介导的突触前神经尿素的轴突递送可稳定树突棘和突触后成分-厦门畜牧期刊杂志论文发表
德文·奥利弗，尚卡尔?拉马钱德兰，艾莉森?菲尔布鲁克，克里斯托弗·兰伯特，阮健健，大卫·霍尔，迈克尔·弗朗西斯
出版日期： 2022年01月28日
抽象
神经回路的功能特性由其配对神经元之间的突触连接模式定义，但稳定回路连接的机制知之甚少。我们在新表征的C树突棘上的突触上系统地检查了这个问题。秀丽隐杆线虫GABA能运动神经元。我们表明突触前粘附蛋白neurexin/ NRX-1是稳定突触后结构所必需的。我们发现，早期突触后发育事件在没有严格要求突触活动的情况下进行，并且不会因neurexin / nrx-1的缺失而中断。然而，在没有突触前NRX-1的情况下，树突棘和受体簇在成年期前变得不稳定和塌陷。我们证明NRX-1递送到突触前末端依赖于驱动蛋白-3 / UNC-104，并表明成熟动物的突触后维持需要持续的UNC-104功能。通过定义体内突触形成和维护事件的动力学和时间顺序，我们描述了一种通过基于神经质毒素的粘附来稳定成熟电路连接的机制。
作者简介
神经系统由称为神经元的相互连接的细胞网络组成。在这些网络中，单个神经元与合作神经元建立连接或突触。这些网络中的关键连接必须在动物的整个生命周期中稳定和保存，以使神经系统正常工作。突触连接和稳定性的改变与许多神经发育和神经退行性疾病有关。因此，全面了解发育中的突触组装的步骤以及突触成熟和维护中涉及的机制至关重要。使用显微镜和实时成像方法对遗传模型生物中新表征的多刺突触，线虫Caenorhabdtis elegans，我们描述了构建发育突触的事件序列。此外，我们表明细胞粘附分子neurexin是将这些突触稳定成年期所必需的。在没有神经质的情况下，神经元连接开始形成，但随后消失。需要一种称为驱动蛋白-3的特定运动蛋白将神经尿素递送到突触，以稳定神经元之间的特定连接。更好地了解突触形成中的事件顺序以及神经质毒素如何传递到发育中的突触以稳定连接可能有助于提高我们对由这些过程中断引起的疾病和疾病的理解。
数字
Fig 3Fig 4Fig 5Fig 1Fig 2Table 1Fig 3Fig 4Fig 5Fig 1Fig 2Table 1
引文： Oliver D， Ramachandran S， Philbrook A， Lambert CM， Nguyen KCQ， Hall DH， et al. （2022） Kinesin-3 介导的突触前神经尿素的轴突递送稳定树突棘和突触后成分。PLoS Genet 18（1）：e1010016。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016
编辑 器： 余凤薇，新加坡国立大学，新加坡
收到： 九月 2， 2021;接受： 一月 3， 2022;发表： 一月 28， 2022
版权所有： ? 2022 奥利弗等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据均在稿件及其支持信息文件中。
资金： 这项研究得到了NIH NINDS RO1NS064263（MF），R21NS101649（MF），NIH OD 01943（DHH）和F31NS103365（DO）的支持。本研究中使用的飞利浦CM10 TEM电子显微镜是通过阿尔伯特爱因斯坦医学院的NIH共享仪器资助（1S10OD016214-01A1）获得的。
相互竞争的利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。
介绍
神经回路执行特定功能的能力源于其伴侣神经元之间的突触连接模式。这些连接的组织是电路特异性的，并通过一个复杂的过程建立，该过程涉及适当的合作神经元上专门的突触前和突触后结构的协调组装和成熟，以及它们在成熟神经系统中的维持。我们现在对突触结构有了大致的了解。活性区（AZ）蛋白和充满神经递质的突触囊泡位于突触前膜附近，用于快速释放，而神经递质受体则以高密度聚集在这些位点上，以确保突触通讯的保真度。遗传学研究已经确定了许多改变电路连接或影响突触整体结构组织的突变[1-3]。然而，对于许多受这些突变影响的突触相关蛋白，我们还没有对它们在建立突触连接中的作用的机制理解，或者它们的破坏如何导致突触稳定性的改变。增强对突触组装，成熟和维护中涉及的事件序列及其在体内的相对时间的了解对于解决这些问题至关重要。
之前的几项研究已经检查了突触发生过程中的分子事件。C. 的体内研究。秀丽隐杆线虫和果蝇主要集中在突触前活动区的形成上。总的来说，这些研究为有源区组装顺序发生的模型提供了令人信服的证据。虽然突触类型之间存在一些差异，但该过程的早期阶段通常由高度保守的突触支架SYD-2 / Liprin-α和SYD-1 / Rho GTP酶组织，然后招募额外的关键保守AZ蛋白，如ELKS-1 / Bruchpilot，Piccolo家族成员和UNC-10 / RIM用于后续组装阶段，包括Ca的聚类2+通道和突触囊泡的募集[2，4-7]。值得注意的是，新生的AZ可以相当迅速地组装（在几分钟内），但随后通常会经历更长的成熟期，可持续数小时[5，8-10]。突触后发育与突触前组装的关系仍然不太清楚。培养小鼠海马神经元的实时影像学研究表明，突触前成分的组装先于突触后受体和支架的募集[11]。最近，来自大鼠海马体的有机质切片培养物的2光子成像显示，新刺在生长的同时积累谷氨酸受体，并且能够在生长后数小时内参与传播[12]。相对较少的体内研究调查了突触前和突触后协调的发展，并且仍然存在关于分子机制的重大问题，这些机制直接连接突触前和突触后特化以促进其成熟和稳定。
进化保守的突触粘附蛋白，如神经氨酸，是突触发生过程中协调突触前和突触后事件的主要候选者。神经质素改变与认知疾病（包括精神分裂症和自闭症谱系障碍）相关，这一事实强调了它们的重要性[13，14]。神经尿素通常在青春期前是局部的，通过细胞外层粘连蛋白和 EGF 样重复序列与突触后结合伴侣（如 dystroglycan、LRRTMs、神经木质素和小脑蛋白）相关联，以建立跨突触连接。神经尿素介导的跨突触信号传导与突触发育和功能的关键方面有关。例如，苍蝇神经肌肉接头处突触前神经尿素的缺失会增加突触前密度的长度，并且还会改变成熟肌谷氨酸受体簇的大小和分子组成[15，16]。神经系统中神经尿素的广泛脑分布和许多神经系统中的神经尿毒素同种型变异使突触处的神经尿毒素具有复杂的细胞型特异性功能[17，18]。例如，小鼠神经尿素的条件缺失揭示了皮质抑制性中间神经元形成的突触和小脑攀爬纤维在浦肯野神经元上形成的突触之间显着不同的功能[19]。重要的是，将神经尿素贩运和递送到突触的分子机制仍未完全确定。因此，能够进行细胞类型特异性分析的遗传工具对于揭示突触粘附蛋白的精确功能作用及其在单个神经回路背景下的调节机制至关重要。
我们之前发现了来自C树突的手指状突起。秀丽隐杆线虫DD GABA能运动神经元（图1A）[20]。我们的实验室和其他人对这些结构的表征指出，它们从突触前胆碱能运动神经元接收突触输入，并起到与哺乳动物大脑中树突棘相似的作用[21-23]。删除 nrx-1，唯一的 C。秀丽隐杆线虫是神经尿素的直系药物，会破坏这些树突棘，并损害胆碱能受体簇在GABA能树突上突触后位点的正确定位[20]。在这里，我们定义了脊柱相关突触突触突触前与突触后发育的顺序和时间，并阐明了神经尿素在体内这些过程的协调中的作用。我们发现，突触前蛋白和突触后受体的簇在脊柱生长之前都清晰可见。在没有神经尿素的情况下，未成熟的棘和受体簇最初形成，但随后消失，表明神经毒素是突触稳定和成熟而不是突触发生所必需的。这些维护和成熟过程由 NRX-1 的驱动素-3/UNC-104 电机依赖性传输到突触前末端提供支持。总之，我们的研究结果表明，将神经质毒素递送到突触形成部位对于稳定成熟的突触后结构至关重要。
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图 1. 秀丽隐杆线虫GABA能DD神经元树突棘与脊椎动物的树突棘具有共同的特征。
（A）具有代表性的荧光图像和具有腹侧突出树突棘的单个L4期GABA能DD（DD2）运动神经元的腹侧神经索/树突的卡通表示。CB，细胞体。（B）来自动物共同表达Pflp-13：：mCherry（标记树突，红色）和Pflp-13：：GFP：：UtrCH（标记F-肌动蛋白，绿色）的DD树突棘的代表性图像。F-肌动蛋白在DD树突棘中高度富集。（C）F-肌动蛋白/GFP：：UtrCH荧光在树突轴中的散射图与树突棘的比较，归一化为ROI内的总荧光。条形表示学生的 t 检验±平均值，***p<0.001，n = 21 只动物。（D）DD神经元中微管蛋白（Pflp-13：：GFP：：TBA-1）（绿色）和肌动蛋白（Pflp-13：：mCherry：：UtrCH）（红色）的荧光图像。树突棘富含F-肌动蛋白，而微管蛋白占据主要的树突。（E）树突干与树突棘中肌动蛋白/微管蛋白的荧光比的定量。学生的 t 检验，****p<0.0001，n = 来自 6 只动物的 31 根刺。（F）在刺激突触前胆碱能运动神经元（Pacr-2：：Chrimson）期间，从表达myrGCaMP6f（Pflp-13：：myrGCaMP6f：SL2：：mCherry）的野生型GABA能DD运动神经元树突中记录的钙瞬变。顶部的代表性图像显示了由mCherry荧光（倒置LUT）识别的树突棘。具有代表性的最大强度投影热图，显示刺激前（刺激前，中间图）和刺激期间（ON，底部图）的钙通量。通过从记录的前4秒（刺激前）和5 s刺激期（G中的红色阴影条）开始的myrGCaMP6f荧光的最大强度投影产生热图。编号对应于图1G中的代表性痕迹（G）野生型动物（野生型1，2和3，图1F），在没有视网膜（-视网膜）和unc-17（e113）突变体的情况下生长的动物中指示的树突棘的代表性诱发反应。钙反应在10 Hz下连续记录15秒。记录刺激前钙通量5 s，然后刺激（625nm，~30 mW/cm2）的胆碱能运动神经元持续5秒。所有数据都归一化为刺激前（ΔF/F0).红色阴影条表示刺激的持续时间。粉红色迹线表示高斯拟合响应 （ΔF/F0）在刺激期间。（H） 显示峰值 ΔF/F 的散点图0野生型或unc-17（e113）突变体刺激期间的反应。柱，均值±SEM.统计分析，学生t检验，****p<0.0001。n ≥10只动物。
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结果
我们最初使用共聚焦成像和电子显微镜对脊柱的3D渲染来探索成熟脊柱的形态特征。我们使用这两种方法观察到相当大的形态多样性，如先前的工作（图1A，S1A和S2）[21，23，24]所述。为了探索神经元细胞骨架如何有助于脊柱形态学特征，我们分别使用GFP：：UtrCH（GFP融合到Utrophin钙蛋白同源结构域）[25]和GFP：：TBA-1（GFP标记的α-微管蛋白）[26]的DD神经元特异性表达检查了GABA能DD树突中F-肌动蛋白和微管蛋白的定位。我们发现这两个标记物在很大程度上占据了不同的区域，其中F-肌动蛋白高度定位到树突棘（图1B和1C），而微管蛋白占据树突轴（图1D和1E），在脊柱基部附近具有更多可变的定位（S1B图）。
我们之前显示刺激胆碱能运动神经元引发Ca2+GABA能运动神经元的反应[20]。在这里，我们询问突触前胆碱能神经元的刺激是否足以在GABA能DD树突中引发钙反应。我们使用DD GABA能神经元中膜相关GCaMP6f钙传感器和胆碱能神经元中红移通道视紫红质（Chrimson）的组合表达，对脊柱中诱发的反应进行体内钙成像[20]。在基线记录5秒（488nm，100 ms暴露）后，我们测量了钙对突触前去极化的反应（5 s，625 nm，30 mW / cm2) （图1F-1H和S3）我们注意到在刺激窗口期间荧光显着增加。这些仅在视网膜存在的情况下发生，并且通常同时出现在多个棘刺上，在刺激后5秒内恢复到基线。重要的是，胆碱能囊泡转运蛋白/ VAChT unc-17的突变使诱发的钙反应降低了81%，表明Ca2+我们在树突中观察到的反应在很大程度上依赖于突触前乙酰胆碱的释放（图1G和1H）。我们的发现与最近的另一项研究[23]一致，表明DD GABA能神经元上的棘是突触输入的主要位点。
线粒体和其他细胞器通常位于突触后特化附近，以维持突触功能[27，28]。我们使用标记高尔基体（AMAN-2：：GFP）[29]，线粒体（Pre-Su9：：GFP）[30]和内质网（RFP：：TRAM-1）[29，31]的荧光报告程序检查了DD树突内细胞器的分布。我们发现高尔基体仅在DD细胞体中被标记（S1C图）。相反，线粒体和粗糙的ER标记存在于脊柱附近的主树突干中（S1D–S1G图），可能提示参与树突信号传导，尽管我们不能完全排除过度表达的潜在贡献[32，33]。线粒体在电子显微镜下脊柱附近的树突中也很明显（S2B-S2D图）。
DD GABA能刺突触的发展
接下来，我们研究了在脊柱上形成突触期间发育事件的相对时间。秀丽隐杆线虫在成虫前经历了四个幼虫发育阶段（L1-L4）。DD神经元经历一个表征良好的突触重塑程序，使得在从L1到L2阶段的过渡期间建立了成熟的回路组织[34，35]。胚胎后出生的胆碱能神经元和DD GABA能神经元的腹侧树突之间新突触连接的形成为研究神经元 - 神经元突触的从头形成提供了一个窗口。我们专注于了解脊柱形成的时间过程相对于突触发生中的2个关键事件：1）突触前释放位点的形成，以及2）突触后受体和F-肌动蛋白的聚集。
新生腹侧胆碱能运动神经元的出现在孵化后约16小时开始前向后进展，与该时间段内胆碱能神经元的出生和整合一致（S4图）[36]。我们分析了DD突触重塑之前（孵化后12小时），出雏后（出雏后16，18，20小时）和之后（出雏后24，32小时，L4级/ 42-50小时）的时间点的突触前和突触后标记物的分布（图2，S4和S5）。我们首先通过分析短笛样活性区蛋白CLA-1（GFP：：CLA-1e）[37]和突触囊泡相关蛋白突触相关蛋白Synaptobrevin/SNB-1（SNB-1：：GFP）（图2A，2D-2E和S5）的聚类来评估活性区的形成和突触前特化。总体而言，我们发现CLA-1在早期时间点和整个发育过程中都比SNB-1更离散地局限于推定的突触，这与它对活跃区域的特定定位一致。在重塑之前（孵化后约12小时），我们没有观察到与DD过程相邻的突触前CLA-1或SNB-1的显着定位。在孵化后不久（孵化后16小时），我们注意到在突触前胆碱能过程中最初出现SNB-1和CLA-1相关荧光。在接下来的4小时（孵化后20小时）中，单个CLA-1簇更清晰地可区分，表明CLA-1与发育中的活性区结构（图2A，2D，2L和S5A）相关联。突触囊泡荧光最初在孵化后16小时扩散，并且在与CLA-1相似的时间过程中更清楚地组织成离散的点（图2A，2E，2L和S5B）。直到孵化后24-32小时，在初始活性区形成和突触囊泡募集（图2A，2C-2E和S5A和S5B）之后，我们才观察到DD树突棘的出现。棘刺在L4阶段继续成熟，长度和数量都增加（S4D-S4F图）。
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图 2. 突触和脊柱发育过程中分子事件的时间顺序。
（A）在孵化后12、16、20、24和32小时以及L4阶段（孵化后~42-50小时）GABA能树突的荧光图像。动物表达GABA能树突标记（Pflp-13：：mCherry），具有突触前活性区（Punc-17β：：GFPnovo2：：CLA-1e）（顶部）或突触囊泡标记（Pacr-5：：SNB-1：：GFP）（底部）。图像为伪彩色，以指示棘（洋红色）和突触前CLA-1或囊泡簇（青色）。（B）孵化后12、16、20、24和32小时以及L4动物（孵化后~42-50小时）GABA能树突的荧光图像。动物表达GABA能树突标记（Pflp-13：：mCherry），具有突触后AChR（Punc-47：：ACR-12：：GFP，顶部）或突触后肌动蛋白（Pflp-13：：GFP：：UtrCH，底部）标记。图像为伪彩色，以指示棘（洋红色）和突触后AChR或F-肌动蛋白（青色）。白色星号（*）表示图2C中使用的图像（C）在孵化后20小时和L4阶段（舱口后约42-50小时）的GABA能树突的荧光图像（倒置LUT）。如图所示。动物表达GABA能树突标记（Pflp-13：：mCherry）。红色虚线框表示图2B中使用的区域（星号）。（D-G）通过显影定量相对于活性区蛋白/ CLA-1（D），突触囊泡/ SNB-1（E），AChR / ACR-12（F）和F-肌动蛋白/ UtrCH（G）（黑色）簇的脊柱数（紫色）。这些标志物中的每一个的簇在脊柱生长之前都清晰可见。蓝色阴影表示 DD 重塑的大致时间。对于这个数字和随后的数字，编号表示在每个时间点对每种基因型的动物进行量化。（H） 在孵化后 24 小时，DD1 AChR/ACR-12 （Pflp-13：：：ACR-12：：GFP，洋红色）和 F-肌动蛋白簇 （Pflp-13：：：mCherry：：UtrCH，青色）的荧光共聚焦图像表示平均±。虚线矩形表示2I中显示的高放大倍率图像（I）图2H中24小时后DD1枝晶的扩展视图（J）L4阶段DD1 AChR/ACR-12（Pflp-13：：ACR-12：：GFP）和F-肌动蛋白簇（Pflp-13：：：mCherry：：UtrCH，青色）的荧光共聚焦图像。虚线矩形表示以2K显示的高放大倍率图像。（K）图2J中24小时孵化后DD1树突的扩展视图。在早期发育中，突触前囊泡（SNB-1）和活性区蛋白（CLA-1）沿着突触前末端定位于突触前末端，而突触后F-肌动蛋白和突触后受体沿着突触后过程聚集。在它们形成之后，树突棘开始延伸。棘刺在整个发育过程中继续伸长，并进入成熟的回路（L4）。
-厦门畜牧期刊杂志论文发表https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.g002
接下来，我们检查了DD树突中突触后乙酰胆碱受体的聚类（ACR-12：：GFP）。在重塑之前（孵化后12小时），我们没有观察到腹侧DD过程中胆碱能受体的可检测水平。令人惊讶的是，我们注意到在孵化后16小时，在树突轴中隐约可见未成熟的受体簇，远在树突棘出现之前（图2B，2F，2L和S5C）。这些受体簇的数量增加，并向生长棘的尖端重新分布32小时（图2B，2F，2L和S5C）。我们发现使用DD神经元特异性标记LEV-10跨膜辅助蛋白[38]发现了类似的发展趋势，先前显示其集中在棘刺中[39]（S6A和S6B图）。到L4阶段，受体和LEV-10簇在成熟棘的尖端清晰可见。我们的分析表明，突触后（AChR和LEV-10簇）结构发育的初始阶段发生在脊柱生长之前，这引发了关于如何调节这些初始过程的问题。
为了开始解决这个问题，我们分析了突触形成过程中DD神经元树突中F-肌动蛋白的分布（图2B，2G-2L和S5D）。我们注意到，在突触重塑完成之前（孵化后12小时），突触前CLA-1和突触囊泡积累之前以及突触后受体聚集之前，腹侧DD过程中F-肌动蛋白簇明显。树突状F-肌动蛋白基结构变得更加丰富，与突触前CLA-1和突触后受体簇数量的增加相吻合。为了实时研究这一过程，我们使用实时成像来检查发育中的DD树突中突触后F-肌动蛋白（GFP：：UtrCH）的动力学。我们发现，与电路已经完成成熟的L4阶段相比，F-肌动蛋白在早期发育阶段（孵化后16-20小时）具有高度动态性（S6C-S6H图和S1和S2视频）。在幼小动物中，GFP：：UtrCH簇经常从细胞体穿梭到主要的树突状过程，可能表明F-肌动蛋白重新分配到突触后组装的部位。到孵化后24小时，我们观察到F-肌动蛋白与树突轴中新形成的AChR簇明显共定位。到L4阶段，AChR簇稳定地隔离在脊柱的尖端，而F-肌动蛋白占据脊柱头部和颈部（图2H-2K）。
树突状脊柱的形成不需要强烈的突触活动
我们的上述分析表明，突触囊泡和活性区蛋白（如CLA-1）的定位发生在脊柱生长之前。在啮齿动物的大脑中，脊柱形态发生明显受突触前活动调节[40-43]，但最近的证据表明，脊柱的初始生长可能独立于突触活动[44-46]。因此，我们接下来询问突触前胆碱能活性是否对DD树突棘的形成很重要。为了解决这个问题，我们分析了L4期树突棘（Pflp-13：：mCherry或Pflp-13：：myrGFP）和胆碱能受体（Pflp-13：：ACR-12：：GFP）的数量，这些突变携带突变，影响突触功能和神经元兴奋性的各个方面（表1和S7图）.令人惊讶的是，L4期棘和受体簇的丰度没有受到胆碱能运动神经元中ACh合成的破坏（囊泡乙酰胆碱转运蛋白unc-17的突变）或突触囊泡胞吐作用的强烈减少（语法蛋白结合蛋白unc-18或融合调节剂unc-13的突变）的显着影响。同样，致密核心囊泡释放（CAPS/unc-31）和Ca所需的基因的功能丧失突变2+信号传导（VGCC / unc-2）没有显着减少成熟电路中棘或受体簇的数量（表1和S7图）。我们的数据表明，突触活性的严重改变对L4期树突棘丰度的影响非常有限。然而，我们不能排除脊柱形成发育迟缓的可能性[23]。值得注意的是，我们检查的许多突变显着改变了脊柱长度和受体簇的大小（表1），这表明活动可能会影响脊柱形态和突触后结构的其他方面。总之，我们的研究结果指向一个模型，其中脊柱形成和突触后发育在没有强烈要求突触活动的情况下进行，而随后的脊柱形态发生受到更明显的影响。
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表 1. 分析突触活性改变的突变菌株中的树突棘和胆碱能受体。
显示了每种基因型（ACR-2/nAChR UNC-2/CaV2α、UNC-13/MUNC-13、UNC-17/VAChT、UNC-18/MUNC-18、UNC-31/CAPS）的树突脊柱数、脊柱长度、ACR-12/AChR 簇数和 L4 阶段的 AChR 簇大小（平均± SEM）。影响突触活性的突变对棘或AChR簇的密度影响不大，但对脊柱长度和AChR簇大小的影响不同。单向 AVOVA，Dunnett 的多重比较检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.t001
突触前 NRX-1 可稳定突触后组件
在之前的工作中，我们发现L4期nrx-1（wy778）突变体中成熟棘刺严重减少[20]。我们发现nrx-1（wy1155）空突变体的减少同样严重，其中整个nrx-1编码区域被删除[47]，表明两个等位基因都是空的，并强调了活性无关机制对脊柱形成的潜在重要性（S7D和S7E图）。nrx-1的突变也破坏了胆碱能运动神经元突触前刺激引起的树突状钙反应（S8图）。为了评估突触前NRX-1在棘建立中的作用，我们询问NRX-1何时首次定位到胆碱能运动神经元的突触前末端。NRX-1：：GFP的轴突簇在舱口后16小时存在（图3A和3B），大约与突触前支架CLA-1的组件可见的时间相同（图2）。弥漫性突触囊泡物质此时也可见（图2），但尚未组织成离散的簇。值得注意的是，突触前NRX-1：：GFP簇和棘在L4阶段的数量相似，而突触前CLA-1和SNB-1簇似乎比棘更丰富（图2D和2E）。这可能表明缺乏NRX-1的突触前释放位点的子集与树突棘无关;然而，其中一些突触前性点可能代表贩运囊泡而不是成熟的释放位点，使解释复杂化。
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图 3. 树突棘和突触后成分最初形成，但随后在没有突触粘附蛋白NRX-1的情况下塌陷。
（A）树突棘（Pflp-13：：mCherry，洋红色）的荧光共聚焦图像和NRX-1：：GFP（Punc-17β：：NRX-1：：GFP，青色）在孵化后16、20和24小时（孵化后约42-50小时）的胆碱能表达。NRX-1：：GFP的突触前簇在孵化后16小时可见，并且直到孵化后大约24小时才增加尺寸。（B）在指定时间点量化刺（紫色）和NRX-1簇（黑色）的平均数量。蓝色阴影表示 DD 重塑的大致时间。数字表示在每个时间点量化的动物数量。（C）野生型（左）和nrx-1（wy778）（右）动物在孵化后16、18、20和24小时以及L4阶段的DD树突棘（Pflp-13：：myrGFP）的荧光图像（倒置LUT）表明SEM±。未成熟的树突棘丛最初形成，但随后在nrx-1突变体中塌陷。（D）在所示时间点具有2个或更多DD树突棘的野生型（黑色）和nrx-1（wy778）（紫色）动物的百分比的定量。YA，年轻人。数字表示在每个时间点量化的动物数量。（E）在孵化后16、20和24小时以及L4阶段（约42-50小时）野生型（左）和nrx-1（wy778）突变体（右）的DD枝晶中的ACR-12 / AChR簇（Pflp-13：：ACR-12：：GFP）的荧光图像。未成熟的AChR簇最初形成，但随后分散在nrx-1突变体中。（F）野生型（黑色）和nrx-1（wy778）突变体（紫色）的DD枝晶中ACR-12：：GFP簇数量的定量。双向方差分析，Sidak 的多重比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。（G）野生型DD枝晶和nrx-1（wy778）动物在孵化后16小时和L4阶段的树突棘（Pflp-13：：：GFP：：UtrCH）和F-肌动蛋白（Pflp-13：：GFP：：UtrCH）的荧光共聚焦图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.g003
NRX-1早期到达突触末端可能表明在初始突触形成或随后的稳定和成熟中起作用。为了区分这些可能性，我们分析了nrx-1（wy778）空突变体中树突棘和胆碱能受体簇的发展。我们量化了脊柱和AChR簇的数量，其时间过程与之前完成的野生型相似。令人惊讶的是，我们注意到在早期发育期间，nrx-1突变体中未成熟的棘和受体簇明显，尽管相对于野生型的密度略有降低（图3C-3F和S9）。nrx-1突变体中刺的密度在接下来的几个小时内显着增加，直到孵化后24小时（图3C，3D和S9A）。然而，在此之后，脊柱密度急剧下降，使得nrx-1突变体的DD树突在L4阶段几乎完全没有刺[20]。在野生型和nrx-1突变体的实时成像研究中对脊柱形成和拆卸的测量为这一结论提供了进一步的支持。成熟的野生型刺（L4）在1-2小时的记录中非常稳定，但在发育电路中（孵化后16-20小时）更具动态性（S9C-S9I图和S3-S5视频）。在nrx-1突变体中发育的棘也具有高度的动态性。值得注意的是，与野生型棘相比，nrx-1突变棘刺在发育的后期阶段表现出更高的动力学。例如，在孵化后21-24小时，近90%的野生型棘刺在记录期间保持稳定，而不到50%的nrx-1突变棘刺保持稳定。
突触后受体簇也存在于nrx-1突变体发育的早期。nrx-1（wy778）动物（6.8±0.8簇/25 μm）孵化后16 h时ACR-12簇的数量和荧光强度与野生型（5.6±0.7簇/25 μm）相似（图3E，3F和S9B）。然而，在几个小时内，nrx-1突变树突中的ACR-12簇数量和强度显着降低，并且在发育的其余时间内保持低水平（图3E，3F和S9B）。值得注意的是，树突状F-肌动蛋白的组织同样受到nrx-1缺失的影响。树突状GFP：：UtrCH在早期发育（孵化后16小时）的nrx-1突变体和野生型中分布相当，沿着主树突过程位于离散簇中（图3G）到L4阶段，F-肌动蛋白标记几乎完全与野生型树突棘相关，但沿着L4阶段nrx-1突变树突的长度扩散定位（图3G）综上所述，我们的结果表明，突触前NRX-1对于突触后组装和脊柱形成的最早阶段是可有可无的，但对于稳定树突棘，F-肌动蛋白组装和AChR簇并促进其成熟至关重要。
突触前神经尿毒素定位于胆碱能末端，并以激肽-3/UNC-104依赖性方式稳定突触后成分
为了进一步研究该模型，我们试图确定突触前神经尿素如何被运输到体内的活性区。先前的研究表明，突触囊泡和CLA-1都依赖于Kinesin-3马达UNC-104将其递送到突触[37，48]。特别是，unc-104的破坏导致神经元体内突触囊泡的积累以及轴突内突囊泡的相应丧失[48]（S10A和S10D图）。 ].我们发现，NRX-1内源性标记的GFP定位于野生动物神经环和神经索的神经元过程中的点缀（S10E图），但在unc-104（e1265）突变体的神经索（图4A，4C和S11A-S11D）中显着减少。NRX-1：：GFP定位的显着缺陷也很明显，NRX-1：：GFP在unc-104突变体中的特异性胆碱能表达（图4B，4C和S11E-S11H）。相比之下，与野生型相比，NRX-1：：GFP荧光在unc-104突变胆碱能体中显着增加（5.4倍）（S11C，S11D，S11G，S11H图）。与UNC-104参与胆碱能NRX-1运输一致，我们发现UNC-104和NRX-1在胆碱能轴突中部分共定位（S11I和S11J图）。胆碱能细胞体中NRX-1的积累，加上轴突的减少，表明在没有功能性UNC-104的情况下，NRX-1转运失败。野生型unc-104突变体中胆碱能特异性表达恢复了轴突NRX-1：：GFP定位，表明细胞自主性要求（图4B和4C）。相比之下，Kinesin-1运动机unc-116的突变在胆碱能体中未产生NRX-1：：GFP的显着积累，并且导致轴突NRX-1：：GFP的相对不太严重的减少，表明驱动蛋白-3优先参与NRX-1转运（S12A-S12D图）。现场成像研究提供了额外的证据，证明突触囊泡和NRX-1贩运可能对UNC-104有共同的依赖性。我们发现NRX-1：：GFP贩运事件的发生速度与SNB-1：：GFP（标记突触囊泡）贩运事件具有相似的顺行和逆行速度，尽管频率较低（S12E-S12I图和S6，S7视频）。先前的研究已经注意到，与突触囊泡运输相比，活动区蛋白运输事件的发生频率较低[9]。总之，我们的分析表明，NRX-1对突触的定位具有很强的UNC-104依赖性，而UNC-116可能更间接地贡献，可能是通过对其他突触相关蛋白的影响[50，51]。
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图 4. 突触前 NRX-1 定位到胆碱能末端，并以 UNC-104/KIF1A 依赖性方式稳定脊柱。
（A）来自野生型背索（倒置LUT）和unc-104（e1265）突变体的NRX-1：：GFP（内源性nrx-1敲入）的代表性共聚焦图像。每行上的图像来自不同的年轻成年动物（每种基因型显示5只）。unc-104的突变损害了轴突NRX-1：GFP的定位。（B）来自野生型的背神经索的胆碱能NRX-1：：GFP（Punc-129：：NRX-1：：GFP，倒置LUT）的代表性共聚焦图像，unc-104（e1265）和unc-104（e1265）突变体通过野生型unc-104（Punc-17 β）的胆碱能表达获救。每行上的图像来自不同的年轻成年动物（每种基因型显示5只）。（C）NRX-1：：GFP（内源性或转基因），CLA-1：：GFP，UNC-10：：GFP或ELKS-1：：mCherry簇的平均数量在unc-104（e1265）突变体中每50μm背神经索的散点图或如指示的救援。值将规范化为其各自的控件。红色虚线表示 50% 的百字符类型值。条形表示 SEM ±平均值。学生的 t 检验，****p<0.0001。n ≥11只动物。带有相应控件的原始值显示在S13图中。（D）来自L4阶段野生型unc-104（e1265）和unc-104（e1265）的DD树突棘（Pflp-13：：myrGFP）的荧光图像（倒置LUT）通过野生型unc-104的胆碱能表达获救。（E）L4级野生型的DD树突（Pflp-13：：ACR-12：：GFP）中AChR/ACR-12簇的荧光图像，unc-104（e1265）和unc-104（e1265）突变体通过野生型unc-104的胆碱能表达获救。（F）散射图显示每15μm（Pflp-13：：myrGFP）（紫色）和DD胆碱能受体簇（Pflp-13：：ACR-12：：GFP）（绿色）在野生型unc-104（e1265）中定量的DD树突棘，并指出细胞特异性救援线。插图，针对每个救援结构测试的救援线数/转基因线总数。单因子方差分析 ±，邓内特多重比较检验，****p<0.0001。n ≥10只动物。（G）来自L4阶段野生型，nrx-1（wy778），cla-1（ok937），unc-10（md1117）或elks-1（ok2762）突变体的DD树突棘（Pflp-13：myrGFP或Pflp-13：：mCherry）的荧光图像。 只有 nrx-1 突变影响树突棘。（H）来自野生型或unc-104（e1265）突变体背神经索的胆碱能CLA-1（Punc-17β：：CLA-1：：GFP，倒置LUT）的代表性共聚焦图像。每行上的图像来自不同的年轻成年动物（每种基因型显示5只）。（I）来自野生型背神经索和unc-104（e1265）突变体的胆碱能UNC-10（Punc-129：：UNC-10：：GFP，倒置LUT）的代表性共聚焦图像。每行上的图像来自不同的年轻成年动物（每种基因型显示5只）。（J）来自野生型背神经索和unc-104（e1265）突变体的胆碱能ELKS-1（Punc-129：：ELKS-1：：mCherry，倒置LUT）的代表性共聚焦图像。每行上的图像来自不同的年轻成年动物（每种基因型显示5只）。
-厦门畜牧期刊杂志论文发表
L4期unc-104（e1265）突变体的棘和AChR簇密度也严重降低（图4D-4F），类似于nrx-1突变体（图4G）。这些效应通过unc-104（e1265）突变体中野生型unc-104的天然或胆碱能表达来挽救，但不能通过GABA或肌肉特异性unc-104表达（图4D-4F）来挽救，这表明UNC-104介导的转运在突触前胆碱能轴突中对于突触后脊柱发育和受体定位至关重要。
接下来，我们询问了AZ成分递送失败如何导致我们在unc-104突变体中观察到的棘和受体簇的严重减少。除CLA-1 [37]外，ELKS-1/ELKS/CAST和UNC-10/RIM的转运均因unc-104突变而受到严重破坏，表明Kinesin-3介导的转运是突触递送和组装这些神经元中几种活性区成分的关键（图4H-4J和S13）。值得注意的是，我们发现只有nrx-1的突变在树突棘中显着减少（图4G），这表明突触前ELKS，UNC-10和CLA-1对于突触后发育是可有可无的。我们的研究结果表明，NRX-1在突触后结构的稳定和成熟方面具有特定的要求，并提供了NRX-1突触传递失败是unc-104突变体突触后结构缺陷的主要致病因素的证据。
成熟树突棘的稳定需要 NRX-1 的持续突触传递
我们的研究结果表明，UNC-104介导的转运位置NRX-1位于突触形成的早期阶段的突触前末端，在那里它的作用是稳定生长的突触后结构，包括棘和受体簇。接下来，我们试图解决在成熟脊柱的稳定中是否需要突触前UNC-104依赖性转运。为了解决这个问题，我们使用了先前表征的温度敏感等位基因unc-104（ce782）。unc-104（ce782）动物在UNC-104的运动结构域中携带G105E错义突变[52]。当在允许的温度（13.5°C）下生长时，与野生型相比，unc-104（ce782）轴突触囊泡丰度和动物运动性适度降低。相反，在限制性温度（20-25°C）下生长后，unc-104（ce782）轴突中突触囊泡完全不存在，并且在转向23°C后12小时内动物的运动能力严重受损[52]。我们在允许的温度（13.5°C）下将unc-104（ce782）动物饲养至L4阶段。然后，我们将L4阶段的动物转移到限制温度（25°C）16-20小时，并在此转移后立即量化NRX-1：：GFP定位和脊柱密度（图5）。与在允许温度下连续升高的相同移位或unc-104（ce782）突变体的对照动物相比，经受温度变化的unc-104（ce782）突变体的轴突NRX-1：：GFP簇显着减少（图5B，5C）。与野生型相比，在允许温度下生长的unc-104（ce782）突变体的刺总数略有减少（图5E）。在L3或L4阶段向限制性温度的转变导致unc-104（ce782）突变体（图5D，5E和S14）的脊柱密度显着降低，但对于野生型则不然。综上所述，我们的研究结果表明，对UNC-104运输的持续需求远远超出了初始突触形成和脊柱生长的时期。在我们调查的UNC-104货物中，只有nrx-1的缺失才能在L4阶段显着降低脊柱密度。因此，我们提出了一个模型，其中正在进行的UNC-104突触前NRX-1的递送对于突触后成熟和成熟脊柱的维持至关重要。
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图 5. 在成熟电路中需要NRX-1的UNC-104 / KIF1A传输以维持突触后结构。
（A）实验时间线的卡通描绘。将动物在13.5°C下生长至L4阶段，然后将动物转移到25°C的限制温度下16-20小时并成像。（B）来自野生型背索的NRX-1：：GFP（敲入内源位点，倒置LUT）的线扫描荧光图像，以及unc-104（ce782）突变体在允许温度（13.5°C）（中间图）下连续生长或在L4阶段移动到限制性温度（25°C）（底图）16-20小时，然后成像（底图）。每次线扫描都标明一只动物。（C）野生型和unc-104（ce782）ts动物沿背神经索50 μm区域的NRX-1：：GFP簇的定量。双向方差分析，Tukey的多重比较检验，ns，不显著，*p<0.05，n≥11只动物。（D）野生型和unc-104（ce782）ts动物在允许温度（13.5°C）（中间图）下连续生长或在L4阶段移动到限制温度（25°C）（底部图）的DD棘的荧光图像在成像前16-20小时。 ±（E）野生型和unc-104（ce782）ts动物每15μm刺数的定量。双向方差分析，Tukey 多重比较检验，ns，不显著，**p<0.001。n ≥13只动物。数据点表示平均±SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.g005
讨论
秀丽隐杆线虫GABA能运动神经元装饰有功能性树突棘
众所周知，树突棘是划分神经传递的专用位点，并且在脊椎动物和无脊椎动物的各种神经元中广泛观察到[53]。虽然先前的EM研究表明，C上存在功能性树突棘。秀丽隐杆线虫神经元直到最近才被充分认识[20，22，23]。在这里，我们检查了位于GABA能运动神经元上的突触后结构（树突棘和胆碱能受体簇）相对于突触前释放位点的发育轨迹，并表明生长的树突棘的稳定需要突触前NRX-1 / neurexin。
神经回路的组织和性能由突触连接的位置和相互连接的神经元的身份决定。因此，阐明控制突触构建的过程及其在突触前轴突和突触后树突之间的协调是理解电路组装和功能的基础。然而，相对较少的研究实时监测了体内突触前和突触后特化的协调组装。我们的工作利用了GABA能DD脊柱模型和C提供的细胞精度，解决了这一重要问题。秀丽隐杆线虫运动电路。我们发现C。秀丽隐杆线虫DD树突棘具有脊椎树突棘的许多标志性特征，但也存在一些关键差异。最值得注意的是，成熟的C。秀丽隐杆线虫棘在野生动物中表现出有限的明显活动依赖性动力学，并且相对于啮齿动物的棘表现出相对稳定。这就提出了一个重要的问题，即棘在GABA能神经元中的功能作用是什么？先前的研究已经为C中的区室化钙信号提供了证据。秀丽隐杆线虫神经元[54]。因此，一个有趣的可能性是，与哺乳动物的情况类似，棘用于划分GABA能神经元中的钙和其他生化信号。为了在腹侧神经索中实现突触的不寻常的二元排列，可能需要棘刺，其中胆碱能运动神经元的突触前特化被定位为同时传递到GABA运动神经元和肌肉突触后伴侣[55]。在这种情况下，GABA能刺可能已经发展为拦截肌肉上的胆碱能释放位点，如前所述[56]。虽然尚未通过光学显微镜表征，但先前的电子显微镜研究表明，其他C中存在脊柱样结构。秀丽隐杆线虫神经元，如RMD、RME、SMD和RIP[21，24，56]。对这些结构的进一步调查应有助于阐明其确切的功能作用。
我们发现，F-肌动蛋白在电路发育的早期（在棘出现之前）被划分为DD神经元树突轴内的离散区域，后来变得完全局限于树突棘。一旦可检测到，脊柱的F-肌动蛋白标记就很明显，这表明F-肌动蛋白组装可能参与脊柱发育的最早阶段。在DD神经元重塑之前，GABA释放的位点位于DD神经元的腹侧过程上。由于基于F-肌动蛋白的结构通常与释放位点相关[57，58]，我们发现F-肌动蛋白在重塑前聚集在腹侧DD过程中，这可能表明最初与释放位点相关的F-肌动蛋白通过重塑在DD神经突中持续存在，然后被重新用于突触后发育，可能作为刺激突触后成熟的标志性或基于肌动蛋白的机制。
值得注意的是，我们还在树突形成前几个小时在GABA能树突中观察到点状胆碱能受体荧光。这些未成熟的受体簇与树突状F-肌动蛋白组合共定位，表明受体被贩运到树突中并与F-肌动蛋白一起定位以快速填充生长的棘刺。事实上，我们观察到，一旦脊柱可以清楚地解决，在生长的脊柱中就可以看到受体簇。这与海马器官样切片培养物的延时2光子成像的最新发现一致，该发现显示棘中受体积聚与脊柱外生同时发生[12]。同样，我们发现突触物质在树突出现棘之前积聚在突触前轴突中。特别是，突触前支架CLA-1和突触囊泡标志物突触蛋白/SNB-1的初始积累在轴突中可见，其时间过程与树突状胆碱能受体簇的出现相似。在接下来的4-6小时内，突触前物质变得更加清晰地定位到离散的点，与生长棘尖处的受体积累大致吻合。值得注意的是，我们的研究结果并不支持脊柱形成中突触前神经递质释放的强烈要求。
经突触 NRX-1/神经尿毒素信号传导可稳定树突状 F-肌动蛋白组件，促进突触后成熟
对各种模型系统的大量研究已经检查了神经尿素在突触发育和功能中的作用。然而，关于神经质毒素功能没有出现单一的共识观点。相反，特定突触处的神经尿素的功能被认为由细胞和分子环境决定[19，59]。哺乳动物基因组编码三个Nrxn基因，这些基因可以产生α，β和γ-Nrxn亚型。这些亚型共享共同的细胞内和跨膜区域，但其细胞外结构域不同。α-Nrxn有六个细胞外LNS结构域，与三个EGF样重复序列交错。β-Nrxn只有一个LNS结构域，而γ-Nrxn缺少所有可识别的细胞外结构域。神经氨酸在脊椎动物突触中的多方面作用可能是由于替代剪接产生的许多神经尿素同种型，其细胞表达的复杂性以及这些同种型选择性地与不同的突触后伴侣相互作用的潜力而出现的。
C.秀丽隐杆线虫基因组编码单个神经质素基因nrx-1，其产生长α和短γ亚型[60]。与其他系统一样，C.秀丽隐杆线虫NRX-1在突触前组织中起作用，例如在活动区处的钙通道聚集中[47]。有趣的是，缺乏可识别的外域的短γ-NRX-1同种型发挥这些作用（蠕虫不编码β-NRX-1），但即使在没有两种同种型的情况下，也保持了一定程度的突触前功能，如突触前运动神经元刺激后肌肉细胞中存在诱发反应所表明的那样[20]。我们之前的研究表明NRX-1在胆碱能神经元和GABA能运动神经元之间的突触中的重要性[20]。令人惊讶的是，我们在这里的时间过程研究表明，最初的脊柱生长和AChR聚集通常发生在缺乏两种亚型的nrx-1突变体中。然而，nrx-1突变体中的棘和AChRs在数小时内变得不稳定并分散，使得GABA能树突在L4阶段几乎完全没有这些突触后成分。树突状F-肌动蛋白组装体通常显示出对棘的离散定位，在nrx-1突变体中也是无序的，并且在nrx-1突变体中扩散分布在整个GABA能树突中。我们提出了一个模型，其中突触前NRX-1需要用于稳定GABA能树突中的树突棘和其他突触后结构。我们认为突触前 NRX-1 指导树突状 F-肌动蛋白的组织，以刺激棘和突触后受体簇的成熟和稳定。类似形式的基于F-肌动蛋白的重组是突触前分化的关键步骤[25，57]。我们的发现与先前的培养研究形成鲜明对比，这些研究认为神经尿素与突触后诱导有关[61]。
我们的工作与最近在非洲爪蟾和果蝇方面的研究有相似之处。在胚胎期非洲爪蟾脑中，突触前β-神经尿毒素通过与神经粘合的结合来稳定树突状丝状体，以指导树突状乔木的发育[62]。同样，在苍蝇变质过程中，基于神经质素/神经木质素的粘附促进神经突起分支的生长，而与突触活性无关（Constance等人，2018）[63]。在目前的研究中，我们发现树突棘的NRX-1稳定与突触活性无关。先前对nlg-1报告基因的研究[64，65]和最近的转录组分析工作[66]表明，nlg-1在GABA能运动神经元中表达不强烈。与这些发现一致，我们先前显示，在L4期，神经木质素/nlg-1的缺失并未显著改变GABA能神经元中的树突棘或受体簇[20]。这些结果表明，NRX-1与GABA能神经元中替代结合伴侣的相互作用至今仍未被识别。确定这些合作伙伴将是未来研究的一个有趣领域。
NRX-1/神经氨酸的 UNC-104/激肽蛋白 3 依赖性定位是突触成熟和稳定所需的基本早期步骤
突触和活动区货物的有效运输到突触前末端对于突触形成和神经元通讯至关重要。突触囊泡和活性区蛋白的远距离轴突转运由顺行驱动蛋白和逆行动力蛋白马达进行。然而，关于哪些突触蛋白被贩运在一起以及它们对特定电机的依赖性仍然存在重大问题。我们发现NRX-1对突触前末端的定位依赖于驱动素-3 UNC-104 / KIF1A。突触和致密核心囊泡的顺行转运也强烈依赖于UNC-104[48，67]。相比之下，一些研究表明，其他AZ蛋白在递送中对UNC-104的要求较弱。例如，ELKS-1和其他AZ蛋白定位于C。秀丽隐杆线虫HSN突触以UNC-104独立的方式[6]）。同样，UNC-10/RIM在unc-104（e1265）突变体的神经环过程中得到适当集中[68]。在这里，我们发现NRX-1，UNC-10 / RIM，ELKS-1 / ELKS和CLA-1 / piccolo都显示出对UNC-104的依赖性，以顺行运输到胆碱能突触。我们研究中使用的unc-104（e1265）等位基因在PH结构域的PI（4，5）P2结合口袋中携带点突变，并降低了UNC-104结合货物的能力[49]，可能将该结构域与这些蛋白质的UNC-104依赖性定位联系起来。
先前对啮齿动物培养神经元的研究也表明，在神经尿毒素转运中需要Kinesin-3马达，这表明NRX-1递送到突触的机制是保守的[69]。我们发现，当UNC-104突触货物的传递被破坏时，树突棘塌陷并且AChR簇分散。在我们分析的推定的UNC-104货物中，只有nrx-1的突变对树突棘产生了显着的破坏。因此，我们建议NRX-1是脊柱稳定所需的关键UNC-104货物。我们的实时成像指出突触囊泡和NRX-1的运输速率相似。然而，目前尚不清楚 NRX-1 是作为突触囊泡的组成部分递送的，还是可能被分离到一个独特的囊泡群体中，例如突触囊泡蛋白转运囊泡 （STV）。我们的发现是，严重损害突触囊泡融合的突变不会影响脊柱密度，这表明了后一种可能性。
先前对unc-104的温度敏感等位基因的鉴定使我们能够探索UNC-104递送NRX-1的时间要求。重要的是，我们发现UNC-104的递送不仅在突触成熟的早期阶段是必需的，而且在通路走向成熟的整个发育过程中至关重要。这些发现认为，在电路组装完成后很长一段时间内，需要提供突触前NRX-1来维持突触后结构。这引发了关于NRX-1转运与突触稳定性之间关系的有趣问题，可能表明轴突NRX-1转运速率的改变可能直接影响成熟动物的突触连接。更广泛地说，我们的研究为电路连接中的粘附机制提供了新的观点，并强调了神经尿素在成熟突触和树突棘稳定方面的新作用。
材料和方法
株
所有菌株均为N2布里斯托尔菌株衍生物（野生型），并在室温（20-24°C）下保持在接种有E的线虫生长培养基板（NGM）上。大肠杆菌菌株 OP50.通过显微注射获得转基因菌株以实现转化[70]，并使用共注射标记物鉴定。集成线通过X射线照射生产，并八次越界到野生型/N2布里斯托尔。本研究仅使用雌雄同体（L1-L4，年轻成人）。本研究中使用的所有菌株的完整列表可在S1文件中找到。通过将新孵化的幼虫转移到接种的OP50板中并转移到25°C（时间点0）来分期用于时间过程研究的蠕虫。
分子生物学
使用双槽网关克隆系统（Invitrogen）构建质粒，并通过限制性酶切和测序进行确认。
促性蛋白/F-肌动蛋白报告基因。
将mCherry的序列编码从pDest-16扩增（并连接到AgeI-HF / BspEI消化的PNYL183（Pflp-13：：GFP：：UtrCH，Dong Yan实验室的礼物）制成pCL87（Pflp-13：：：mCherry：：UtrCH）。
TBA-1/微管蛋白报告。
将GFP：：TBA-1的序列编码从质粒pYJ128（康申实验室的礼物）扩增并连接到目标载体中以产生pDest-173。pDest-173与pENTR-5'-flp-13重组以生成pDO61（Pflp-13：：GFP：：TBA-1）。
高尔基体仪器记者。
pDest-161 （AMAN-2：：GFP） 与 pENTR-3'-flp-13 重新组合生成 pDO47 （Pflp-13：：AMAN-2：：GFP）。pDest-161是由HindIII-HF消化Pgpa-4：：AMAN：：GFP（Gert Jansen实验室的礼物）并用目标载体连接而创建的。
线粒体记者。
从XmaI/ SphI-HF消化的pDM1389（来自A.V. Maricq实验室的礼物）中分离出GFP，并连接到目标载体中以创建pDest-91（pre-su9：：GFP）。pDest-91与pENTR-5'-flp-13重新组合以生成pAP102（Pflp-13：:p re-Su9：：GFP）。
急诊记者。
Tag-RFP：：TRAM-1从质粒pCT27（来自A.V. Maricq实验室的礼物）扩配并连接到KpnI-HF / NgoMIV消化的靶向载体上以生成pDest-169。pDest-169与pENTR-3'-flp-13重新组合以生成pDO59（Pflp-13：：RFP：：TRAM-1）。
突触前囊泡记者。
将acr-5启动子从质粒pDM806扩增并连接成pENTR-D-TOPO以生成pENTR-40。然后将pENTR-40与pDest-5重新组合以生成pAP264（Pacr-5：：SNB-1：：GFP）。
B型特异性运动神经元报告基因。
pDO45（Pacr-5：：GFP）是通过重组pDest-94（GFP）和pENTR-40（acr-5启动子）而产生的。
myrGCamp6f.
将myrGCaMP6f从质粒pDest-164扩增并连接成目标载体以产生pDest-180。pDest-180与pENTR3'-flp-13重新组合以创建pDO69（Pflp-13：：SL2：：myrGCamp6f）。
CLA-1报告者。
3XnovoGFP：：CLA-1e从SphI-HF / AgeI-HF消化的pKP85（Peri Kurshan的礼物）中分离出来，并与目标载体连接以创建pDest-307 pDest-307与pENTR-3'-unc-17β重组以生成pSR58（Punc-17β：：3XnovoGFP：：CLA-1e cDNA）。
unc-104救援结构。
UNC-104cDNA：：mCherry从SphI-HF / NheI-HF消化的plL48（康申实验室的礼物）中分离出来，并与目标载体连接以制成pDest-308。将pDest-308与pENTR-unc-17β重组以生成pDO126（Punc-17β：：UNC-104cDNA：：mCherry），pENTR-3'-unc-47生成pDO134（Punc-47：：UNC-104cDNA：：：mCherry），pENTR-3'-myo-3生成pDO136（Pmyo-3：：UNC-104cDNA：：：mCherry）。
Punc-17β：：NRX-1：：GFP.
pAP112是通过将pENTR-3'-unc-17β与pDest-99（NRX-1：：GFP）重组而生成的。
ELKS-1：：-厦门畜牧期刊杂志论文发表
mCherry：：ELKS-1cDNA从SphI-HF / Ascl中分离出消化的pK043（Peri Kurshan实验室的礼物），并与目标载体连接以产生pDest-325。pDest-325与pENTR-unc-129重新组合以生成pDO156（Punc-129：：ELKS-1：：mCherry）。
UNC-10：：GFP.
从BamHI-HF / SbfI消化的pRIM3（Michael Nonet实验室的礼物）中分离出UNC-10：：GFP，并与目标载体连接以生成pDest-304。pDest-304与pENTR-3'-unc-129重新组合生成pDO128（Punc-129：：UNC-10：：GFP）。
CRISPR/Cas-9内源性标记NRX-1：：GFP。
株PHX3578 nrx-1（syb3578）由SunyBiotech在N2动物中产生。将连接子序列和GFP插入到C29A12.4a1 /nrx-1末端的外显子27之后。GFP侧面的序列如下。
5'： CGGGAATGGAGTCGAAAAAAAAAGGATTTTAAAGAGTAGGTTAAAGGTACCGCGCCC
gggatccaccggtcgccaccatggtg
3'： TCCATTTCTTCAATCAAAACTCAATACAATGATGATTAAAAAATTCACTTTTGTCTGCAAA
TTGCCACAACTTCAAAACGGGTAC
PAM 序列带下划线
同义词突变以粗体显示
链接器为小写字母
nrx-1基因被俘虏化
水凝胶溶液
将水凝胶制备为聚乙二醇（20%w / v）和光引发剂Irgacure（0.5%储备，0.1%工作浓度）的水溶液，并在黑暗中储存在4°C。
共聚焦显微镜
所有菌株均用叠氮化钠（0.3 M）固定在2%或5%琼脂糖垫上。使用配备63x物镜的奥林巴斯BX51WI旋转盘共聚焦获得图像。对于时间过程分析，将新孵化的幼虫转移到接种的OP50板中并保持在25°C。
树突棘和 F-肌动蛋白的长期活体成像。
使用2μL50mM麝香酚在10μL 20%PEG水凝胶溶液中固定线虫。一旦瘫痪，使用手持式UV透射仪（312nm，3分钟）策划水凝胶。Z-堆栈每5分钟采集一次，持续至少一小时。
突触囊泡和 NRX-1 运输的实时成像。
线虫使用50 mM麝香酚固定在5%琼脂糖垫上。使用Perkin Elmer旋转盘共聚焦成像胆碱能共聚焦，该共聚焦配备63x物镜，使用100 ms曝光30秒。
共聚焦显微镜分析
所有图像分析均使用ImageJ软件（开源）在定义的ROI内使用从对照实验中确定的强度阈值进行。ROI位于DD1，DD2或DD3体质前15-30μm处。
脊柱分析。
成熟的刺被量化为树突的突起，长度>0.3μm（从基部到突起的尖端测量）。脊柱密度定义为所选ROI内的脊柱数量/单位长度。
使用Imaris/bitplane 3D图像分析软件进行3D渲染。形态学分类根据[71]中使用的标准确定。ImageJ 线工具用于测量脊柱 3D 渲染的长度和宽度。根据这些计算，根据以下标准将棘分为四个形态学类别之一：Stubby：中间宽度>总长度;薄：中间宽度=尖端宽度;蘑菇：尖端宽度>中间宽度;分支：>1脊柱头。
荧光强度分析
F-肌动蛋白/脊柱和F-肌动蛋白/微管蛋白。
DD神经突使用线和线矫直函数提取。测量树突轴（线宽4）和树突轴（线宽8）下的总荧光强度（utrophin/UtrCH，微管蛋白/TBA-1，ER/TRAM-1）。对于体细胞荧光强度，在体细胞周边绘制ROI。
突触标志物和受体簇。
减去背景荧光，并使用"分析粒子"功能测量突触/受体点的数量和大小。共聚焦蒙太奇使用"直线"功能在背神经索的50μm区域组装。
实时成像
事件定义为在整个实时成像记录期间脊柱不稳定/修剪，伸长/形成或脊柱稳定的发生率。每5分钟采集一次DD1枝晶的Z-堆叠，持续60-160分钟。数字表示每个时间点每种基因型的事件数。
钙成像
将动物生长在含有2.7mM全反式视网膜（ATR）的OP50种子的平板上。将板在4°C的黑暗条件下储存，并在一周内使用。使用固定在水凝胶中的L4动物进行成像[72]。将动物转移到7.5μL水凝胶混合物中，置于硅烷化的载玻片上并用载玻片覆盖。使用手持式UV透射仪（312nm，3分钟）固化水凝胶。固化后，取下覆盖玻片并用盖玻片代替。使用配备EM-CCD相机（滨松，C9100-50）和63X油浸物镜的横河电机CSU-X1-A1N旋转盘共聚焦系统（Perkin Elmer）进行成像。铬光活化（~30 mW/cm2）是使用TTL控制的625 nm光导耦合LED（Mightex系统）实现的。一个556 nm的BrightLine单边短通二向色性分束器被放置在光路（Semrock）（S3图）中。使用Volocity软件以10 Hz采集数据15秒，并在采集过程中以1×1的频率进行分档。使用ImageJ执行分析。使用拉直函数提取每个时间序列中的DD神经突，减去背景并通过将指数函数拟合到数据（CorrectBleach插件）来执行光漂白校正。对数据应用了平滑功能以增强信噪比。使用mCherry荧光鉴定单个脊柱ROI。成像后处理，前刺激基线荧光（F0） 计算为记录前 4 秒内数据点的平均值。将数据归一化为刺激前基线为 ΔF/F0，其中 ΔF = F–F0.峰值 ΔF/F0通过将高斯函数拟合到 ΔF/F 来确定0使用多峰值2.0的时间序列（Igor Pro，WaveMetrics）。分析所有收集的数据，包括失败（对刺激无反应）。对照记录在没有视网膜的情况下进行。
电子显微镜
使用HPM10高压冷冻机对L4野生型（Pflp-13：：ACR-12：：GFP）雌雄同体进行高压冷冻固定。将雌雄同体缓慢冷冻取代在2%四氧化锇（OSO4）、0.1%乙酸铀酰、2%H2O丙酮固定剂中[73，74]。将样品嵌入块中，以70 nm厚的串行切片进行切片，随后收集在铜槽网格上。将样品在2.5%乙酸铀酰酯中用70%甲醇后染色20分钟，并在H中用1：6柠檬酸铅染色2O在室温下2分钟。图像是使用飞利浦 CM10 TEM 采集的。
我们鉴定并表征了来自腹头区域35μm区域的6个DD1棘，其中神经突从DD1 GABA能运动神经元的细胞体中出现。
温度变化实验
将野生型和unc-104（ce782）ts动物卵在13.5°C下饲养至L3或L4阶段，然后在成像前移位至25°C16–20 h。动物在温度变化时进行年龄匹配，以解释unc-104（ce782）ts突变体的发育延迟，unc-104（ce782）ts突变体约为L4阶段144小时，野生型为120小时。
支持信息
菌株列表。
显示 1/22： pgen.1010016.s001.xlsx
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一个 B C D E
1 S1 文件应变列表
2 菌株名称 基因型 描述 质粒（浓度）
3 IZ1464 ufIs128 DD特异性转录报告（红色） Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50 ng/mL）
4 IZ2727 ufIs172;ufIs128 DD特异性F-肌动蛋白（绿色）和DD特异性转录报告（红色） Pflp-13：：GFP：：UtrCH （pPNYL183 @50 ng/mL）;Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50 ng/mL）
5 IZ3566 ufEx1419;ufEx1454 DD特异性微管蛋白（绿色）和DD特异性F-肌动蛋白（红色） Pflp-13：：GFP：：TBA-1 （pDO61 @50 ng/mL）;Pflp-13：：mCherry：：UtrCH （pCL87 @50 ng/mL）
6 IZ3537 ufEx1491;ufIs157 DD特异性GCaMP6f（红色）和Chrimson的胆碱能表达 Pflp-13：：myrGCaMP6f：：SL2：：mCherry （pDO69@50 ng/mL）;Pacr-2：：Chrimson （pRB2 @50 ng/mL）
7 IZ3910 unc-17（e113）;ufEx1491;ufIs157 DD特异性GCaMP6f（红色）和Chrimson的胆碱能表达 Pflp-13：：myrGCaMP6f：：SL2：：mCherry （pDO69@50 ng/mL）;Pacr-2：：Chrimson （pRB2 @50 ng/mL）
8 IZ1905 ufIs126 DD 特异性 ACR-12：：GFP 表达 Pflp-13：：ACR-12：：GFP （pCL32 @150 ng/mL）
9 IZ3243 ufEx1314;ufIs128 DD特异性高尔基标记（绿色）和DD特异性转录报告（红色） Pflp-13：：AMAN-2：：GFP （pDO47 @50 ng/mL） & Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50ng/mL）
10 IZ2801 ufIs151;ufIs170 DD特异性线粒体报告程序（绿色）和DD特异性转录报告程序（红色） Pflp-13：:p re-Su9：：GFP （pAP102 @50 ng/mL） & Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50ng/mL）
11 IZ3654 ufEx1511;ufIs175 DD 特异性 ER 标记（红色）和 DD 特异性转录报告（绿色） Pflp-13：：RFP：：TRAM-1 （pDO59 @50 ng/mL） & Pflp-13：：myrGFP （pAP168 @30 ng/mL）
12 IZ3973 ufEx1679;ufIs128 胆碱能特异性CLA-1报告基因（绿色）和DD特异性转录报告基因（红色） Punc17b：：novo2GFP：：CLA-1 （pSR58 @30 ng/mL） & Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50 ng/mL）
13 IZ3998 ufEx1684;ufIs128 SNB-1（绿色）和DD特异性转录报告（红色）的胆碱能特异性表达 Pacr-5：：SNB-1：：GFP （pAP264 @25ng/mL） & Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50 ng/mL）
14 IZ3404 acr-12（ok367）;ufIs92;ufIs128 GABA特异性ACR-12表达（VD和DD）（绿色）和DD特异性转录报告（红色） Punc-47：：ACR-12：：GFP （pHP7）;Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50 ng/mL）
15 IZ4285 ufEx1823： ufIs128 胆碱能特异性转录报告（绿色）和DD特异性转录报告（红色） Pacr-5：：GFP （pDO45 @30 ng/mL） & Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50 ng/mL）
16 IZ4150 ufIs126;ufEx1454 DD特异性F-肌动蛋白表达（红色）和DD特异性ACR-12（绿色） Pflp-13：：ACR-12：：GFP （pCL32 @150 ng/mL）;Pflp-13：：mCherry：：UtrCH （pCL87 @50 ng/mL）
17 IZ3105 ufIs175 DD 特异性转录报告器（绿色） Pflp-13：：myrGFP （pAP168 @ 30ng/mL）
18 IZ4126 列弗-10（wd116）;juIs463;ufIs170 LEV-10（绿色）和DD特异性转录报告书（红色）的胆碱能特异性表达 Pflp-13：：GFP1-10;Pflp-13：：m 樱桃 （pAP31 @ 50ng/mL）
19 IZ4057 ufEx1704;ufIs128 NRX-1（绿色）和DD特异性转录报告书（红色）的胆碱能特异性表达 Punc17b：：NRX-1：：GFP （pAP112 @50ng/mL）;& Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50 ng/mL）
20 IZ3881 nrx-1（wy778）;ufIs175 DD 特异性转录报告器（绿色） Pflp-13：：肉豆蔻酸 （PAP168 @ 30ng/mL）
21 IZ2098 nrx-1（wy778）;acr-12（ok367）;wdIs950 GABA 特异性 ACR-12 表达（VD 和 DD）（绿色） Punc-47：：ACR-12：：GFP （pHP7 @ 50 ng/mL）
22 IZ2323 ufEx788;ufIs128 DD特异性肌动蛋白（绿色）和DD特异性转录报告（红色） Pflp-13：：GFP：：UtrCH （pPNYL183@50 ng/uL）;Pflp-13：：m 樱桃 （pAP31 @ 50ng/mL）
23 IZ4105 nrx-1（wy778）;ufEx788;ufIs128 DD特异性肌动蛋白（绿色）和DD特异性转录报告（红色） Pflp-13：：GFP：：UtrCH （pPNYL183@50 ng/uL）;Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50ng/mL）
24 IZ3619 acr-2（ok1887）;ufIs128 DD特异性转录报告（红色） Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50 ng/mL）
25 IZ3745 unc-2（e55）;ufIs128 DD特异性转录报告（红色） Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50 ng/mL）
26 IZ3253 unc-13（e51）;ufIs128 DD特异性转录报告（红色） Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50 ng/mL）
27 IZ4415 unc-13（ es69）;ufIs175 DD 特异性转录报告器（绿色） Pflp-13：：myrGFP （PAP168 @ 30ng/μL）
28 IZ1717 unc-17（e113）;ufIs128 DD特异性转录报告（红色） Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50 ng/mL）
29 IZ3355 unc-18（e234）;ufIs128 DD特异性转录报告（红色） Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50 ng/mL）
30 IZ3649 unc-31（e928）;ufIs175 DD 特异性转录报告器（绿色） Pflp-13：：myrGFP （PAP168 @ 30ng/μL）
31 IZ4000 acr-2（n2420）;ufIs128 DD特异性转录报告（红色） Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50 ng/mL）
32 IZ3610 unc-2（zf35）;ufIs128 DD特异性转录报告（红色） Pflp-13：：mCherry （pAP31 @50 ng/mL）
33 IZ2229 acr-2（ok1887）;ufIs126 DD 特异性 ACR-12：：GFP 表达 PFLP-13：ACR-12：：GFP （pCL32@ 150纳克/毫升）
34 IZ3750 unc-2（e55）;ufIs126 DD 特异性 ACR-12：：GFP 表达 PFLP-13：ACR-12：：GFP （pCL32@ 150纳克/毫升）
35 IZ1768 unc-13（e51）;ufIs126 DD 特异性 ACR-12：：GFP 表达 PFLP-13：ACR-12：：GFP （pCL32@ 150纳克/毫升）
36 IZ1678 unc-17（e113）;ufIs126 DD 特异性 ACR-12：：GFP 表达 PFLP-13：ACR-12：：GFP （pCL32@ 150纳克/毫升）
37 IZ3815 unc-18（e234）;ufIs126 DD 特异性 ACR-12：：GFP 表达 PFLP-13：ACR-12：：GFP （pCL32@ 150纳克/毫升）
38 IZ3773 unc-31（e928）;ufIs126 DD 特异性 ACR-12：：GFP 表达 PFLP-13：ACR-12：：GFP （pCL32@ 150纳克/毫升）
39 IZ3760 unc-43（e408）;ufIs126 DD 特异性 ACR-12：：GFP 表达 PFLP-13：ACR-12：：GFP （pCL32@ 150纳克/毫升）
40 IZ3758 acr-2（n2420）;ufIs126 DD 特异性 ACR-12：：GFP 表达 PFLP-13：ACR-12：：GFP （pCL32@ 150纳克/毫升）
41 IZ1898 unc-2（zf35）;ufIs126 DD 特异性 ACR-12：：GFP 表达 PFLP-13：ACR-12：：GFP （pCL32@ 150纳克/毫升）
42 IZ3759 unc-43（n498）;ufIs126 DD 特异性 ACR-12：：GFP 表达 PFLP-13：ACR-12：：GFP （pCL32@ 150纳克/毫升）
43 IZ4166 acr-16（ok789）;ufEx1491;ufIs157 DD特异性GCaMP6f（红色）和Chrimson的胆碱能表达 Pflp-13：：myrGCaMP6f：：SL2：：mCherry （pDO69@50 ng/mL）;Pacr-2：：Chrimson （pRB2@50 ng/mL）
44 IZ3999 acr-12（ok367）;ufEx1491;ufIs157 DD特异性GCaMP6f（红色）和Chrimson的胆碱能表达 Pflp-13：：myrGCaMP6f：：SL2：：mCherry （pDO69@50 ng/mL）;Pacr-2：：Chrimson （pRB2@50 ng/mL）
45 IZ3978 nrx-1（wy778）;ufEx1491;ufIs157 DD特异性GCaMP6f（红色）和Chrimson的胆碱能表达 Pflp-13：：myrGCaMP6f：：SL2：：mCherry （pDO69@50 ng/mL）;Pacr-2：：Chrimson （pRB2@50 ng/mL）
46 IZ4134 nrx-1（nu485）;ufEx1491;ufIs157 DD特异性GCaMP6f（红色）和Chrimson的胆碱能表达 Pflp-13：：myrGCaMP6f：：SL2：：mCherry （pDO69@50 ng/mL）;Pacr-2：：Chrimson （pRB2@50 ng/mL）
47 IZ4147 nrx-1（ok1649）;ufEx1491;ufIs157 DD特异性GCaMP6f（红色）和Chrimson的胆碱能表达 Pflp-13：：myrGCaMP6f：：SL2：：mCherry （pDO69@50 ng/mL）;Pacr-2：：Chrimson （pRB2@50 ng/mL）
48 PHX3578系列 nrx-1（syb3578） 内源性敲入GFP进入nrx-1的C末端（绿色） CRISPR/Cas-9 GFP 内源性敲入
49 IZ4254 unc-104（e1265）;nrx-1（syb3578） 内源性敲入GFP进入nrx-1的C末端（绿色） CRISPR/Cas-9 GFP 内源性敲入
50 IZ2359 ufEx847 NRX-1的胆碱能特异性表达（绿色） Punc-129：：NRX-1：：GFP （pAP120 @ 50 ng/mL）
表1
-厦门畜牧期刊杂志论文发表
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无花果
S1 文件。 菌株列表。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s001
（XLSX）
S1 图 DD树突和棘的细胞生物学表征。
（A）来自动物的DD树突棘的荧光图像（顶部，倒置LUT）和3D渲染（中间和插图），表达Pflp-13：：mCherry，显示出不同的脊柱形态。DD树突棘与哺乳动物树突棘具有形态相似性：蘑菇（5.49±0.66%），分支（5.49±0.66%），短刺（73.63±3.09%）和薄（15.38±1.21%）。箭头，脊柱嵌入。n = 来自11只动物的83根树突棘，测量值，±SD的百分比.（B）DD神经元中微管蛋白（Pflp-13：：GFP：：TBA-1）和F-肌动蛋白（Pflp-13：：：mCherry：：UtrCH）的荧光图像。白色箭头表示微管蛋白与树突状脊柱基部接触的树突状区域。（C）DD神经元中DD1树突棘（Pflp-13：：mCherry）和高尔基标记（Pflp-13：：AMAN-2：：GFP）的荧光图像。高尔基体荧光主要局限于DD1体细胞。虚线白线追踪神经元细胞体。（D）DD1树突棘（Pflp-13：：mCherry）和线粒体（Pflp-13：:p re-Su9：：GFP）的荧光图像。线粒体荧光在脊柱附近DD神经元的主要树突中可见。（E）树突轴和树突棘中线粒体荧光强度的定量。柱，均值± SEM. 学生的 t 检验，****p<0.0001。（F）DD3树突棘（Pflp-13：：myrGFP）和粗糙的内质网（ER）的荧光图像（Pflp-13：RFP：：TRAM）。TRAM荧光在DD细胞体中富集，但在DD神经元的树突中也更弱可见。（G）DD1树突棘（Pflp-13：：myrGFP）和粗糙的内质网（ER）（Pflp-13：：RFP：：TRAM）的荧光图像。荧光信号强度增加，以更好地显示过程。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s002
（TIF）
S2 图 DD树突棘的超微结构。
（A）用于腹侧神经索电子显微镜研究的前序列横截面的卡通描绘，重点是DD1神经元的树突。B中的横截面来自White及其同事[21]，而C和D中的截面来自这项工作。（B）N2U系列腹侧神经索的连续横截面（443-446/597）[21]。蓝绿色表示 DD1 树突和树突棘浸入腹侧神经索以满足突触前胆碱能终末（品红色）。星号表示树突轴内的线粒体，见S1图。（C）腹侧神经索电子显微镜照片。腹侧神经索的连续横截面（225-228/491）。蓝绿色表示 DD1 树突和树突棘（226/491 和 227/491）浸入腹侧神经索以满足突触前胆碱能末端（可能是 VA/VB 神经元，洋红色）。星号表示树突轴内的线粒体，见S1图。比例尺，100 nm。（D）显示了两张来自连续部分的代表性显微照片，其中脊柱的整个范围可见。星号表示树突轴内的线粒体。比例尺，100 nm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s003
（TIF）
S3 图 钙成像记录平台的卡通插图。
使用配备EM-CCD相机（滨松，C9100-50）和63X油浸物镜的横河电机CSU-X1-A1N旋转盘共聚焦系统（Perkin Elmer）进行成像。铬光活化（~30 mW/cm2）使用TTL控制的625nm光导耦合LED（Mightex系统）实现，允许照亮整个固定的动物，同时记录GCaMP6f荧光（激发488nm，发射525nm）。在光路（Semrock）中放置了一个556 nm边缘BrightLine单边短通二向色性分束器，以防止625 nm光到达相机。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s004
（TIF）
S4 图 胚胎后出生的腹侧胆碱能运动神经元和GABA能树突棘的前后发育。
（A）B型胆碱能神经元（DB / VB）（Pacr-5：：GFP）（绿色）和DD GABA能神经元（Pflp-13：：mCherry）（红色）在孵化后16和24小时的荧光图像。VB胆碱能神经元在胚胎后以后序（蓝色）的前序出生。请注意，在孵化后16小时，Pacr-5：：GFP荧光表明VB1和VB2细胞体可见。在孵化后24小时，Pacr-5：：GFP荧光表明VB3可见。白色虚线圆圈勾勒出神经元细胞体。（B）动物前腹侧神经索的荧光图像在孵化后12、16和24小时与Pflp-13：：mCherry标记DD GABA能神经元（红色）中B型胆碱能神经元（DB/VB）（绿色）中共表达突触囊泡标志物Pacr-5：SNB-1：：GFP。12小时时，腹侧神经索可见少量SNB-1：：GFP荧光。胚胎出生的背向B型（DB）胆碱能运动神经元主要在背神经索中进行突触接触。腹侧导向的B型（VB）胆碱能运动神经元在胚胎后出生，此时尚未完成成熟。SNB-1：腹侧神经索中的GFP荧光在孵化后16小时隐约可见，在孵化后24小时变得更加突出，与VB运动神经元的成熟相吻合。白色虚线圆圈表示神经元细胞体的轮廓。黄色箭头表示突触前囊泡簇SNB-1。（C）胚胎后出生的腹侧胆碱能运动神经元，脊柱生长和胆碱能突触囊泡定位的发育时间的卡通表示。（D-E）DD1 和 DD2 树突棘在孵化后 24 小时和 L4（孵化后~42–50 小时）阶段 （E） 的荧光图像（倒置 LUT）。动物表达Pflp-13：：mCherry来标记树突棘。红色虚线矩形表示 DD1 体马前部有内陷。蓝色虚线矩形表示 DD2 体细胞前部有内陷。请注意，DD1 棘在 DD2 棘之前形成。（F）在孵化后24和32小时以及L4（?孵化后42-50小时）阶段对生长的树突棘的长度进行定量。数据点表示平均±SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s005
（TIF）
S5 图 突触前和突触后组件的开发。
在孵化后12、16、20、24和32小时以及L4阶段（孵化后~42-50小时）的GABA能树突的荧光图像。动物表达GABA能树突标记物（Pflp-13：：mCherry），其中（A）突触前活性区标记（Punc-17β：：GFPnovo2：：CLA-1e），（B）突触囊泡标志物（Pacr-5：：SNB-1：：GFP）或突触后受体（C）（Punc-47：：ACR-12：：GFP）或（D）F-肌动蛋白（Pflp-13：：GFP：：UtrCH）（Punc-17β：：GFPnovo2：：CLA-1e）。图像为伪彩色，以指示棘（洋红色）和突触成分（CLA-1，囊泡簇，F-肌动蛋白或AChRs）（青色）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s006
（TIF）
S6 图 发育过程中的LEV-10定位和肌动蛋白动力学。
（A）荧光共聚焦图像显示树突棘（洋红色）和突触后CUB跨膜结构域LEV-10（青色）。动物用DD神经元特异性LEV-10：：GFP11表达Pflp-13：：mCherryx7使用内源性LEV-10（NATF）的细胞特异性标记策略[39]。（B）在孵化后16、20和24小时以及L4阶段（孵化后~42-50小时）定量DD树突棘和LEV-10簇的数量。（C） （C， E， G） 线阵扫描显示 F-肌动蛋白 （Pflp-13：：GFP：：UtrCH） 在孵化后 16 小时、孵化后 24 小时 （E） 和 L4 （~42–50 小时） 动物 （G） 的相对荧光强度。每种颜色表示以5分钟间隔获得的相同DD枝晶ROI的荧光强度线扫描。请注意，与后期时间点相比，在孵化后近16小时获得的图像的线阵扫描中，荧光强度的分布变化不一，表明在早期发育期间F-肌动蛋白动力学增加。（D， F， H）共聚焦图像（倒置LUT）显示Pflp-13：：GFP：：UtrCH荧光（标记F-肌动蛋白）在DD树突中16（D），或24（F）小时后，或在L4阶段（孵化后约42-50小时）（H）。对于每个，显示相隔30分钟的荧光图像序列。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s007
（TIF）
S7 图 棘和 AChR 独立于突触前活动定位。
（A、 B）DD1树突棘（Pflp-13：：mCherry （A）或Pflp-13：：myrGFP （B）））在L4期野生型和选定的突变菌株中荧光共聚焦图像（倒置LUT），其中突触活性受到影响。（A）L4期野生型DD树突中AChR簇（Pflp-13：：ACR-12：：GFP）的荧光共聚焦图像，以及受突触活性影响的选定突变菌株。（B）L4期野生型DD1树突棘（Pflp-13：：myrGFP）和nrx-1（wy1155）空突变体的荧光共聚焦图像（倒置LUT）。（C）L4野生型和nrx-1（wy1155）空突变体中DD1树突棘数量的定量。学生的 t-test，****p<0.0001。柱，均值±SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s008
（TIF）
S8 图 树突状钙反应在 nrx-1 突变体中严重降低。
显示峰值 ΔF/F 的散点图o在野生型acr-16（ok789）;acr-12（ok367），nrx-1（wy778），nrx-1（nu485）和nrx-1（ok1649）突变体的5s胆碱能光刺激期间，GABA能DD运动神经元树突的响应。 所有基因型共表达 Pflp-13：：myrGCaMP6f：：SL2：：mCherry 用于测量树突状钙反应，Pacr-2：：Chrimson 用于胆碱能神经元去极化。树突状钙反应不受同源nAChR亚基acr-16缺失的显著影响，但因acr-12或nrx-1突变而显著降低。± 单因子方差分析，邓内特多重比较，****p<0.0001。野生类型控件与图 1H 相同。n ≥10只动物。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s009
（TIF）
S9 图 开发野生型和nrx-1（wy778）突变体的脊柱和AChR定位以及脊柱动力学.
（A）在孵化后16，20，24，32小时以及L4（孵化后约42-50小时）和年轻成体（YA）（孵化后约52-56小时）阶段的野生型（黑色）和nrx-1（wy778）（紫色）动物中DD棘/ 15μm的数量的定量。双向方差分析，Sidak 的多重比较检验，* p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。数据点表示平均±SEM值，数字表示每个时间点量化的动物。（B） 在孵化后 16、20 和 24 小时以及 L4 阶段（孵化后~42–50 小时）定量野生型（黑色）和 nrx-1（wy778）（紫色）动物的 DD 树突的 ACR-12：：GFP 荧光强度。双向方差分析，Sidak 的多重比较检验，**p<0.01，***p<0.001。（C）野生型动物在孵化后16-20小时在时间点为零处的DD树突棘的荧光图像（倒置LUT）的 ±SEM值。红色虚线框表示S9D图中所示的区域。（D）在S9C图中红框指示的区域的实时成像期间，在0，45和70分钟的时间点处，单个野生型DD树突脊柱（Pflp-13：：mCherry）的荧光图像（倒置LUT）。红色虚线表示脊柱生长的最大范围。（E）在孵化后16-20小时获得零点时点的nrx-1（wy778）突变DD1树突棘（Pflp-13：：mCherry）的荧光图像（倒置LUT）。红色和蓝色虚线框表示S9F图中所示的区域。（F）单个nrx-1（wy778）突变DD树突棘（Pflp-13：：mCherry）的荧光图像（倒置LUT）在（顶部）90。S9E图中红框指示的区域的实时成像期间的95分钟和100分钟时间点，以及S9E图中蓝框指示的区域的实时成像期间的555，70，75，90分钟时间点（底部）。红色虚线表示脊柱生长的最大范围。红色箭头表示脊柱动力学。（G）L4阶段时间点零处野生型DD树突棘（Pflp-13：：mCherry）的荧光图像（倒置LUT）。红色虚线框表示S9H图中所示区域。（H）在S9G图中红框指示的区域的实时成像期间，在0，30和65分钟的时间点处的单个野生型DD树突状脊柱（Pflp-13：：mCherry）的荧光图像（倒置LUT）。（I）量化野生型和nrx-1（wy778）动物在孵化后16-20小时，孵化后21-24小时和L4（孵化后约42-50小时）的脊柱事件与事件总数的比较。事件定义为在整个实时成像记录期间脊柱不稳定/修剪，伸长/形成或脊柱稳定的发生率。每5分钟采集一次DD1枝晶的Z-堆叠，持续60-160分钟。数字表示每个时间点每种基因型的事件数。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s010
（TIF）
S10 图 unc-104的突变损害了突触囊泡向背神经索中胆碱能轴突的递送，并且NRX-1内源性标记GFP定位到神经元过程。
（A）年轻成年野生型和unc-104（e1265）突变体背神经索中胆碱能突触囊泡（Pacr-2：：mCherry：：RAB-3）的荧光图像。每行上的图像来自不同的动物（每种基因型显示4个）。（B）胆碱能突触囊泡（Pacr-2：：mCherry：：RAB-3）每50μm野生型和unc-104（e1265）突变体背神经索的定量。学生的 t-test， ****p<0.0001.（C）野生型体细胞和表达胆碱能囊泡的unc-104（e1265）突变体的荧光图像（Pacr-2：：mCherry：：RAB-3）。 ±白色虚线勾勒出单元格主体的轮廓。（D）野生型和unc-104（e1265）突变体的体胆碱能突触囊泡荧光强度（AU）（Pacr-2：：mCherry：：RAB-3）的定量。学生的 t-test， ****p<0.0001.（E） NRX-1：：GFP位于神经环的神经元过程内 ±，并在L4期蠕虫的腹侧和背侧神经索过程中显示点状定位。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s011
（TIF）
S11 图 NRX-1在unc-104突变体中对胆碱能轴突的定位减少，并在胆碱能轴突末端与UNC-104共定位。
（A）野生型和unc-104（e1265）动物背神经索50μm区域中NRX-1：：GFP（内源性敲入）簇的定量。柱，均值 ± SEM. 学生的 t-检验，****p<0.0001。n ≥11只动物。（B）定量NRX-1：：GFP（内源性敲入）轴突荧光强度在背神经索50μm区域。柱，均值 ± SEM. 学生 t 检验，****p<0.0001。n ≥11只动物。（C）NRX-1：：GFP（内源性敲入）在野生型和unc-104（e1265）突变体中的荧光图像。白色虚线勾勒出神经元细胞体。（D）NRX-1：：GFP体细胞荧光强度的定量。条形图，平均± SEM. 学生考试，****p<0.001。（E）定量野生型背神经索50μm区域的NRX-1：：GFP（Punc129：：NRX-1：：GFP）簇的数量，unc-104（e1265）和unc-104（e1265）突变体用野生型unc-104的胆碱能表达获救。单因素方差分析 ±，邓内特多重比较检验，****p<0.0001。n ≥11只动物。（F）定量肾背神经索50μm区域胆碱能轴突（Punc129：：NRX-1：：GFP）中的NRX-1：：GFP荧光强度。单因子方差分析 ±，邓内特多重比较检验，****p<0.0001。n ≥11只动物。（G）NRX-1：：GFP在野生型胆碱能体细胞，unc-104（e1265）和unc-104（e1265）突变体中的荧光图像，用野生型unc-104的胆碱能表达获救。白色虚线勾勒出神经元细胞体。（H）NRX-1：：GFP荧光强度在胆碱能体中的定量。单因子方差分析 ±，邓内特多重比较检验，****p<0.001。（I）线扫描，描述NRX-1：：GFP（绿色）和UNC-104：：mCherry（红色）的相对荧光强度，用于背神经索的50μm区域。灰色虚线矩形表示S11J图中的相应点数。（J）成年动物背神经索的荧光图像，表达NRX-1：：GFP（Punc-129：：NRX-1：：GFP）和UNC-104：：mCherry（Punc-129：：UNC-104：：mCherry）。共定位由白色插入记号表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s012
（TIF）
S12 图 NRX-1的定位独立于UNC-116 / KIF5A / C，并且具有与SNB-1相似的顺行和逆行速度。
（A）来自野生型和unc-116（e2310）突变体背神经索的NRX-1：：GFP（Punc-129：：NRX-1：：GFP）的荧光图像（倒置LUT）。每行上的图像来自不同的动物（每种基因型显示5个）。（B）定量野生型和unc-116（e2310）动物背神经索50μm区域中的NRX-1簇（Punc-129：：NRX-1：：GFP）的数量。柱，均值 ± SEM. 学生 t 检验，***p<0.001。n ≥14只动物。（C）来自野生型胆碱能神经元体质和unc-116（e2310）突变体的NRX-1（Punc-129：：NRX-1：：GFP）的荧光图像。白色虚线勾勒出细胞体的轮廓。（D）从野生型胆碱能体和unc-116（e2310）突变体中定量NRX-1（Punc-129：：NRX-1：：GFP）的荧光强度。条形，表示 SEM ±。学生的 t 检验 ns，不显著。（五、法）突触囊泡的Kymographs（Punc-129：：SNB-1：：GFP）（E）和NRX-1（Punc-129：：NRX-1：：GFP）（F）从胆碱能神经元小卖点记录的运输事件。（G） SNB-1：：GFP（蓝色）和NRX-1：：GFP（橙色）沿轴突群的顺行速度（μm/秒）的量化。ns，不重要。n 所有面板≥10只动物。（H） 量化SNB-1：：GFP（蓝色）和NRX-1：：GFP（橙色）沿轴突的逆行速度（μm/秒）。ns，不重要。（I） 量化SNB-1：：GFP（蓝色）和NRX-1：：GFP（橙色）贩运事件的总数，这些事件被分箱到逆行和顺行方向。请注意，NRX-1 贩运事件的发生频率明显低于 SNB-1 事件。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s013
（TIF）
S13 图 unc-104（e1265）突变体中的活性区蛋白定位。
（A）野生型和unc-104（e1265）动物背神经索50μm区域中CLA-1：：GFP点数的散点图。学生的 t-test， ****p<0.0001.柱，均值±SEM。这些数据对应于图4C中的量化。（B）野生型和unc-104（e1265）动物中CLA-1：：GFP荧光强度在背神经索50μm区域的散点图。学生的 t-test， ****p<0.0001.（C）野生型 ±和unc-104（e1265）动物背神经索50μm区域的UNC-10：：GFP点数的散点图。学生的 t-test，****p<0.0001。柱，均值±SEM。这些数据对应于图4C中的量化。（D）野生型和unc-104（e1265）突变体中UNC-10：：GFP荧光强度在背神经索50μm区域的散射图。学生的 t-test， ****p<0.0001.（E）野生型 ±和unc-104（e1265）动物中每50μm背神经索的ELKS-1：：m樱桃点数的散点图。学生的 t-test，****p<0.0001。柱，均值±SEM。这些数据对应于图4C中的量化。（F）ELKS-1：：m樱桃荧光强度在野生型和unc-104（e1265）突变体背神经索50μm区域的散射图。学生的 t-test， ***p<0.001.柱，均值±SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s014-厦门畜牧期刊杂志论文发表
（TIF）
S14 图 在野生型和unc-104（ce782）ts动物的L3期间转向限制性温度。
（A）实验时间线的卡通描绘。将动物在13.5°C下生长至L3阶段（unc-104（ce782）突变体约120小时，野生动物96小时），然后将动物转移到25°C的限制温度下16-20小时并成像。（B）来自野生型（顶部）或unc-104（ce782）ts动物的DD棘（Pflp-13：：myrGFP）的荧光图像，在允许的温度（13.5°C）（中间图）下连续生长或在成像前移动到限制温度（25°C）16-20小时。（C）从野生型和unc-104（ce782）ts突变体中定量每15μm的DD棘。双向方差分析，Tukey的多重比较检验，****p<0.0001，n≥12只动物。数据点表示平均±SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s015
（TIF）
S1 视频。 孵化后16小时在野生动物DD1树突中F-肌动蛋白动力学的共聚焦实时成像视频（由Pflp-13：：GFP：：UtrCH标记）。为了显示，短片以3 fps显示。每5分钟采集一次图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s016
（AVI）
S2 视频。 在L4阶段野生动物的DD1树突中F-肌动蛋白动力学的共聚焦实时成像视频（由Pflp-13：：GFP：：UtrCH标记）。为了显示，短片以3 fps显示。每5分钟采集一次图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s017
（AVI）
S3 视频。 野生型DD树突棘（Pflp-13：：myrGFP）在孵化后16小时。每5分钟采集一个z-stack，至少持续1小时的成像持续时间。
对于显示，短片以 3 fps 的速度显示
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s018
（AVI）
S4 视频. nrx-1（wy778）突变DD树突棘（Pflp-13：：myrGFP）在孵化后16小时。
每5分钟采集一个z-stack，至少持续1小时的成像持续时间。对于显示，短片以 3 fps 的速度显示
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s019
（AVI）
S5 视频。 野生型DD树突棘（Pflp-13：：myrGFP）在L4阶段。每5分钟采集一个z-stack，至少持续1小时的成像持续时间。
对于显示，短片以 3 fps 的速度显示
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s020
（AVI）
S6 视频。 NRX-1：：GFP贩运年轻成年动物的胆碱能小卖部（Punc-129：：NRX-1：：GFP）。
视频以100毫秒的曝光时间录制30秒。为了显示，视频以25 fps显示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s021
（AVI）
S7 视频. SNB-1：：GFP贩运年轻成年动物的胆碱能小卖部（Punc-129：：SNB-1：：GFP）。
视频以100毫秒的曝光时间录制30秒。为了显示，视频以25 fps显示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010016.s022
（AVI）
确认
线虫菌株由Caenorhabditis遗传学中心提供，该中心由NIH国家研究资源中心资助。感谢Dori Schafer访问3D渲染Imaris软件。感谢Dirk Albrecht的实验室对水凝胶固定的建议。感谢Dong Yan，Kang Shen，Andres Maricq，Michael Nonet，Peri Kurshan和Gert Jansen的实验室提供试剂。感谢Peri Kurshan分享未发表的结果。感谢William Joyce和Michael Gorczyca的技术援助。感谢史蒂夫·库克（Steve Cook）在分析电子显微镜照片方面的帮助，以及约翰·怀特（John White）使用N2U电子显微镜照片的帮助。最后，我们感谢弗朗西斯实验室成员的手稿评论。
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