小鼠毛滴虫（血吸虫科）神经侵袭期间宿主免疫反应和蠕虫诱导的病理学机制-厦门畜牧期刊杂志论文发表

托马斯·马查切克 ，罗曼·列昂托维奇，巴尔博拉·什米多瓦，马丁?马杰尔，Old?ich Vondrá?ek，Iveta Vojtěchová，托马斯·彼得拉塞克，彼得·霍拉克

出版日期： 2022年02月04日

抽象

蠕虫神经感染代表严重的疾病，但神经组织内宿主 - 寄生虫相互作用的多样性通常仍然知之甚少，部分原因是缺乏实验室模型。在这里，我们研究了Trichobilharzia regenti（血吸虫科）对小鼠脊髓的神经侵入。T.再生血吸虫通过小鼠脊髓诱导后肢运动缺陷，但不影响一般运动或工作记忆。感染脊髓的组织学检查显示嗜酸性粒细胞性脑膜肌炎伴富含嗜酸性粒细胞的浸润物包裹血吸虫。流式细胞术和脊髓转录组学分析证实了宿主免疫反应的大规模激活。值得注意的是，我们记录了主要组织相容性复合物II途径和M2相关标志物（如精氨酸酶或几丁质酶样3）的惊人上调。精氨酸酶还主导了在微切除组织中发现的蛋白质，这些蛋白质来自迁移的血吸虫附近，其不选择性地以宿主神经组织为食。接下来，我们评估了T的病理后遗症。再生神经侵入。虽然没有注意到脱髓鞘或血脑屏障改变，但我们的转录组学数据显示，蠕虫神经感染中尚未记录的神经生理功能受到显着破坏。我们还在宿主 - 血吸虫界面处检测到DNA片段化，但血吸虫抗原不影响体外神经元和神经胶质细胞的活力。总的来说，运动改变，神经生理功能的显着破坏以及强烈的M2极化是T最突出的特征。再生神经侵袭，使其成为进一步神经感染研究的有希望的候选者。事实上，了解病原体相关神经炎症过程的多样性是开发更好的保护措施，治疗策略和诊断工具的先决条件。

作者简介

猪绦虫或大鼠肺虫等寄生虫感染人类中枢神经系统是一种健康威胁，特别是在个人卫生和环境卫生条件差的社区。了解宿主 - 寄生虫相互作用的多样性，可能导致开发有效的治疗方法或疫苗，需要合适的动物模型。我们的研究深刻地描述了神经致病性扁虫Trichobilharzia regenti对小鼠脊髓的神经侵入。它在神经组织内的行为（主动迁移，急切进食）和感染的临床结果（体重减轻，运动功能障碍，强烈的神经炎症）类似于在人类疾病中观察到的行为。使用整合方法，我们阐明了小鼠如何对抗寄生虫以及哪些机制可能导致病理性后遗症。此外，我们确定了可能参与修复受损神经组织的途径。所有这些特征使T.小鼠中的再生是寄生虫学和神经免疫学进一步研究的有希望的候选者。

数字

Table 1图1图2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Fig 9Fig 10Fig 11Fig 12Table 1图1图2Fig 3

引文： Machá?ek T， Leontovy? R， ?mídová B， Majer M， Vondrá?ek O， Vojtěchová I， et al. （2022） 小鼠Trichobilharzia regenti（血吸虫科）神经侵袭期间宿主免疫反应和蠕虫诱导的病理学机制。PLoS Pathog 18（2）：e1010302。https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010302

编辑 器： Elise O'Connell，美国国立卫生研究院临床中心

收到： 八月 24， 2021;接受： 一月 24， 2022;发表： 二月 4， 2022

版权所有： ? 2022 Machá?ek et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据均在稿件及其支持信息文件中。RNA-seq读取数据可通过NCBI序列读取存档（BioProject ID：PRJNA716607）下载。

资金： TM，RL，B?，MM，OV和PH由捷克科学基金会（18-11140S;https://gacr.cz/en），欧洲区域发展基金和捷克共和国教育、青年和体育部（CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759;https://ec.europa.eu/regional_policy/en/funding/erdf），以及查理大学的机构资助（PROGRES Q43，Cooperatio Biology，UNCE/SCI/012-204072/2018，SVV 260432/2018;https://cuni.cz/UKEN-65.html）。OV得到了查理大学资助局（1374119;https://cuni.cz/UKEN-753.html）。显微镜检查由欧洲区域发展基金和捷克共和国国家预算共同资助的共聚焦和荧光显微镜实验室进行（CZ.1.05/4.1.00/16.0347，CZ.2.16/3.1.00/21515;https://ec.europa.eu/regional_policy/en/funding/erdf）并得到捷克生物成像大型RI项目LM2018129的支持。计算资源由"e-Infrastruktura CZ"（e-INFRA LM2018140）项目提供，该项目为大型研究，开发和创新基础设施项目以及ELIXIR-CZ项目LM2015047和LM2018131提供，这是捷克共和国教育，青年和体育部支持的国际ELIXIR基础设施的一部分（https://www.msmt.cz/?lang=2).资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

相互竞争的利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。-厦门畜牧期刊杂志论文发表

介绍

寄生虫经常侵入哺乳动物（包括人类）的中枢神经系统（CNS）。中枢神经系统侵袭要么是其躯体迁移的自然部分，要么代表不需要的异位定位[1]。蠕虫神经感染的临床表现从大部分无症状到非常严重，导致感觉或认知缺陷以及癫痫发作或癫痫[2-4]。许多因素，例如寄生虫负荷或中枢神经系统内的定位，都会影响神经感染的病程和结局[5]。此外，宿主免疫应答影响蠕虫的生长和存活，但也可能参与发病机制或行为改变[6，7]。因此，需要深入了解宿主与寄生虫的免疫相互作用，以开发更好的保护措施、治疗策略和诊断工具。

合适的实验室模型的可用性决定了蠕虫神经感染研究的主要方向。因此，神经囊尾蚴病、脑血管性血管病和神经轴索血症成为焦点，因为它们的模型已经建立[8-13]。相反，缺乏代表血吸虫病或棘球蚴病神经系统形式的有效模型[14-16]。因此，需要用于研究蠕虫神经感染的新型模型物种来揭示宿主 - 寄生虫相互作用和（免疫）病理后遗症的多样性。即使它们不能完全反映任何特定的人类疾病，调查它们与宿主的相互作用也可以带来有价值的见解。这也是一些丝状或肠道模型蠕虫的情况，它们仅部分反映了人类疾病，但在整合实验结果后是有用的[17，18]。关于嗜神经性蠕虫，自然侵入中枢神经系统的物种应被视为不需要人工操作，例如将寄生虫注射到CNS中[12，16]。

生殖毛滴虫是一种血吸虫，通过鸟类和哺乳动物的CNS自然迁移（鸟类是最终宿主，而哺乳动物代表意外宿主）。在穿透宿主皮肤后，新转化的血吸虫会找到进入脊髓的周围神经[19，20]。在这里，它们急切地以神经组织为食，但没有观察到明显的脱髓鞘[21-23]。然而，在鸭和免疫功能低下的小鼠中，由于血吸虫负担增加和/或其在CNS内长期持续存在，腿部麻痹经常见于鸭和免疫功能低下的小鼠[21，22]。相反，免疫功能正常的小鼠有效控制T。再生神经侵入。事实上，募集的外周白细胞在感染后7-14天（dpi）诱捕并破坏脊髓中的血吸虫[22，24]。中枢神经系统寄生的小胶质细胞也被激活[22]，但似乎不会伤害活的血吸虫，例如，通过产生一氧化氮[25，26]。尽管在21 dpi后很少发现活的血吸虫[22，24]，但宿主效应免疫机制仍不清楚。

在这里，我们采用了一种复杂的方法，从行为测试到"组学"分析（图1），以探索感染T的小鼠CNS中宿主免疫反应和蠕虫诱导的病理学的机制。雷根蒂。我们全面的洞察力使我们能够比较T。再生神经侵袭与其他医学上重要的蠕虫神经感染并揭示神经组织内宿主 - 寄生虫相互作用的多样性。在这方面，神经生理功能的显着破坏（尚未在其他蠕虫中观察到）和T中强烈的M2极化。生殖器感染的脊髓应该特别感兴趣。

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图 1. 实验程序摘要。

C57BL/6J雌性小鼠感染T。regenti cercariae并在所需的时间点进行检查（由填充的红点表示）。未感染的小鼠被用作对照;每个分析都显示特定的年龄匹配（填充蓝点）。空点表示未在相应的时间点执行分析。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010302.g001

结果

T. regenti触发外周免疫并侵入中枢神经系统，特别是脊髓

首先，我们简要描述了T的一般特征。Regenti感染以建立模型并验证其在C57BL / 6J小鼠7，14，21和28 dpi中的再现性。感染没有改变小鼠存活率，但受感染个体的体重增加减少（图2A;p（7 dpi）= 0.0022，p（14 dpi） = 0.0024; p（28 dpi） = 0.0009），尽管其饲料消耗率与未感染组相同。受感染的小鼠在7 dpi时产生寄生虫特异性IgG1和IgG2a。Th2相关IgG1的水平持续上升，并优于Th1相关的IgG2a（图2B），特别是28 dpi（p <0.0001）。这些抗体反应的观察结果与先前的研究相吻合[27-29]，这证明了宿主免疫反应的可重复性。血液嗜酸性粒细胞的数量达到7 dpi的峰值，并保持升高14和21 dpi（图2C;p（7 dpi）<0.0001; p（14 dpi） = 0.0017; p（21 dpi） = 0.0053）。在脾脏肿大的情况下观察到类似的趋势（图2D;p（7 dpi）= 0.0007;p（14 dpi） = 0.0019;p（21 dpi） = 0.0456），这与已经报道的脾CD4 +和CD8 + T细胞7和14 dpi数量增加相关[29]。

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图 2. T. 的一般特征。C57BL / 6J小鼠的再生感染。

（A）受感染的小鼠比年龄匹配的未感染对照组表现出较低的体重增加。（二）T的能级。在整个感染过程中，在小鼠血清中检测到的再生特异性IgG1和IgG2a稳步上升。Th2 相关的 IgG1 优先于 Th1 相关的 IgG2a，尤其是 28 dpi。（C）受感染小鼠的血液嗜酸性粒细胞计数增加7-21 dpi。（D）在7-21 dpi的感染小鼠中观察到脾脏肿大。（E）在中枢神经系统内，发现大多数活的血吸虫7 dpi主要局限于脊髓。释放的血吸虫的数量在以后的时间点显着减少。（F） 与来自半球的相反，T.雷根蒂在大多数7-21 dpi的脊髓组织样本中检测到DNA。在每个图表中，点显示来自单个小鼠的数据。显示了来自2-3个独立实验的汇总数据。通过重复测量的双向方差分析和希达克检验（A），普通二元方差分析和希达克检验（B，F），克鲁斯卡尔 - 沃利斯和邓恩检验（C）或普通单因素方差分析和邓内特检验（D）评估数据;*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010302.g002

由于 T.Regenti neurotropism，我们进一步检查了CNS内血吸虫的分布，这在C57BL / 6J小鼠中尚未彻底完成。提取活血吸虫数量最多的是7 dpi（每只小鼠27.3±9.8，n = 10）。它们主要侵入脊髓（图2E），但也局限于脑干或小脑。然而，10只小鼠中只有3只在半球中携带1-2只血吸虫。从整个CNS 14 dpi（3.0±每只小鼠2.1，n = 10）和21 dpi（从10只小鼠中的2只小鼠中分离出4只血吸虫）释放的血吸虫明显减少;没有记录到28 dpi的血吸虫。这种迁移模式与历史记录（从其他小鼠品系获得）一致，显示脊髓中血吸虫的积累和中枢神经系统内最高负荷约为7 dpi[20，21]。为了补充血吸虫分布的数据，我们还分析了T。雷根蒂脊髓和半球组织样本中的DNA含量。寄生虫DNA存在于所有7和14 dpi小鼠的脊髓中，大多数小鼠为21 dpi（图2F; p（7，14和21 dpi）<0.0001）。相反，半球很少含有寄生虫DNA;不到一半的样本在14和21 dpi时呈阳性。

总的来说，我们的数据表明早期激活了针对T的外周免疫反应。regenti，它成功地侵入了CNS，特别是脊髓，以7 dpi的速度。

运动功能障碍影响了T的下半身。再生感染小鼠

在脊髓7 dpi中检测到最高的血吸虫负担。此时，我们评估了神经侵入对小鼠行为各个方面的影响。最重要的是，受感染的小鼠表现出运动功能缺陷。当穿过宽（p = 0.0006）或窄（p <0.0001）光束时，它们犯了更多的错误（图3A和S1视频），当倒挂在网格上时表现出较低的耐力（图3B; p = 0.0313），并且步长较短（图3C;p（前肢）= 0.0027;p（后肢）= 0.0059）。视觉观察还显示受感染小鼠的尾巴姿势改变（尾巴拖曳，尾巴运动降低）。我们认为下半身的运动功能受到影响，因为主要取决于前肢力量的杆保持任务的性能保持不变（图3D），并且仅在后肢中台阶宽度减小（图3C; p（前肢）= 0.2545; p（后肢） = 0.001）。然而，开放区域中的一般运动活动（图3E），加上迷宫或Y迷宫是正常的，以及Y迷宫中的空间工作记忆（S1图）。在新奇诱导的吞咽不足的测试中，受感染的小鼠比对照组吃得更多（p = 0.0094）和排便更少（p = 0.0117）。这种行为更可能与更强的开胃动机有关，而不是情绪的改变，因为我们在其他几个测试中没有检测到焦虑加剧的迹象（图3E）或抑郁样行为（S1图）。总的来说，我们的实验表明，运动功能缺陷是T最明显的行为后遗症。再生神经侵入。

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图 3. T. 的影响小鼠行为7 dpi上的雷根蒂感染。-厦门畜牧期刊杂志论文发表

（A）光束在宽窄光束上行走，受感染小鼠的运动协调受损。（B）网格测试，受感染小鼠的前肢和后肢的耐力较差。（C）感染小鼠前肢和后肢的足迹分析，改变的姿势和步态。（D）两组的杆持，正常耐力和前肢力量。（E）两组开放场地，运动活动不受影响，焦虑。（F）新奇诱导的吞咽不足，食用量较高的燕麦片引起的食欲动机较强，而不是感染小鼠的焦虑增加。在每个图表中，点显示来自单个小鼠的数据。提出了来自3个独立实验的汇总数据。数据通过Mann-Whitney测试（A，B，F-进食）或未配对的t检验（C，D，E，F-粪便）进行评估;*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010302.g003

富含嗜酸性粒细胞的浸润被困住并消除了脊髓中的血吸虫

评估 T 的一般影响后。对小鼠进行再生感染，我们对脊髓进行组织学检查，以阐明中枢神经系统受影响最严重部分的感染过程。仅观察到完整的血吸虫7 dpi主要局限于白质（图4B）。具有挤压细胞核的扁平细胞包围了一些血吸虫，而一些则随后是"火箭尾"白细胞簇（见下文）。在靠近迁移血吸虫的地区记录了白细胞的外渗，主要是嗜酸性粒细胞（图4B，插图）。神经炎症达到14 dpi的高潮，当时没有血吸虫被宿主免疫细胞注意到。值得注意的是，引人注目的"火箭尾"白细胞簇，主要由嗜酸性粒细胞和单核细胞组成（图4C，插图），形成在血吸虫后面（图4C）。一些寄生虫仍然很紧凑，但体壁较薄，内部组织具有凝聚的细胞核。然而，一些血吸虫已经受损，嗜酸性粒细胞，嗜中性粒细胞，单核细胞和淋巴细胞广泛浸润病变（图4D）。相邻的软脑膜间隙也增厚并严重发炎。难以区分的血吸虫或其残留物周围的炎性病灶仍然明显为21 dpi（图4E），但白细胞浸润正在消失。28 dpi时未检测到血吸虫残留物和炎性病灶（图4F）。综上所述，T.再生神经侵袭引起嗜酸性粒细胞性脑膜肌炎，峰值为 14 dpi。细胞浸润对于消除寄生虫至关重要。

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图 4. T 的组织学检查。再生感染的脊髓。

（A）在未感染的脊髓中，没有明显的白细胞浸润。（B）完整的血吸虫在白质7 dpi。没有炎症细胞包围血吸虫，但在相邻区域记录了嗜酸性粒细胞外渗（插图，嗜酸性粒细胞以白色箭头标记）。（C）血吸虫14 dpi后面的"火箭尾"白细胞簇。嗜酸性粒细胞和单核细胞在簇中占优势（灰色箭头和插图）。（D）被破坏的血吸虫14 dpi周围的炎症性病变。相邻的软脑膜间隙（灰色星号）变厚并严重发炎。（E）褪色炎性病变内的血吸虫残留物21 dpi。（F）脊髓组织28 dpi，无血吸虫残留或炎性病灶明显。显示每个时间点来自2个独立实验（每个实验有2-3只小鼠）的代表性图像。比例尺（大图像）= 50μm，比例尺（插图）= 10μm。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010302.g004

嗜酸性粒细胞是T期间浸润整个CNS的细胞数量最多的细胞。雷根蒂感染

根据组织学发现，我们采用流式细胞术来量化浸润受感染神经组织的免疫细胞，以查看细胞免疫反应的动态。除了脊髓之外，我们还检查了脑干，小脑和半球，然而，血吸虫也可能在较小程度上侵入（图2E）。脊髓和半球主要由嗜酸性粒细胞，淋巴细胞和巨噬细胞/单核细胞浸润，峰值为14 dpi（图5A和5D）。在脑干中观察到类似的情况（图5B），其中小胶质细胞和嗜中性粒细胞计数7 dpi也显着增加。在小脑中，嗜酸性粒细胞计数飙升14 dpi（图5C），但嗜中性粒细胞，巨噬细胞/单核细胞和淋巴细胞计数已经达到7 dpi的高潮。除脑干7 dpi外，所有节段的小胶质细胞计数保持不变（见上文）。然而，它们的相对代表有利于浸润白细胞，特别是嗜酸性粒细胞（图5E-5H）。综上所述，T.再生神经侵袭导致外周白细胞对中枢神经系统有显著浸润。毫无疑问，嗜酸性粒细胞在所有检查的片段中都占上风，峰值为14 dpi。

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图 5. T期间小鼠CNS中主要免疫细胞群的动力学。雷根蒂感染。

（A–D）通过流式细胞术分析脊髓（A），脑干（B），小脑（C）和半球（D）中的小胶质细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，巨噬细胞/单核细胞和淋巴细胞。在所有检查的片段中，嗜酸性粒细胞计数14 dpi中观察到最显着的增加。浇注策略显示在 S4 文件中。数据（每个时间点n = 5）由普通单向或韦尔奇方差分析评估，然后进行邓内特检验;*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001.（E–H）脊髓（E），脑干（F），小脑（G）和半球（H）中检查的免疫细胞群的相对比例。外周白细胞的大量浸润导致小胶质细胞比例明显下降。显示了来自2个独立实验中1个的代表性数据。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010302.g005

受感染的脊髓显示免疫系统通路的转录上调和神经生理功能的破坏

为了深入了解受感染脊髓中正在进行的过程，使用各自的年龄匹配的未感染对照组进行了7，14和21 dpi的整个组织的转录组学分析。总共对24个转录组进行了测序，平均数量为43，115±2，276个转录本（图6A）。RNA-seq读取数据可通过NCBI序列读取存档（BioProject ID：PRJNA716607）下载。差异表达分析显示，当下调转录本（6，943）多于上调转录本（4，128）时，差异表达转录本（DETs）的数量最高，为7 dpi。DETs的数量分别减少了14和21 dpi，上调的成绩单优先于下调的成绩单（图6B和S1表）。

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图 6. T脊髓转录组学分析。再生感染小鼠。

（A）在受感染或年龄匹配的未感染（对照）小鼠的脊髓中鉴定的转录本数量7，14和21 dpi。转录组学分析是用一组独立于本文提出的其他实验感染的小鼠（每个时间点n = 4）进行的。通过普通的双向方差分析和希达克检验评估数据;*第<0.05页。（B） 基于对数的差异表示的成绩单数 7、14 和 21 dpi 的数量2折叠变化（FC;上调>2，下调<-2）。（C）具有京都基因和基因组百科全书（KEGG）注释的差异表达转录本及其在受感染脊髓7，14和21 dpi中的排他性/共享发生。（D）根据KEGG注释的上调转录本的富集免疫系统通路。（E）根据KEGG注释，与神经系统相关的下调转录本的丰富通路以及发育和再生。（F） 前 20 个上/下调记录的成绩单（基于日志）2FC） 7、14 和 21 dpi。显示缩写的基因名称，灰色背景标记在所有时间点发现的"前20名"中发现的基因。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010302.g006

京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库用于注释DET，以获得上/下调过程的一般概述。总共共鉴定出2，225，1，536和1，248个上调的KEGG-ID，分别为7，14和21 dpi（图6C），并代表27（7 dpi），47（14 dpi）和27（21 dpi）显着富集的生物途径（S1表）。最丰富的途径在所有时间点都与免疫系统有关（图6D）。例如，当外周白细胞的脊髓浸润呈上升趋势时，趋化因子信号传导和白细胞经内皮迁移途径在7和14 dpi处显着富集（图5A）。详细的分析揭示了几种趋化因子（Ccl2，Ccl5，Ccl7，Ccl8，Ccl24，Cxcl9，Cxcl16）及其受体（图7A和7B）的上调，其促进白细胞募集到CNS中。在整个感染过程中，在Toll样受体信号通路中也注意到显着的富集，该通路参与识别病原体相关的分子模式。即，Tlr8，Tlr11和Tlr12表现出最高的上调（图7C）。与抗原处理相关的途径也被富集，特别是7 dpi。事实上，组织蛋白酶S（Ctss）是一种对抗原呈递至关重要的溶酶体酶，被发现在前20个上调的DET 7 dpi中（图6F），并保留了显着升高的表达14和21 dpi（对数2折倍变化分别为 15 和 11）。因此，Th1/Th2/Th17细胞分化和B细胞受体信号通路在7 dpi时被上调，提示早期适应性反应激活。这些转录组学数据对应于我们的实验结果，表明产生寄生虫特异性抗体（图2B）或混合Th1 / Th2 / Th17脾表型[29] 7 dpi。有趣的是，当在脊髓中发现最高的嗜酸性粒细胞浸润和第一次受伤的血吸虫时，补体和凝血酶级联反应以及C型凝集素受体通路大多富集14 dpi（图4C和4D）。

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图 7. T脊髓中免疫和神经标志物的表达。再生感染小鼠。

（A–F）热图显示日志2趋化因子 （A）、趋化因子受体 （B）、Toll 样受体 （C）、髓鞘相关标志物 （D）、神经丝 （E） 和病理相关标志物 （F） 表达的折叠变化 （FC）。带日志的基因/转录本2FC >2或<-2分别被认为是上调或下调。只有具有重要日志的基因2除非另有说明，否则将显示 FC（交叉单元格）。在每个时间点分析4只感染小鼠和4只未感染年龄匹配小鼠的脊髓。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010302.g007

小鼠脊髓的感染也与转录的显着下调有关。总体而言，分别鉴定出7、14和21 dpi的2，492、827和857个下调KEGG-ID（图6C），并代表33（7 dpi）、18（14 dpi）和9（21 dpi）富集途径（S1表）。它们主要与信号转导，突触传递和轴突发育有关（图6E）。因此，我们观察到驱动蛋白家族成员Kif1a和Kif1b的巨大下调，这是突触囊泡和线粒体轴突转运的重要参与者[30，31]，以及细胞质羧肽酶1（Agtpbp1，也称为CCP）缺乏，其导致协调缺陷[32]。在所有时间点，它们甚至都跻身前20名下调的DET之列（图6F）。相反，除了神经胶质瘢痕形成所需的巢素（Nes，图7D）外，结构性神经丝的表达几乎保持不变[33，34]。在髓鞘相关转录本中，只有蛋白1（Plp1）在7 dpi时显著上调（图7E），这可能会促进小胶质细胞的活化[35]。重要的是，没有发现脱髓鞘过程的转录证据（图7E），这与先前的组织病理学研究一致[22，26]。然而，在所有时间点的淀粉样蛋白前体蛋白（App，图7F）的情况下都观察到大规模的上调，这可能与迁移性血吸虫引起的轴突损伤有关[22]。

总而言之，T.生殖器感染的脊髓基本上阐明了宿主-寄生虫关系的一般特征。最重要的是，我们证明了免疫过程的上调和神经生理通路的下调。基于转录组学数据，我们进一步检查了T的几个方面。再生神经侵入。

精氨酸酶-1在仅在迁移的血吸虫周围发现的蛋白质中占主导地位，血吸虫不选择性地以神经组织为食

为了更好地了解迁移的血吸虫附近的生物过程，我们在距离血吸虫100μm的范围内对周围组织进行了显微解剖（图8A），并对其进行了质谱（MS）分析。仅以7 dpi的速度对受感染的脊髓进行了分析，因为此时可以找到最高数量的血吸虫，并且可以正确区分血吸虫 - 宿主组织界面（图6B和8B）。此外，大多数DET都是在这个时间点发现的。最初，分别分析了三个脊髓节段（骶骨，腰椎，胸椎）的显微解剖。由于来自不同片段的显微碎片的蛋白质组成没有发现显着差异（S2表，片F-H），因此对所有三个片段的合并数据集进行了后续数据分析。

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图 8. T周围脊髓组织的蛋白质组学分析。regenti schistosomula.

（A） 感兴趣区域的示意图。对距离血吸虫100μm以内的区域以及血吸虫消化道进行显微解剖（用星号标记;有关肠道结果，请参阅正文）。（B）来自显微镜的真实图像，标记与（A）一致 - 即已经显微解剖的区域以红色勾勒轮廓。比例尺 = 100 μm。（C）显微解剖神经组织的蛋白质组学分析摘要。仅在未感染（蓝色）或T中发现的蛋白质（粗线）或更丰富的蛋白质（虚线）。显示再生感染（红色）脊髓。向上/向下箭头指示日志2转录组学分析揭示的蛋白mRNA表达中的折叠变化（FC）（见图6）。每个蛋白质更多的箭头意味着在转录组中检测到更多的亚型。如果未显示箭头，则日志2FC可以忽略不计（–1;+1）或不显著。蛋白质组学分析是使用从一组小鼠（n = 3-4，详见材料和方法）获得的样品进行的，这些小鼠独立于本文提出的其他实验。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010302.g008

总共在受感染和未感染（对照）脊髓中鉴定出1，690种蛋白质。总共有752个蛋白质被记录在4个重复中的至少3个中，因此被认为是可靠的鉴定。绝大多数（705种）蛋白质在感染和对照脊髓的显微解剖中是常见的，但其中15种在感染（8）或对照（7）中差异丰富（图8C，虚线轮廓和S2表，表C）。在感染脊髓的微切片中仅发现了15种蛋白质（图8C，厚红色轮廓和S2表，A片），包括可能参与宿主免疫反应的蛋白质：精氨酸酶（替代激活的M2小胶质细胞/巨噬细胞的标志物），整合素β1（白细胞粘附分子）或干扰素诱导的鸟苷酸结合蛋白2（具有抗寄生虫活性的神秘蛋白;相反，在未感染的小鼠中只发现了35种蛋白质（图8C，粗蓝线和S2表，B页）。它们主要与细胞骨架和细胞信号传导有关，但没有识别出特定的途径/模式。与蛋白质组学数据相证，大多数排他性和差异丰度的蛋白质在"7 dpi"转录组中被鉴定为差异表达（上调或下调）。其中一些由表达水平不同的多个转录变体表示（图8C，向上/向下箭头和S2表，工作表E）。

此外，通过MS分析血吸虫消化道的蛋白质组成以揭示寄生虫饮食。更好地了解 T.摄取的饮食习惯可能有助于揭示宿主与寄生虫的相互作用。在237种可靠鉴定的蛋白质中，179种被注释为小鼠蛋白质，39种被注释为T。regenti和19与两种生物体共享同源性（S2表，表I）。小鼠蛋白质中最丰富的是与髓鞘相关的蛋白质，例如髓鞘碱性蛋白，髓鞘蛋白脂蛋白，2，3-环核苷酸3-磷酸二酯酶和髓鞘 - 少突胶质细胞糖蛋白。此外，存在神经元和星形细胞中间丝（神经丝轻质和中度多肽，神经胶质纤维酸性蛋白，vimentin）以及CNS细胞外基质糖蛋白骨脂素。有趣的是，血吸虫消化道还含有与宿主免疫系统相关的蛋白质，如溶菌酶C-1，精氨酸酶或嗜酸性粒细胞阳离子蛋白1。内源性 T.再生蛋白主要由消化肽酶（组织蛋白酶B1.6，B1.3，B1.4，C和亮氨酸氨基肽酶），解毒酶（硫氧还蛋白，过氧化物毒素和谷胱甘肽S-转移酶）和代谢酶（乳酸脱氢酶A和甘油醛3-磷酸脱氢酶）代表。与小鼠和T同源的蛋白质。regenti包括高度保守的蛋白质，如肌动蛋白，微管蛋白，钙调蛋白和组蛋白。

总的来说，组织显微碎片的蛋白质组学分析表明，表明主免疫反应激活的标志物已经存在于血吸虫周围，已经存在7 dpi。精氨酸酶是最丰富的独家蛋白质，表明存在具有M2表型的小胶质细胞/巨噬细胞。我们还发现，迁移的血吸虫在饮食中没有选择性，因为在消化道中检测到与神经组织和宿主免疫系统相关的蛋白质混合物。

T. regenti 感染诱导小胶质细胞/巨噬细胞的 M2 极化，这些小胶质细胞/巨噬细胞积聚在迁移的血吸虫周围

活化的小胶质细胞/巨噬细胞的极化，无论是促炎性M1还是抗炎性M2，在很大程度上决定了它们在宿主免疫反应中的作用。小胶质细胞/巨噬细胞的标志物Aif1（也称为Iba1）的显着上调表明细胞响应于T的脊髓侵袭而激活。regenti（图9A）。最初，Iba-1主要在血吸虫迁徙轨道（7 dpi）中被发现，但后来，它积聚在血吸虫（14 dpi）周围，甚至在它们受损的身体内（图9D）。由于这一观察结果表明小胶质细胞/巨噬细胞积极参与血吸虫消除，我们进一步检查了与M1 / M2极化相关的标志物的表达。尽管在整个感染过程中M1促进细胞因子（Ifng，Il1b）的上调，但诱导的NO合成酶（Nos2），M1极化的效应分子，没有表现出表达或可以忽略不计的变化（图9B）。它证实了我们之前的免疫组织化学数据，证明受感染的脊髓中缺乏诱导的NO合成酶[26]。

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图 9. T型脊髓中的M1 / M2极化。再生感染小鼠。-厦门畜牧期刊杂志论文发表

（A–C）热图显示日志2与小胶质细胞 （A）、M1 （B） 和 M2 （C） 极化相关的标记物表达的折叠变化 （FC）。带日志的基因/转录本2FC >2被认为是上调的，只有具有显着日志的基因2除非另有说明，否则将显示 FC（交叉单元格）。在每个时间点分析4只感染小鼠和4只未感染年龄匹配小鼠的脊髓。（D–E）IL-4 + Iba-1（D）和Arg-1（E）的免疫定位。显示代表性图像，白线表示血吸虫所占用的空间。比例尺 = 50 um。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010302.g009

另一方面，我们记录了M2相关标志物的惊人上调，例如精氨酸酶（Arg1）和几丁质酶样3（Chil3，也称为Ym1）。因此，M2触发细胞因子（Il4，Il10，Il13，Tgfb）与M2促进半乳糖凝集素-3（Lgals3）[39]（图9C）一起上调7和/或14 dpi。为了验证转录组学数据，我们继续进行IL-4的免疫组织化学检测，IL-4驱动M2极化和精氨酸酶的产生[40]。IL-4与Iba-1共定位在血吸虫迁移轨迹中为7 dpi，但减少了14 dpi（图9D）。然而，在被摧毁的21 dpi血吸虫区域检测到强烈的IL-4信号。相反，精氨酸酶（Arg-1）紧密包围着7 dpi的血吸虫（图9E），这与前面显示的显微切割数据一致（图8C）。在14 dpi时，Arg-1信号进一步扩散到组织中，但主要积聚在受损的血吸虫21 dpi内。

总的来说，转录组学和免疫组织化学数据证实了受感染脊髓中小胶质细胞/巨噬细胞的强烈M2极化，特别是在血吸虫附近。

3D成像揭示了T期间MHC II +细胞的扩增。再生神经侵袭

主要组织相容性复合物（MHC）II的表达，无论是通过专业抗原呈递还是其他细胞，都反映了宿主免疫应答的激活状态。在 T.再生感染的脊髓，我们记录了Cd74，H2-Aa，H2-Ab1和MHC II通路的其他成员在整个感染过程中的显着上调（图10A）。免疫组化显示MHC II +细胞在血吸虫周围积聚，MHC II与Iba-1（小胶质细胞/巨噬细胞的标志物）部分共定位（图10B）。由于具有合适的模型（MHC II-EGFP小鼠），我们采用了光片荧光显微镜（LSFM），这使我们能够显示3D组织环境并可视化MHC II在7和14 dpi中的分布。高水平的背景自发荧光阻碍了对灰质的分析，因此我们检查了胸脊髓的白质区域，无论如何，这是血吸虫的首选[41]。

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图 10. T脊髓中的主要组织相容性复合物（MHC）II。再生感染小鼠。

（A） 热图显示日志2与MHC II途径相关的标记物表达的折叠变化（FC）。带日志的基因/转录本2FC >2被认为是上调的，只有具有显着日志的基因2除非另有说明，否则将显示 FC（交叉单元格）。在每个时间点分析4只感染小鼠和4只未感染年龄匹配小鼠的脊髓。（B）MHC II和Iba-1的免疫定位。显示代表性图像，白线表示血吸虫所占用的空间。比例尺 = 50 μm。（C）通过光片荧光显微镜（LSFM）获得的3D图像，显示脊髓中的MHC II +细胞。血吸虫用灰色箭头标记。（D）血吸虫周围MHC II+体积的定量。它是在血吸虫周围的虚拟盒子（400×800×110μm，S5 Video）或健康小鼠中随机选择的六个区域中计算的。（E）MHC II积累模式及其与血吸虫损伤的关系。识别出三类：（+）完整血吸虫周围/后面的MHC II +细胞很少，（++）包裹完整血吸虫的MHC II +细胞明显浸润（但血吸虫内没有MHC II信号），（+++）包围受损血吸虫的大量簇（MHC II信号也存在于血吸虫内部）。通过LSFM获得2D图像，并从z轴上的五个拼接平面（每个1.4μm）创建。比例尺 = 50 μm。（F） 使用（E）中的类别对MHC II积累和血吸虫损伤进行量化。在每个时间点检查两只小鼠中的十三只血吸虫。数据由Kruskal-Wallis和Dunn的测试（D）和Fisher的精确测试（F）评估;p<0.001。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010302.g010

七个dpi，MHC II +细胞散布在实质中，但其中一些已经接触了血吸虫（图10C，S2和S3视频）。当MHC II信号经常复制实质血管和前或后正中沟的形状时，在14 dpi的血吸虫周围形成大块MHC II +簇（图10C和S4视频）。这些观测结果与MHC II信号的体积分析数据相关，MHC II信号飙升了14 dpi（p <0.0001）。事实上，与未感染的小鼠相比，记录了1000倍的增加（图10D）。我们还试图计算MHC II +细胞的确切数量，但簇非常密集，以至于几乎无法识别单个细胞核，这阻碍了分析。然而，大规模的光学切片为我们提供了对个体血吸虫周围免疫反应强度（称为MHC II积累）的有力见解。我们建立了三类免疫反应（图10E）："轻度"（+），在完整的血吸虫周围/后面（"火箭尾巴"）的MHC II +细胞很少;"中度"（++），伴有包围完整血吸虫的MHC II +细胞明显浸润（但血吸虫内没有MHC II信号）;"严重"（+++），伴有包围受损血吸虫的大量簇（裂殖瘤内部也存在MHC II信号）。虽然轻度和中度反应占7 dpi，但严重反应占主导地位14 dpi（图10F; p = 0.0009）。

总之，转录组学分析和2D / 3D成像表明T中MHC II途径的强上调。再生感染的脊髓。有趣的是，MHC II不仅发生在迁移的血吸虫周围，而且沿着血管和脑膜区域发生，表明广泛的神经炎症。

T. regenti 感染影响血管通透性、血脑屏障完整性并引发反应性星形胶质细胞增多症

中枢神经系统内的血吸虫迁移可能导致严重的病理。首先，我们专注于血管通透性和血脑屏障完整性的变化，这对于维持CNS稳态至关重要。在血管通透性的标志物中，水通道蛋白-4（Aqp4），定位于星形胶质细胞末端的水道，在7 dpi处显着上调（图11A）。负责血脑屏障紧绷的蛋白质E-钙粘蛋白（Cdh1）和闭塞素（Ocln）的表达也增加，特别是7 dpi（图11B）。相反，在紧密连接蛋白1（Tjp1，也称为Zo1）中注意到显着的下调，这是一种支架蛋白，将紧密连接锚定在肌动蛋白纤维上[42]。虽然我们的转录组学数据表明血管通透性和血脑屏障完整性在7 dpi下略有改变，但我们没有观察到Evans blue渗入神经组织的任何显着增加（S2图）。

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图 11. 与 T 相关的病理学。小鼠脊髓内的再生迁移。

（A–C）热图显示日志2与血管通透性 （A）、血脑屏障紧绷 （B） 和星形胶质细胞 （C） 相关的标志物表达的折叠变化 （FC）。带日志的基因/转录本2FC >2或<-2分别被认为是上调或下调的。只有具有重要日志的基因2除非另有说明，否则将显示 FC（交叉单元格）。在每个时间点分析4只感染小鼠和4只未感染年龄匹配小鼠的脊髓。（D）星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和促进星形胶质细胞的IL-6的免疫定位显示星形胶质细胞肥大21 dpi最突出。显示代表性图像，白线表示血吸虫所占用的空间。比例尺 = 50 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010302.g011

其次，我们检查了与血吸虫迁移相关的组织损伤。星形胶质酸性原纤维蛋白（Gfap）在14和21 dpi上调（图11C），这表明反应性星形胶质细胞增多症的开始和神经胶质瘢痕的形成[43]。虽然GFAP在神经组织内呈7 dpi的正态分布，但它在血吸虫病变周围积聚，并在以后的时间点在其迁移轨迹中积累（图11D）。星形胶质细胞肥大最突出的是21 dpi，当星形胶质细胞过程包围血吸虫，甚至通过它们占据的空间生长时。为了支持星形胶质细胞活化的观察，我们还对IL-6进行了免疫定位，IL-6可促进星形胶质细胞增多和神经胶质瘢痕形成[44]。在7 dpi的血吸虫迁移轨道和受损的血吸虫及其周围环境14和21 dpi的区域检测到IL-6（图11E）。这些数据表明，反应性星形胶质细胞增多症和神经胶质瘢痕，可能由IL-6驱动，发展为修复由血吸虫迁移损伤的组织。

DNA片段化发生在宿主-血吸虫界面处，但血吸虫抗原不会引发神经元或神经胶质细胞的凋亡。

细胞凋亡在宿主 - 寄生虫相互作用中起重要作用，因为它可以负责组织病理学或帮助寄生虫逃避宿主免疫系统。在 T.再生感染脊髓，我们观察到促凋亡基因Gzmb和Prf分别编码颗粒酶B和穿孔素-1的上调（图12A）。它们由细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞表达，自然杀伤细胞利用它们诱导靶细胞凋亡[45]。因此，我们通过TUNEL测定对片段DNA（细胞凋亡的标志）进行染色，以定位受感染脊髓内的凋亡细胞。虽然在未感染的脊髓中没有发现TUNEL +细胞，但它们的频率增加了7和14 dpi，无论是在宿主还是血吸虫组织中（图12B和12C）。TUNEL+细胞特别局限于宿主 - 寄生虫界面，但有些也被记录在血吸虫迁移轨迹中。为了评估血吸虫衍生分子直接诱导宿主神经细胞凋亡的可能性，我们用可溶性部分的血吸虫匀浆刺激小鼠Neuro2a和原代混合神经胶质培养物。然而，治疗没有改变凋亡群体的频率（图12D）。这些数据表明，细胞凋亡不是T的主要特征。再生神经侵袭，不负责组织发病机制。

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图 12. T.脊髓细胞凋亡。再生感染小鼠。

（A） 热图显示日志2促凋亡标记物和抗凋亡标记物表达中的折叠变化（FC）。带日志的基因/转录本2FC >2或<-2分别被认为是上调或下调。只有具有重要日志的基因2如果没有另有说明，则显示FC（交叉单元格）。在每个时间点分析4只感染小鼠和4只未感染年龄匹配小鼠的脊髓。（B）检测脊髓冷冻切片中的DNA片段化（TUNEL+细胞）。显示代表性图像，白线表示血吸虫所占用的空间。比例尺 = 50 μm。（C）在脊髓冷冻切片中定量的TUNEL +细胞，如（B）所示。TUNEL+细胞的频率在所有细胞中显示，或单独显示宿主神经组织和T。再生组织。（D）检测由T处理的Neuro2a和混合胶质培养物中的凋亡群体。Regenti 血吸虫匀浆 （TrSH） 48 小时;司他孢菌素被用作阳性对照。图中显示了来自4个实验的汇总数据。数据（C，D）由Kruskal-Wallis和Dunn的测试评估;*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010302.g012

讨论

除了是人类脑蚴性皮炎的致病因子[46，47]，T。regenti侵入实验感染小鼠的中枢神经系统[19，20]。然而，该物种的神经侵入尚未从人类中报道。在这里，我们彻底研究了T对小鼠中枢神经系统的侵入。regenti，以更好地了解神经感染期间宿主 - 寄生虫相互作用的多样性。虽然T.regenti并没有完全概括任何人类神经感染，它代表了一个特征良好且易于跟踪的系统，为病原体相关神经炎症的多样性提供了新的见解。

小鼠中枢神经系统，T。再生主要影响脊髓，通过周围神经从皮肤迁移到脊髓[19–22，41]。这种途径在嗜神经性蠕虫中是非同寻常的，它们主要依赖于血液发生性扩散到CNS中[48]。事实上，T.神经内再生通路与神经致病性变形虫Naegleria fowleri的通路非常相似[49]。与之前的研究相证[19-22]，我们观察到脊髓7 dpi中血吸虫负担最高。此外，我们还检测到T。雷根蒂一些半球样本中的DNA样本为14-21 dpi，但我们假设它起源于少数并且很可能已经受损的血吸虫，因为活的寄生虫很少被分离到甚至7 dpi。血吸虫进入大脑在很大程度上受到限制，这可以解释缺乏工作记忆缺陷、焦虑或抑郁样行为的原因，这些行为源于半球中枢的功能障碍[50-52]。

通过主要影响脊髓，T。regenti与其他嗜神经性蠕虫不同，例如血管绞盘、弓形虫属或猪带绦虫，它们主要侵入大脑并损害认知功能或引起癫痫发作[9，53-56]。然而，T.Regenti类似于A的嗜神经幼虫。Cantonensis和Toxocara属关于神经组织内的大小和活跃迁移[9，54]。相反，血吸虫卵被动地扩散到脊髓中会诱发人类神经血吸虫病，通常表现为脊髓炎[57]。尽管具有一些共同的组织病理学或临床特征，例如脊髓炎和下肢/后肢运动功能障碍[58]，T。再生神经侵袭不能直接与神经血吸虫病进行比较，这主要是由于致病因子的性质不同（迁移性血吸虫与播散卵）。总体而言，T.再生神经侵袭代表了一种独特的生物学现象，但特别方面，它可以与其他嗜神经性蠕虫进行比较。关于一般特征，例如大小和行为，T。regenti代表了一个相关的比较模型，特别是用于研究与神经嗜性蠕虫（如A）迁移相关的病理学。Cantonensis 或 Toxocara spp.

我们复杂的方法揭示了T的严重影响。对小鼠健康的再生神经侵入。它们表现为体重增加减少，尽管饲料消耗或运动保持不变。我们推测，这可能是由于与抗击感染相关的能量需求增加[59-61]。值得注意的是，在所有时间点都观察到体重减轻。它表明外周免疫反应，峰值为7 dpi[29]，以及后来的神经炎症可能影响了体重增加。体重减轻伴随A的小鼠感染。Cantonensis和Toxocara属也是如此，并且通常与神经系统评分受损相关[55，62，63]。这些观察结果强调了蠕虫神经感染的系统性影响，然而，缺乏将体重减轻与可能与宿主免疫反应相关的能量消耗增加联系起来的直接证据。

广泛的行为测试显示 T 的下半身运动功能缺陷。再生感染小鼠。到目前为止，据报道，主要是鸭子（确定宿主）和免疫功能低下的小鼠患有与T相关的神经运动障碍。雷根蒂神经侵袭[19]。这一事实的解释是这些宿主血吸虫的负担较高，因此轴突损伤更频繁[21，22]。类似的神经运动异常也经常出现在感染A的小鼠中。坎通斯和弓形虫属[53，62，64，65]。髓鞘相关基因表达失调、广泛的组织脱髓鞘和神经元凋亡被认为是这种行为改变的病理基础[63，65-68]。然而，我们在T中没有检测到髓鞘相关基因的显着凋亡或下调。再生感染的脊髓。此外，在既往的组织学研究中未发现髓鞘缺失[22，26]。相反，我们的转录组学数据揭示了神经元信号转导，突触传递和轴突发育的大规模下调。例如，我们注意到动力学超家族运动蛋白Kif1a和Kif1b的下调，这对顺行轴突转运至关重要[30，31]。它们的作用在Kif1a-和Kif1b-敲除小鼠中很明显，它们表现出运动活动减少、肢体运动异常和平衡受损[69，70]。因此，我们认为脊髓中神经生理功能的破坏是观察到的运动缺陷的原因。迄今为止，在其他以蠕虫神经感染为重点的转录组学研究中，尚未注意到如此宽范围的神经元功能下调[65，66]，但最近从感染弓形虫的小鼠大脑中报道[7]。具体而言，Boillat等人。提出由T引起的行为改变。gondii反映了神经炎症的副作用，即神经免疫反应在调节宿主行为中起主要作用[7]。因此，我们认为，可能由神经炎症引发的神经生理功能受损可能是蠕虫神经感染中的一种新型病理机制。

与鸭子相反，小鼠作为意外（死胡同）宿主有效地控制T。再生神经侵入。这使得它们成为研究保护性免疫反应的合适物种。此外，缺乏明确定义的鸭株和合适的工具箱（主要是抗体）明显限制了对T的免疫学研究。反正都是鸭子。我们的复杂数据强烈支持这样一种观点，即小鼠免疫反应的快速激活导致感染后2-3周内血吸虫的消除。它与免疫功能正常的小鼠血吸虫生长暂停和存活率降低的历史记录一致[21，22，71]。在A的情况下也观察到这种免疫介导的宿主不相容。cantonensis - 它在大鼠中繁殖，但在小鼠中发育迟缓。后者的神经炎症比大鼠强得多，这在迁徙幼虫死亡后明显[9，11，72，73]。相反，小鼠是弓形虫属的合适斜侧宿主，其很好地适应了其组织中的存活，包括CNS[74]。类似地，T的活囊尾迹。猪带可主动逃避人体免疫反应，不会引起或轻度炎症[56]。因此，T.小鼠中的regenti是一个完美的模型，使我们能够研究导致CNS内蠕虫消除的自然机制。

强烈的嗜酸性粒细胞性脑膜脊髓炎是T最突出的组织病理学标志。再生神经侵入。外周血 （7 dpi） 和脊髓 （14 dpi） 中嗜酸性粒细胞计数峰值的比较表明，基于嗜酸性粒细胞的免疫应答在外周和中枢神经系统内时空分离。在感染A的小鼠中也观察到类似的区别。坎通斯 [73].将嗜酸性粒细胞招募到T.在我们的研究中发现的生殖器感染的脊髓可能主要由Ccl24编码的eotaxin-2介导[75]，其分别显示180倍和700倍的表达增加7和14 dpi。然而，在这些时间点（Ccl5，Ccl7，Ccl8）上调的其他嗜酸性粒细胞吸引趋化因子的参与不能被排除，甚至是可能的。此外，Chil3的表达升高可能促进组织嗜酸性粒细胞增多症的维持[76]，尤其是14 dpi。有人建议A。加拿大感染小鼠的Chil3通过IL-13介导的正反馈回路加重嗜酸性粒细胞性脑膜炎[73]，在我们的样本中也明显上调。我们的数据共同表明嗜酸性粒细胞大量浸润到T中。再生感染脊髓，表明它们在消除血吸虫方面的潜在作用。

嗜酸性粒细胞通过抗体和/或补体诱导的有毒颗粒蛋白和活性氧的分泌来危害蠕虫[77]。嗜酸性粒细胞在限制寄生虫负荷方面的作用在小鼠脑囊尾蚴病中得到证实[78]，但用于对抗蠕虫的具体效应机制尚未确定。由于我们的解剖和组织学数据表明在14 dpi左右消除了血吸虫，因此我们检索了转录组数据集，以查找与嗜酸性粒细胞效应器功能相关的途径，这些功能主要在此时上调/富集。有趣的是，我们发现补体和凝血级联反应被富集。具体而言，C1配合物和C2，C3，C4和C5补体组分的组分显着上调（log2折叠变化>2），提示抗原-抗体复合物引发的经典补体途径的激活。已知这种机制会引发嗜酸性粒细胞脱颗粒，导致杀死 S 型血吸虫。曼索尼[79]，我们提出它伤害T。中枢神经系统内血吸虫以相同的方式。

嗜酸性粒细胞细胞外DNA陷阱（EET）是抗菌武器库的另一个组成部分。EET以C-凝集素依赖性方式释放，可以固定蠕虫并促进其进一步清除，正如最近线虫微丝蚴的情况所证明的那样[80]。在 T.再生菌感染的脊髓，C-凝集素受体信号通路大多富集14 dpi，例如，dectin-1上调（log2折叠变化>5），即使在所有时间点。值得注意的是，dectin-1是一种C型凝集素，可作为跨膜模式识别受体[81]介导嗜酸性粒细胞外DNA陷阱的释放[80]。我们的观察提出了一个令人兴奋的问题，需要进一步测试EET是否在T中释放。再生感染的脊髓，如果它们可以阻止CNS中主动移动的蠕虫。

小胶质细胞是中枢神经系统驻留的巨噬细胞样细胞，是中枢神经系统先天免疫的重要组成部分，因为它们感知并消除入侵的病原体[82]。因此，它们被牵连为启动A中神经炎症的细胞。Cantonensis-或T.再生感染小鼠[25，83]。我们的转录组学和2D / 3D成像数据证实了受感染脊髓中小胶质细胞/巨噬细胞标志物的上调，并且持续积累，甚至非常亲密，在血吸虫周围，Iba-1 + MHC II +细胞在7 dpi。此时，我们注意到Tlr2，Tlr6，Tlr8和Tlr12的上调，可以用小胶质细胞表达[84]。 其中，TLR2/TLR6的异源二聚体可能参与对T的识别。生殖器感染与鼠性脑囊尾蚴病相似[85]。然而，TLR8和TLR12在初始血吸虫识别中的作用预计相对较小，因为它们都是细胞内受体，小鼠TLR8在免疫识别方面甚至无功能[86]。此外，C型凝集素依赖性通路（包括以dectin-1为受体）可能参与检测聚糖，聚糖在寄生虫的表面和排泄分泌产物中含量丰富[89，90]。在小鼠神经囊尾蚴病中，富聚糖物质的单核细胞吞噬作用促进免疫细胞浸润至CNS[8，91]。因此，我们得出结论，小胶质细胞可能用作T的传感器。使用多样化和互补的识别途径在脊髓中再生。

除了识别之外，Lichtenbergová等人。提出活化的小胶质细胞/巨噬细胞在破坏T中起主要作用。神经组织中的再生血吸虫[22]。然而，我们的数据显示，在受感染的脊髓中建立了由上调的Il4和Il13驱动的强2型细胞因子环境，提示诱导替代激活的M2小胶质细胞/巨噬细胞[40，92-94]。转录组M2特征通过检测精氨酸酶得到证实，精氨酸酶是蛋白质水平上替代激活的小胶质细胞/巨噬细胞的标志。这种环境的诱导对于其他蠕虫神经感染也是典型的[95-97]，并且可以解释为蠕虫诱导的对M1极化的预防，这与有害的一氧化氮的产生有关。与这一假设相符的是，T.血吸虫在体外或脊髓中不会引发一氧化氮的产生[25，26]。小胶质细胞/巨噬细胞在杀死T中的作用。因此，需要重新考虑血吸虫再生症。我们提出，活化的小胶质细胞/巨噬细胞吞噬血吸虫迁移轨迹中的组织碎片，类似于弓形虫感染大脑中的giter细胞[54，68]。之后，他们也可能清除已经受损的血吸虫的疏通性残余物。通过2D / 3D成像技术揭示的Iba-1 +和/或MHC II +细胞的定位以及富集的FcγR介导的吞噬作用途径支持了关于T中小胶质细胞/巨噬细胞功能的新假设。再生感染的脊髓。

最后，我们认为M2极化促进受伤神经组织的修复。星形胶质细胞介导的IL-6驱动神经胶质瘢痕的形成，我们观察到14-21 dpi，通常被认为是神经组织修复的主要机制，也从其他蠕虫神经感染中得知[22，98，99]。然而，M2小胶质细胞/巨噬细胞通过驱动少突胶质细胞的分化来促进组织再生和髓鞘再生[100，101]。由M2细胞表达和分泌的Chil3促进少突发生[102]，精氨酸酶通过合成多胺（如亚精胺）帮助轴突再生[103，104]。Chil3和Arg1在T中都进行了大规模的上调。再生感染的脊髓和精氨酸酶甚至是在血吸虫附近发现的最丰富的蛋白质。同时，没有注意到脱髓鞘或显着的组织病理学的迹象。因此，我们得出结论，感染脊髓内M2极化的诱导限制了可能与T相关的广泛病理学。再生神经侵入。有必要鉴定负责这种效应的寄生虫分子，因为它们可能代表适用于自身免疫或神经退行性疾病的合适的组织特异性免疫调节剂。

总之，我们提出了一项全面的，转录组驱动的研究，研究血吸虫侵入小鼠脊髓。我们揭示了神经生理功能的显着下调，这有助于在受感染的小鼠中观察到的运动缺陷。宿主免疫反应以嗜酸性粒细胞炎症为主，从而消除了感染。通过大量产生精氨酸酶来证明强烈的M2极化，可以防止广泛的组织损伤。由于寄生虫学，免疫学或病理学与人类神经病原体相似，T。regenti代表了进一步研究神经感染的合适模型。

材料和方法

道德声明-厦门畜牧期刊杂志论文发表

动物实验是按照欧洲和捷克立法（欧盟指令2010/63/EU，第246/1992号法案）进行的。查理大学理学院和捷克共和国教育、青年和体育部的动物福利委员会批准了所有实验程序（MSMT-33740/2017-2、MSMT-37946/2020-3）。采用异氟醚麻醉，然后进行心肌灌注（血化）以牺牲小鼠，如下所示。

动物

C57BL / 6JOlaHsd小鼠（Envigo，Venray，荷兰）被安置在实验生物模型中心（查理大学第一医学院）或动物住房设施（查理大学理学院）。将小鼠饲养在4-10个体/笼子（如果没有另行说明）的组中，并随意提供食物和水;每周监测一次粮食消费。感染 T.Regenti cercariae在8周龄时进行。混合胶质培养物由不超过48小时的两性新生幼崽制备。对Jan ?erny教授（查理大学理学院细胞生物学系）提供的MHC II-EGFP C57BL / 6J敲入小鼠的器官样品进行了光片荧光显微镜成像。

寄生虫和小鼠感染

T的完整生命周期。regenti被保存在查理大学理学院寄生虫学系。淡水蜗牛（Radix lagotis）和家鸭（Anas platyrhynchos f. domestica）分别被用作中间和最终宿主[19]。根据完善的"水浴"方案，使用2000个新收集的cercariae的感染剂量对小鼠进行经皮感染[22，26，29，41]。

试验设计

进行了全面调查以检查T的影响。小鼠的再生感染，强调中枢神经系统中的宿主免疫反应和病理学（图1）。为了表征感染的一般/全身影响，监测了身体和脾脏的重量以及T的水平。再生特异性血清抗体、血液嗜酸性粒细胞计数和受感染小鼠的行为改变。然后通过图1中总结的几种方法广泛探索了CNS中的宿主 - 寄生虫相互作用，特别是在脊髓中。未感染的小鼠总是被用作对照组，特定的年龄匹配如图1所示。进行分析的时间点代表了感染的不同阶段[22]。

酶联免疫吸附

根据[29]，在小鼠血清样品（稀释1：80）中分析了Tregenti特异性IgG1和IgG2a。根据[105]计算的临界值为99.9%的置信水平。

中枢神经系统寄生虫负担

使用两种互补的方法评估T。中枢神经系统中的生殖负荷。首先，我们直接量化了T。再生血吸虫在磷酸盐缓冲盐水中被尖锐的镊子撕成1-2毫米碎片后，从脊髓，脑干，小脑和半球主动释放PBS） [26].器官悬浮液在6小时内由三人独立检查，这足以让活的血吸虫离开组织。

其次，我们通过用于流式细胞术的脊髓和半球样品中的定量实时聚合酶链反应（PCR）检测了血吸虫DNA。具体而言，我们使用细胞悬浮液过滤后细胞过滤器中剩余的材料（?10mg，详见"流式细胞术"）。总DNA由Exgene Tissue SV分离（加！（基因全部;葡萄牙里斯本）使用100μl洗脱缓冲液并储存在–20°C下，然后在采用iQ SYBR绿色超级混合（Bio-Rad;赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国）。选取毛滴虫特异性Sau3A重复序列作为分子靶标，采用5'-GTGACTTGCTACAGGTTGG-3'（正向）和5'-GGCAAGCTCGTATACCATTC-3'（反向）引物[106]扩增预期大小的PCR产物200 bp。将五μl洗脱的DNA加入到单个反应中，每个样品一式三份运行。超纯脱氧核糖核酸酶/无红细胞纳米酶 dH2O（体外生殖器;美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）被列为阴性对照，而从T中分离出10ng DNA。Regenti cercariae（对应于最高标准，见下文）在每次运行中作为阳性对照。qPCR扩增如下：在95°C下3分钟，在95°C下循环40次，15秒，在57°C下15秒，在72°C下15秒，在72°C下1分钟。 获得定量循环值，并根据10ng至1 fg的标准曲线（一系列10倍稀释）进行最终的寄生虫DNA计算。始终检查熔融曲线以确保反应的特异性。截止值计算为来自未感染小鼠的样本的平均值加三个标准差。

行为测试

盲法研究人员进行和评估了几项测试，以探索小鼠行为的各个方面（详见表1）。任务过程的详细说明可以在 S1 文本中找到。用于行为测试的小鼠单独饲养。在所有测试中，用70%乙醇清洁设备并在每次会话后干燥。

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表 1. 行为测试电池。

这些检验按其时间顺序列出。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010302.t001

组织学

从通过肝素化（10 IU / ml）PBS和4%多聚甲醛（PFA）灌注的异氟醚麻醉小鼠中小心提取脊髓。将组织在4°C下在4%PFA中后固定过夜，脱水并包埋在石蜡块中。制备5μm厚的切片，并常规用苏木精-曙红染色。

流式细胞术

采用流式细胞术表征感染小鼠的外周和CNS浸润白细胞。年龄与7和28 dpi匹配的未感染小鼠用作对照，以防止潜在的年龄相关偏倚，特别是在CNS浸润中。由于没有发现差异（S2文本），因此正文中仅显示年龄与7 dpi匹配的未感染小鼠。单独处理血液样本，但将三只小鼠汇集在CNS样本中获得足够和稳定量的白细胞。

首先，从异氟醚麻醉小鼠的右心房收集血液，并在冰上与PBS中等体积的10mM EDTA混合。用ACK缓冲液裂解红细胞[29]，并将其余细胞进行流式细胞术处理。在收集血液后，用PBS经心线灌注小鼠，并提取脊髓，脑干，小脑和左半球并在冰上进行进一步处理。组织被轻轻地机械匀浆，通过70μm细胞过滤器过滤，并使用30/70%Percoll（GE Healthcare;美国伊利诺伊州芝加哥）梯度离心[118]。具体而言，从30/70%Percoll间期仔细收集细胞并进行流式细胞术处理。

制备细胞悬浮液后，加入抗CD16 / CD32抗体（1：100，eBioscience /圣地亚哥，加利福尼亚州，美国/，克隆93）10分钟，然后加入表面标记抗体的混合物：APC-eFluor 780抗CD45（1：100，eBioscience/San Diego，加利福尼亚州，美国/，克隆30F11）;PE-Cy7抗CD11b（1：120，生物遗传学，克隆M1 / 70）;FITC抗F4 / 80（1：100，生物遗传学，克隆BM8）;PE抗SiglecF（1：80，生物基因，克隆S17007L）;APC抗Ly6G（1：150，生物基因，克隆1A8）。在黑暗中在4°C下将细胞染色30分钟，然后使用Hoechst 33258（1：22，500，Sigma Aldrich;美国密苏里州圣路易斯）在测量前10分钟加入以排除死细胞。样品由CytoFLEX S（贝克曼库尔特;布雷亚， 加利福尼亚州， 美国;BC）使用CytExpert（BC）并在FlowJo中进行了分析（v. 10.7.1）。FMO对照用于所有标记物;在F4 / 80的情况下，还包括同种型对照。每个组织的门控策略显示在 S2 文本中。感兴趣的细胞群特征如下：小胶质细胞：CD45地中海CD11b，巨噬细胞/单核细胞：CD45 CD11b F4/80 Ly6G++++–西格莱克地中海， 嗜酸性粒细胞： CD45 CD11b F4/80 Ly6G+++–嗜中性粒细胞： CD45 CD11b F4/80 Ly6G SiglecF+++++低/中，淋巴细胞：CD45 CD11b+–.

转录组学分析

RNA 分离、文库制备和测序。

使用TRIzol（Invitrogen）从受感染和年龄匹配的对照小鼠的整个解剖脊髓中分离总RNA。每个时间点处理每组四个生物重复。使用TURBO无DNA试剂盒（Invitrogen）去除残留的DNA，并通过Bioanalyzer 2100（Agilent;圣克拉拉，加利福尼亚州，美国）。在BGISEQ-500平台上进行配对端（2x100 bp）测序。

生物信息分析。

通过FastQC检查原始读数的测序质量（v. 0.11.5）[119]，并使用Trimomatic（v. 0.39）去除低质量核苷酸（Phred质量评分<20）[120]。使用RSEM（v. 1.3.3）[121]将修剪后的读数映射到从参考基因组（v. GRCm38）推断的转录组，并且具有映射速率>10预期计数的转录本被认为是转录的。在每个时间点使用DESeq2-package（v. 1.12.3）[122]在R（v. 3.5.2）中计算受感染样品和相应年龄匹配对照组之间的差异基因表达。带日志的成绩单2折叠更改（日志2FC）>2或<-2和< = 0.05的错误发现率（FDR）记录为差异表达。为了全面了解每个时间点富集的蛋白质类别和代谢途径，使用转码器（v. 3.0.1）[123]翻译参考转录组，并由GhostKOALA（v. 2.2）[124]注释到KEGG数据库[125]。上调（日志2FC >2） 和下调（日志2带有KEGG注释的FC <-2）转录本被提交给KEGG Mapper在线工具以重建代谢途径。Fisher在R（v. 3.5.2）中的精确测试（调整后的p值<0.05）确定了每个时间点的富集代谢途径。

激光捕获显微解剖和蛋白质组学分析

嵌入、冷冻切片和激光显微切割。

从先前通过肝素化（10 IU / ml）PBS和4%PFA灌注的小鼠中提取颈椎，胸椎和腰椎脊髓段。将片段在室温（RT）下在4%PFA中后固定5小时，在PBS中洗涤3×5分钟，浸入组织冷冻培养基（徕卡;Wetzlar，德国）在室温下冷冻30分钟，并在–80°C下冷冻。 十微米切片（CM3050 S研究低温恒温器，徕卡）安装在膜架载玻片（MMI;Ecching，德国），储存在–80°C直至使用。

使用MMI SmartCut系统（奥林巴斯CKX41倒置显微镜;奥林巴斯SmartCut Plus软件）。从每个脊髓节段分离出感兴趣的区域，最终体积为7.5×106μm3 [具体来说，感兴趣的区域是血吸虫周围长达100μm的每个脊髓节段的白质。将未感染小鼠中随机选择的适当片段的白质作为对照样本。微切除剂储存在–80°C，直到MS分析。它是在合并的（颈椎，胸部和腰椎）上进行的，7.5×106μm3的，n = 4，即 22.5×106μm3每个重复的显微碎片数）或分离（n = 3，7.5×106μm3每个单个节段复制的微切除术）脊髓节段。

此外，肠道中T.还对再生血吸虫进行了显微剖和分析。将4只小鼠血吸虫的肠道含量汇集到一个样品中，一式三份进行实验。由于微解剖材料的产量低，仅为1.3×106μm3的肠内容物是每个样品的显微切除。

MS分析和数据评估。

根据[126]对微分剖面进行纳米流相色谱-MS分析。简而言之，蛋白质在[127]之后使用In-StageTips方法一步变性，还原和烷基化。使用MaxQuant软件（v. 1.6.10.43）处理和量化原始数据，该软件具有内置的Andromeda搜索引擎，针对M的蛋白质数据库。肌肉（2020年6月从 www.uniprot.org 下载）和T。雷根蒂 （trichobilharzia_regenti.PRJEB4662.WBPS14.protein）从WormBase（parasite.wormbase.org）下载，参数设置根据[127]。使用无标记算法进行定量[128]。进一步的数据分析由Perseus软件（v. 1.6.14.0）[129]完成，其中学生的t检验与基于排列的FDR计算（250个随机化）（FDR = 0.05，S0 = 0.1）进行。根据KEGG数据库，对被认为具有可靠可识别性的蛋白质进行了进一步注释并分类为蛋白质组[125]。

免疫组化

按照已经发表的[26]制备了10微米脊髓冷冻切片，并在使用前储存在–80°C。回火后，用PBS洗涤，用PBS中的0.1%（v / v）Triton X-100透化，用0.1%Triton X-100阻断PBS中的1%（w / v）牛血清白蛋白（BSA），并在4°C下与一抗一起孵育过夜：单克隆大鼠抗IL-4（1：40，Abcam /Cambridge，UK/，克隆BVD4-1D11），单克隆大鼠抗IL-6（1：200，Acris抗体/Herford，德国/， 克隆MP5-20F3），单克隆大鼠抗MHC II（1：150，Abcam，克隆NIMR-4），多克隆兔抗精氨酸酶-1（Arg-1）（1：1000，赛默飞世尔科技/沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国/），多克隆兔抗神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（1：1000，Dako/Santa Clara，加利福尼亚州，美国/），多克隆兔抗离子钙结合适配器分子1（Iba-1）（1：1000，Synaptic Systems/哥廷根，德国/）。阴性兔血清作为Arg-1，GFAP和Iba-1的对照。第二天，用PBS洗涤载玻片，用相应的二抗（山羊抗兔F（ab'）2 AlexaFluor 594，山羊抗兔F（ab'）2 AlexaFluor 488，山羊抗兔AlexaFluor 488，所有1：1000，Cell Signaling Technology/Danvers，马萨诸塞州，美国/; 山羊抗鼠Alexa Fluor 568，1：1000，Abcam）在室温下孵育60分钟，用PBS洗涤并安装到带有DAPI（Sigma Aldrich）的Fluoroshield中。NIKON TiE 2捕获了检测到Arg-1的载玻片，并在ImageJ中进行了处理（v. 1.8）。其他幻灯片由配备奥林巴斯DP-2相机的奥林巴斯BX51拍摄，并在Quick Photo Micro（v. 3.0）和Gimp（v. 2.10.22）中处理。每个时间点使用4只小鼠，并且每个抗体组合每只小鼠至少分析3个血吸虫阳性载玻片。用于该分析的小鼠独立于本文提出的其他实验进行感染。

光片荧光显微镜

MHC II-EGFP C57BL / 6J敲入小鼠被冰冷的肝素化PBS和4%PFA（pH 7.4）灌注，其脊髓在4°C下在PFA中后固定过夜。 在CUBIC-1溶液中清除组织[25%（w / v）尿素，25%（w / v）Quadrol，15%（v / v）Triton X-100（所有Sigma-Aldrich）在dH中2O]在黑暗中至少5天（或直到组织透明），在37°C下眶振荡。 之后，将组织在黑暗中洗涤[0.5%（w / v）BSA，0.01%（w / v）叠氮化钠，0.1%（v / v）Triton X-100在PBS中]，在37°C下轨道振荡5小时。将洗涤后的样品在黑暗中用DRAQ5（赛默飞世尔科技）（1：7500）染色2天，在4°C下摇摆。 最后，将组织在CUBIC-2溶液[22.5%（w / v）尿素，9%（v / v）三乙醇胺（Sigma-Aldrich），45%（w / v）蔗糖，0.1%（v / v）Triton X-100在dH2O中孵育;折射率= 1.47）]中，在黑暗中至少5天，在37°C下轨道振荡。 组织清除方案改编自[130]，并由Jaromír Novák和Jan Pa?es（查理大学理学院细胞生物学系）修改。将样品安装在1%（w / v）低熔点琼脂糖中，并使用10×照明和20×检测目标在蔡司Lightsheet Z.1上处理。在ZEN（黑色版）中对数据进行了分析和处理（v. 9.2.8.54;蔡司），阿里维斯（v. 3.1.3;阿里维斯）和达芬奇决议（v. 16.2.7.010;黑魔法设计）。用于该分析的小鼠独立于本文提出的其他实验进行感染。

评估血脑屏障完整性

血脑屏障的完整性通过埃文斯蓝渗入神经组织来评估[131]。将小鼠进行微妙麻醉（100mg / kg氯胺酮，10mg / kg木拉嗪），并将200μl2%（w / v）Evans blue注射到侧尾静脉中。1小时后，通过40ml肝素化（10IU / ml）PBS经心肌灌注小鼠，并分离脊髓，脑干，小脑和半球并称重。然后将组织机械匀浆在50%的三氯乙酸（脊髓，脑干和脑炎在100μl中，半球在300μl中），离心（20分钟，10，000×g）并将上清液用乙醇稀释4倍。在620/680nm处测量荧光强度，并使用标准曲线转换为埃文斯蓝的量。用于该分析的小鼠独立于本文提出的其他实验进行感染。

细胞凋亡检测

根据制造商的说明，通过Click-iT Plus TUNEL测定法使用Alexa Fluor 488染料（赛默飞世尔科技）在脊髓冷冻切片上检测到DNA片段化（参见"免疫组织化学"制备）。然后将载玻片与DAPI一起安装在VectaShield中，以染色所有细胞核，并用荧光显微镜（奥林巴斯BX51）进行检查。在ImageJ中处理图像，通过该图像计算血吸虫周围和内部的TUNEL +核的比例，并与未感染的小鼠进行比较。每个时间点使用4只小鼠，每只小鼠至少分析2个血吸虫阳性载玻片。用于该分析的小鼠独立于本文提出的其他实验进行感染。

T. 的凋亡作用在Neuro2a细胞系和原代混合神经胶质培养物上进行体外测试再生抗原。Neuro2a是从Ond?ej Honc（查理大学理学院生理学系）获得的，并在Dulbecco的改良Eagle培养基中生长，补充了10%（v / v）胎牛血清和1%（v / v）青霉素/链霉素（全部来自Lonza;巴塞尔，瑞士）。从新生小鼠幼崽中制备混合胶质培养物并生长如已经描述的那样[25]。将细胞接种到12孔板中，并用可溶性部分的血吸虫匀浆（5和50μg/ ml;参见[25]进行详细制备）处理48小时。使用Staurosporin（终浓度0.1μM）作为阳性对照。接下来，根据制造商的说明，通过PBS洗涤细胞，胰蛋白酶消化，并用掺联蛋白V-Alexa Fluor 488和碘化丙啶（赛默飞世尔科技）用死细胞凋亡试剂盒染色细胞。使用Diva（Becton Dickinson;富兰克林湖，新泽西州，美国）并在FlowJo中进行了分析（v. 10.7.1）。

统计分析

统计分析和数据可视化是在GraphPad Prism（v. 9）中进行的，如果没有另有说明的话。所应用的特定测试在图例中表示，p值<0.05被认为是显着的，如下所示：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。如果确切的 p 值为 0.05–0.10，则还会显示该值。单个数据在图形中显示，或者如果使用汇总统计数据（平均值±标准差）来更好地表示图形，则明确说明"n"。

支持信息

脊髓转录组学数据。-厦门畜牧期刊杂志论文发表

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无花果

S1 表。 脊髓转录组学数据。

10.1371/journal.ppat.1010302.s001

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S2 表。 显微解剖蛋白质组学数据。

10.1371/journal.ppat.1010302.s002

（XLSX）

S1 文本。 行为测试的详细说明。

10.1371/journal.ppat.1010302.s003

（文档）

S2 文本。 门控策略和流式细胞术数据未在正文中提供。

10.1371/journal.ppat.1010302.s004

（文档）

S1 图 正文中未显示的行为数据。

10.1371/期刊 ppat.1010302.s005

（TIF）

S2 图 Evans Blue在未感染（0 dpi）和受感染（7 dpi）小鼠中评估血脑屏障完整性。

（A）提取的脊髓和大脑的代表性图像。（B）神经组织中埃文斯蓝的定量。通过不成对的 t 检验评估数据，显示 p 值。

10.1371/journal.ppat.1010302.s006

（TIF）

S1 视频。 光束行走，未感染和受感染（7 dpi）小鼠。

10.1371/期刊.ppat.1010302.s007

（MP4）

S2 视频。 光片荧光显微镜，未感染小鼠（0 dpi）。

10.1371/journal.ppat.1010302.s008

（MP4）

S3 视频。 光片荧光显微镜检查，感染小鼠（7 dpi）。

10.1371/期刊 ppat.1010302.s009

（MP4）

S4 视频. 光片荧光显微镜检查，感染小鼠（14 dpi）。

10.1371/journal.ppat.1010302.s010

（MP4）

S5 视频。 用于定量血吸虫周围MHC II +体积的虚拟盒子的可视化。-厦门畜牧期刊杂志论文发表

10.1371/journal.ppat.1010302.s011

（MP4）

确认

我们要感谢Vladimír ?teiger和Irena Parohová分别对qPCR和细胞凋亡相关实验的帮助。我们的同事因共享动物（Jan ?erny教授），细胞（Ond?ej Honc），协议（Jan Pa?es，Jaromír Novák）或设备（Ivana Stru?inská博士）而受到认可。我们也感谢Zuzana Burdíková博士（光片荧光显微镜），Veronika King（小鼠感染），Veronika Siegelová（维持T.Regenti life cycle）、Pavel Talacko（LC-MS分析）和Jana Bulantová博士（动物处理）。

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