布鲁氏锥虫腺嘌呤磷酸核糖基转移酶 （APRT） 活性的表征：两种亚型中只有一种具有动力学活性

凯拉·格洛克津，托马斯·米克 ，阿尔达拉·卡茨弗斯-厦门畜牧期刊杂志论文发表

出版日期： 2022年02月01日

抽象

非洲人类锥虫病（HAT），也称为昏睡病，是一种被忽视的热带病，在36个非洲国家流行，目前约有7000万人面临感染风险。目前的治疗方法由于毒性、不良副作用和新出现的耐药性而欠佳。因此，迫切需要有效和负担得起的治疗方法。HAT的病原体是原生动物布鲁氏锥虫。对其基因组的注释证实了先前的观察结果，即T.布鲁西是嘌呤辅助营养动物。这些原生动物寄生虫无法从头合成嘌呤，依靠嘌呤磷酸核糖基转移酶从宿主中挽救嘌呤以合成嘌呤单磷酸盐。完整而准确的基因组注释与嘌呤挽救酶催化活性的鉴定和表征相结合，除了提供对T中嘌呤代谢的更深入理解外，还可以开发靶标特异性疗法。布鲁西。在锥虫中，嘌呤磷酸核糖基转移酶代表了有希望的药物靶点，因为它们在嘌呤挽救中起着重要和核心作用。参与腺嘌呤和腺苷挽救的酶，如腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRTs，EC 2.4.2.7），因其在激活腺嘌呤和腺苷基促药物中的潜在作用而特别令人感兴趣。T.布鲁氏基因组显示两个假定的aprt基因：APRT1（Tb927.7.1780）和APRT2（Tb927.7.1790）。在这里，我们报告了对每个推定的APRT的催化活性的研究，揭示了两个T的催化活性。布鲁斯推定的APRT，只有APRT1具有动力学活性，因此表示Tb927.7.1790的基因组错误注释（推定的APRT2）。可靠的基因组注释对于建立潜在的药物靶标和鉴定参与腺嘌呤和基于腺苷的前体药物激活的酶是必要的。

作者简介

被忽视的热带病，包括非洲人类锥虫病（HAT），被世界卫生组织定义为由20种不同疾病组成的多样化群体，对世界上最贫穷的人口产生不成比例的影响。HAT在36个非洲国家流行，目前全世界约有7000万人面临感染风险。目前的治疗方法由于毒性、不良副作用和新出现的耐药性而欠佳。HAT的病原体是布鲁氏锥虫。与人类不同，这些原生动物寄生虫依靠嘌呤磷酸核糖基转移酶从宿主中挽救嘌呤碱基，用于DNA和RNA的合成。在这里，我们报道了布鲁氏锥虫中腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT）活性的表征。参与腺嘌呤和腺苷挽救的酶，如APRT，因其在腺嘌呤和基于腺苷的促药物的激活中的潜在作用而特别令人感兴趣。我们的研究表明，在两种推定的APRT中，只有APRT1在生理条件下具有动力学活性。准确的基因组注释与嘌呤挽救酶的表征相结合，可以开发靶向特异性疗法。

数字

Fig 7图1表 1表 2Fig 2Table 3Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7图1表 1表 2

引文： Glockzin K，Meek TD，Katzfuss A（2022）布鲁氏锥虫中腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT）活性的表征：两种亚型中只有一种具有动力学活性。PLoS Negl Trop Dis 16（2）：e0009926。https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009926

编辑 器： Margaret A. Phillips，德克萨斯大学西南医学院，美国

收到： 十月 19， 2021;接受： 一月 22， 2022;发表： 二月 1， 2022

版权所有： ? 2022 格洛克津等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据均在手稿（方法部分）及其支持信息文件中。

资金： TDM和AK由美国国立卫生研究院，国家过敏和传染病研究所 - NIH / NIAID资助，拨款1R01AI127807。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

相互竞争的利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。

介绍

布鲁氏锥虫是人类非洲锥虫病（HAT）的病因，也称为昏睡病。布鲁氏冈比亚锥虫和罗得西亚布鲁氏锥虫分别引起人类慢性和急性形式的这种疾病[1，2]，其中慢性感染更为普遍（>90%的报告病例）[3]。HAT表现为头痛、发热和疲劳的初始症状。并且主要由Glossina属的矢量采采蝇水平传播[4]，但也从母亲垂直传播到后代[5]，有性传播的证据[6]。一旦进入中枢神经系统（CNS），寄生虫就会改变睡眠习惯，引起情绪波动，推理和心理处理受损，如果不治疗，则会出现昏迷和死亡[7-9]。HAT的进展导致中枢神经系统脱髓鞘，即使在清除寄生虫后也无法治愈[1]。HAT是36个非洲国家的特有种;估计威胁7000万人[3，10]。

目前尚无疫苗或预防性治疗[8]，目前的治疗标准较差。目前有五种药物用于治疗HAT。喷他脒和苏拉明用于感染的早期阶段。美拉索特罗是晚期疾病的一线治疗;依氟鸟氨酸仅对 T 有效。布鲁氏冈比亚氏菌感染，但必要的剂量限制了其使用。患者不依从性导致的治疗失败率约为30%，与美拉胂醇毒性相关的死亡率较高（高达12%）[1，3]。世界卫生组织（WHO）强调需要加紧努力治疗HAT，包括开发新疗法[11];尽管如此，直到最近，最后一种用于治疗的药物是1990年的依氟鸟氨酸[3]。2019年，世界卫生组织在其T中添加了非昔尼唑 - 一种抑制DNA合成的硝基咪唑。brucei gambienseHAT治疗指南作为一线治疗[12，13]，其次是欧洲药品管理局（EMA）[14]和美国食品和药物管理局（FDA）[15]分别于2018年和2021年批准。非昔硝唑的成功率为>90%，已被批准用于6岁以上且体重至少为20 Kg的患者，用于治疗早期和晚期HAT作为口服药物，每天给药一次，持续10天[12]。报告的副作用被认为是轻度的（头痛、呕吐、失眠、恶心、虚弱、震颤和食欲下降）[16]，但对于有精神疾病史、35 Kg以下的儿童以及白细胞升高（>100/μL）的病例，住院治疗被认为是强制性的[12]。药代动力学研究表明，母乳中存在非昔尼达唑，其在妊娠期的效果和益处仍在研究中[12]。

开发治疗被忽视的热带病的新药的困难包括许多社会、经济和政治因素。在HAT的情况下，这些并发症因T的内在复杂性而加剧。布鲁西 ssp. 复杂的生命周期。T. brucei ssp.是一种单细胞专性寄生虫，有人类和昆虫宿主。为了完成其生命周期，寄生虫必须适应它在两个宿主中面临的截然不同的环境，并且通过调节其基因表达，代谢状态，形态和繁殖策略来完成这项任务[4，17-19]。在采采蝇内部，锥虫的原环形式适应一系列微环境，包括探虫、唾液腺、中肠前部和中肠后部[20-22]。在人类宿主中，血流形成T。布鲁氏菌感染血液和间质液，包括脑脊液和淋巴液[23]。

T.brucei于2005年为T完成。布鲁氏布鲁氏菌株 TREU927.布鲁氏蝽虫在牛和其他脊椎动物中引起疾病（Nagana）[24]，但它无法感染人类，被认为是传染性亚种的模式生物[25-27]。这些数据来自基因组注释，与几项蛋白质组学研究相关，这些研究确定了沿T的差异表达基因。brucei的生命周期[28-31]允许使用药物开发的靶向特异性策略作为识别和开发新疗法的有希望的方法[32]。T. 的基因组注释。b. brucei证实了先前的观察结果，即与其他寄生原生动物一样，T.brucei ssp.是一种嘌呤营养因子[32，33]，无法从头合成嘌呤核苷酸，并且依靠宿主的摄取通过嘌呤挽救途径满足其代谢需求。锥虫通过高选择性核碱基/质子共排系统结合嘌呤核碱基和嘌呤类似物，在前环和血流阶段具有差异表达[34-37]。一旦进入细胞，嘌呤核碱基和核苷通过挽救途径的酶进一步转化为核苷酸，包括具有一些重叠底物特异性的三种嘌呤磷酸核苷酸转移酶。嘌呤挽救的许多酶存在阶段特异性表达谱[38];以前的细胞研究表明，任何一个嘌呤都足以支持T。布鲁氏菌体外生长[39]。正确的基因组注释，以及嘌呤挽救酶催化活性的鉴定和表征不仅是理解T的关键步骤。布鲁氏代谢途径，但有助于开发靶点特异性新疗法。参与腺嘌呤和腺苷抢救的酶因其在腺嘌呤和腺苷基抗代谢物前体药物的活化中的潜在作用而特别令人感兴趣[40-43]。

在这项工作中，我们描述了T的动力学表征。布鲁氏腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT）活性。APRTs（EC 2.4.2.7）是嘌呤挽救途径的酶，催化5-磷酸-α-D-核糖-1-二磷酸（PRPP）和腺嘌呤形成单磷酸腺苷（AMP）（图1）。有两个假定的aprt基因预测到T中。布鲁西布鲁氏基因组。APRT1和APRT2在7号染色体上串联，具有低氨基酸序列同一性（22%）。此外，APRT1已被证明是一种细胞质蛋白，而APRT2可共定位到糖体[31]。APRT1也被证明在血流形式和前环锥虫上均有表达，而APRT2表达主要在原环形式上检测到[40]。既往关于 T. 中 APRT 活性的表型研究。布鲁西在APRT1/APRT2双敲除中进行[40]。其他关于APRT的报告是使用总细胞提取物活性[44]，mRNA检测[29]，共免疫沉淀[45]或蛋白质组学分析[31]进行的。APRT已被评估为潜在的药物靶点，但以往的工作在独立评估APRT1和APRT2方面并不成功[46]。在本研究中，我们分别关注每个推定的APRT的催化活性。我们的结果揭示了两个T。brucei brucei基因被注释为假定的APRT，只有一个APRT1在生物学上与催化腺嘌呤转化为AMP有关。

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图 1. 腺嘌呤磷酸核糖基转移酶催化的反应（APRT，EC 2.4.2.7）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009926.g001

方法

蛋白质克隆、表达和纯化

对密码子1（Tb927.7.1780，UNIPROT访问代码Q57V32）和APRT2（Tb927.7.1790，UNIPROT访问代码Q57V31）进行了密码子优化，可在皮基亚牧区表达。在每个ORF的5'和3'端添加悬垂，以组装到pPICZ向量中（S1附录）。每个基因最初被克隆到pET-28a（+）载体中，使用NdeI和HindIII限制位点（Genscript，USA）。将质粒pET-28a（+）：：aprt1-Ntag，pET-28a（+）：：aprt1-Ctag，pET-28a（+）：：aprt2-Ntag和pET-28a（+）：：aprt2-Ctag通过PCR（S2附录）线性化，并使用HiFi DNA组装试剂盒（NEB）克隆到pPICZ载体（pPICZ-Ntag和pPICZ-Ctag）中。随后使用热休克将组装的产品转化为NEB 5-α感受态大肠杆菌细胞，并在含有卡那霉素50μgmL的LB琼脂平板上在37°C下孵育过夜-1.质粒在转化为P之前通过PCR线性化。牧羊犬菌株smPP，使用引物向前（5'至3'）GCTGTCTTGGAACCTAATATG，反向（5'至3'）TGTCAGTTTTGGGCCATTTG。pPICZ-Ctag载体包含C端mCherry标签上游的烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶的切割位点，后跟Strep-II标签和6×His-标签。pPICZ-Ntag载体包含一个N端TEV蛋白酶切割位点，该位点位于6×His标签的下游，后跟一个mCherry标签（S1和S2 Figs）。根据mCherry表达水平选择APRT1和APRT2表达水平最高的克隆（S3图）。使用单个菌落在50μgmL玉米蛋白酶存在下接种25mL酵母提取物 - 蛋白胨 - 葡萄糖（YPD）培养基-1.将预开始培养物在30°C下在设置为200RPM的轨道振荡器中孵育过夜。使用10 mL的预开始培养样品在玉米素50μgmL的存在下接种600mL缓冲甘油复合培养基（BMGY）-1.在30°C和200RPM下培养24小时，并通过在室温（RT）下离心2，000×g，5分钟收获。将颗粒与40mL新鲜缓冲甲醇复合培养基（BMMY）重悬。使用重悬沉淀的10mL样品在沸石蛋白50μgmL存在下接种600mL BMMY培养基-1.培养物在30°C下生长，并在200RPM下设置24小时。通过加入终浓度为0.5%（v / v）的甲醇诱导蛋白表达。细胞在这些条件下进一步生长24小时。通过以2，000×g离心收获细胞，用50mM EPPS（pH 8.3）洗涤并在-80°C下储存直至纯化。将10克细胞浆液重悬于50mM Na中2断续器4/呵呵2采购订单4（pH 7.4），300 mM NaCl（重悬缓冲液）并用微流速器裂解（在30 kpsi下4个循环）。将裂解细胞以18，000 RPM离心，并取含有目标可溶性蛋白（POI）的上清液部分进行纯化。使用HisPur Ni-NTA树脂（Thermo Fisher Scientific）在室温下纯化His标记的蛋白质，蛋白质与柱的结合在含有20mM咪唑的重悬缓冲液中进行。结合蛋白在重悬缓冲液中以增加浓度的咪唑（20-50mM）洗涤，并在含有300-600mM咪唑梯度的该缓冲液的10柱体积中洗脱。通过用12%SDS-PAGE染色考马斯蓝进行分析推断，含有POI的馏分被汇集并透析到50 mM EPPS（pH 8.0），300mM NaCl。用TEV蛋白酶处理标记的蛋白质，以根据[47]中描述的方法去除相应的N或C端标记。将裂解的蛋白质混合物在Ni-NTA树脂上进行第二轮色谱纯化，遵循相同的洗脱梯度。通过含有无标签的APRT1或APRT2的馏分，通过用考马斯蓝染色的12%SDS-PAGE推断，汇集并透析50mM HEPES（pH 7.4），300mM NaCl，50mM L-精氨酸和50mM L-谷氨酸。均质的APRT1在10%甘油（v / v），2.5mM TCEP的存在下储存在-80°C下。 均质的APRT2在-80°C的10%甘油（v / v）存在下储存。

不连续的 APRT 活性测定 （HPLC）

除非另有说明，否则所有化学品均从西格玛奥尔德里奇购买。PRPP浓度按照供应商指示的纯度（75%纯度）进行了校正。9-脱氮腺嘌呤是从AA块（AA0037QI）购买的。除非另有说明，否则所有动力学测定均在室温下进行。

对于APRT的正向（生物合成）测定，反应混合物含有50 mM EPPS（pH 8.3），12mM MgCl2（测定缓冲液），含 1 mM PRPP、150 μM 腺嘌呤、0.03 U 无机焦磷酸酶（EC 3.6.1.1，赛默飞世尔科技）和 APRT1 （0.1–25 μM） 或 APRT2 （0.2–25 μM）。将反应孵育30分钟并过夜，并使用具有10，000 kDa截止的Amicon Ultra（0.5mL）过滤器过滤以过滤停止以除去酶，然后以14，000 RPM离心25分钟。对反向反应混合物进行类似处理，反应混合物含有150μMAMP，1mM无机焦磷酸盐和4μM E。大肠杆菌K12腺嘌呤脱氨酶（EC 3.5.4.2）[48]和APRT1（0.1-25μM）或APRT2（0.2-25μM）。单个色谱标准品在测定缓冲液中含有150μM腺嘌呤，AMP或次黄嘌呤。阴性对照设置在与反应混合物相同的条件下，在没有APRT1或APRT2的情况下。使用配备二极管阵列检测器（DAD）的Ultimate 3000（赛默飞世尔科技）系统，通过HPLC（高效液相色谱）分析样品的核碱基/核苷酸含量。在Synergi Fusion-RP（4μM，4.6×150 mm）柱上分析样品。将15μL样品注入柱中，并以1mL min的流速在10分钟内用3至40%溶剂B的梯度洗脱-1.溶剂A：20mM乙酸铵pH值4.5，溶剂B：100%乙腈。在260nm处监测核碱基和核苷酸。

APRT活性的连续偶联酶测定-厦门畜牧期刊杂志论文发表

使用由肌激酶（MK），丙酮酸激酶（PK）和乳酸脱氢酶（LDH）组成的偶联酶系统测量正向反应的稳态动力学测定，以催化AMP产物分别转化为ADP，丙酮酸，乳酸盐和NAD;后者的形成在340nm处以分光光度法监测（方案1）。测定按照[49]中描述的方法进行，并进行了一些修改。所有测定均在100 mM HEPES缓冲液（pH 7.8）中进行，存在25 mM MgCl+2， 1 mM ATP， 0.5 mM PEP， 300 μM NADH， 36 U mL-1MK， 50 U mL-1PK 和 36 U mL-1LDH的总体积为250μL。在340 nm （ε = 6220 M下监测NADH向NAD的转化+-1厘米-1).

（方案1）

APRT1 和 APRT2 的表观动力学参数（应用 KM、应用 k猫和应用 k猫/KM）从初始速度测量中确定腺嘌呤的一式两份或一式三份，具有至少七种不同的底物浓度，并且PRPP的表观饱和浓度（1mM）。250μL的反应混合物含有腺嘌呤2.5-60μM，存在PRPP的表观饱和浓度（1mM）。动力学参数是通过使用GraphPad Prism 9.2软件将初始速率数据拟合到Eq（1）来计算的[50]。初始速度数据 （KM， k猫和 k猫/KM）将重组APRT1（200 nM）确定为腺嘌呤（1-20μM）变化固定浓度与可变PRPP（10-250μM），或PRPP（25-150μM）的变化固定浓度与可变腺嘌呤（1.5-50μM），并将数据拟合到方程（2）。

使用 APRT1 和 APRT2 混合物的初始速度数据

纯化的APRT1（2.5μM）和APRT2（2.5μM）以1：1等摩尔比在冰上孵育4小时。将5μM APRT1稀释成两半作为稀释对照。动力学测定如上所述用于连续APRT活性测定。将200 nM的APRT（APRT1或APRT1：APRT2混合物）加入到测定混合物中以开始反应。在100 nM时仅含有APRT1的稀释对照与APRT1：APRT2混合物进行比较。测定一式三份进行。

抑制研究

为了确定9-脱氮腺嘌呤对腺嘌呤和PRPP的抑制模式是否具有竞争性，非竞争性或非竞争性，在存在5种明显的非饱和浓度的9-脱氮腺嘌呤的情况下收集了初始速度数据。9-脱氮腺嘌呤与腺嘌呤通过初始速度数据确定，该初始速度数据绘制为9-脱氮腺嘌呤（0-300μM）与9-脱氮腺嘌呤固定浓度变化的双倒数图。可变腺嘌呤（2.5-150μM）在PRPP的表观饱和条件下（1mM）。对PRPP的9-脱氮腺嘌呤抑制模式被确定为初始速度数据的双倒数图，在存在9-脱氮杂氮腺嘌呤（0-600μM）的固定浓度变化的情况下与。可变PRPP（12.5-1000μM）在腺嘌呤表观饱和浓度（100μM）下。将抑制数据拟合到Eqs（3）–（5）。AMP的形成如前所述，使用连续偶联酶APRT活性测定法进行测量。

交联检测

根据Davies和Stark的方法，用二甲基亚胺化物（DMS）处理均质APRT1，APRT2-Ntag和APRT2-Ctag，以评估均质二聚体或其他多聚体形式在溶液中存在的程度，例如蛋白质交联。简而言之，含有0.2 M三乙醇胺（pH 8.5）和纯化的APRT（17.8，35，69或140μgmL）的反应混合物-1）在存在或不存在8.7mM DMS的情况下，在室温下孵育5-8小时，然后用SDS-PAGE样品缓冲液变性。用12%SDS-PAGE用考马斯蓝染色对样品进行分析，以确定存在的酶的单体和多聚体形式的各自水平。

均质APRT1和APRT2的尺寸排阻色谱（SEC）

为了验证低聚状态并确保纯化的蛋白质不聚集，将APRT1和APRT2进行SEC.纯化的APRT1和APRT2浓缩至13.8mg mL-1和 10.8 毫克毫升-1分别。使用?KTA纯品（GE Healthcare）将200μL浓缩APRT1或APRT2应用于GE Superdex 200增加10/300 GL SEC色谱柱。用1.2 CV的SEC缓冲液洗脱蛋白质：50mM HEPES（pH 7.8），300mM NaCl，50mM L-精氨酸，50mM L-谷氨酸。在样品应用之前，使用分子量为1，350至670，000 Da的冻干标准品校准色谱柱，其中含有甲状腺球蛋白，牛γ球蛋白，鸡肉卵清蛋白，马肌红蛋白和维生素B12（BioRad，Cat #1511901）的混合物，重悬于SEC缓冲液中。将样品与标准进行比较，以确定Mr（相对分子量），其表示低聚态。

评估 APRT2 的其他核碱基底物

使用替代的含N亲核试剂作为可能的底物，包括乳清酸，尿嘧啶，次黄嘌呤，鸟嘌呤和黄嘌呤，以分光光度法测试APRT2酶活性。所有测定均在含有1mM PRPP，APRT2（25-50μM）和150μM碱基的测定缓冲液中进行，最终体积为250μL。可能的活性测定如下：乳清酸磷酸核糖基转移酶（OPRT-EC 2.4.2.10）活性的测定如[52]中所述，其中在293nm处监测OMP的形成。次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGXPRT–EC 2.4.2.8）活性的测定如[53，54]所述。分别在245 nm、257.5 nm和255 nm处监测IMP、GMP和XMP的形成。尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（UPRT–EC 2.4.2.9）活性的测量如[55]中所述，其中在280nm处进行UMP形成监测。APRT2催化从ATP和核糖-5-磷酸（PRPP合成酶-EC 2.7.6.1）合成PRPP的能力使用所描述的偶联酶测定法进行评估，其中通过将PRPP合成酶反应（）偶联到含有100 mM HEPES（pH 7.8）的反应混合物中的MK，PK和LDH（方案1）[56，57]来测量产物AMP， 25 mM 氯化镁2， 2 mM ATP， 0.5 mM PEP， 300 μM NADH， 150 μM 核糖-5-磷酸盐， 36 U mL-1MK， 50 U mL-1PK 和 36 U mL-1LDH的总体积为250μL。APRT2催化腺苷磷酸化酶（EC 2.4.2.1）和5'-核苷酸酶（EC 3.1.3.5）活性反应的能力也使用上述不连续APRT活性测定（HPLC）描述的相同方法进行了分析，并进行了以下修改。将样品（15μL）注入柱中，并以0.425mL min的流速在15.1分钟内用5-40%溶剂B的梯度洗脱-1.溶剂A：20mM乙酸铵pH 4.5，溶剂B：100%乙腈。在260nm处监测核碱基和核苷。在测定缓冲液中进行检测腺苷磷酸化酶（EC 2.4.2.1）活性的测定，含有1mM PRPP，150μM腺苷，0.03 U无机焦磷酸酶（EC 3.6.1.1，赛默飞世尔科技）和APRT2（25-50μM）。在测定缓冲液中进行检测5'-核苷酸酶（EC 3.1.3.5）活性的测定，含有150μM AMP，4μM E。大肠杆菌K12腺嘌呤脱氨酶（EC 3.5.4.2）[48]和APRT2（25-50μM）。将测定物孵育30分钟并过夜。使用具有10，000 kDa截止值的Amicon Ultra（0.5mL）过滤器过滤以除去酶来停止反应，然后以14，000 RPM离心25分钟。

溴化氰裂解蛋白质

溴化氰裂解反应如[58]所述。使用10μL的5M HCl酸化250μgmL-1APRT2-Ntag，APRT2-Ctag或APRT Ec（E.大肠杆菌表达的APRT2储存在5mM DTT中，总体积为95μL（Milli-Q水）。在200摩尔过量（200：1，CNBr / Met残留物）中加入5 M溴化氰。APRT2含有5个Met残留物，约2.1%的Met残留物含量。将样品涡旋，用铝箔覆盖，并在室温下孵育24小时。通过加入5体积的Milli-Q水来停止反应。使用真空吸尘器（60°C，2小时）干燥样品，重悬于50μL水中，并用12%SDS-PAGE染色考马斯蓝进行分析。

天然质谱（MS）

将APRT2-Ntag和APRT2-Ctag缓冲液交换到挥发性缓冲液（200mM乙酸铵，pH 7.4）中，使用Micro Bio-Spin 6装置（Bio-Rad）。如[59]所述，将样品装入内部制备的拉动玻璃毛细管中，并通过电喷雾电离引入Orbitrap质谱仪（具有扩展质量范围的Exactive Plus（EMR），Thermo Scientific）。对仪器参数进行了调整，以保留蛋白质的天然样结构，如[59]所述。

APRT2野生型和突变体的克隆、表达和纯化

APRT2野生型（WT）以及突变体M73Q和M128Q在E中的表达进行了密码子优化。大肠杆菌并克隆到pET-28a（+）载体中，使用NdeI和HindIII限制位点（Genscript，美国）。使用 Terrific-Broth 培养基在 BL21（DE3） 细胞中获得所有三种蛋白质的最佳表达。将pET-28a（+）：：aprt2、pET-28a（+）：：aprt2M73Q和pET-28a（+）：：aprt2M128Q的质粒分别通过热休克转化成BL21（DE3）细胞，并将含有卡那霉素50 μg mL的板单独转化成BL21（DE3）细胞。-1在37°C下孵育过夜。 使用每个菌株的单个菌落在卡那霉素50μgmL存在下接种50mL Terrific-Broth培养基的培养物-1.起始培养物在37°C下以180RPM的轨道振荡器孵育过夜。起始培养物（13mL）用于在卡那霉素50μgmL存在下接种500mL Terrific-Broth培养基-1.培养物在37°C和180RPM下生长，直至外径。600达到 0.4–0.6。通过加入IPTG诱导蛋白质表达至终浓度为1mM。细胞在这些条件下进一步生长24小时。通过离心8，000×g收获细胞，用50mM Tris HCl（pH 7.4），300mM NaCl洗涤并储存在-20°C直至纯化。将5克细胞糊剂重悬于重悬缓冲液中，并在0.2mg mL存在下通过超声处理（15个循环，在60%振幅下10秒）破坏-1溶菌酶。在以48，000×g离心后，使用HisPur Ni-NTA树脂（Thermo Fisher Scientific）在单步方案中纯化N端His标记蛋白，在室温下平衡。结合蛋白在重悬缓冲液中以增加浓度的咪唑（20-50mM）洗涤，并在含有300-600mM咪唑的重悬缓冲液的10柱体积中洗脱。将含有明显均匀的APRT2 WT，APRT2 M73Q和APRT2 M128Q的馏分，通过SDS-PAGE（12%聚丙烯酰胺;用考马斯蓝染色）进行汇集并透析，以50 mM EPPS（pH 8.0），300mM NaCl。在APRT2 WT中加入5 mM DTT，以确保在细胞裂解过程中可能氧化的Met残基完全减少。将均质重组蛋白储存在-80°C的10%（v / v）甘油存在下。

如上所述克隆，表达和纯化APRT2突变体M156Q，并进行以下修改：使用R terrific-Broth培养基在C43（DE3）细胞中观察到APRT2 M156Q最佳表达。IPTG诱导后，细胞在18°C下生长24小时。 均匀的APRT2 M156Q，由12%的SDS-PAGE用考马斯蓝染色推断，在上述相同条件下被汇集，透析和储存。

数据分析

数据分析是使用GraphPad Prism 9.2软件进行的。将单个不同底物A在固定浓度下获得的另一个底物的可变浓度下获得的初始速度数据拟合到Eq（1），其中v是初始速度，Et是酶浓度，k猫是周转数，A是可变底物的浓度，K一个是明显的米凯利斯常数。

(1)

将单个底物A在变化的浓度下获得的第二个底物B的可变浓度下的初始速度数据拟合到方程（2），其中Kia和 K一个是 A 和 K 的各自解离和米迦勒常数b是底物 B 的米凯利斯常数。

(2)

用于抑制研究，其中抑制剂（I）与抑制剂的双倒性图可变底物（A）分别符合明显的竞争性、非竞争性或非竞争性抑制，初始速度数据（v）拟合到Eqs（3）–（5），其中Et是酶的浓度，k猫和 K一个分别是基底 A 和 K 的周转数和米歇斯常数是和 K第二分别是视斜率和截距抑制常数。

(3)

(4)

(5)

结果和讨论-厦门畜牧期刊杂志论文发表

布鲁氏锥虫基因组数据包括两个推定的aprt基因（APRT1 –Tb927.7.1780和APRT2 –Tb927.7.1790），它们串联位于7号染色体上。为了确定这两个基因的蛋白质产物的催化活性，两者都被单独克隆，表达和纯化。在评估体外活性后，APRT1能够催化APRT的正向和反向反应（图1，S4，S5和S6），而APRT2催化正向APRT反应可以忽略不计（表1和S4图）。通过对APRT1和APRT2在PRPP表观饱和固定浓度下正向反应的稳态动力学分析，确定表观k猫和 KM腺嘌呤的值（表1）。APRT2 显示显著降低的 k 值猫/KM与APRT1相比，该值（>减少40，000倍）（表1）。虽然检测到由APRT1催化的反向活性，但与APRT1正向活性相比，AMP转化为腺嘌呤的程度很小（在室温下含有25μM APRT1的测定中转化率为2.5%，孵育30分钟-S5图）。这一观察结果支持了这样一种假设，即APRT1的主要细胞作用是从宿主中清除6-氨基嘌呤碱基，并通过嘌呤挽救途径将其掺入核苷酸和核酸中。对于强制性嘌呤营养因子，可以预期对正向反应的更大偏好。

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表 1. APRT1和APRT2的表观动力学参数。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009926.t001

值得注意的是，与APRT1相比，APRT2对APRT生物合成反应的催化可以忽略不计。内源性腺嘌呤存在于人血浆中，浓度约为9 nM [60]，该值比APRT2测定的表观K低近30，000M对于腺嘌呤（表1），这意味着在正常代谢条件下检测到的APRT活性不具有生物学相关性。人血清中的腺嘌呤浓度受到严格调节，因为腺嘌呤浓度较高与许多疾病有关[61-63]。此外，高浓度的腺嘌呤对血流分期和前环期T有毒。布鲁西（IC50?300μM）[40]，证实了我们的发现，即APRT2在T中不是生理相关的APRT。布鲁西。此外，表观K增加了近100倍M与 APRT1 相比，APRT2 的腺嘌呤表明腺嘌呤不是 APRT2 的天然底物（表 1）。

APRT1的动力学机制进一步表征。PRPP 与 的初始速度数据当以双倒数形式绘制的腺嘌呤（S6和S7图）符合相交模式，这表明序贯双底物机制对APRT1有效。将数据拟合到方程（2）可提供表2中所示的动力学参数。实物中，腺嘌呤与腺嘌呤初始速度数据的双倒数图。PRPP还符合相交模式，与PRPP相比，PRPP和腺嘌呤提供了几乎相同的动力学参数。腺嘌呤初始速度数据（S6图）。利什曼原虫多诺瓦尼也是一种单细胞寄生原生动物嘌呤辅助营养物，具有复杂的生命周期，包括昆虫和人类宿主，具有单个细胞质APRT（LdAPRT）。与LdAPRT相比，APRT1呈现相似的KM对于腺嘌呤，但显示出较低的催化效率（k猫/KM）对于两种底物，腺嘌呤减少近30倍，PRPP减少100倍（表2）。催化效率的显着差异似乎令人困惑，但是先前报道的APRT1的表观动力学[46]与在我们的实验条件下确定的真实初始速度常数处于相同的范围内。更重要的是，6-氧代嘌呤磷酸核糖基转移酶HG（X）PRTs，来自T。b. brucei因其表观动力学常数[38]和类似于6-氨基磷酸核糖基转移酶APRT1的催化效率而被表征（表2）。根据我们的经验，T.b. brucei 磷酸核糖基转移酶的效率比密切相关的克氏锥虫同系物低几倍（手稿正在准备中，[64]）。而两者 L.多诺瓦尼和T.克氏菌是细胞内寄生虫，T。布鲁氏菌感染宿主的细胞外液。人们可以推测，它们生命周期的这种差异是否会对催化效率较低的酶的进化产生选择性压力的影响，以反映宿主微环境中可用的游离底物的浓度。例如，人血浆中腺嘌呤的浓度约为9 nM[60]，而其细胞内浓度估计为1μM[65]。同样，细胞外原生动物寄生虫贾第鞭毛虫也含有单一的APRT（GlAPRT），并且与APRT1相比呈现相似的k猫/KMPRPP 和腺嘌呤的值。

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表 2. APRT1和其他表征的寄生原生动物APRT的生物合成反应的初始速度数据。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009926.t002

通过分析死端抑制剂9-脱氮腺嘌呤（表3和图2和S8）来确定APRT1的底物结合和产物释放的顺序，其中9-脱氮杂氮丙烯作为腺嘌呤的竞争性抑制剂，如PRPP表观饱和浓度的初始速度数据的双倒数图所示，固定变化的浓度为9-脱氮杂腺嘌呤， 和可变浓度的腺嘌呤（图2）。在增加9-脱氮腺嘌呤的固定浓度时，截距不改变（1 / V麦克斯） 但斜率 （KM/V麦克斯）被改变，表明竞争性抑制，并提示9-脱氮杂氮腺嘌呤和腺嘌呤与相同的酶形式结合。

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图 2. 在存在死端抑制剂9-脱氮腺嘌呤的情况下初始速度数据的双倒数图。

（A）9-脱氮腺嘌呤是一种竞争性抑制剂在PRPP（1 mM）（B）的固定表观饱和浓度下变化的腺嘌呤（2.5-150μM）9-脱氮腺嘌呤是一种无竞争力的抑制剂。在固定的视在饱和浓度的腺嘌呤（100μM）下变化PRPP（12.5-1000μM）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009926.g002

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表 3. 9-脱氮腺嘌呤对各种腺嘌呤和PRPP的死胡同抑制数据。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009926.t003

在9-脱氮腺嘌呤的固定变化浓度下，腺嘌呤表观饱和浓度（100μM）下初始速度数据的双倒数图与不同的PRPP提供了一种明显缺乏竞争力的模式。在9-脱氮腺嘌呤浓度增加时，截距改变（1 / V麦克斯） 但斜率 （KM/V麦克斯）不受影响，表明PRPP在加入9-脱氮腺嘌呤之前与酶结合。这些结果与APRT1的初始速度数据一致（表1和表2），并揭示了Bi-Bi顺序有序动力学机制，其中磷酸核糖基供体PRPP与游离酶结合，其次是第二个底物腺嘌呤。催化后，PP我是第一个从酶产物复合物中解离的产物，其次是核苷单磷酸AMP（S9图）。这些结果排除了随机机制的可能性，因为在这种情况下，模拟第二底物以结合酶活性位点的死端抑制剂（例如9-脱氮腺嘌呤）将表现为与底物PRPP的混合型抑制剂[66]。此外，I型核糖基转移酶家族的序序机制已被描述并得到很好的保存[67]。

LdAPRT之前已经描述了一种有序的顺序机制[68]。胞质LdAPRT[61-63]对胞质T具有更高的序列保存。布鲁氏[40，46] APRT1 （52%）高于糖体APRT2 （27%） [40，46]。有趣的是，GlAPRT被描述为遵循磷酸核糖基转移酶中的独特反应机制，其中有随机添加底物（PRPP和腺嘌呤），然后催化和产物的有序释放，其中PPi是第一个离开酶产物复合物的产物，其次是AMP. GlAPRT原序列对APRT1具有35%的相同性和对APRT2的29%的一致性。

据报道，APRT1采用二聚体四元结构（PDB代码5VN4），因此我们研究了APRT1：APRT2的异源二聚体是否可以在体外形成并提供能够催化的杂交酶。在含有两种APRT等摩尔量的反应混合物中评估AMP的形成，这可能产生三组二聚体：APRT1均聚体，APRT2均聚体和APRT1：APRT2异源二聚体，以各种比例。AMP的形成从仅含有APRT1的对照反应混合物中减少了2倍（图3）。APRT活性的降低可以用APRT1的1：1稀释来解释，从而表明没有形成催化活性的APRT1：APRT2异源二聚体。当APRT1在反应缓冲液中稀释至对照浓度的一半时观察到的活性支持这一结论，因为如果酶不相互作用并且只有APRT1在反应混合物中具有催化活性，则该酶将是APRT1：APRT2混合物中存在的活性酶的分数。

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图 3. APRT活性通过反应混合物的AMP形成来测量。

混合物由150μM腺嘌呤，1mM PRPP和200 nM APRT1（左），200 nM APRT混合物（100 nM APRT1：100 nM APRT2，中间）和1：1稀释的APRT1在反应缓冲液（100 nM APRT1，右）组成。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009926.g003

最近的一项研究显示，APRT1和APRT2在体内不相互作用，APRT1在体内和体外都显示出同源二聚体性质[46]，与图3所示的结果一致。标记的APRT1和APRT2在血流形式的T中的共表达和共免疫沉淀。brucei显示标记的APRT2只能恢复标记的APRT2，而标记的APRT1与标记的和内源性的APRT1相互作用[46]。这些结果证实了先前描述的APRT2在血流生命阶段的弱表达，主要以前环T表达。布鲁氏菌形成并定位于糖小体，而胞质性APRT1在两个生命阶段均等表达[31，40]。综合这些结果表明，由于沿T的不同表达模式，APRT1和APRT2的相互作用不太可能。布鲁氏菌的生命周期及其不匹配的亚细胞定位。

通过用DMS处理APRT1和APRT2在体外评估APRT1和APRT2的四元结构，DMS是一种化学交联单体内两个赖氨酸残基的试剂，也是在两个或多个相关单体中发现的赖氨酸残基之间的化学交联剂（图4）[51]。通过变性聚丙烯酰胺电泳对交联蛋白质的分析将显示同源二聚体和其他多聚体，表明季铵结构，在显着的蛋白质稀释后仍将观察到。纯化后 APRT1 （17.8–140 μg mL-1）在pH 8.5下用8.7mM DMS处理。我们的结果证实了APRT1在体外形成同源二聚体的发现，正如观察到的二聚体结构所表明的那样，二聚体结构在4倍稀释后保持。为确保APRT2的C端定位糖体信号序列不阻断二聚化事件，使用使用pPICZ-Ntag（APRT2-Ntag）和pPICZ-Ctag（APRT2-Ctag）载体表达的重组酶进行APRT2交联测定（S2图）。APRT2-Ntag和APRT2-Ctag之间没有观察到显着差异，并且两者都显示出较少的二聚体季铵结构的形成，与APRT1相比，在相同的浓度和条件下稀释后无法维持（图4）。尺寸排阻色谱（SEC）显示重组APRT1和APRT2以P表达。游牧在溶液中不形成聚集体，并证实了观察到的APRT1的同源二聚体第四纪结构（S10图）。有趣的是，SEC对APRT2的结果表明二聚四元结构，尽管与交联测定中观察到的相比，两个具有几乎相同洗脱时间的峰的存在可能表明溶液中这种四元结构的稳定性较低（S10图）。

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图 4. 化学交联重组APRT1和APRT2的SDS-PAGE分析。

APRT1 （A） 均质二聚体季铵结构可在交联测定条件下以 35 μg mL ≥的浓度可视化-1，在交联试剂DMS（8.7 mM）存在的情况下，由（+）表示。负控制通道（-）显示APRT1单体。APRT2 用 N 端子 （B） 或 C 端子 （C） 标签表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009926.g004

APRTs属于核苷酸合成和挽救途径的同源酶和调节蛋白的1型核糖基转移酶（1型PRTases）家族。使用ClustalW[69]对APRT1和APRT2原代序列的比对表明，只有22%的氨基酸是保守的（图5）。1型PRTas具有高度保守的结构，但除PRPP结合基序外，序列同一性水平较低[67]。该基序在APRT1（VVLIDDVIATGGT）和APRT2（VLIVDDFIGTGST）中都是守恒的（图5 - 红色下划线和S11图）。使用 APRT2 作为查询序列的 BLASTp 搜索（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）将其分类为类型 1 PRTase，没有其他同源匹配项。缺乏相关的APRT活性表明APRT2可能发挥替代代谢作用。低序列同一性并不排除该家族蛋白质的功能保守性，并且由于APRT2呈现保守的PRPP结合基序，我们使用其他潜在的底物测试了假定的APRT2活性作为1型PRTase。在存在次黄嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、乳清酸或尿嘧啶的情况下，不能检测到磷酸核苷转移，分别排除了可能的HGXPRT（EC 2.4.2.8）、OPRT（EC 2.4.2.10）或UPRT（EC 2.4.2.9）活性（S12图）。在我们的测定条件下，既不能检测到腺苷磷酸化酶（EC 2.4.2.1），5'-核苷酸酶（EC 3.1.3.5）和PRPP合成酶（EC 2.7.6.1）活性（S12和S13图）。

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图 5. T 的对齐方式。b. brucei APRT1 和 APRT2。

保守的残留物以蓝色阴影显示。保守的PRPP结合结构域（一个13个残基长的活动位点环路）以红色下划线显示。APRT2突变的蛋氨酸残基（M至Q）用橙色箭头表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009926.g005

最近的一项出版物表明，RNAi沉默了T中APRT1和APRT2活性。布鲁氏血流阶段细胞未产生主要的生长表型，表明HGXPRT活性足以在正常生长条件下维持细胞生长[46]。当将相同的RNAi细胞系作为血流阶段细胞进行测试时，在含有腺嘌呤作为唯一可用嘌呤的培养基中生长，观察到显着的生长表型表明APRT是唯一可以将腺嘌呤纳入嘌呤挽救途径的酶。同一出版物报道了另一种RNAi细胞系，仅沉默了APRT1活性，其生长表型与在仅含有腺嘌呤的培养基中生长的血流阶段细胞相似，这表明即使培养基含有高达50μM腺嘌呤，APRT2也无法补偿APRT1的损失[46]。

因此，APRT2的作用或功能是什么？关于APRT2的现有文献没有提供关于其催化或代谢作用的数据。除了对糖体的定位和在前周期生命阶段的表达[40，70]外，一项共免疫沉淀研究将APRT2确定为与TbTim17（锥虫中线粒体内膜转座酶复合物的主要成分）相关的蛋白质，并检测到翻译后修饰（PTM），其中APRT2的蛋氨酸残基被完全氧化为蛋氨酸亚砜（MetO）[45].PTMs在锥虫中已有描述[71]，并且是一种在蛋白质水平上可自由逆的控制机制，使寄生虫能够对环境变化做出快速反应，包括与载体（采采蝇）向宿主传播相关的可能突然变化[72]。由于线粒体的活化，原环锥虫从糖酵解到氧化磷酸化的代谢变化[73，74]可能使活性氧（ROS）将Met残基氧化为MetO[75]。已经描述了通过ROS可逆地形成MetO作为酶激活机制[76，77];而介导这种氧化逆转的酶，蛋氨酸亚砜还原酶，推定定定位于T中。布鲁氏基因组（Tb927.8.550）。

利用真核表达，如P。牧灵，提供了许多优点，包括PTMs的发生[78]，包括蛋氨酸残基的氧化，先前已报道过在其他异源蛋白中以P表达。帕斯托里斯[79，80]。我们采用蛋氨酸特异性试剂溴化氰（CNBr）来确定APRT2中是否（任何）蛋氨酸残基以P表达。牧羊犬被氧化成MetO。我们使用了以E表示的APRT2。大肠杆菌（APRT2 Ec）——一种无法进行PTM的表达系统——作为阴性对照。纯化后，APRT2 Ec在还原剂DTT（5mM）的存在下储存，以确保在细胞裂解过程中可能氧化的蛋氨酸残基完全减少。通过CNBr处理蛋白质中蛋氨酸残基的C端的肽裂解是鉴定蛋白质中氧化蛋氨酸残基存在的选择性方法，因为这些残基对这种化学是难治的[81]。APRT2在其初级序列中具有五个蛋氨酸残基。用0.5 M HCl（终浓度）处理重组APRT2，然后加入250mM CNBr。使用SDS-PAGE观察所得蛋白质片段的分析。重组APRT2以P表示。牧羊犬（APRT2-Ntag和APRT2-Ctag）为对照组（APRT2 Ec）提供了相同的模式。从而表明APRT2-Ntag和APRT2-Ctag在其一级序列上存在的五个已知蛋氨酸残基中的任何一个上都没有MetO PTM（图6A）。实际上，所得的蛋白质片段提供了S14 Fig上指示的具有表观分子质量的条带，其中5个蛋氨酸残基都没有被氧化成MetO。这些结果在Native-MS中得到证实，其中蛋白质亚基质量（相当于MetO PTM）上16 Da的变化无法识别（图6B和6C）。重组APRT2-Ntag和APRT2-Ctag的天然MS分别提供了25，860和26，637 Da的测量质量。APRT2-Ntag和APRT2-Ctag的理论同位素质量分别为25，853和26，647 Da。APRT2单体的理论同位素质量没有增加16 Da，这证实了缺乏MetO的形成。这些结果与我们对CNBr处理的分析一致，表明重组APRT2s均不含MetO修饰。有趣的是，APRT2-Ntag还显示出质量为51，739 Da的二聚体，提供了C端糖体信号肽可能参与二聚体形成的证据。使用SEC也检测到二聚寡聚态（S10图）;然而，与DMS交联重组的APRT2-Ntag并没有为稳定的二聚体季铵结构提供证据，因为在测试条件下充分稀释后二聚体多聚体无法维持，表明APRT2-Ntag二聚体可能不稳定（图4）。

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图 6.

CNBr裂解反应（A）和重组APRT2s（B，C）的天然质谱分析的SDS-PAGE分析。（A）当APRT2蛋氨酸残基未被氧化为MetO时，将观察到具有S14图中所示预期尺寸的分子质量条带。APRT2 以 E 表示。大肠杆菌和储存在5mM DTT（APRT2 Ec）的存在下作为对照。由CNBr分裂产生的APRT2-Ntag，APRT2-Ctag和APRT2 Ec的条带显示在（+）泳道中。阴性对照（-）和未经处理的天然蛋白（o）显示对应于单体质量的条带。重组APRT2-Ntag（B）和APRT2-Ctag（C）的天然MS分别提供了25，860和26，637 Da的测量质量。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009926.g006

由于重组APRT2中明显缺乏MetO形成，我们将蛋氨酸引入谷氨酰胺（M至Q）突变以模仿这种PTM。此前已发现蛋氨酸残基突变为谷氨酰胺可模仿MetO的功能效应，因为谷氨酰胺和MetO在其侧链中的相同位置呈氧原子，并且表现出大致相同的疏水指数值[75，82]。APRT1的晶体学结构显示两个蛋氨酸残基位于PRPP结合位点附近，一个蛋氨酸残基分别位于亚基界面附近，分别为M129，M155和M89，根据APRT1原序列编号（S15图）。位于APRT1（M73，M128和M156，根据APRT2的主要序列- 图5，橙色箭头）的相应位置的APRT2蛋氨酸残基突变为谷氨酰胺，并分析重组突变蛋白的APRT活性。在无机焦磷酸酶（EC 3.6.1.1）存在下监测正向反应反应，以取代反应平衡以形成AMP：。APRT1用作反应对照，并且在两种对照测定条件（30分钟和过夜孵育）中观察到腺嘌呤完全转化为AMP。三种APRT2 M至Q突变体（M73Q，M128Q和M156Q）即使在高浓度酶（25μM）存在下过夜进行测定，其APRT活性也可忽略不计（图7和S16）。这些数据表明，MetO的存在不会增加或引发APRT2的催化APRT活性，并且观察到的APRT活性的缺失确实反映了Tb927.7.1790作为推定的APRT酶的错误注释。

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图 7. APRT2 M至Q突变体活性的HPLC色谱图。

APRT2 M至Q突变体的活性测定的APRT活性测定，孵育30分钟（上图）或过夜（下图）。正向反应的对照显示对应于腺嘌呤的洗脱峰（保留时间（Rt） = 4.2 分钟，黑线），反向反应显示洗脱峰对应于 AMP（Rt= 3.6 分钟，蓝线）。6.2分钟时洗脱的峰存在于所有APRT2测定组分中，并且在当前测定条件下无法令人满意地分离和鉴定。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009926.g007

结论

作为嘌呤生长激素，布鲁氏锥虫依靠嘌呤磷酸核糖基转移酶从宿主中挽救嘌呤以合成嘌呤单磷酸盐。APRT活性不仅在腺嘌呤和腺苷代谢中很重要，而且在腺嘌呤前体药物的活化中的作用也很重要[40，42，43]。所有锥虫串联存在两个假定的aprt基因;然而，在另一个寄生原生动物上没有观察到这种特征。APRT活性在恶性疟原虫[83]和刚地弓形虫[84]中未被注释或不存在。两者 L.多诺瓦尼[85]和G。lamblia [86]存在单个aprt基因，LdAPRT和GlAPRT都与T共享更高的序列保守性。布鲁西布鲁西APRT1（52%和35%）比APRT2（27%和29%）。

在系统发育分析中，锥虫APRT2基因簇与APRT1不同，与OPRT的亲缘关系比其他1型PRTases更为密切[40]。然而，我们无法使用乳清酸盐作为磷酸核糖基转移的底物来显示酶活性，也无法显示其他已知是1型PRTases底物的嘌呤碱（S12和S13 Figs）。当APRT2被测试为可能的腺苷磷酸化酶，5'-核苷酸酶或PRPP合成酶（S12和S13无花果）时，我们无法检测到任何酶活性。研究了PTM作为APRT活性调节剂的可能性，并且APRT2被证明对MetO修饰无反应，这表明M-Q突变体（APRT2 M73Q，APRT2 M128Q和APRT2 M156Q）缺乏增加的活性（图7和S16）。1型PRTases家族的一些细菌成员似乎没有催化功能，而是充当参与嘌呤和嘧啶合成的基因的表达调节因子[67]。虽然目前尚不能排除APRT2的调控作用，但不太可能，因为锥虫中的基因表达调控主要通过转录后控制来实现[72]，并且RNA聚合酶II的转录启动不受单个编码基因的控制[87]。在锥虫[88-90]中已经描述了催化非活性酶（称为酶原酶）在激活其动力学上有效的对应物中的作用，其中异质低聚物复合物的形成导致有效酶的激活或增强活性。APRT1和APRT2的差异表达模式[31，40]，它们在单独的亚细胞区室中的定位[40，46]，共表达和共免疫沉淀的结果表明体内不存在APRT1和APRT2相互作用[46]，以及体外 这里介绍的测定似乎表明APRT2不太可能作为APRT1的酶原。酿酒酵母中描述了6-氨基磷酸磷酸肌基转移酶活性丧失的基因复制示例，这是基于序列鉴定的第二种APRT，APRT2，但后来根据体内补体测定显示为催化无活性[91]。

这里和最近发表的一项研究[46]中对APRT1活性的表征，其在蛋白质组学中的检测[29，31]，以及与其他原生动物APRT的更高序列同一性，与APRT2缺乏相关的催化APRT活性相关，表明APRT1是T中唯一的功能性APRT酶。b. 布鲁斯。虽然APRT1位于细胞质基质中[40，46]，而嘌呤代谢的其他几种酶是糖体[28，31];嘌呤挽救酶的亚细胞定位在原生动物中并不保守，该途径也不限于单个亚细胞区室[40，92]。我们的研究结果表明，APRT1对前向反应具有更大的偏好 - 根据寄生虫作为嘌呤清除剂的性质。布氏嘌呤转运蛋白对游离嘌呤碱基表现出极大的亲和力[36，37]，并且很好地描述了高细胞内腺嘌呤浓度的毒性[40]，突出了磷酸核糖基转移酶的重要性，其极大地有利于将嘌呤碱基掺入核苷单磷酸盐中的正向反应。我们的研究结果提供了对参与腺嘌呤挽救的酶的更深入的了解，加强了在开发具有高选择性和亲和力的药物或促药物时将APRT用于治疗目的的能力。APRT2（如果有的话）在嘌呤挽救途径中的作用，或作为1型PRTase的作用，需要进一步评估，同时牢记基因复制和活性丧失的可能事件。

支持信息

优化了APRT1和APRT2的序列，显示了用于P异源表达的ORFs。牧羊犬，N 和 C 末端悬垂用于克隆成 pPICZ 载体（下划线）。

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S1 附录。优化的 APRT1 和 APRT2 序列，显示用于异源表达P. 帕斯托里斯，具有用于克隆的N和C端悬垂pPICZ 向量（下划线）。>APRT1_opt_Ntagtgtacttccaaagcggtaccatgagtcttgttgaggttttgcctaactattttacattgtctaaggattcaccattgaaagaagttcgagaaagtctataagtggtactctccagctttttctcctcatgatgttccaagattcgctgaagttggtaacattactgaaaatcctgaggttatgagaggtatcagagatttctttgttgatagatacaagaacttgcaacaaccaatcactcacattttgggttttgattctagaggtttcttttgttgggtcctatgattgctgttgaattgaatttccattcgttttgattagaaaggctaacaagattgctggtgttattattaagtctgagccttacactaaagaatatgctgctgagtctgaagagtgtatgactgttagattcggttttttcgataagaactctagagttgttttgatcgatgatgttattgctactggtggtggtactatgttggctggtgttcaattggttgatgcttgtggtgctactttggttgaggttgctggtattttgggtttgactttcttgaaaggtactcaacctgctcatactttcgctggtggtagatactctaacgttccattcgttactttggttgatgaaactgttttgtctgatgaattgtggtgacccattgcaccacaaaggaagtagaattattagttgcgctgaagccaagaagttgatttgagtttgtagccttagaca>APRT2_opt_Ntagtgtacttccaaagcggtaccatgagtcagtatgatgctatccttaccgaaagacacccaccaccacttcacccttgccgacacccacccacttgctaaagaacttcacgctaacatttttggagagtctgatttgactcatgctaattgtgctcacgtttacgatatttcttctttgactgactgaaaagccagctttgtttagaaaagttattgagttcttgaagtgtagatacgaaactatgggagatactggtcctactcatattattggtgttgagtctagaggttatattattggtgctccattggctgttgctttgggtattccttttgttactgctagagttactaagagatttccatcttctttcgttcctgaaggagatg

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S1 附录。 优化了APRT1和APRT2的序列，显示了用于P异源表达的ORFs。牧羊犬，N 和 C 末端悬垂用于克隆成 pPICZ 载体（下划线）。

10.1371/journal.pntd.0009926.s001

（英文）

S2 附录。 用于将质粒pET-28a（+）：：aprt1-Ntag，pET-28a（+）：：aprt1-Ctag，pET-28a（+）：：aprt2-Ntag和pET-28a（+）：：aprt2-Ntag和pET-28a（+）：aprt2-Ctag的引物克隆到pPICZ载体之前。

10.1371/journal.pntd.0009926.s002-厦门畜牧期刊杂志论文发表

（英文）

S1 图

APRT1-Ntag（左）和APRT1-Ctag（右）的矢量图。P. pastoris表达载体pPICZ图谱，显示aprt1基因插入位置和mCherry标签的位置。

10.1371/journal.pntd.0009926.s003

（英文）

S2 图

APRT2-Ntag（左）和APRT2-Ctag（右）的矢量图。P. pastoris表达载体pPICZ图谱，显示aprt2基因插入位置和mCherry标签的位置。

10.1371/journal.pntd.0009926.s004

（英文）

S3 图 P重组APRT1和APRT2的小规模表达筛查。牧师，与mCherry共同表达。

根据mCherry表达水平（洋红色）选择表达最高的克隆。

10.1371/journal.pntd.0009926.s005

（英文）

S4 图 APRT1和APRT2在PRPP表观饱和浓度（1mM）下的初始速度数据。

与 APRT1 相比，APRT2 的 Y 轴刻度明显更小

10.1371/journal.pntd.0009926.s006

（英文）

S5 图 APRT1逆转活性的HPLC色谱图。

在腺嘌呤脱氨酶（EC 3.5.4.2）存在的情况下监测APRT反向反应，以有利于腺嘌呤合成： 。正向反应对照显示对应于腺嘌呤的洗脱峰（Rt= 4.2 分钟，黑线），反向反应对照显示与 AMP 对应的洗脱峰（Rt= 3.6 分钟，蓝线）。虽然检测到反向APRT活性，但与正向反应相比，在相似的测定条件下，AMP（插入物）转化为腺嘌呤的程度很小（表1）。

10.1371/journal.pntd.0009926.s007

（英文）

S6 图 APRT1正向反应的双底物动力学.

(A）APRT1在固定变化的PRPP浓度下的初始速度，改变底物腺嘌呤。（B）APRT1在固定变化的腺嘌呤浓度下的初始速度，改变底物PRPP。数据插页显示 A 和 B 的双倒数图。

10.1371/journal.pntd.0009926.s008

（英文）

S7 图 来自初始速度数据的二次倒易图，具有固定和变化的PRPP浓度，改变底物腺嘌呤。

明显的 Kia该值是使用初始速度双倒易斜率（右）的次级重绘获得的，如图S6图所示，其中斜率 = KiaKb/V麦克斯.表观 Kia用作使用 Eq （2） 对初始速度数据进行全局拟合的起始参数，如方法中所述。

10.1371/journal.pntd.0009926.s009

（英文）

S8 图

腺嘌呤（左）和9-脱氮杂氮腺嘌呤（右）的结构。

10.1371/journal.pntd.0009926.s010

（英文）

S9 图 从初始速度和死端抑制研究获得的APRT1的顺序Bi Bi动力学机制。

10.1371/journal.pntd.0009926.s011

（英文）

S10 图 APRT1和APRT2的大小排阻色谱。

APRT1（蓝色）和APRT2（红色）的洗脱体积表明两种APRT都形成同源二聚体，洗脱馏分的SDS-PAGE分析说明了样品的纯度。右上图显示了用于确定APRT1（红色）和APRT2（绿色）低聚态的校准曲线（蓝色）。

10.1371/journal.pntd.0009926.s012

（英文）

S11 图 APRT1、APRT2 和先前表征的 APRT 的序列比对。

所有APRT中保守的氨基酸残基以蓝色突出显示 - 反映了I型核糖基转移酶家族酶的较低序列守恒。β磷酸结合序列用黑色下划线;催化环序列以绿色下划线，PRPP结合域以红色下划线。长APRT的C端延伸特征以灰色下划线显示。TbbAPRT2上的C端糖体信号肽以橙色框住。保守的残留精氨酸82（TbbAPRT1编号 - 黑点）参与PRPP的β磷酸基团的结合。精氨酸102（灰点）组成相邻亚基的活性位点 - 突出了二聚体四元结构对催化活性的重要性。酪氨酸121（红点）位于环的尖端，在两个底物结合后关闭在活性位点上，这对于APRT采用其催化构象至关重要。有关被确定为APRT底物结合和催化所必需的氨基酸残基的更多详细信息，请参阅[65，93，94]。

10.1371/journal.pntd.0009926.s013

（英文）

S12 图 APRT2 1型PRTase活性测试使用替代的含N亲核试剂 - 第1部分。

APRT2作为潜在的HGXPRT，EC 2.4.2.8（A，B，C）的活性测试;OPRT， EC 2.4.2.10 （D）， UPRT， EC 2.4.2.9 （E） 和 PRPP 合成酶， EC 2.7.6.1 （F）。在方法中描述的测定条件下，无法检测到酶活性。

10.1371/journal.pntd.0009926.s014

（英文）

S13 图 APRT2 1型PRTase活性测试使用替代的含N亲核试剂 - 第2部分。

测试了APRT2作为潜在腺苷磷酸化酶EC 2.4.2.1（A）和5'-核苷酸酶EC 3.1.3.5（B）的活性。在方法中描述的测定条件下，无法检测到酶活性。

10.1371/journal.pntd.0009926.s015

（英文）

S14 图 预期的APRT2片段，没有用溴氰处理的MetO修饰。

溴化氰选择性地在还原的蛋氨酸残基的C端切割肽。APRT2含有5个Met残基，当所有Met残留物减少时，会产生6个片段。APRT2-Ntag（A）和APRT2-Ctag（B）预期的所有6个片段的分子量都描绘在每个片段上。

10.1371/journal.pntd.0009926.s016

（英文）

S15 图 甲硫氨酸残基在APRT1上的位置（PDB代码5VN4）。

APRT1的晶体结构显示2个蛋氨酸残基位于PRPP结合位点附近（M129和M155，右上方）和一个蛋氨酸残基位于亚基界面附近（M85，右下侧）。APRT1亚基以绿色和蓝色丝带着色。配体（腺嘌呤和核糖-5-磷酸）以及蛋氨酸侧链表示为棒状。

10.1371/journal.pntd.0009926.s017-厦门畜牧期刊杂志论文发表

（英文）

S16 图 APRT2 M至Q突变体活性的HPLC色谱图。

在腺嘌呤脱氨酶（EC 3.5.4.2）存在的情况下监测APRT反向反应，以有利于腺嘌呤合成： 。三个 APRT2 M 至 Q 突变体均未显示 APRT 反向活性，无论是在 30 分钟（上图）还是过夜（下图）孵育中，如不变的 AMP 峰和没有腺嘌呤形成所示。正向反应对照显示对应于腺嘌呤的洗脱峰（黑线），反向反应对照显示对应于AMP（蓝线）的洗脱峰。6.2分钟时洗脱的峰存在于所有APRT2测定级分中（图7），并且在当前测定条件下无法令人满意地分离和鉴定。

10.1371/journal.pntd.0009926.s018

（英文）

确认

P.用于表达APRT1和APRT2的牧羊犬菌株（smPP）和pPICZ载体是Arthur Laganowsky博士（德克萨斯A&M大学化学系）的慷慨礼物。Samantha Schrecke（德克萨斯A&M大学化学系）协助PRAT1和APRT2的表达条件。牧师。Zahra Moghadamchargari（德克萨斯A&M大学化学系）收集了重组APRT2-Ntag和APRT2-Ctag的天然质谱数据。

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