和端粒HTT阵列，Het-A，TAHRE和TART的每个成员。此外，我们发现Stwl峰与ChIP-Seq相对于转录因子pzg产生的峰高度相似，并且Stwl与Dref共享DNA结合基序（S5表，图5C）。这些因素中的每一个都局限于端粒维持，并且是端粒维持所必需的[57，58]。最后，我们发现大多数Stwl结合的端粒重复序列也在stwl null卵巢中上调（图6B中红色的基因名称）。这些发现表明，Stwl定位于端粒并抑制端粒重复的表达。

讨论

由于其多效性活性，鉴定Stwl的分子功能尤其具有挑战性，包括在GSC维持，卵母细胞测定，DNA损伤反应和TE抑制方面。推断 Stwl 功能因 Stwl 丧失的后果而进一步复杂化，例如细胞凋亡和雌性种系的最终丧失。由此产生的细胞内容改变可能导致识别与野生型变种人的实际目标不对应的stwl突变体中错误调节的转录本。在分析受秸秆丢失影响的组织的稳态RNA谱时，我们试图梳理出直接与间接影响。首先，我们在两个发育阶段测定了卵巢，从而将卵巢发育状态作为差异表达的广义线性模型中的一个因素。其次，我们观察了S2细胞在stwell敲低后的差异表达，以测定均质组织中的Stwl功能。通过结合这两种测定，我们能够鉴定出由于stwl丢失而持续上调的基因。

Stwl压制男性特异性转录本

我们发现，富含睾丸的基因在粗卵巢中显示出上下调节的混合模式。引人注目的是，富含睾丸的基因一直是卵巢中上调程度最高的基因之一。这些错误调节的基因中的大多数并不直接与Stwl结合，这表明其转录本的抑制可能是stwl丢失的下游后果。我们发现，stwl null ovary表达了主性别决定因子Phf7的男性特异性转录本，但S2细胞中它被Stwl结合的证据是暂定的。Phf7仍然是一个有吸引力的候选者，作为卵巢中Stwl调节的直接目标。

我们在swl null卵巢中发现了染色体2R上高度上调，富含睾丸的单个簇。该簇中的基因是卵巢中上调基因的前1%，包括GSC基因HP1Lcsd，ord，RpL37b和RpL22样基因。59C4-59D 集群位于层关联域 （LAD） 内。这种结构被认为通过将这些基因簇与核层紧密结合并阻止其表达来特异性抑制睾丸特异性基因的表达。除了这个簇之外，我们没有发现stwl丢失与富含睾丸的基因簇或LADs的错误调节之间存在关联。我们也没有发现Stwl与该区域绑定，或与LAD重叠。

我们发现，59C4-59D簇中的多个基因在stwl-dsRNA处理的S2细胞中也受到抑制，以及Sxl和piwi突变体或缺陷卵巢，以及卵子，wde和hp1a种系敲低卵巢。在每种情况下，簇中的许多基因相对于野生型卵巢是异位表达的。我们得出结论，59C4-59D簇和其他富含睾丸的基因的异位表达是与stwl，Sxl，bam，hp1a，wde和卵突变体相关的"男性化"缺陷的一致报告。

Stwl 调节 Bgcn

虽然男性转录本在stwl突变体中被上调和/或异位表达，但我们的ChIP数据表明Stwl在S2细胞的这些位点不结合，这表明男性化缺陷是stwl丢失的间接后果。一种可能性是，这些表型与bgcn的异位表达有关，bgcn通常仅限于卵巢中的GCCs和膀胱母细胞，但在整个精子发生过程中广泛且高度表达[46，59]。bgcn是Stwl调控的有力候选者：其启动子与S2细胞中的Stwl结合，并且在stwl null ovaria和stwl dsRNA处理的S2细胞中高度上调。此外，卵巢中bgcn转录本的表达与Stwl相反，表达hs-bgcn转基因的女性不育[46]。然而，bgcn的异位表达不太可能是stwl突变体不育的唯一原因，因为bgcn;Stwl突变体保持无菌状态（S19图）。

Stwl在种系干细胞保留或卵母细胞测定阶段维持卵生的分子途径可能与Bam和Bgcn是关键参与者的途径显着重叠。Stwl对Bam和Bgcn的GSC分化功能具有拮抗作用并处于下游：bam和bgcn突变体表现为GSC肿瘤卵巢，而stwl;砰砰 bgcn双突变体形成基本种系囊肿[13，14]。尽管Bgcn在卵巢中具有明确而重要的作用，但它在整个卵生过程中基本上是沉默的[45]。Stwl在雌性种系中的功能之一可能是将bgcn的表达限制在GSCs上。考虑到所有这些结果，我们提出stwl是bgcn GSC分化功能的下游，同时也需要抑制其后期表达。然而，卵巢中的Stwl结合位点是未知的，并且可能与我们在S2细胞中发现的不同。针对卵巢中 Stwl 的 ChIP-Seq 可以进一步阐明 Stwl 与男性转录本（包括 bgcn）之间的关系。

秸秆在基因组绝缘子和异染色质处积聚

stwl的丧失导致重复元素的抑制，这种表型也在bam和piwi突变卵巢中观察到。虽然 Piwi 是通过 piRNA 途径已知的 TE 调节因子，但尚不清楚 bam 和 stwl 突变卵巢中 TE 的上调是否反映了 TE 沉默中的直接作用。为了回答Stwl是否直接靶向重复DNA以及它如何参与TE控制，我们开发了Stwl抗体并测定了S2细胞中的Stwl结合。我们的分析表明，Stwl定位于绝缘体元件。大多数秸秆峰位于启动子的上游;这种结合谱在绝缘体结合蛋白中很常见。更直接地说，我们从许多绝缘子结合蛋白（包括BEAF-32，Dref，ZIPIC，Pita，Hmr和Su（Hw））中鉴定出Stwl峰和峰之间的强序列相似性。此外，我们发现秸秆峰积聚在异色位点，特别是致密体周围异染色质边界，端粒和点染色体。

这些数据表明，Stwl是一种绝缘体结合蛋白。未来的生化研究将需要证实这一点，并且确定我们从S2细胞中的ChIP-Seq数据中发现的定位模式是否也发生在生殖系中也很重要。尽管如此，我们的提案与先前的工作一致，表明Stwl在免疫荧光实验中与绝缘体复合物相关[22]。绝缘子具有多种功能，包括阻断增强子 - 启动子相互作用和建立边界以防止染色质修饰的扩散并分离差异表达的启动子对。绝缘体结合蛋白，如CP190，也可以介导长程相互作用[60，61]。如果Stwl参与长距离相互作用的形成，它可能会促进异色绝缘体站点与异色区域的拴合。我们推测，Stwl结合的位点位于受抑制的染色质区域附近，并且Stwl的丢失导致这些被抑制的染色质标记扩散到邻近的位点。Stwl很可能通过与其他绝缘体结合或异染色质相关蛋白建立边界来发挥其作为绝缘体的功能，以确保附近基因的正确表达。

D.黑色素胃卵巢是成蝇中细胞类型的复杂混合物。分化的体细胞作为支持细胞，引导生殖细胞走向产生活配子的最终命运。此外，这些细胞谱系中的每一个都来自一小群自我更新的干细胞。我们认为，绝缘体允许基因在卵巢等复杂组织的发育过程中具有多效性功能。绝缘子通过破坏增强子 - 启动子相互作用，为基因调控增加了一层基因组复杂性。对卵发生过程中启动子、增强子和绝缘子的详细相互作用知之甚少，但可能是解释发育中卵巢中多效性基因调控的关键。

方法

果蝇库存

P{w[+mC] = lacW}stwlj6C3 (叽叽喳喳j6C3）从布卢明顿股票中心[BDSC #12087]收购。该等位基因是女性不育的，当跨杂合子到秸秆缺乏染色体（Df（3L）Exel6122）时，显示stwl突变表型（卵巢萎缩，种系丧失，卵母细胞中缺乏Orb积累）[BDSC #7601]。我们观察到没有核信号与抗 Stwl 抗体在 stwl 中j6C3纯合子，表明它是一个空等位基因（S2图）。

我们发现j6C3染色体是纯合致死的，提示致死性隐性突变的积累。为了消除这些致命的突变并使遗传背景同质化，我们超越了stwl。j6C3从近交系y w品系（10代近亲繁殖;随后称为y w F10）的雄性突变雌性为8代。通过平衡重组的第三条染色体与来自w的TM6b来建立库存;Sp/CyO;TM2/TM6b 原液在单雌交配中。在秸秆中存在P元件插入j6C3随后是其w标记物并通过PCR确认。由此产生的种群产生了可行且肥沃的纯合雄性和可行但不育的纯合子雌性。y w F10枪托被用作野生型（stwl）控制。++

在图 1A、S4 和 S19 中，stwl 零基因型对应于 stwlj6C3/Df（3L）Exel6122如图例所示。在 S2 和 S3 Figs 中，我们使用了 stwlΔ95空突变体 （stwlΔ95， ry/TM3， Sb e ry），由 D. McKearin 教授（HHMI，华盛顿特区）提供。该等位基因在 stwl 位点处包含 5' 缺失，导致移码突变和 stwl 空表型 [11]。在所有其他实验中，stwl null基因型对应于stwlj6C3/叽叽喳喳j6C3.

对于S9 Fig中的生育力测定，通过将含Gal4的雌性杂交到UAS-stwl-RNAi（y1sc v*1;P{y[+t7.7] v[+t1.8] = TRiP。GL00337}attP2） [BDSC #35415] 男性.使用以下Gal4线：Actin5c-Gal4：y1 w*;P{Act5C-GAL4}17bFO1/TM6B， Tb1[BDSC #3954]， nos-Gal4： w1118;P{GAL4：：VP16- 否UTR}CG6326MVD1[BDSC #4937]， C355-Gal4： P{w[+mW.hs] = GawB}c355， w1118[BDSC #3750]， T155-Gal4： P{w[+mW.hs] = GawB}T155 [BDSC #5076]， GR1-Gal4： w*;P{w[+mW.hs] = GawB}GR1 [BDSC #36287]， C306-Gal4： P{w[+mW.hs] = GawB}c306， w1118[BDSC #3743]， Matalpha-Gal4： w*;P{w[+mC] = matalpha4-Fal-VP16}V37 [BDSC #7063]， y1 w* P{w[+mC] = bam-Gal4：VP16}1 [BDSC #80579].Tub-Gal4 / TM3是Wolfner实验室（康奈尔大学，伊萨卡，纽约州）的礼物。

为了生成bgcn跨杂合突变体，我们穿越了y w;断续器1/CyO to cn bgcnz2-1748 bw/CyO.这两只bgcn股票都是Aquadro实验室的礼物。

用于qRT-PCR和RNA-seq的性腺组织的制备

所有苍蝇在25°C下饲养，收集每种基因型的处女雄性和雌性，并为"较老"的样本老化两天;对于新关闭的样本，收集并立即解剖处女雌性（关闭后<4小时）。睾丸和卵巢清扫术根据先前公布的方案进行[62，63]。简而言之，一次使用CO镇静剂15-30只苍蝇2并储存在冰上。使用锋利的镊子在冰冷的1x PBS中提取性腺，与肠道组织（和男性的辅助腺体）分离，并在冰冷的1x PBS中储存约30分钟。在液体NO中快速冷冻之前，将PBS吸出并将组织匀浆在100-600μlTrizol（取决于解剖组织的总体积）中2并在-80°C下储存。RNA-seq的所有样本重复均由约30个卵巢/睾丸对组成，其中大部分是在23天内大约相同时间在一天中的同一时间以单次解剖收集的。在RNA提取之前，将来自表型"大"卵巢（2天大的y w F10）的Trizol匀浆以1：10稀释，以防止色谱柱过载。

根据先前发表的实验方案提取RNA[64]。简而言之，将Trizol匀浆组织样品在室温下解冻并用0.2体积的氯仿处理以促进相分离。使用Qiagen RNeasy Plus Mini Kit从水相中提取RNA。这包括在Qiagen gDNA消除剂离心柱中应用水相，以限制基因组DNA的残留。DNA污染也通过列上DNA酶消化（Promega RQ1 DNAse）得到解决。通过安捷伦生物分析仪验证RNA质量和浓度;确认所有样品的RNA质量具有RQN> = 7.0和至少1.0μg的起始物质。

搁浅的cDNA文库制备由Polar Genomics（纽约州伊萨卡）进行。从总RNA池中分离和片段化mRNA，然后进行第1和第2（dUTP掺入）链合成。随后对dSDNA进行dA尾和适配器连接，然后进行大小选择，UDG消化以消除第二链，并进行PCR扩增。所有库（总共18个）都在Illumina NextSeq（单端，75 bp）的单通道上进行测序。原始序列读取已上传到NCBI序列读取存档（SRA），格式为.fastq格式，格式为BioProject ID PRJNA788954。

在对测序读数的初步分析中，我们发现2个文库（2个从0日龄y w;叽叽喳喳j6C3/叽叽喳喳j6C3卵巢）质量不足，可能是由于样品回收或文库制备过程中的污染。因此，我们丢弃了这些读数并准备了新的样本。如上所述，在Trizol中收集，解剖和均质卵巢（除了卵巢池从每次复制30个增加到45个卵巢对）。如上所述制备搁浅的cDNA文库，随后在Illumina HiSeq 2500高输出（单端，50 bp）的单通道上进行测序。

对于qRT-PCR，如上所述解剖和处理卵巢，每个样品具有约30个卵巢对的三个生物学重复。使用标准方案用Invitrogen寡分T引物和逆转录酶合成cDNA。所有qRT-PCR测定均采用三种技术重复进行。将每个技术重复的转录本丰度归一化为源生物样品中Rpl32转录本的平均水平。

针对 Stwl 的多克隆抗体的生产和验证

从D扩配来自Stwl蛋白C末端的编码氨基酸911-1037的DNA片段。从~20 y w F10个体中提取的黑色素胃卵巢cDNA。该区域缺乏预测的相互作用域，使其更有可能被免疫反应性所利用。使用NEB Gibson组装试剂盒[65]将片段克隆到N端标记MBP融合载体（Genbank：AF097412.1）中，并转化为具有化学能力的E。大肠杆菌（一针TOP10）。通过PCR和Sanger测序确认了成功的组装和转化。

使用直链淀粉树脂（NEB：E8021L）从诱导细菌培养物中纯化MBP-Stwl抗原。简而言之，在1 L含有MBP-Stwl质粒的细菌培养物中以0.2mM IPTG诱导抗原表达，然后在18°C下摇动?18小时。将细菌沉淀并重悬于裂解缓冲液（50mM Tris pH 8.8，200mM NaCl，2 mM DTT，1 mM PMSF，1mg / ml溶菌酶， 1x Roche cOmplete EDTA-Free蛋白酶抑制剂鸡尾酒）在4°C下，将裂解物在冰上超声处理以确保彻底裂解，然后以20，000xg旋转45分钟以沉淀碎屑。然后将上清液施用于柱上的直链淀粉树脂。将Stwl-MBP结合树脂用1柱体积的低盐缓冲液（50 mM Tris pH 8.8，200 mM NaCl，2 mM DTT）洗涤4次，然后用1柱体积的高盐缓冲液（50 mM Tris pH 8.8，1.5 M NaCl，2 mM DTT）洗涤4次，然后用1柱体积的低盐缓冲液洗涤4次。在低盐缓冲液中用10 mM麦芽糖洗脱Stwl-MBP。在10%SDS PAGE上使用考马斯染色确认存在57.5 kDa MBP-stwl蛋白;使用布拉德福德测定法估计浓度。使用Amicon Ultra-4 10K离心过滤装置将含蛋白质的馏分汇集至终浓度为1.0mg / ml。

纯化的蛋白质被提交给Pocono Rabbit Farm & Laboratory Inc.注射。根据免疫前血清中缺乏背景信号（通过探测野生D型确定）选择两只豚鼠（以下简称GP 76和GP 77）进行抗原注射。黑色素胃病卵巢与血清在免疫荧光测定）。

我们发现两种抗体都能识别野生型卵巢（S14图）和S2细胞（图3A）中的~135 kDa蛋白。在空和RNA敲低样品中，以及用免疫前血清探测的野生型裂解物中不存在该信号。预计初级秸秆转录本将产生112.9 kDa蛋白;先前的研究表明，针对Stwl的抗体可以识别出大小相似的蛋白质[11]。

我们进行了免疫荧光（IF）实验，以确认Stwl抗体靶向核蛋白，并与使用其他Stwl抗体进行的IF实验进行比较。D. melanogaster卵巢在冷的1x PBS中从野生型（y w F10）个体中解剖，并固定在4%多聚甲醛中，0.1%Triton X-100在PBS中。然后将组织在PBT中洗涤3x（1x PBS，0.1%吐温20），然后在PBTA中洗涤4x（PBT与1.5%BSA）。将样品在4°C下孵育过夜，一抗浓度为1：200，用于Santa Cruz Biotechnology，Inc.的Stwl抗血清和1：200的Rabbit Vasa。在PBT中洗涤3次并在PBTA中洗涤4次后，组织用二抗（1：500山羊抗豚鼠罗丹明Red-X，1：500山羊抗兔Alexa 488）孵育2小时。在PBT中洗涤3次后，将组织与DAPI一起安装在vectashield中，并在蔡司共聚焦上成像。我们发现两种抗体都特异性标记了睾丸和卵巢中的生殖细胞核（S15图）。此外，HA标记的Stwl [FlyORF库存#F001844]的异位表达与来自两个Stwl反血清[66]的信号共定位（S16图）。

细胞培养和核苷酸

将S2细胞在M3 + BPYE培养基中培养，按照指示由Shields和Sang粉末培养基（Sigma S-8398）制成，补充0.5gKHCO3，每升1克酵母提取物和2.5克巴托砜，pH值调节至6.6并无菌过滤。添加了100x抗生素抗真菌药（Thermo-Fisher 15240062）和胎牛血清（Sigma F2442批次#078K8405），浓度分别为1x和10%。将细胞维持在25°C，每3-4天传代7次，然后用于RNAi实验。

对于dsRNA诱导的敲低，将细胞接种在浓度为250万个细胞/ ml的无血清培养基中，然后用30μg/ ml的lacZ或stwl-dsRNA处理60分钟，然后加入含有13%FBS（终浓度，10%FBS，7.5μg/ μl dsRNA）的M3 / BPYE培养基。细胞在3天后化学交联并冷冻。

使用NEB HiScribe T7高产量RNA合成试剂盒（E2040S）合成RNA，该试剂盒来自YEp365质粒（lacZ对照）生成的PCR产物或从S2细胞中提取的基因组DNA。为了获得有效的stwl KD，我们从参考文献中生成了三种不同的dsRNA，每个dsRNA靶向stwl的第二个外显子，该外显子存在于所有stwl转录本中[67]。用每个dsRNA的10μg/ ml处理S2细胞。

S2细胞中的染色质免疫沉淀

在dsRNA处理3天后，将细胞以1000xg离心5分钟，然后取出培养基，在1x PBS中洗涤一次，并在1x PBS中重悬，并通过加入16%多聚甲醛至1%终浓度在室温下交联2分钟。在室温下通过在1x PBS（终浓度0.15 M）中加入2.5M甘氨酸来淬灭交联5分钟。将细胞在4°C下煮沸15分钟，纺丝并在1x PBS中洗涤至4°C，并在液氮中沉淀并速冻。

将细胞在冰上解冻，并在含有0.1%SDS，1%Nonidet P-40和1片/ 10ml Pierce蛋白酶抑制剂迷你片剂，不含EDTA（A32955）的RIPA缓冲液中裂解20分钟。然后将裂解物在生物裂变器（Diagenode）水浴中以高强度超声处理，将DNA剪切到所需的大小范围（300-500 bp），总共45分钟，循环20秒，休息1分钟，每15分钟快速旋转裂解物以沉降样品并用冰冷的水重新填充生物破碎机。

将6μl新鲜解冻的Stwl抗血清和免疫前血清加入300μl细胞裂解物（1：50稀释）中，并在4°C下孵育过夜。 用每μl约34，000个细胞制备细胞裂解物，因此每个IP实验在大约10 x 10上进行6细胞。用Invitrogen Dynabeads蛋白A免疫沉淀IP复合物进行免疫沉淀（10001D）。使用前，将珠子在含有1mg / ml BSA，1mg / ml丙基乙烯基吡咯烷酮封闭剂和1片/ 10ml Pierce蛋白酶抑制剂Mini片剂，不含EDTA（A32955）的封闭缓冲液中洗涤2x 10分钟，并在冷冻的RIPA缓冲液（也使用蛋白酶抑制剂）中洗涤1x 10分钟。将IP样品加入到封闭的珠中，并在4°C下孵育2小时;每个IP使用50μl微珠。

将磁珠在低盐缓冲液中洗涤1x，在高盐缓冲液中洗涤2x，在LiCl缓冲液中洗涤1x，在TE缓冲液中洗涤2x。从10%SDS，1M NaHCO的珠子中洗脱IP复合物3洗脱缓冲液在65°C下洗脱30分钟。 通过加入5 M NaCl至0.2 M NaCl终浓度并在65°C下孵育过夜来逆转交联.DNA在37°C下用RNAse A处理2小时，蛋白酶K在55°C下处理2小时，然后使用Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒进行清洁。输入样品在超声处理后冷冻，然后解冻并如上所述反向交联。使用NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒制备Illumina（NEB#E7645）制备DNA文库，使用Ampure XP珠进行清理，无需选择尺寸。

使用Qiagen RNEasy加提取试剂盒，从来自用于ChIP-Seq实验的相同群体的S2细胞中提取RNA一式三份，其中包括从样品中额外消除gDNA。所有RNA样品均具有RQN>7.0，由生物分析仪仪器（安捷伦）测定。使用NEBNext Ultra II定向RNA文库制备试剂盒制备Illumina（E7760G）制备cDNA文库，使用Ampure XP珠进行清理。所有cDNA和ChIP文库（共22个）被汇集在一起，并在Illumina NextSeq的单通道（单端，75 bp）上进行测序。原始序列读取已上传到NCBI序列读取存档（SRA），格式为.fastq格式，格式为BioProject ID PRJNA788954。RNA-Seq数据处理，QC和S2细胞样品的分析按照"读取处理，比对和归一化"部分中所述进行。

读取处理、对齐和规范化

我们使用FastQC（版本0.11.6）测定了fastq格式的原始读数的质量，并使用Trimomatic（版本0.32）对适配器序列和质量进行了修剪;（java -jar trimmomatic-0.32.jar SE [raw_reads.fq] [trimmed_reads.fq] ILLUMINACLIP：TruSeq3-SE.fa：2：30：10 SLIDINGWINDOW：4：20 MINLEN：50 AVGQUAL：20）[68，69].我们使用FastQ Screen来识别我们文库中的非果蝇污染物[70]。

For RNA-Seq, we aligned reads to a curated list of consensus sequences for repetitive elements using relaxed bowtie2 settings (bowtie2 -x [repetitive_consensus_sequences.fasta] -U [trimmed_reads.fq] -S [repetitive_alignment.sam]—un-gz [unmapped_reads.fq.gz]—score-min L,0,-1.5 -L 11 -N 1 -i S,1,.5 -D 100 -R 5) [71]. Unmapped reads from this alignment were saved and aligned to the unmasked Drosophila melanogaster genome (r6.03) using bowtie2 default settings [72]. We counted the number of reads mapping to each repetitive element; we utilized HTSeq version 0.6.0 to count the number of reads aligning to exons in the genomic alignment [73]. We concatenated the read counts into a single file for each sample.

In order to normalize for sequencing bias resulting from GC-content bias or batch effects, we normalized the read counts using EDAseq [74]. We removed counts for all genes with a mean read count less than or equal to 10 across all samples. We then performed within-lane normalization for GC-content: read counts within individual samples were transformed via full-quantile normalization between feature strata to normalize for GC-content of assayed genes. Between-lane normalization was then performed (again using full-quantile normalization between feature strata) to account for differences in sequencing depth, and offset values were generated for each transcript in the count matrix so that raw counts could be analyzed for differential expression analysis.

In order to provide context for our biological observations, we compared stwl null ovary data to available data from genotypes that reduce or eliminate bam, egg, wde, hp1a, Sxl, and piwi in ovaries. The bam data comes from bam1/bam114-97 females (SRA PRJNA117723); piwi data from piwi1/piwi2 females (SRA PRJNA289709); egg, wde and hp1a data from germline-specific RNAi knockdown females (SRA PRJNA432192); and Sxl data from snf148 homozygous females, a mutant that phenocopies germline-specific loss of Sxl (SRA PRJNA275434) [27,30,31,33]. Alignment and normalization for all datasets were as described above.

For ChIP-Seq, trimmed reads were aligned to the unmasked Drosophila melanogaster genome (r6.03) using bowtie2 default settings [72]. All reads with mapping quality <20 were removed using SAMtools [75]. All alignment files were corrected for GC bias using the deepTools commands computeGCbias and correctGCbias [76]. Briefly, the distribution of GC content per read is assessed over the contents of each alignment file, typically revealing overamplification of high-GC content sequences. The correctGCbias command generates an alignment file identical to the original, except with reads artificially removed or duplicated at biased regions to eliminate GC bias.

Repetitive DNA alignment and analysis for ChIP-Seq

从ChIP-Seq数据中识别丰富重复元素的局限性和挑战已得到充分记录[77-79]。对于相对较短的（75 bp）单端读取，几乎不可能识别来自重复DNA的大多数读取的基因组起源，因此不能根据真实的背景信号调用富集。因此，我们计算了IP样本中重复DNA相对于模拟样本的差异富集，并根据基因组读数进行归一化。下面将更详细地解释该过程。

为了分析重复的DNA，读取被修剪和对齐，如RNA-Seq读取所述。对于基因组读数，我们计算的读取数量与基因组的每个1 kb bin对齐的读数不同，而不是像我们用于RNA-Seq分析那样计算与基因体对齐的读取次数。我们将每个样本的重复和基因组读取计数连接到单个文件中。

差异表达/富集分析

我们使用DESeq2分析计数数据[29]。如上所述，我们从所有样本的平均读取计数>10的基因中导入原始计数和偏移量。对于睾丸，我们估计了突变型和野生型样品之间基因的差异表达。对于卵巢比较，考虑了样本的年龄：如果实验基因型的归一化读取计数与对照基因型中的读数一致，则基因称为差异表达，不包括那些发现基因在0天和2天大样本之间差异表达的情况。

对于ChIP-Seq，我们估计了IP和模拟样品之间基因组区域的差异富集，同时考虑了使用的抗体（GP 76或GP 77）和源S2群体（重复1或2）。据报道，只有当IP样本中该区域的归一化读取计数始终大于模拟样本时，基因组区域才被报告为差异表达，而不是由于IP条件（源动物抗体或源细胞群）的差异。计数矩阵上的PCA证实，计数数据中的大多数方差是由模拟样本和IP样本之间的差异解释的（S21图）。

在微分表达/富集分析之后，所有日志2使用apeGLM收缩估计器转换（折叠变化）估计值，以减少低计数基因中LFC值的变异性[80]。缩小的LFC值用于所有后续分析，包括过度代表性测试，基因集富集分析和基因本体分析，使用R包ClusterProfiler实施[81]。

ChIP-Seq 峰值调用和分析

每个IP实验用2个生物重复进行;每个生物复制品来自单个150厘米2lacZ-dsRNA处理的S2细胞的烧瓶。从每个烧瓶中，我们使用Stwl抗血清76和77（IP），免疫前血清76和77（模拟）免疫沉淀染色质，并且还测序输入DNA。因此，每个ChIP-Seq实验都可以针对其自身输入DNA的富集进行调用，并且可以使用针对两种抗体的模拟数据集来排除虚假峰。

我们遵循了ModERN联盟建立的峰值呼叫标准[49]。我们使用峰值调用算法MACS2 [82]对所有模拟和IP样本执行峰值调用。为了为下游 IDR（不可重复的发现率）分析生成一组有意嘈杂的峰值，以低严格性 （FDR<0.75） 调用峰值，如下所示：macs2 callpeak -t {IP/Mock.bam} -c {Input.Bam} -g 142573024—tsize 75 -n output.file -m 2 50 -q 0.75 — keep-dup all。此命令生成大量统计上无关紧要的峰值，这些峰值可以输入到 IDR 算法 [83] 中。通过使用IDR截止值0.05对生物重复之间的峰集进行IDR分析来识别置信峰集;超过此IDR阈值的重要峰值以相似的强度在同一基因组位置共同发生。IDR也是在模拟样品上进行的，限制要宽松得多（IDR<0.25），以便创建可能由生物噪声产生的更广泛的峰值列表（S18图）。

在 IDR 之后，IDR 76 和 IDR 77 IP 峰值集中与任一模拟中的杂散峰值重叠的任何峰值均使用 BEDTools 减法删除 [84]。然后使用BEDTools合并将这些过滤的峰集合并在一起，以便最终的Stwl峰集包含从任一抗体中自信地调用IP的峰的并集。最后，使用MACS2宽峰设置（mfold 2–50，q<0.50）重复峰值调用，并遵循与以前相同的步骤。最终的阔峰和窄峰呼叫合并在一起，形成一组宽峰格式的峰值。基序识别需要狭窄的，清晰定义的峰，仅在窄峰呼叫上完成;所有其他分析均对宽峰格式调用执行。

对于主题分析，我们从1，379个窄峰呼叫中提取了如上所述的山峰。然后将对称峰提取为以每个峰为中心的500 bp序列。这些序列被加载到MEME-ChIP Web浏览器（版本5.0.5）上，并在默认设置下使用MEME，DREME和CentriMo程序识别图案[51]。

鉴定组织富集和异位表达的基因

我们利用modENCODE解剖结构RNA-Seq数据集中的RPKM值，根据组织偏倚表达对所有基因进行分类[33]。Tau度量是确定给定基因组织特异性表达的最简单、最可靠的工具之一[85，86]。Tau 是根据对数计算得出的2（RPKM）可用组织子集中的值（S6表）。Tau值的范围从0到1，对应于从无处不在的表达到高度组织特异性表达的范围。Tau> = 0.7的基因被认为是组织特异性的;为了确定每个基因都富集在哪些组织中，我们分配了任何组织，其中记录了2（RPKM） 大于平均对数上方 1.5 个标准差2（RPKM）跨越该基因的所有组织（S7表）。根据这种分类，我们发现45.5%的注释基因表现出组织特异性表达，这意味着这些基因的转录本优先富集在一个或多个代表组织中（S8表）。

异位基因表达是指在正常条件下沉默的组织中基因的表达。由于异位表达的性质（即从非常低计数的基线增加转录本丰度），捕获准确的对数具有挑战性2（折叠变化）值，特别是因为GC归一化通常需要去除低计数基因。从DESeq2中计算的库大小校正RPKM值中测定卵巢，睾丸和S2细胞中的异位基因表达，而不去除低计数基因。我们通过以下方式定义了异位基因表达：1）将基因鉴定为野生型组织中表型沉默，2）发现基因表达在突变组织中显着增加至少2倍。根据Mann-Whitney（p<0.1）在给定的WT组织中平均RPKM<2.0的基因被认为是转录惰性的。mean_RPKM_null/mean_RPKM_WT>2.0的惰性基因经BH校正的曼惠特尼试验（p<0.25）以确定异位表达。

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断续器/stwllj6c3j6c3卵巢显示已知的无表型。

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S1 图 断续器lj6c3/stwlj6c3卵巢显示已知的无表型。

在闭合后3-6天从指示基因型的女性中解剖卵巢。无卵巢通常缺乏生殖细胞或含有严重紊乱的种系囊肿[11-13]。ɑ-Vasa标记生殖细胞，ɑ-Hts-1B1标记分支的富体或光谱体以及卵泡细胞膜。Germaria的位置从前到后（从左到右）。卵巢（y w F10）含有自我更新的GSCs（最前面的生殖细胞），它们分化成膀胱母细胞并成为有序的，有组织的种系囊肿。所有图像都是来自 z 系列的最大强度投影，表示深度为 10 微米。比例尺为20微米。+

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s001

（TIF）

S2 图 卵巢缺陷随着年龄的增长无法保留种系细胞。

D. melanogaster卵巢在Eclosion后10-15天从女性中解剖，用GP 76的ɑ-Stwl血清免疫染色（方法）。ɑ-Vasa标记生殖细胞，这些生殖细胞通常不会保留在较老的突变卵巢中。Germaria的位置从左到右从前到后。所有图像都是来自 z 系列的最大强度投影，表示深度为 10 微米。在 stwl 突变图像中，绿色通道过度曝光以表明不存在 Stwl 信号。比例尺为20微米。斯图尔Δ95/Df（3L）Exel6122卵巢（中间行面板）相对于其他图像以0.4倍的放大倍率显示，以显示整个卵巢的种系丢失。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s002

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S3 图 来自突变体的新闭合卵巢类似于WT卵巢。

D. melanogaster卵巢在闭合后<12小时从女性中解剖，并用GP 76的ɑ-Stwl血清免疫染色（方法）。ɑ-Vasa标记生殖细胞，这些生殖细胞通常不会保留在较老的突变卵巢中。Germaria的位置从左到右从前到后。野生型卵巢产生卵室，直到第7或8阶段，而突变卵巢将卵室维持到大约6或7阶段。低（0.24倍）放大倍率图像是单个共聚焦切片（第一行和第三行），高倍率图像是来自z系列的最大强度投影，表示深度为10微米（第二行和第四行）。在 stwl 突变图像中，绿色通道过度曝光，以表明没有 Stwl 信号。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s003

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S4 图 stwl null和WT卵巢的大小与新近关闭的个体相比，相对于年长的苍蝇更相似。

从指示基因型的新近关闭和两天大的女性中解剖卵巢。stwl缺陷的卵巢是基本的，但当来自新关闭的个体时，更接近于野生型卵巢。比例尺为 1 mm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s004

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S5 图 RNA-Seq样品的样品到样品的距离矩阵。

读取计数在DESeq中对对数进行正则化，并根据这些转换后的计数值计算样本之间的距离。热图在分层聚类后按相似度排序，并根据距离进行颜色编码，其中深蓝色单元格表示距离为0（完全自相似），白色单元格表示最大距离（完全不同）。同一组（相同年龄和基因型）内的样本一起出现并形成蓝色簇。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s005

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S6 图 RNA-Seq计数基质的主成分分析（PCA）。

对计数矩阵中500个最可变基因的正则化对数转换读取计数进行PCA。同一组（相同年龄和基因型）内的样本聚集在一起，表明批次效应最小。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s006

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S7 图 转座子和富含睾丸的基因在无卵巢中一直上调。

（A-B）STWL null 中 TE 的折叠变化 （stwlj6c3/叽叽喳喳j6c3）相对于来自 RNA-Seq 测定的 0 天和 2 天大卵巢的野生型。黑色箭头指向图1A和/或1B中用qRT-PCR数据验证的TE。"G"，"S"，"B"表示TE是否通常分别在种系、卵巢体或两者中表达[26]。（三）日志2相对于野生型，在GLM，2天和0天数据集中，TE与来自stwall null卵巢的所有基因的折叠变化（LFC）相比。横杆显示所有 TE 的平均 LFC。（D-E）相对于野生型，stwl null 卵巢中前 14 个和后 14 个受影响最大的注释基因（基于 FlyBase 注释）的折叠变化。男性和女性符号分别标记具有睾丸和卵巢富集的野生型表达的基因;"*"标记属于图2中描述的59C4-59D睾丸特异性簇的基因。（F）在错误调节基因的顶部和底部1%中富集的组织类别。绘制了相对于野生型的粗卵巢中富集的每组组织富集基因的平均LFC。仅绘制了FDR <0.05的基因集。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s007

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S8 图 来自卵巢的RNA-Seq数据的MA图。

将每个基因的折叠变化与其在所有测定的卵巢样本（野生型和空型）中的平均转录本丰度进行绘制。转录本丰度由根据 GC 内容和库大小标准化的计数表示。log2（Fold-change）值（LFC）被"缩小"，以最小化与低计数基因相关的方差。填充点（蓝色和红色）鉴定在此比较中差异表达的基因（调整后的p值<0.01）。红点代表来自Repbase的条目，蓝点代表来自基因组注释。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s008

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S9 图 卵巢卵泡细胞中的stwl表达对于女性生育能力是可有可无的。

将年龄匹配的 Gal4 / UAS - stwl - RNAi 经杂合子处女雌性连续与 1 - 5 天大 的 y w 雄配，以确定 stwl KD 在卵泡细胞和生殖细胞中的作用。每天的后代数是在指定的时间范围内出现的后代总数除以该时间跨度的天数。每个小瓶包含10名女性和10名男性。C355-Gal4，T155-Gal4和C306-Gal4从第9阶段开始驱动边界细胞和卵泡细胞中的表达（C306-Gal4还驱动茎细胞中的表达）;GR1-Gal4驱动生殖细胞卵泡干细胞中的表达进入卵生的后期阶段;bam-Gal4从膀胱母细胞开始驱动生殖细胞的表达;Mat-α-Gal4驱动后GSC种系中的表达;bam-Gal4驱动早期和晚期生殖细胞的表达;nos-Gal4驱动GSC中的表达;Act5c-gal4和Tub-Gal4驱动生殖细胞和体细胞中无处不在的表达。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s009

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S10 图 TE 在 stwl、bam 和 piwi 突变卵巢中解除抑制。

基因集富集分析（GSEA）结果的比较。为突变体/WT 卵巢中富集的每组重复元素绘制归一化富集评分（NES）。较高的NES表明突变卵巢中的基因集上调性更强。计数表示该集合中的基因数。仅绘制了具有FDR<0.05的基因集。还分析了Sxl缺陷卵巢，但没有显示，因为它们没有在任何重复类中富集。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s010

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S11 图 在 stwl、bam、Sxl 和 piwi 突变或缺陷卵巢中上调的基因重叠。

维恩图显示了在S2表的每个DESeq2结果输出中被上调的基因数量（来自基因组注释）（LFC>0，FDR<0.01）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s011

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S12 图 比较组织富集的基因集富集分析（GSEA）结果。

针对在突变或缺陷/WT 卵巢中富集的每组组织富集基因绘制归一化富集评分（NES）。较高/较低的NES表明该基因集在突变或缺陷卵巢中高度上调/下调。计数表示该集合中的基因数。仅绘制了具有FDR<0.05的基因集。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s012

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S13 图 来自S2细胞的RNA-Seq数据的MA图。

将每个基因的折叠变化与其所有测定的S2细胞样品（用stwl dsRNA和lacZ dsRNA处理的细胞作为对照处理的细胞）的平均转录本丰度进行绘制。转录本丰度由根据 GC 内容和库大小标准化的计数表示。log2（Fold-change）值（LFC）被"缩小"，以最小化与低计数基因相关的方差。填充点（蓝色和红色）识别在此比较中差异表达的基因和重复序列（调整后的p值<0.01）。红点代表来自Repbase的条目，蓝点代表来自基因组注释。Y轴刻度与S8图相同，用于比较。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s013

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S14 图 Stwl抗体可识别~130 kDA片段。

全蝇裂解物上的蛋白质印迹从~10 stwl（y w F10）和~10 stwl null（stwl）开始+j6c3/Df（3L）Exel6122）1-4天的人。将6%SDS PAGE凝胶上样标有指示的裂解物（行标记为"stwl基因型"），然后转移并用每只动物的预免疫或抗体血清探针，如图所示。底部面板显示了使用加载控制（豚鼠ɑ-色谱仪）剥离并重新探测的相同膜。每种 Stwl 抗体的最终出血血清可识别对 Stwl 裂解物特异性的 ~130 kDa 片段。+

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s014

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S15 图 ɑ-Stwl sera 标记睾丸（A，B）和卵巢（C，D）中的生殖细胞核。+

在闭合后10-15天从y w F10苍蝇中解剖组织，并用GP 76（A，C）和GP 77（B，D）的ɑ-Stwl血清进行免疫染色。Vasa标记生殖细胞，DAPI标记细胞核。所有图像都是来自 z 系列的最大强度投影，表示深度为 10 μm。比例尺为20μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s015

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S16 图 ɑ-Stwl 血清检测异位表达的 Stwl-HA 蛋白。

在闭合后0-1天从Act5c-Gal4 / UAS-stwl-HA雌性中解剖卵巢。用ɑ-Vasa（生殖细胞），ɑ-HA和GP 76或GP 77 ɑ-Stwl血清探针卵巢。HA信号识别表达Stwl-HA的细胞;在这些例子中，表达主要限于体细胞（卵泡细胞和茎细胞）。两种抗体的ɑ-Stwl信号与HA信号明显重叠，导致复合图像中出现亮黄色病灶。所有图像都是来自 z 系列的最大强度投影，表示深度为 10 μm。比例尺为20μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s016

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S17 图 ɑ-Stwl sera免疫沉淀来自S2细胞裂解物的Stwl。

将S2细胞核在RIPA缓冲液（输入）中裂解，然后与两种ɑ-Stwl血清或对照抗体（ɑ-色度仪）中的一种以1：50和1：100稀释液孵育。用蛋白-A琼脂糖珠分离抗体-蛋白质复合物。用ɑ-Stwl GP 76血清（上图）检测输入，流通（FT）和IP复合物（IP）的蛋白质印迹，然后剥离并用ɑ-Chromator抗体（下图）探针。Stwl以~130 kDa的速度运行（如图S14和图3A所示），Chromator也是如此。两种ɑ-Stwl血清在1：100的浓度下有效地沉淀Stwl（Stwl蛋白从流过中消除）。ɑ-Chromator抗体无法免疫沉淀Stwl（Stwl蛋白仍然处于流经状态），但成功免疫沉淀了Chromator。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s017

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S18 图 Stwl IP 复制可创建可重现的峰集。

IDR 图显示了重复项 1（x 轴）与重复项 2（y 轴）中峰值分数的分布。灰点是超过给定 IDR 阈值的可重现峰值，红点是不可重复的峰值。每个点代表一个 ChIP-Seq 峰，在单个抗体 （C， D） 或模拟 （A， B） 实验的两个重复中调用。峰值分数反映了 IP 或模拟样本中相对于输入的读取的折叠丰富程度。IDR 识别信号强度（即分数）在两个重复中相似的峰值。在两次重复中，信号强度较低的峰值都不会超过 IDR 阈值，但对于生成用于 IDR 分析的背景数据集非常有用。在模拟ChIP-Seq实验中，很少有峰值被识别出来，即使IDR阈值为0.25。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s018

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S19 图 bgcn;stwl双突变卵巢类似于stwl突变卵巢。

在闭合后1-3天从指示基因型的女性中解剖卵巢。ɑ-Vasa标记生殖细胞，ɑ-Hts-1B1标记分支的富体或光谱体以及卵泡细胞膜。Germaria的位置从左到右从前到后。stwl突变体形成基本的囊肿，由分支的fusomes表示，而bgcn突变卵巢则填充有GSC样细胞，如光谱体和缺乏分支fusomes所表明的那样[11-13，46-47]。箭头指向stwl突变体和bgcn中的分支fusomes;Stwl双突变体和bgcn突变体中的光谱体。bgcn;stwl结果与先前的发现一致[14]。所有图像都是来自 z 系列的最大强度投影，表示深度为 10 微米。比例尺为20微米。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s019

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S20 图 GSC基因富集于无卵巢。

来自Rust et al. 2020的单细胞数据[45]用于在分析数据集中鉴定GSC，未分化生殖细胞和较旧的生殖细胞转录本。这些是Rust等人研究中确定的仅有的三种类型的种系细胞。（A）指示突变体或缺陷卵巢中错误调节基因的顶部和底部1%中的种系转录本。（B）种系转录本在无卵巢和swl dsRNA处理的S2细胞中异位表达的基因中过度代表。还通过LFC对stwl null卵巢中的异位基因以及对stwl null ova和stwl dsRNA处理的S2细胞的异位基因的前1%进行了过度代表性测试（对于该交叉组，绘制了stwl null ova中的平均LFC值）。（A-B）为每个单细胞生殖系簇绘制指示突变或缺陷卵巢中的平均LFC。所有FDR >0.1的基因集均为灰色阴影。（C）属于以下类别的基因重叠：在睾丸中富集（S7表），在GSCs中表达，或在stwl null ova和stwl dsRNA处理的S2细胞中异位表达。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s020

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S21 图 ɑ-Stwl ChIP-Seq 读取计数的主成分分析 （PCA） 将模拟与 IP 分开。

PCA，用于从对齐到基因组箱和重复索引生成的读取计数。标记为模拟的实验是用免疫前血清进行的，IP是用Stwl抗体进行的。使用相同的表位从两种不同的动物（称为76和77）产生抗体。从两个S2细胞池中分离出DNA（生物复制）。数据中的大部分差异包含在PC1中，并且由模拟和IP条件之间的差异来解释，而不是由源动物或复制池的差异来解释。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s021

（TIF）

S1 表。 差异表达基因的摘要。

对于每个实验，通过将"分子"样本中的计数与"参考"样本的计数进行差异表达分析。如果调整后的p值为<0.01，则基因被鉴定为差异表达（D.E.）（Wald Test p值与Benjamini-Hochberg FDR校正）。上调和下调基因的对数折叠变化（LFC）值大于0（向上）或小于0（向下）。对于卵巢数据集，新关闭的和两天前的卵巢数据在GLM中合并，如方法中所述。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s022

（XLSX）

S2 表。 DE分析结果。

本研究中使用的所有RNA-Seq数据集的DESeq2输出结果。LFC = 缩小 log2FoldChange 值，FDR = 调整后的 p 值（使用 Benjamini-Hochberg FDR 校正的 Wald 检验 p 值）。"重复信息"：对于重复，列出指定重复的详细信息;基因组注释被标记为"基因组"。"stwl 突变体的异位状态"指定指示的基因是否在 stwl null ova、stwl KD S2 细胞或两者中异位表达。"Stwl_Bound"表示在任一方向上，在指示基因的TSS的1 Kb范围内是否存在Stwl峰。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s023

（XLSX）

S3 表。 基因在 stwl、bam、Sxl 和 piwi 突变或缺陷卵巢中上调。

在S2表的每个DESeq2结果输出中上调的所有基因（来自基因组注释）（LFC>0，FDR<0.01）的交集。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s024

（XLSX）

S4 表。 59C4-59D簇中基因和表达谱的摘要。

文中描述了估计组织富集，野生型表达，上调和异位表达的方法。基因之间的距离计算为指示基因体的最右边坐标和相邻基因体最左边坐标之间的差值，而不管基因取向如何。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s025

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S5 表。 具有 ChIP-Seq 的转录因子与 Stwl 重叠。

本研究中确定的Stwl ChIP-Seq峰集与ModERN小组编制的所有峰集的比较（包括他们对Stwl的独立分析）。此表表示前 40 个转录因子的子集，其结合谱与 Stwl 最相似（总共 475 个 TF）。褶皱富集是指根据峰集的大小和可映射基因组，相对于预期峰的数量，观察到的与Stwl重叠的峰数。还显示了所列峰集中的峰数、与 Stwl 峰集重叠的这些峰数、此重叠中的 Stwl 峰的百分比（来自总共 2153 个峰）、所列峰集中覆盖的 Stwl 站点 （bp） 的百分比、所列峰集中重叠峰的百分比、 以及 Stwl 覆盖的所列峰集中的 % 站点。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s026

（XLSX）

S6 表。 组织分组是组织富集数据的关键，基于modENCODE解剖学RNA-Seq[34]。

我们选择了为modENCODE组织谱测定的组织子集。第 1 列给出了 modENCODE 数据库中列出的每个数据集的名称。在相关的情况下，组织被分为更广泛的类别（例如A_MateM_4d_head和A_MateF_4d_head被分组到一个"头部"类别中）。A—成人;L3_Wand—游荡3龄幼虫;WPP—白色前蛹;P8—成虫阶段P8;MateM/MateF——适用于成年人、交配的男性或女性;4d - 成人，闭合后4天。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s027

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S7 表。 每个基因的组织特异性指数（τ）计算，基于modENCODE解剖RNA-Seq [34]。

对于每个成绩单，RPKM是从Flybase预先计算的文件"gene_rpkm_report_fb_2018_05.tsv.gz"下载的。modENCODE组织根据S6表进行分组，因此给定组的任何成员中的富集称为该组织组中的富集。所有 RPKM 值在 R 中都转换为 log2（RPKM），不包括 0 计数。log2（RPKM）显示在每个组织列中。log2（RPKM）< = 1被认为没有表达。所有未在至少一个组织中表达的成绩单都被编码为"未表达"。对于每个转录本，τ是根据log2归一化RPKM值计算的，如Yanai等人，2005年所述：其中x

我是转录本在组织 i 中的表达。其中 τ<0.70 的脚本称为"未丰富"。转录本被认为富集在给定组织中，其中τ> = 0.70，并且该组织中的表达大于临界值（平均表达量+ 1.5个标准差）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s028

（XLSX）

S8 表。 基于modENCODE解剖结构RNA-Seq的组织富集摘要[34]。

按组织类别划分的具有组织特异性表达的基因总数（S6表）。标记为"未表达"的基因在18个选定的modENCODE数据集中的任何一个中均未表达（所有样本中的RPKM<2）。"未富集"基因是表达的基因，没有通过S7表中指定的tau（τ）阈值。%的基因组基于总共18，194个注释基因。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s029

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S9 表。 本研究中使用的引物。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010110.s030

（XLSX）

确认

我们感谢Chip Aquadro，Shuqing Ji，Heather Flores，Satyaki Prasad，Kevin Wei，Michael McGurk，Jackie Bubnell和Dean Castillo在该项目各个阶段的投入。我们还感谢Abdullah Ozer，Judhajeet Ray，Roman Spektor和Tawny Cuykendall对ChIP-Seq图书馆准备的宝贵指导，Aaron Chen的技术贡献，Helen Salz的有益对话，以及Iskander Said在数据管理方面的帮助。

引用

1.宋X，Xie T. DE-钙粘蛋白介导的细胞粘附对于维持果蝇卵巢中的体细胞干细胞至关重要。美国国家科学院院刊 2002;99： 14813–14818.pmid：12393817

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

2.谢婷婷， 斯普拉德林在果蝇卵巢中维持生殖系干细胞的利基。科学。2000;290: 328–330.下午：11030649

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

3.谢婷.控制果蝇卵巢中生殖系干细胞的自我更新和分化：生态位信号和内在因素的协同作用。Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2012;2： 261–273.下午：24009036

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

4.林H， Spradling AC.一组新的脓疱性突变影响果蝇卵巢中生殖系干细胞的不对称分裂。发展。1997;124: 2463–2476.pmid：9199372

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

5.Ma X， Wang S， Do T， Song X， Inaba M， Nishimoto Y， et al. Piwi在多种细胞类型中是必需的，以控制果蝇卵巢中的生殖系干细胞谱系发育。普洛斯一号。2014;9.pmid：24658126

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

6.Klenov MS， Sokolova OA， Yakushev EY， Stolyarenko AD， Mikhaleva EA， Lavrov SA， et al.分离Piwi蛋白的干细胞维持和转座子沉默功能。2011;108： 18760–18765.下午：22065765

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

7.Li Y，Zhang Q，Carreira-Rosario A，Maines JZ，McKearin DM，Buszczak M. Mei-p26与Bam，Bgcn和Sxl合作促进果蝇卵巢的早期种系发育。普洛斯一号。2013;8： e58301.pmid：23526974

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

8.Hashiyama K，Hayashi Y，Kobayashi S. Drosophila性致命基因在种系祖细胞中启动女性发育。科学。2011;333: 885–888.pmid：21737698

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

9.Berg CA， Spradling AC. P元素转位速率和位点特异性研究.遗传学。1991;127: 515–524.pmid：1849859

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

10.Karpen GH，Spradling AC.通过单P元素插入诱变分析果蝇小染色体Dp1187中的亚端粒异染色质。遗传学。1992;132: 737–753.下午：1334894

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

11.克拉克KA，麦基林DM。果蝇石壁基因编码对生殖细胞发育至关重要的推定转录因子。发展。1996;122: 937–950.pmid：8631271

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

12.Akiyama T. 石壁突变破坏了黑腹果蝇中雌性生殖细胞干细胞的维持。开发增长不同。2002;44: 97–102.下午：11940096

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

13.Maines JZ，Park JK，Williams M，McKearin DM.通过表观遗传对照进行石墙果蝇干细胞分化。发展。2007;134: 1471–1479.下午：17344229

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

14.朴JK.表征控制黑腹果蝇生殖系干细胞维持的因素。博士论文，德克萨斯大学西南医学中心。2007.

15.Yi X， de Vries HI， Siudeja K， Rana A， Lemstra W， Brunsting JF， et al. Stwl 修饰染色质压实，需要在存在扰动 DNA 复制的情况下保持 DNA 完整性。摩尔生物细胞。2009;20: 983–994.pmid：19056684

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

16.Lespinet O， Wolf YI， Koonin EV， Aravind L.谱系特异性基因家族扩增在真核生物进化中的作用.基因组研究 2002;12： 1048–1059.下午：12097341

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

17.舒克拉五世，哈比卜F，库尔卡尼A，拉特纳帕基GS。MADF-BESS家族模式果蝇翼铰链中的基因复制，谱系特异性扩增和亚功能化。遗传学。2014;196: 481–496.pmid：24336749

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

18.Choi JY， Aquadro CF. 沃尔巴克氏体感染无花果蝇的协同进化期及其对宿主种系干细胞调控基因进化的影响.Mol Biol Evol.2014;31: 2457–2471.pmid：24974378

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

19.Flores HA， DuMont VLB， Fatoo A， Hubbard D， Hijji M， Barbash DA， et al. 参与调控黑果蝇和D种系干细胞的基因的适应性进化。模拟。G3基因基因组遗传学。2015;5: 583–592.pmid：25670770

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

20.Shukla V， Dhiman N， Nayak P， Dahanukar N， Deshpande G， Ratnaparkhi GS.石墙和砖墙：果蝇中雌性种系维持所需的两个部分冗余决定因素。G3基因基因组遗传学。2018;8: 2027–2041.下午：29669801

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

21.DuMont B， L V， Flores HA， Wright MH， Aquadro CF. Bgcn的复发性正选择是种系分化的关键决定因素，似乎不是由与其伴侣蛋白Bam的简单共进化驱动的。Mol Biol Evol.2007;24: 182–191.pmid：17056645

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

22.Rohrbaugh M， Clore A， Davis J， Johnson S， Jones B， Jones K， et al.使用果蝇GFP蛋白质捕获线鉴定和表征参与核组织的蛋白质。普洛斯一号。2013;8.pmid：23341925

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

23.Dorman ER， Bushey AM， Corces VG.绝缘子元件在大尺度间染色质结构中的作用。Semin Cell Dev Biol. 2007;18： 682–690.下午：17919949

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

24.捷克B，Preall JB，McGinn J，Hannon GJ。果蝇卵巢中的转录组范围的RNAi筛选揭示了生殖系piRNA途径的因素。摩尔细胞。2013;50: 749–761.下午：23665227

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

25.李超， 阴道 VV， 李姗， 徐军， 马姗， 席海， 等.如果没有Argonaute3，茄子结合的piRNA会崩溃，但Piwi结合的piRNA仍然存在。细胞。2009;137: 509–521.pmid：19395009

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

26.Malone CD， Brennecke J， Dus M， Stark A， McCombie WR， Sachidanandam R， et al.专门的piRNA途径在果蝇卵巢的种系和体细胞组织中起作用。细胞。2009;137: 522–535.pmid：19395010

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

27.Shapiro-Kulnane L， Smolko AE， Salz HK.果蝇种系干细胞在卵生和肿瘤发生中的性身份的维持。发展。2015;142: 1073–1082.pmid：25758221

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

28.孙 S， 克莱恩 TW.沃尔巴克氏体感染和卵巢肿瘤突变对果蝇性致死性生殖细胞功能的影响.遗传学。2009;181: 1291–1301.pmid：19171941

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

29.Love MI，Huber W，Anders S.使用DESeq2对RNA-seq数据的褶皱变化和色散进行适度估计。基因组生物学. 2014;15.下午：25516281

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

30.甘强， 切佩列夫一世， 魏国， 塔拉拉 L， 崔坤， 赵坤， 等.RNA-seq揭示的果蝇性腺中替代剪接和染色质结构的动态调控。细胞研究 2010;20： 763–783.pmid：20440302

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

31.Smolko AE， Shapiro-Kulnane L， Salz HK.H3K9甲基转移酶SETDB1在果蝇生殖细胞中保持女性身份。纳特公社。2018;9: 4155.pmid：30297796

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

32.考克斯 DN， 赵 A， 贝克 J， 张磊， 乔 D， 林 H.由piwi定义的一类新的进化保守基因对于干细胞的自我更新至关重要。Genes Dev. 1998;12： 3715–3727.pmid：9851978

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

33.Peng JC，Valouev A，Liu N，Lin H. Piwi通过Polycomb Group蛋白的负调节来维持果蝇中的生殖细胞干细胞和卵子生成。纳特·热内。2016;48: 283–291.pmid：26780607

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

34.Brown JB， Boley N， Eisman R， May GE， Stoiber MH， Duff MO， et al.果蝇转录组的多样性和动态。自然界。2014;512: 393–399.下午：24670639

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

35.洪刚， 张伟， 李海， 沈霞， 郭志. 上下调基因通路的单独富集分析.J R Soc 接口。2014;11.pmid：24352673

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

36.典狱长CD，金谷，陈姗姗，袁永春。BD-Func：一种简化的算法，用于预测通路的激活和抑制。皮尔J.2013;1： e159.下午：24058887

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

37.Shevelyov YY， Lavrov SA， Mikhaylova LM， Nurminsky ID， Kulathinal RJ， Egorova KS， et al.B型层粘连蛋白是体细胞抑制睾丸特异性基因簇所必需的。美国国家科学院院刊 2009;106： 3282–3287.pmid：19218438

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

38.Schneider I.细胞系来自果蝇黑色素胃病的晚期胚胎阶段。J Embryol Exp Morphol. 1972;27： 353–365.pmid：4625067

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

39.张勇， 马龙 JH， 鲍威尔 SK， 佩里瓦尔 V， 斯帕纳 E， 麦克阿尔平 DM， 等.在非整倍体果蝇S2细胞中的表达。PLoS Biol. 2010;8.下午：20186269

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

40.Salz HK， Dawson EP， Heaney JD.生殖细胞肿瘤：来自果蝇卵巢和小鼠睾丸的见解。Mol Reprod Dev. 2017;84： 200–211.pmid：28079292

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

41.Yang SY，Baxter EM，Van Doren M. Phf7控制果蝇种系中的男性性别决定。开发单元。2012;22: 1041–1051.pmid：22595675

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

42.杨世宇， 张永春， 万毅华， 惠特沃斯， 巴克斯特EM， Primus S， 等.通过黑腹果蝇雄性种系性别决定因子PHF7控制新型精子细胞促进因子。遗传学。2017;206: 1939–1949.pmid：28588035

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

43.周军， 库尔纳内 LS， 萨尔茨香港.性致死促进果蝇卵巢中从生殖干细胞到承诺子细胞的过渡。遗传学。2009;182: 121–132.pmid：19237687

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

44.麦基林D，奥尔斯坦B.果蝇大理石袋蛋白在生殖系干细胞中膀胱母细胞分化中的作用。发展。1995;121: 2937–2947.pmid：7555720

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

45.Rust K， Byrnes LE， Yu KS， Park JS， Sneddon JB， Tward AD， et al.成人果蝇卵巢的单细胞图谱和谱系分析。纳特公社。2020;11: 5628.pmid：33159074

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

46.Ohlstein B， Lavoie CA， Vef O， Gateff E， McKearin DM.果蝇膀胱母细胞分化因子，良性角细胞肿瘤，与DExH盒蛋白有关，并与弹珠袋遗传相互作用。遗传学。2000;155: 1809–1819.pmid：10924476

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

47.McCarthy A，Deiulio A，Martin ET，Upadhyay M，Rangan P. Tip60复合物促进分化因子的表达，以调节雌性果蝇的种系分化。蒙特尔D，编辑。摩尔生物细胞。2018;29: 2933–2945.pmid：30230973

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

48.于刚， 王立刚， 何庆娟.ChIPseeker：用于ChIP峰注释，比较和可视化的R /生物导体包。生物信息学。2015;31: 2382–2383.pmid：25765347

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

49.Kudron MM， Victorsen A， Gevirtzman L， Hillier LW， Fisher WW， Vafeados D， et al.ModERN资源：数百种果蝇和秀丽隐杆线虫转录因子的全基因组结合图谱。遗传学。2018;208: 937–949.下午：29284660

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

50.Heger A， Webber C， Goodson M， Ponting CP， Lunter G. GAT：用于测试基因组区间关联的模拟框架。生物信息学。2013;29: 2046–2048.pmid：23782611

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

51.Bailey TL， Boden M， Buske FA， Frith M， Grant CE， Clementi L， et al. MEME Suite： tools for motif discovery and search.核酸研究 2009;37： W202–W208.pmid：19458158

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

52.Tue NT，Yoshioka Y，Mizoguchi M，Yoshida H，Zurita M，Yamaguchi M. DREF在果蝇发育过程中扮演着多种角色。Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 2017;1860： 705–712.pmid：28363744

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

53.威廉姆斯TM，塞莱格JE，维尔纳T，Gompel N，Kopp A，Carroll SB。控制果蝇性二态性状的遗传开关的调控和进化.细胞。2008;134: 610–623.pmid：18724934

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

54.Riddle NC， Elgin SCR.果蝇点染色体：基因在重复中茁壮成长的地方。遗传学。2018;210: 757–772.pmid：30401762

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

55.Gerland TA， Sun B， Smialowski P， Lukacs A， Thomae AW， Imhof A.果蝇形态因子HMR定位于基因组绝缘体位点。普洛斯一号。2017;12： e0171798.pmid：28207793

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

56.Thomae AW， Schade GOM， Padeken J， Borath M， Vetter I， Kremmer E， et al.一对着丝粒蛋白介导果蝇物种的生殖分离。开发单元。2013;27: 412–424.pmid：24239514

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

57.安德烈耶娃EN， Belyaeva ES， Semeshin VF， Pokholkova GV， Zhimulev IF.黑果蝇 Tel 突变体中多烯染色体端端的三个不同染色质结构域。细胞科学学报 2005;118： 5465–5477.pmid：16278293

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

58.席尔瓦-索萨，巴雷拉，卡萨库贝塔Putzig的合作伙伴DREF，TRF2和KEN参与了果蝇端粒反转座子，HeT-A和TART的调节。生物DNA。2013;4: 18.pmid：23822164

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

59.Insco ML， Bailey AS， Kim J， Olivares GH， Wapinski OL， Tam CH， et al.基于翻译控制的自限性开关调节成体干细胞谱系中从增殖到分化的过渡。细胞干细胞。2012;11.pmid：23122292

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

60.Vogelmann J， Gall AL， Dejardin S， Allemand F， Gamot A， Labesse G， et al. 参与长程DNA相互作用的染色质绝缘体因子及其在果蝇基因组折叠中的作用。普洛斯·热内。2014;10： e1004544.pmid：25165871

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

61.Saha P， Sowpati DT， Mishra RK.黑腹果蝇异色基因的表观基因组和基因组景观。基因组学。2019;111: 177–185.pmid：29432976

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

62.Wong LC，Schedl P.解剖果蝇卵巢。JoVE J Vis Exp. 2006;e52.pmid：18704176

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

63.Zamore PD，Ma S.分离果蝇黑色素食睾丸。JoVE J Vis Exp. 2011;e2641.下午：21610676

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

64.Rio DC， Ares M， Hannon GJ， Nilsen TW.使用TRIzol（TRI试剂）纯化RNA。冷泉哈布原型。2010;2010： pdb.prot5439.pmid：20516177

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

65.Sheffield P，Garrard S，Derewenda Z.使用一系列"平行"表达载体克服RhoGDI的表达和纯化问题。蛋白质外显纯化剂。1999;15: 34–39.pmid：10024467

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

66.比绍夫 J， 比约克伦德 M， 富尔格 E， 舍特尔 C， 泰帕莱 J， 巴斯勒 K.一个多功能平台，用于在果蝇中创建全面的UAS-ORFeome库。Dev Camb Engl. 2013;140： 2434–2442.pmid：23637332

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

67.Hu Y， Comjean A， Roesel C， Vinayagam A， Flockhart I， Zirin J， et al. FlyRNAi.org——果蝇RNAi筛查中心和转基因RNAi项目的数据库：2017年更新。核酸研究. 2016.pmid：27924039

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

68.Andrews S. FastQC 一种用于高通量序列数据的质量控制工具。2010. 上市时间：https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/

查看文章谷歌学术搜索

69.Bolger AM，Lohse M，Usadel B. Trimmomatic：Illumina序列数据的灵活修剪器。生物信息学。2014;30: 2114–2120.pmid：24695404

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

70.Wingett SW，Andrews S. FastQ Screen：用于多基因组图谱和质量控制的工具。F1000研究.2018;7: 1338.下午：30254741

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

71.麦格克议员，巴巴什DA。可转座元素的双重插入为卫星DNA的进化提供了基质。基因组研究 2018;28： 714–725.下午：29588362

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

72.Langmead B， Salzberg SL. 快速间隙读取与Bowtie 2对齐。Nat 方法。2012;9: 357–359.pmid：22388286

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

73.Anders S，Pyl PT，Huber W. HTSeq - 一个用于处理高通量测序数据的Python框架。生物信息学。2015;31: 166–169.pmid：25260700

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

74.Risso D， Schwartz K， Sherlock G， Dudoit S. RNA-Seq Data的GC-Content Normalization.BMC 生物信息学。2011;12: 480.pmid：22177264

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

75.李 H， 汉德克 B， Wysoker A， Fennell T， Ruan J， Homer N， et al.序列比对/映射格式和SAM工具。生物信息学 Oxf Engl. 2009;25： 2078–2079.pmid：19505943

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

76.Ramírez F， Dündar F， Diehl S， Grüning BA， Manke T. deepTools：探索深度测序数据的灵活平台。核酸研究. 2014;42： W187–W191.pmid：24799436

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

77.黄霞， 尹华， 斯威尼S， 拉哈D， 斯奈德M， 林华.由piRNA引导的主要表观遗传编程机制。开发单元。2013;24: 502–516.pmid：23434410

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

78.Marinov GK， Wang J， Handler D， will BJ， Weng Z， Hannon GJ， et al.将高通量测序数据映射到重复序列的陷阱：Piwi的基因组靶标仍未确定。开发单元。2015;32: 765–771.pmid：25805138

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

79.林华， 陈明， 坤达杰 A， 瓦鲁耶夫 A， 尹华， 刘宁， 等.重新评估Piwi与基因组的结合以及Piwi对RNA聚合酶II分布的影响。开发单元。2015;32: 772–774.pmid：25805139

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

80.朱 A， Ibrahim JG， Love MI. 序列计数数据的重尾先验分布：消除噪声并保留较大的差异。生物资讯乐施会 Engl. 2018.pmid：30395178

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

81.于刚， 王立刚， 韩毅， 何庆元.clusterProfiler：用于比较基因簇之间生物学主题的R包。OMICS J Integr Biol. 2012;16： 284–287.pmid：22455463

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

82.冯军， 刘婷， 秦斌， 张毅， 刘旭.使用 MACS 识别 ChIP-seq 扩充。Nat Protoc.2012;7.pmid：22936215

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

83.李强， 布朗 JB， 黄海， 比克尔.测量高通量实验的再现性。Ann Appl Stat. 2011;5： 1752–1779.

查看文章谷歌学术搜索

84.昆兰AR，霍尔IM。BEDTools：一套灵活的实用程序，用于比较基因组特征。生物信息学。2010;26: 841–842.下午：20110278

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

85.柳井一世，本杰明H，什莫伊什M，查利法-卡斯皮五世，什克拉M，奥菲尔R等人。全基因组中端转录谱揭示了人体组织规范中的表达水平关系。生物资讯乐施恩 2005;21： 650–659.pmid：15388519

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

86.克留奇科娃-莫斯塔奇，罗宾逊-雷查维基因表达组织特异性指标的基准。简要生物信息。2017;18: 205–214.下午：26891983

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