内源性产生的儿茶酚胺改善TLR9活化的B细胞的调节功能-厦门畜牧期刊杂志论文发表
纳丁·洪克 ，托斯滕·洛因，比尔吉特·奥普吉努尔斯，纳米尔·沙巴尼，亚历山大?劳特温，约翰·泰哈罗，马蒂亚斯·施耐德，格奥尔格·庞格拉茨
出版日期： 2022年01月24日
抽象
交感神经系统（SNS）通过促进抗炎B细胞来促进免疫平衡。然而，B细胞是否具有调节调节B细胞（Breg）功能的自我调节机制尚不清楚。在这项研究中，我们研究了B细胞在用不同的B细胞激活剂刺激时合成自己的儿茶酚胺的能力，并发现产生儿茶酚胺所需的酪氨酸羟化酶（TH）的表达受到Toll样受体（TLR）9的上调。TH的TLR9依赖性表达与肾上腺素能受体（ADR）的上调，白细胞介素（IL）-10的产生增强以及协同抑制配体的程序性死亡配体1（PD-L1）和Fas配体（FasL）的过表达相关。此外，伴随的 ?1-3-ADR 刺激与 B 细胞受体 （BCR）/TLR9 刺激一起明显增强 Bregs 的抗炎潜力，以抑制 CD4 T 细胞，CD4 T 细胞是自身免疫性疾病发病机制的关键群体，如类风湿性关节炎 （RA）。此外，在胶原诱导的关节炎（CIA）过程中，TH上调也在B细胞中得到证实，CIA是研究RA的小鼠模型。总之，我们的数据表明，B细胞具有自主机制，以自分泌和/或旁分泌方式调节其调节功能。这些发现有助于更好地了解B细胞在自身免疫性疾病调节中的功能以及SNS的相互作用。
数字
Fig 7Table 1Fig 1图2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Table 1Fig 1图2Fig 3
引文：Honke N，Lowin T，Opgenoorth B，Shaabani N，Lautwein A，Teijaro JR等人（2022）内源性产生的儿茶酚胺改善了TLR9激活的B细胞的调节功能。PLoS Biol 20（1）：e3001513。https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513
学术编辑：Takeshi Tsubata，東京醫科牙科大學醫學研究所，日本
收到：七月 14， 2021;接受：十二月 10， 2021;发表：一月 24， 2022
版权所有：? 2022 鸿科等人。这是一篇根据知识共享署名许可协议条款分发的开放获取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。
数据可用性：原始的 fcs。在此项目期间生成的文件已存档在Zenodo（https://doi.org/10.5281/zenodo.5666505）。所有其他相关数据均在白皮书及其支持信息文件中。
资金：N.H.得到了德国联邦研究金（DFG）奖学金（PO801/8-1）的支持。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
相互竞争的利益：作者宣布不存在相互竞争的利益。
缩写：ADR，肾上腺素能受体;方差分析，方差分析;APC，抗原呈递细胞;BCR，B细胞受体;布雷格，调节B细胞;CFA，完整的弗氏佐剂;中央情报局，胶原蛋白诱导的关节炎;CII，II型胶原蛋白;EAE，实验性自身免疫性脑脊髓炎;法斯尔，法斯配体;FBS，胎牛血清;GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶;HRP，辣根过氧化物酶;IL，白细胞介素;异丙肾上腺素，异丙肾上腺素;L-3，4-二羟基苯丙氨酸;LPS，脂多糖;MACS，磁性激活细胞分选;MFI，平均或中位荧光强度;MHC-II，主要组织相容性复合物II类;NE，去甲肾上腺素;NET，去甲肾上腺素转运蛋白;neurosensor_521 NS_521;ODN，寡脱氧核苷酸;PD-L1，程序性死亡配体1;PI，碘化丙啶;PNMT， 苯乙醇胺 N-甲基转移酶;聚I：C，聚肌苷酸;qRT-PCR，定量实时聚合酶链反应;RA，类风湿性关节炎;RQ，相对数量;SNS，交感神经系统;TD，T细胞依赖性;TGF-?，肿瘤生长因子β;TH，酪氨酸羟化酶;TI，T细胞独立;TLR，Toll样受体;VMAT，囊泡单胺转运蛋白;WT，野生型
介绍
免疫系统需要检查点来防止对自身抗原的反应。错误的检查点抑制可导致多种疾病和自身免疫性疾病。虽然中枢耐受性负责删除自身反应性适应性免疫细胞，但外周耐受被认为是控制原发性淋巴组织中逃脱缺失的淋巴细胞的二线检查点。交感神经系统（SNS）可能是这些过程的调节因子之一，因为一些研究表明SNS影响自身免疫性疾病的发展和严重程度，如类风湿性关节炎（RA）[1]。在小鼠中消耗SNS表明，SNS的影响取决于疾病的阶段，在胶原诱导的关节炎（CIA）的早期阶段具有促炎作用，在胶原诱导的关节炎（CIA）的晚期具有抗炎作用[2]。虽然早期促炎SNS介导的机制是由非特异性全身效应提供的，例如增加能量提供，更高的血液和淋巴流量以及淋巴细胞的募集增加，但晚期抗炎作用已被提出对适应性免疫更具特异性，并涉及调节细胞和白细胞介素（IL）-10[1，3，4]。在人类中，在活动性RA患者中观察到SNS活性的增加[5]和迷走神经的电刺激，这导致脾脏中交感神经递质释放的其他影响，显示出一些缓解作用[6]。
在之前的几项研究中已经显示出强烈的神经免疫相互作用[7–9]。例如，表达酪氨酸羟化酶（TH）[10]的交感神经，儿茶酚胺，神经支配淋巴器官和肠道相关淋巴组织生物合成的关键酶，其神经纤维末梢与巨噬细胞和T和B淋巴细胞等免疫细胞密切接触[11，12]。虽然免疫细胞衍生的细胞因子调节SNS，但神经递质如去甲肾上腺素（NE），肾上腺素和从SNS释放的神经肽可以影响几种免疫细胞的功能[13，14]。对儿茶酚胺的反应需要G蛋白偶联肾上腺素能受体（ADR）的表达。这些受体对免疫细胞的影响以前已经过表征[15–17]。在几种ADR亚型中，?2-ADR是研究最多的，在自身免疫性疾病中具有双向作用[18]。
B细胞是RA发病机制的主要参与者之一，因为它们可以产生自身抗体[19，20]，并且效应B细胞激活CD4 + T辅助细胞，这可能会使受影响关节的情况恶化[21，22]。调节性B细胞（Bregs）最近成为焦点，因为对小鼠的研究表明，它们不仅对减少慢性炎症至关重要[23，24]，而且在改善自身免疫性疾病和维持耐受性方面也有效[3，25–27]。在小鼠中已经描述了几种不同的Breg亚群，其表面标记和功能相似[28–34]。除了IL-10分泌外，Bregs的免疫抑制能力或检查点活性还与IL-35[35]，肿瘤生长因子β（TGF-?）[36]和抑制性共刺激分子的产生有关，例如程序性死亡配体1（PD-L1）[37，38]和Fas配体（FasL）[39，40]。
由于已知Bregs的功能由SNS介质支持，但另一方面，交感神经纤维在慢性炎症期间丢失[10，41]，我们假设B细胞具有自我维持的交感神经备份机制，以调节其在慢性炎症期间的Breg功能。
结果
B细胞有自己的儿茶酚胺合成机制
需要几种酶来形成儿茶酚胺，如去甲肾上腺素（NE;去甲肾上腺素）和/或肾上腺素（肾上腺素），从氨基酸酪氨酸[42]开始（图1A）。该过程中的第一个和限速酶是TH，它将酪氨酸转化为L-3，4-二羟基苯丙氨酸（L-Dopa），而苯乙醇胺N-甲基转移酶（PNMT），该级联反应中的末端酶，将NE代谢为肾上腺素（图1A）。首先，我们测试了B细胞是否表达儿茶酚胺生物合成所需的酶。从幼稚的DBA / 1J小鼠的脾脏中分离B细胞，并用抗B细胞受体（BCR）IgM和Toll样受体（TLR）9激动剂CpG独立激活T细胞。 类似地，用抗IgM / CpG激活B细胞增加了PNMT的蛋白质水平（图1D，S1B图），将其NE转化为肾上腺素。为了评估来自DBA / 1J小鼠的B细胞TH表达的增加是否具有特异性，另外分离并研究了来自其他小鼠品系的脾B细胞的TH表达。来自C57BL / 6和BALB / c小鼠的B细胞在用抗IgM / CpG激活后也以与DBA / 1J小鼠相似的方式增加了TH表达（S2A图）。由于儿茶酚胺会影响RA的严重程度，我们想知道B细胞是否在小鼠CIA期间上调TH，这是一种用于研究RA的自身免疫模型。在DBA / 1J小鼠中诱导CIA，并且随着时间的推移监测TH的表达，显示关节炎过程中的增加（图1E）。这表明在CIA期间在体外或体内激活的B细胞上调酶，这些酶是独立于SNS合成自己的儿茶酚胺所必需的。
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图 1.B细胞有自己的儿茶酚胺合成机制。-厦门畜牧期刊杂志论文发表
(A）儿茶酚胺生物合成途径的图形描述。（B–D）用抗IgM / CpG激活B细胞24或48小时或保持未活化。通过蛋白质印迹（B）和流式细胞术（C; 0 h： n = 10; 24 h， 48 h： n = 13）分析TH的表达。通过蛋白质印迹（D）检查PNMT的表达。显示一个代表性的3印迹（B，D;n = 3）。（E）DBA / 1J小鼠用100μlCII和CFA乳液免疫。0，8，16和24 d后，通过MACS分离免疫小鼠的脾B细胞，并通过流式细胞术（n = 4）分析TH表达。图中显示了一个具有代表性的点阵图（C、E）。TH和PNMT表达与管家蛋白GAPDH（B，D）相关。完整的蛋白质印迹图像可在S1图中找到。数据来自6个实验（C）。Brown-Forsythe和Welch单因子方差分析检验，然后是Tamhane T2多元比较检验（C）和普通单因子方差分析，然后是Dunnet多元比较检验（E）确定统计学意义。不重要;*p < 0.5;**p < 0.01;p < 0.0001。有关基础数据，请参 阅S1 数据。方差分析，方差分析;CFA，完整的弗氏佐剂;CII，II型胶原蛋白;GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶;MACS，磁性激活细胞分选;PNMT， 苯乙醇胺 N-甲基转移酶;TH，酪氨酸羟化酶。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.g001
儿茶酚胺以时间/刺激依赖性的方式产生
儿茶酚胺由交感神经纤维分泌，从而影响其他细胞的功能。一些免疫细胞产生自己的儿茶酚胺[43–45]，但目前尚不清楚这是否是一个受调节的过程。为了研究儿茶酚胺的产生是否取决于效率和活化的持久性，B细胞要么用BCR刺激抗IgM，TLR9激动剂CpG激活，要么两者（BCR / TLR9）激活，要么不治疗。通过使用neurosensor_521（NS_521）可视化细胞内儿茶酚胺的积累，NS_521是一种与多巴胺和NE特异性反应的荧光染料。活化4小时后，与未刺激的B细胞相比，B细胞显示出儿茶酚胺水平升高（图2A）。此外，仅用抗IgM活化B细胞导致儿茶酚胺的产生最少，而大多数儿茶酚胺是在用抗IgM / CpG活化时产生的（图2A）。用利血平（一种特殊的、不可逆的囊泡单胺转运蛋白（VMAT）1和2抑制剂）处理B细胞，导致B细胞中内源性儿茶酚胺的严重消耗（图2A）。此外，用NE处理B细胞，一种以浓度依赖性方式作用于α和β-ADR的激动剂[46]，减少细胞中的内源性儿茶酚胺，类似于抑制剂利血平（图2A）。然而，在长期活化（24小时）后，细胞内染色显示儿茶酚胺水平较低，因此，我们假设儿茶酚胺从细胞中释放出来（图2A）。除了流式细胞术外，免疫荧光研究还支持我们的结果，即B细胞在短期孵育后上调细胞内儿茶酚胺，而长期刺激似乎促进产生的儿茶酚胺的释放（图2B和2C）。为了分析儿茶酚胺是否实际从B细胞中释放出来，在活化后4小时和24小时测定B细胞和B细胞培养物上清液中多巴胺，NE和肾上腺素的浓度。我们发现所有研究的儿茶酚胺在4小时后在B细胞中是可检测到的（图2D），并且已经从细胞中部分释放，而在长期刺激（24小时）后，大多数NE和肾上腺素在B细胞中减少，在上清液中可检测到（图2D）。总之，我们的研究结果表明，B细胞与抗IgM / CpG的协同激活导致儿茶酚胺的产生增强，儿茶酚胺随着时间的推移由B细胞释放。
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图 2.儿茶酚胺以时间/刺激依赖性的方式产生。
(A）B细胞用抗IgM，CpG或抗IgM / CpG活化4小时或24小时，并同时用利血平（1μM）或NE（10μM）处理1小时或未处理。作为对照组，使用未活化的B细胞。通过流式细胞术测量NS_521（5μM）的MFI。显示了与对照组相关的 MFI （n = 6）。包括门控策略和代表性直方图。（B， C）将抗IgM / CpG激活的B细胞培养4小时或24小时，未活化的B细胞作为对照组。用NS_521（10μM;绿色）和Dapi（蓝色）染色的培养B细胞的免疫荧光。图像是用蔡司AxioVision显微镜以40×放大倍率拍摄的。比例尺表示 20 μm（主图像）和 10 μm（插图）。显示3个代表性图像之一（B;n = 3）。使用AxioVision软件（C; NS_521n = 34 B 细胞/条件）。（D） 1 × 107用抗IgM / cpG（5μg/ ml / 1.25μg / ml）激活来自DBA / 1J小鼠的脾B细胞4小时和24小时或保持灭活。将M30二盐酸盐（MAO抑制剂，1μM，Tocris，目录号：6067）和OR-486（COMT抑制剂，1μM，Tocris，目录号：0483）加入培养的B细胞中以减少儿茶酚胺降解。孵育后，将EDTA（1mM）和焦亚硫酸钠（4mM）补充到细胞培养基和B细胞沉淀中，以进一步防止儿茶酚胺降解。B细胞在超声波化下在水中裂解。将细胞碎片在4°C下以1，500×g离心10分钟。 多巴胺，NE和肾上腺素的浓度通过裂解的B细胞和B细胞培养物上清液（n = 3-4）中的竞争性ELISA测定。图中包括培养基对照（上清液组）和水对照（B细胞）。统计学显著性由普通单因素方差分析确定，然后进行邓内特多重比较检验（A）或学生t检验（C，D）。不重要;*p < 0.5;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。有关基础数据，请参 阅S1 数据。方差分析，方差分析;COMT， 儿茶酚-邻甲基转移酶;乙二胺四乙酸乙二胺乙二醇;MAO，单胺氧化酶;MFI，中位荧光强度;NE，去甲肾上腺素;neurosensor_521，NS_521。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.g002
TLR9活化诱导B细胞中TH表达
已知B细胞分别通过刺激CD40或TLR信号通路以T细胞依赖性（TD）或T细胞依赖性（TI）方式被激活。因此，我们研究了B细胞中TH的上调是否也由TLR9激活以外的其他机制介导。为此，用TD刺激抗CD40与IL-4或配体联合TLR3，TLR4和TLR9（TI）刺激B细胞。未受刺激的B细胞作为对照。TLR9活化在诱导TH（图3A）方面最有效，尽管TLR4配体脂多糖（LPS）和抗CD40 / IL-4刺激增加了细胞表面水平的主要组织相容性复合物II类（MHC-II）和CD86类似于TLR9配体CpG（图3B）。有趣的是，较高浓度的TD和TI有丝分裂原导致活化标志物（S3A和S3B图）和TH表达（S4A图）的表达增加。此外，通过测试不同的CpG-寡脱氧核苷酸（ODN），CpG-ODN 1826是最强的激活刺激（S5A图），并且这种活化与TH的最高表达相关（S5B图）。综上所述，TLR9连接后B细胞中的TH增加。
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图 3.TLR9激活诱导B细胞中的TH表达。
(A， B）用TD刺激抗CD40（1.25μg/ mL）与IL-4（1.25ng / mL）或用不同的TI刺激（Poly I：C（TLR3;1.25μg/ mL），LPS（TLR4;1.25μg/ mL）和CpG（TLR9;1.25μg/ mL）激活B细胞24小时。作为对照组，使用未活化的B细胞。CD19 + TH + B细胞（A;n = 4）和MHC-II +，CD86 +和CD40 + B细胞（B;n = 4）通过流式细胞术定量。显示一个具有代表性的点图 （A） 或直方图 （B）。来自幼稚DBA / 1J小鼠的B细胞用于实验。统计学显著性由普通单因子方差分析确定，然后进行邓内特多重比较检验（A，B）。不重要;*p < 0.5;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。有关基础数据，请参 阅S1 数据。方差分析，方差分析;IL，白细胞介素;LPS，脂多糖;MFI，中位荧光强度;TD，T细胞依赖性;TH，酪氨酸羟化酶;TI，T细胞独立;TLR，Toll样受体。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.g003
B细胞表达儿茶酚胺受体和转运蛋白
由B细胞合成的儿茶酚胺可能以自分泌方式起作用，或通过旁分泌或内分泌机制分泌以影响其他细胞。由于ADRs的表达是用儿茶酚胺刺激的先决条件，因此我们确定了用抗IgM / CpG刺激的B细胞表达哪些ADR。测定活化时ADRA1A、ADRA1B、ADRA2B和ADRB2在B细胞上的表面表达，并与未活化的B细胞进行比较。48小时后，我们发现与未受刺激的对照细胞相比，活化的B细胞上调所有研究的ADR（图4A，S6A图），这也与TH的增强表达相关（图4B）。为了进一步分析TH的表达是否与ADRs的表达一致，我们通过流式细胞术分析了TH，ADRA1A，ADRA1B，ADRA2B和ADRB2（图4C，S6B图）的表达。我们发现未激活的B细胞要么是ADR?TH+（无响应者和生产者），ADR + TH?（响应者和非生产者），ADR + TH +（响应者和生产者）或ADR-TH?（无响应者和无生产者）。虽然激活的B细胞在不同的ADR和TH之间显示出相似的表达模式，但观察到ADR?TH? B细胞比例的降低和所有其他群体的增加（图4C）。这些数据表明，TLR9刺激的B细胞可能以自分泌和/或旁分泌方式被它们自己的单胺调节。单胺转运蛋白控制单胺神经递质的细胞外浓度。因此，我们还测试了B细胞是否表达儿茶酚胺转运蛋白并且能够调节儿茶酚胺的摄取。在B细胞中研究了3种不同转运蛋白的表达：去甲肾上腺素转运蛋白（NET），VMAT-1和VMAT-2。后者负责儿茶酚胺穿梭到囊泡中[47，48]，而NET介导儿茶酚胺从细胞外空间的再摄取[49]。在未受刺激的B细胞中，我们在质膜上检测到NET，而VMAT-1和VMAT2位于细胞内（图4D，S6C图）。与未活化的B细胞相比，活化的B细胞显示出所有3种转运蛋白的细胞内水平增加（图4E）。此外，通过用荧光儿茶酚胺染料处理未刺激的B细胞NS_521，可视化细胞内儿茶酚胺。观察到的染色模式表明B细胞中儿茶酚胺的囊泡储存（图4F），这也表明利血平处理后儿茶酚胺减少，如上所述。通过在存在或不存在H +偶联VMAT阻滞剂（利血平）的情况下，将非活化和抗IgM / CpG激活的B细胞与选择性荧光VMAT2底物（FFN200二盐酸盐）一起孵育来评估转运蛋白的功能。我们证实了非活化和活化的B细胞对FFN200的摄取（图4G）。用泛VMAT抑制剂利血平的额外治疗阻断了FFN-200的摄取，导致荧光强度降低。总之，我们发现B细胞具有通过其ADR对儿茶酚胺作出反应的先决条件，并且能够在细胞内运输和储存儿茶酚胺，以便以后从细胞中释放。
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图 4.B细胞表达儿茶酚胺受体和转运蛋白。
(A–C）B细胞用抗IgM / CpG活化24小时和48小时，未活化的B细胞用作对照组（0小时）。（A） 通过流式细胞术测定所有分析的ADR（0小时：n = 7;24小时，48小时：n = 12）的MFI。浇注策略在S6A图中可用。（B）48 h后定量TH与ADR表达的相关性（n = 12）。（C） 通过流式细胞术（0 h： n = 7; 24， 48 h： n = 12）分析不同ADR和TH表达（ADR+TH?，ADR+TH+，ADR?TH+和ADR?TH?）的表达。对照组（0 h）和激活后（48 h）的门控策略和代表性点图如图S6B所示。（D， E）将未活化的B细胞（D）或抗IgM / CpG激活的B细胞（E）培养24小时。标记的单胺转运蛋白的MFI通过流式细胞术（n = 7）测定。浇口策略在S6C图中可用。（F） 将未活化的B细胞在37°C和5%CO下用NS_521（10μM）染色30分钟2.通过免疫荧光组织学分析产生儿茶酚胺的B细胞。使用蔡司AxioVision显微镜以40×放大倍率捕获荧光图像。图中显示了 3 张具有代表性的图像之一。比例尺 = 5 μm （n = 3）。（G）未活化和活化的B细胞用利血平处理45分钟或未处理。之后，将细胞与FFN200二盐酸盐（10μM）孵育1.15小时，FFN200二盐酸盐和利血平未处理的细胞用作对照。用板多模读数仪（n = 6）测量FFN-200二盐酸盐的荧光强度。对于实验，使用来自幼稚DBA / 1J小鼠的B细胞。数据来自5个实验（A-C）。统计显著性由单因素方差分析确定，然后是Tukey多元比较检验（A），Brown-Forsythe和Welch方差分析检验，然后是Dunnett T3多元比较检验（C，G），学生t检验（D，E）。使用线性回归分析连续变量，用皮尔逊相关（B）计算r值。不重要;*p < 0.5;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。有关基础数据，请参 阅S1 数据。ADR，肾上腺素能受体;方差分析，方差分析;MFI，平均荧光强度;neurosensor_521 NS_521;TH，酪氨酸羟化酶。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.g004
TH 上调与 IL-10 生产相关
在以前的研究中，我们发现离体β2-ADR刺激以增加B细胞衍生的IL-10产生[4]。在这项研究中，我们证实，通过qRT-PCR（图5A），ELISA（图5B，S7B图）和流式细胞术（S7A图）评估，用抗IgM / CpG激活诱导DBA / 1J小鼠B细胞中的IL-10表达。B细胞诱导的IL-10表达与C57BL / 6和BALB / c小鼠相当（S2B图）。根据我们的发现，CpG增加了TH水平，我们还证实，在不同类别的CpG-ODN中，CpG-ODN 1826增强了IL-10的产生（S5C图）。较高浓度的TD（抗CD40 / IL-4）和TI丝裂原（LPS，Poly I：C）也能够诱导IL-10的产生（S4B图），但与CpG活化相比，水平较低（图5B）。因此，CpG不仅增加TH表达，而且还诱导调节性IL-10阳性B细胞表型，通过流式细胞术证实，在TLR9刺激后，不同类型的Breg群体及其TH表达百分比增加（图5C，S8和S9图）。 此外，TGF-β和IL-35的表达也得到了增强（图5D）。接下来，我们通过流式细胞术研究了TH的表达是否与B细胞中IL-10的产生有关。近80%的IL10+B细胞为TH阳性（图5E），显示出儿茶酚胺的产生能力与调控功能的强关联。此外，通过使用特异性TH抑制剂3-碘-L-酪氨酸抑制TH导致B细胞IL-10产生显着减少（图5F），而B细胞活力不受该处理的影响（S10图）。从这些数据中，我们得出结论，TLR9激动剂导致B细胞的内在TH上调和分化成不同类型的Breg群体，同时增加IL-10的产生。
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图 5.TH上调与IL-10的产生有关。
(A）B细胞用抗IgM / CpG激活4小时和24小时或保持未活化。IL-10的表达通过qRT-PCR（n = 6）测定。（B） B细胞被指示的TD或TI刺激（抗CD40;聚硅：C，液化石油钾，氯丙酮：1.25微克/毫升;抗 IgM： 5 微克/毫升;IL-4：1.25纳克/毫升）。未活化的B细胞用作对照。通过ELISA（n = 8）在细胞培养物上清液中测量IL-10的产生。（C）B细胞用抗IgM / CpG激活或未处理。48 h后，通过流式细胞术分析Breg群体及其TH和IL-10表达，并与对照B细胞（0 h）（n = 4）进行比较。指示的Breg群体及其特征表面标记物的门控策略在S8和S9图中可用。指示基因的表达通过qRT-PCR（n = 6）确定。（E）B细胞用抗IgM / CpG活化24小时或保持未活化。采用流式细胞术（n = 8）分析CD19 + TH +，CD19 + IL-10 +，TH + IL -10 +和IL10 + TH + B细胞的表达。图中显示了一个具有代表性的点图。（F）B细胞用不同浓度的TH抑制剂3-碘-L-酪氨酸处理30分钟，然后用抗IgM / CpG活化。通过ELISA（n = 5）分析细胞上清液中IL-10的产生。使用来自幼稚DBA / 1J小鼠的B细胞进行实验。数据来自3（E）或4（B）实验。统计学意义由学生t检验 （C， E） 与韦尔奇校正 （A， D） 或布朗-福赛斯和韦尔奇单因素差分析检验 （B） 或普通单因素方差分析，然后邓内特多重比较检验 （F） 确定。不重要;*p < 0.5;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。有关基础数据，请参 阅S1 数据。方差分析，方差分析;酶联免疫吸附测定;IL，白细胞介素;LPS，脂多糖;聚I：C，聚蚯：聚胞苷酸;qRT-PCR，定量实时聚合酶链反应;TD，T细胞依赖性;TH，酪氨酸羟化酶;TI，T细胞非依赖性。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.g005
β-ADR的活化可增强B细胞衍生的IL-10的产生
由于抗IgM / CpG激活的B细胞上调了几种ADR，因此我们检查了ADR信号传导对于获得调节表型是否重要。为此，用激动剂处理α1-，α2-，β2-和β3-ADR的抗IgM / CpG引发的B细胞，或用拮抗剂处理α2-和β2-ADR。α1-和α2-ADR的活化导致IL-10产生的显着和浓度依赖性降低（图6A），而阻断α2-ADR升高IL-10水平（图6B）。相比之下，用亚型特异性β-ADR激动剂刺激B细胞可增强IL-10的产生（图6A），而抑制β2-ADR可降低IL-10水平（图6B）。此外，同时用非选择性β-ADR激动剂异丙肾上腺素刺激所有不同的β-ADR，进一步增强了IL-10的产生（图6C）。这种作用被泛-β-ADR拮抗剂纳多洛尔抑制（图6C）。此外，β-ADR刺激促进了独立于CpG激活的IL-10的产生，并显着提高了CpG诱导的IL-10水平（图6D）。这些数据表明，B细胞衍生的IL-10的产生是通过整合?-ADR和α-ADR信号来确定的，因此取决于B细胞附近的儿茶酚胺浓度进行调节。
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图 6.β-ADR的活化可增强B细胞衍生的IL-10的产生。
(A）将抗IgM / CpG激活或未活化的B细胞培养4小时，并另外用不同浓度的α1，α2或β-ADR激动剂处理24小时（n = 6）。（B）B细胞在用指定浓度的α2-ADR拮抗剂RS79948盐酸盐或用?2-ADR拮抗剂ICI118，551处理前30分钟用抗IgM / CpG活化24小时（n = 4）。（C）B细胞要么在用抗IgM / CpG活化前30分钟用β-ADR拮抗剂纳多洛尔[5μM]处理，要么首先用抗IgM / CpG活化4小时，然后用泛β-ADR激动剂Isopr处理细胞。（10微米）（n = 12）。IL-10的产生通过ELISA（A-C）进行分析。（D）B细胞用NE（10μM），CpG（1.25μg/ ml）或两者（CpG + NE）培养4小时，未处理的B细胞作为对照组。通过qRT-PCR分析IL-10 mRNA表达（n = 6）。使用来自幼稚DBA / 1J小鼠的B细胞进行实验。数据从3（D）或5个实验（C）中汇集。统计显著性由普通单因素方差分析确定，然后是邓内特多重比较检验（A，B）或图基多重比较检验（C）或布朗-福赛斯和韦尔奇方差分析检验，然后是Tamhane T2多重比较检验（D）。不重要;*p < 0.5;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。有关基础数据，请参 阅S1 数据。ADR，肾上腺素能受体;方差分析，方差分析;酶联免疫吸附测定;IL，白细胞介素;异丙肾上腺素;NE，去甲肾上腺素;qRT-PCR，定量实时聚合酶链反应。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.g006
IL-10改善Breg功能以抑制T细胞
Bregs抑制或抑制由CD4 + T细胞介导的炎症，主要是T辅助1细胞（Th1）[50，51]，这是在RA等自身炎症性疾病的发病机制中起关键作用的主要群体之一。为了证明CIA期间抗原引发Bregs的发展，在与CD3 / CD28激活和eFluor450标记的CD4 +标记的CD4 +脾细胞共培养之前，将来自CIA小鼠的B细胞与II型胶原（CII）抗原或肽脉冲。我们发现CII抗原脉冲B细胞而不是CII肽引发的B细胞以浓度依赖性方式抑制CD4 T细胞的增殖（S11图）。然而，由TLR9激活产生的Bregs具有或不伴随的?-ADR刺激也能够以类似的方式抑制CD4 + T细胞的增殖（图7A和7B）。此外，CpG预活化B细胞的β-ADR刺激进一步增强了CD4 + T细胞抑制（图7A和7B）。即使单独使用异丙肾上腺素也会略微抑制独立于CpG激活的T细胞增殖（图7A-7C）。这些结果表明，CpG引发的Bregs具有最高的抑制CD4 + T细胞诱导的炎症的能力，这另外通过β-ADR刺激增强（图7A和7B）。几种机制负责Breg介导的免疫抑制。为了确定IL-10在CpG诱导的CD4 + T细胞抑制中的作用，将抗IL-10耗尽抗体添加到共培养基中，与同种型对照抗体相比，导致CD4 + T细胞的抑制降低（图7D）。此外，分析是否通过IL-10，野生型（WT）和IL-10介导通过β-ADR刺激增强抑制CD4 + T细胞增殖?/?使用小鼠。伊尔-10?/?与WT小鼠相比，小鼠未能通过额外的?-ADR刺激来增强CD4 T细胞增殖的抑制（S12图），这表明在β-ADR刺激后增强的T细胞增殖抑制是由IL-10介导的。然而，与WT小鼠相比，CpG治疗后的基础抑制水平已经更高，这表明IL-10的代偿机制?/?B 细胞。除了IL-10，Bregs还通过PD-L1[37，38]和FasL[39，40]等表面蛋白损害T细胞功能。因此，我们确定了TLR9活化产生的Bregs是否显示出这些蛋白质的表达增强。事实上，我们证明了与未处理的细胞相比，PD-L1和FasL在TLR9激活的B细胞上均显着上调（图7E）。然而，表达水平不依赖于β-ADR刺激（图7E和7F）。为了评估细胞间相互作用，细胞因子产生或两者在抑制CD4 + T细胞增殖方面的影响，进行了跨孔实验。然而，在这种情况下，TLR9激活的B细胞促进CD4 + T细胞增殖而不是抑制它（图7G）。这种增加的增殖是由于IL-10的存在，因为IL-10的消耗显着降低了CD4 + T细胞增殖（图7G）。总之，TLR9活化的B细胞主要以细胞 - 细胞接触依赖性方式抑制CD4 + T细胞增殖，并且通过IL-10和?-ADR信号传导的额外存在显着增强了这种抑制。
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图 7.IL-10改善Breg功能以抑制T细胞。
(A–G）DBA/ 1J小鼠用100μlCII和CFA乳液免疫。14-21天后，通过MACS分离免疫小鼠的脾B细胞，使用B细胞耗尽的脾细胞进行共培养和转孔实验。用CpG（1.25μg/ mL），Isopr预活B细胞。（10 μM），或 NE （10 μM）单独或组合或未经处理。用细胞增殖染料eFluor 450标记脾细胞，并在与B细胞共培养72小时之前用CD3 /CD28活化C细胞活化。通过流式细胞术监测CD4 + T细胞的增殖（A，B，C和D）（B，C：n = 11;D：n = 6）。图中显示了一个具有代表性的直方图（A、D）。（E， F）通过流式细胞术（PDL-1，FasL：n = 12）在72小时后在联合培养的B细胞上分析PD-L1和FasL的表达。（G）CpG预活化B细胞和CD3/CD28活化脾细胞分别使用转孔培养，并额外处理抗IL-10耗竭或抗IgG同种型对照抗体。72 h后，通过流式细胞术（n = 6）分析CD4 + T细胞的增殖。数据来自4个实验（B，C，E和F）。PI是使用在每个除法峰值中测量的事件数来计算的。统计学意义由普通单因子方差分析（B-D，F）或布朗-福赛斯和韦尔奇方差分析确定，然后进行Tamhane T2多元比较检验（E，G）。不重要;*p < 0.5;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001）。有关基础数据，请参 阅S1 数据。方差分析，方差分析;布雷格，调节B细胞;CFA，完整的弗氏佐剂;CII，II型胶原蛋白;法斯尔，法斯配体;IL，白细胞介素;异丙肾上腺素;MACS，磁性激活细胞分选;NE，去甲肾上腺素;PD-L1，程序性死亡配体1;PI，扩散指数。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.g007
讨论
在这项研究中，我们报告说，TLR9激活的B细胞不仅表达增加的儿茶酚胺产生酶的水平，如TH和PNMT，而且还具有以时间和刺激依赖性的方式合成自身儿茶酚胺的能力。此外，它们采用内源性儿茶酚胺进行自分泌和/或旁分泌信号传导，以影响其功能，并具有α和β-ADR以及单胺转运蛋白，其控制儿茶酚胺的摄取和储存。此外，IL-10的产生与TH相关和调节，TLR9-Bregs抑制CD4 + T细胞的能力主要由共抑制表面分子（例如PD-L1和FasL）的表达增加介导，但通过?-ADR刺激增加IL-10产生来增强。
神经系统和免疫系统之间通过交感神经纤维之间的相互作用非常重要。这种相互作用的干扰被证明与几种免疫系统疾病有关，不仅在病毒感染期间[52]，而且在自身免疫性疾病中[ 53–55]。其中，B细胞是SNS的靶标，一些研究表明这种相互作用具有重要的生理作用，例如，在特异性和多克隆抗体产生的背景下[9，56，57]。应有一种额外的备用策略，以在慢性炎症期间外周交感神经丧失时恢复缺乏脑控制的情况[10，41]。B细胞补偿肾上腺素能信号传导减少的能力可以被认为是局部预防免疫系统和免疫病理学过度激活的检查点机制之一。
我们发现B细胞在功能上能够补偿慢性发炎组织中交感神经纤维的损失，因为它们具有合成，感知和运输儿茶酚胺所需的蛋白质，从而抑制CD4 + T细胞增殖。单独使用B细胞是否可以接管在慢性发炎的关节和组织中失去的交感神经的儿茶酚胺能信号传导，或者是否需要其他细胞的支持，必须在进一步的研究中研究。在这种情况下，关于B细胞产生的儿茶酚胺的量以及完全补偿交感神经纤维损失所需的浓度的问题出现了。然而，我们发现阻断TH导致纯B细胞培养物中IL-10产生减少，这强调了B细胞儿茶酚胺产生对B细胞调节功能的重要性。我们测定了B细胞和B细胞培养物上清液中多巴胺，NE和肾上腺素的浓度。B细胞的短期活化增加了B细胞中所有研究的儿茶酚胺的浓度及其从细胞中的部分释放。而长期活化显示B细胞中儿茶酚胺的浓度降低，上清液中的含量升高。这是B细胞合成多巴胺，NE和肾上腺素并随后从细胞中释放这些儿茶酚胺的证据。与从活化和非活化细胞中提取的上清液相比，培养基对照显示更高的多巴胺浓度，这可以解释为B细胞从培养基中摄取儿茶酚胺的能力的指示。据我们所知，这是第一项全面表征B细胞中儿茶酚胺代谢的研究。
NS_521用于直接检测和监测B细胞中的儿茶酚胺含量。使用这种荧光染料，我们证明了儿茶酚胺可以通过流式细胞术在B细胞中检测到，并且它们通过VMAT介导的摄取机制储存在突触样囊泡中，从而模仿神经元组织的进一步功能方面。儿茶酚胺含量的监测以前只在以HPLC[58，59]或毛细管电泳检测和电化学检测[43，44]表征的色度细胞中进行。据我们所知，这是第一次直接观察免疫细胞中的儿茶酚胺代谢。
ADR也在其他免疫细胞上表达，如T细胞[60]。不同的研究表明，通过这些受体的信号传导对于调节其功能很重要，循环T细胞中β2-ADR的信号传导受损会促进免疫性疾病，如RA[16，18，61]。T细胞是否也受到B细胞产生的儿茶酚胺的调节功能的影响还有待确定。一些作者提出，T细胞也表达TH[62，63]，并且与本报告中描述的B细胞类似的机制也可能对T细胞或其他表达TH的免疫细胞有效。然而，也有免疫细胞，如巨噬细胞，它们确实表达儿茶酚胺的转运蛋白，使它们能够吸收儿茶酚胺，但不能自行合成它们[64]。总体而言，这些发现表明整个免疫系统中存在一个分化和独立的交感神经系统，该系统不一定由CNS等更高级别的系统控制。
Bregs影响各种免疫细胞，例如，通过抑制Th1和Th17细胞的分化[50，1]或通过影响单核细胞和树突状细胞的细胞因子产生[50，65]，同时促进调节性T细胞的扩增[66–68]。 在共培养实验中，我们发现TLR9激活的Bregs能够通过IL-10支持的抑制性细胞 - 细胞接触分子的表达来抑制CD3 / CD28激活的CD4 + T细胞的增殖。TLR9活化后PD-L1和FasL在B细胞上的强上调表明，这些抑制分子对抑制CD4 + T细胞增殖至关重要。此外，我们证明了通过IL-10和?-ADR信号传导的产生进一步增强了Breg介导的通过细胞表面分子的抑制。通过膜（转孔）分离活化的B细胞和脾细胞不会导致CD4 T细胞的抑制，但反之亦然，增加了T细胞增殖。这表明IL-10等可溶性因子不能自给自足地直接增强T细胞抑制，而是增强细胞表面信号。这一假设得到了先前的一项研究的支持，该研究表明，用不同浓度的重组IL-10处理活化的T细胞不会直接抑制增殖，而是首先影响抗原呈递细胞（APC），然后抑制T细胞[69]。此外，IL-10对B细胞的调节作用已经在早期的研究中得到证实[70，71]。IL-10是否影响细胞抑制分子（例如PD-L1，FasL）的表达以直接增加B细胞的细胞接触依赖性抑制活性目前尚不清楚，但先前的数据表明IL-10诱导的PD-L1在单核细胞上的表达[75，76].对我们数据的另一种解释是，IL-10直接影响T细胞抑制，但仅在存在来自细胞抑制分子的信号传导的情况下。
在几种自身免疫性疾病的实验小鼠模型中，观察到Breg功能降低[77]。这与人类研究一致，显示产生IL-10的Bregs在活动性自身免疫性疾病中的减少或功能障碍，如系统性硬化症[78，79]，ANCA相关的血管炎[80，81]，RA[82–84]或系统性红斑狼疮[73]。观察表明，当患者处于缓解期时，Breg数量恢复到正常水平。这些观察结果表明，增强Breg功能或离体数量并将这些细胞转移回宿主可以改善疾病并恢复促炎和抗炎信号之间的平衡。事实上，在一些实验小鼠模型中，已经证实Bregs转移回宿主可以改善几种自身免疫性疾病，包括CIA[77，85]，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）[86]或狼疮[31]。SNS在这方面的积极作用得到了先前实验的支持，该实验表明，只有从具有完整SNS的小鼠转移脾B细胞，而不是从交感神经切除小鼠转移的B细胞才能改善CIA [4]。
在本研究中，我们发现超过80%的产生IL-10的B细胞也表达TH。对CpG诱导的Bregs的详细分析揭示了表达Breg群体的不同TH +和IL-10的发育，这些群体已被鉴定为边缘B区细胞（B220 + CD1d + CD21 / 35 + CD9 +），浆母细胞（B220 + CD138 + CD44hi），T2-MZP B细胞（CD19 + CD1hiCD23hiCD24hi）和CD1d + Tim-1 + CD5 + B细胞。由于活化的B细胞中TH的增加，我们建议TH作为至少TLR9活化的B细胞的一般标志物。如果TH也可以被归类为Bregs的额外生物标志物，则需要进一步的研究来获得有关其在Bregs中长期表达的信息。
然而，先前的一项研究证实，TH表达与细胞的抗炎特性之间存在一般联系，因为体外产生的TH +依赖性抗炎神经元细胞的过继转移导致小鼠CIA显着降低[87]。虽然TH表达导致疾病改善的确切机制没有报道，但作者假设儿茶酚胺的产生很重要。这些发现与我们的结果一致，因为活化的B细胞在TLR9激活后增加TH，并且在CIA过程中，产生儿茶酚胺并通过增加IL-10增强抑制作用。然而，我们的研究结果还表明，儿茶酚胺对B细胞功能的影响取决于表达的ADR亚型的模式，因此不是静态的，而是可能取决于决定这些模式的背景因素。虽然通过?-ADR的额外刺激显着改善了Breg功能，但通过α-ADR激活减少了IL-10的产生。?-ADR信号通路在增加IL-10中起着重要作用，这得到了其他最新出版物的支持[88，89]。在这种情况下，我们证明了同时激活所有β-ADR亚型，而不仅仅是β2-ADR，协同增加IL-10的产生，而阻断β-ADR或刺激α-ADR降低了IL-10的水平。这些结果表明，儿茶酚胺的量与B细胞的抗炎电位之间存在很强的联系，因为例如，NE优先与低浓度的α-ADR结合，在高浓度下与?-ADR结合[46]。这些发现可能有助于开发新的治疗策略，例如Bregs的离体生成和随后的自体转移，或者通过在当前的治疗方案中加入β-ADR激动剂或α-ADR拮抗剂来增加Breg在自身免疫中的功能。
在这项研究中，我们首次表明TLR9激活的B细胞类似于神经元，能够合成，储存和释放儿茶酚胺。此外，B细胞吸收并响应儿茶酚胺，这对于通过功能性β-和α-ADR以自分泌和/或旁分泌方式调节Breg功能非常重要。此外，我们通过提供数据表明IL-10不能自给自足地促进T细胞免疫抑制，而是增强细胞接触依赖性抑制机制，从而为Breg功能的一般理解做出了贡献。此外，我们建议TH可以被认为是活化的B细胞的一般标志物。综上所述，B细胞中这种有趣的、自我维持的儿茶酚胺系统以及其他免疫细胞都可能被用来开发免疫介导疾病的新治疗策略。
材料和方法
小 鼠
所有实验均在北莱茵-威斯特法伦州（德国杜塞尔多夫）的授权下，根据德国动物保护法，将动物安置在单个通风笼子中的动物进行。雄性DBA / 1J小鼠，6至10周龄，最初从Janvier Labs（法国鲁贝）购买。C57BL / 6和BALB / c小鼠从ZETT（德国杜塞尔多夫）获得。伊尔-10?/?小鼠从J.G. Bode教授和Ehlting.C博士（德国杜塞尔多夫大学医院胃肠病学，肝病学和感染学诊所）获得。每个笼子里饲养5只动物，并在温度和光照的标准条件下随意喂食标准的实验室食物和水。动物护理符合机构准则。所有实验方案均由北莱茵-威斯特法伦州国家自然、Umwelt und Verbraucherschutz （LANUV） 批准。
中央情报局
雄性DBA / 1J小鼠（8至10周龄）在其尾巴底部用含有牛CII（2mg / ml，Chondrex，Redmond，Redmond，Washington，USA OF AMERICA）的100μl乳液在其尾巴底部进行皮内免疫，以产生CIA。乳液的制备是根据制造商的协议完成的。在初始注射后的指定时间点使用小鼠。
抗体
一抗。
抗α-1A肾上腺素能受体（ADRA1A，Abcam，剑桥，英国，克隆：EPR9691（B））;抗α-1B肾上腺素能受体（ADRA1B，Abcam，克隆：EPR 10336）;抗α-2B肾上腺素能受体（ADRA2B，Abcam，克隆：EPR9623）;抗β-2肾上腺素能受体（ADRB2，Abcam，克隆：EPR707（N））;anti-CD1d-PE-Vio770 （Miltenyi Biotec， Bergisch Gladbach， Germany， Clone： 1B1）;抗CD4-APC-Vio770 （Miltenyi Biotec， Clone： REA604）;抗CD5-PerCp-Vio700 （Miltenyi Biotec， Clone： REA421）;抗CD9-APC（Miltenyi Biotec，克隆：MZ3）;抗CD19（APC，PE，VioBright-Fitc，Miltenyi Biotec，克隆：6D5）;抗CD21/ 35-VioBright B515（Miltenyi Biotec，克隆：REA800）;抗CD23-APC（Miltenyi Biotec，克隆：REA1068）;抗CD24-APC-Vio770 （Miltenyi Biotec， Clone： REA743）;抗CD40-APC（Miltenyi Biotec，克隆：FGK45.5）;anti-CD44-VioBright Fitc （Miltenyi Biotec， Clone： REA644）;抗CD45R （B220）-APC-Vio770 （Miltenyi Biotec， Clone： RA3-6B2）;抗CD86-APC-Vio770 （Miltenyi Biotec， Clone： PO3.3）;抗CD138-APC （Miltenyi Biotec， Clone： REA104）;anti-Fas Ligand-APC （FasL， CD178， eBioscience， Thermo Fisher Scientific， Clone： MFL3）;抗白细胞介素-10（IL-10-PE，Miltenyi-Biotec，克隆：JES5-16E3）;抗白细胞介素-10（R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国;克隆：JES052A5）用于耗尽;抗主要组织相容性复合物II（MHC-II-PE（Miltenyi Biotec，克隆：REA610）;抗去甲肾上腺素转运蛋白（NET，Alomone，目录号：AMT-002）;抗程序性死亡配体1（PD-L1-PE/Cy7，BioLegend，英国伦敦，克隆：10F.9G2）;抗Tim-1-APC（Miltenyi Biotec，克隆：REA692）;抗酪氨酸羟化酶-Alexa Fluor488和抗酪氨酸羟化酶-PE（TH，FACS：Abcam，克隆：EP1533Y）;抗囊泡单胺转运蛋白-1（VMAT-1，Alomone，目录号：AMT-007）; 抗水泡单胺转运蛋白-2（VMAT-2，Alomone;目录号：AMT-006）。
二抗。
Goat anti-rabbit IgG H&L-Alexa Fluor 488 （Abcam，目录号：ab150077）。
同种型控制。
兔IgG-PE和兔IgG-Alexa Fluor 488，单克隆（Abcam，克隆：EPR25A）;兔IgG，单克隆（Abcam，克隆：EPR25A）;兔IgG，多克隆（Abcam，目录号：ab37415）;大鼠IgG kappa（eBioscience，Thermo Fisher Scientific，Clone：eBRG1）;大鼠IgG 2bk-PE / Cy7（生物遗传学，克隆：RTK4530）;亚美尼亚仓鼠IgG-APC（eBioscience，Thermo Fisher Scientific，Clone：eBio299Arm）;大鼠IgG2ak（APC，APC-Vio770，PE，PerCpVio700，VioBright-Fitc，Miltenyi Biotec，克隆：ES26-15B7.3）;大鼠IgG2bk（APC-Vio770，PE，PE-Vio770，Miltenyi Biotec，克隆：ES26-5E12.4）;和REA控制（APC，APC-Vio770 PE，VioBright Fitc，VioBright B515;Miltenyi Biotec，Clone：REA293）。
B细胞分离
根据制造商的协议，通过磁性激活细胞分选（MACS）与小鼠B细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotech，目录号：130-090-862）通过阴性选择分离来自幼稚或免疫DBA / 1J小鼠的脾小鼠B细胞。纯度由流式细胞术控制，为98%。B细胞消耗的脾细胞用于T细胞抑制测定。
B细胞培养
在罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养的脾小鼠B淋巴细胞（Gibco，Thermo Fisher Scientific，佩斯利，英国），含有GlutaMax（200mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽），25mM HEPES（2（-4-羟乙基）-1-哌啶基）乙酰磺酸）并补充10%（v / v）胎牛血清（FBS;Gibco，Thermo Fisher Scientific），10，000 U / mL（v / v）青霉素 - 链霉素（Gibco，Thermo Fisher Scientific）和0.1%（v / v）2-巯基乙醇（?-ME，默克，德国达姆施塔特）。B细胞培养物在含有5%CO的37°C下维持2.
B细胞的活化
用不同浓度的TI丝裂原LPS（德国斯坦海姆的Sigma-Aldrich，目录号：L2630），聚肌苷 - 多胞苷酸钠盐（Poly I：C，Sigma，目录号：P1530）和CpG（小鼠TLR9激动剂试剂盒，InvivoGen，目录号：tlrl-kit9m）或TD丝裂原抗CD40（Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国;克隆：1C10）联合或不联合重组白细胞介素-4（IL-4，Miltenyi Biotec，目录号：130-094-061）24小时。在S5图中测试了不同的CpG-ODN后，CpG-ODN 1826（1.25μg/ml，InvivoGen，目录代码：tlrl-1826-1）用于本研究的所有进一步实验。对于BCR活化，用5μg/ mL抗IgM F（ab'）2（μ链）片段处理细胞（Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pennsylvania，目录号：115-006-075）。
用不同的ADR激动剂和拮抗剂治疗B细胞
对于ADR配体的体外刺激，在2.5×10接种脾B细胞596孔板中的每孔细胞。B细胞在活化前30分钟与泛β-ADR拮抗剂纳多洛尔[5μM，Sigma-Aldrich]或指定浓度的α和β-ADR拮抗剂一起孵育，然后用5μg/ mL抗IgM和1.25μg/ mL CpG处理，或首先用抗IgM / CpG活化4小时，然后用指定浓度的α或β-ADR激动剂孵育24小时。： ADRA1： （R）-（-）-去氧肾上腺素盐酸盐（英国布里斯托尔托克里斯，目录号：2838），ADRA2：盐酸右美托咪定（托克利斯，目录号：2749），ADRB2：L-（-）-NE （+）-酒石酸联盐一水合物（西格玛奥德里奇，目录号：A9512），ADRB3：CL316243二钠盐（托克里斯，目录号：1499），ADRB：（-）-盐酸异丙孕烯醇（西格玛-奥尔德里奇，目录号：I6504）。拮抗剂：ADRA2：RS79948盐酸盐（Tocris，目录号：0987），ADRB2：ICI 118，551盐酸盐（Tocris，目录号：0821）。
单胺转运蛋白VMAT-1/2的功能
为了测试儿茶酚胺转运蛋白VMAT-1 / 2的功能，将抗IgM / CpG激活或未活化的B细胞与或不与利血平（5μM，Tocris，目录号：2747）一起孵育抗IgM / CpG激活或非活化的B细胞（5μM，Tocris，目录号：2747），VMAT-1和VMAT-2抑制剂45分钟。然后，将B细胞与FFN200（10μM，Tocris，目录号：5911）孵育B细胞，这是VMAT-2的选择性底物1.15小时。荧光强度在多模读板仪Infinite 200 PRO（Tecan，M?nnedorf，瑞士）中进行定量。
总RNA提取、cDNA合成和定量实时聚合酶链反应
使用RNA Mini Kit（德国希尔登Qiagen）从MACS分选的脾B细胞中分离RNA。使用纳米光度计（德国慕尼黑Implen）进行RNA的定量。RNA用定量逆转录试剂盒（Qiagen）反向转录为cDNA。基因表达分析是用Qiagen[IL-10]和Eurofins[IL-12α，Ebi3]的引物测定进行的;Tgfb2， B2m;表 1]对于定量分析，所有靶基因的表达水平都根据β-2-微球蛋白（B2m;Δ周期阈值[Ct]）进行归一化。对于IL-10、IL-12α、Ebi3和Tgfb2，则用δδCt（ΔΔCt）方法计算基因表达值，对照组的平均值是比较所有其他样品的校准品。 相对量（RQ）通过等式RQ = 2确定?ΔΔCt.
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表 1.用于定量逆转录 PCR 的引物。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.t001
免疫荧光组织学
为了儿茶酚胺的可视化，用抗IgM / CpG处理B细胞4小时和24小时或未处理。之后，将细胞固定在2%PBS /甲醛中，然后在37°C下用NS_521（10μM，绿色）染色30分钟。 细胞核用DAPI（蓝色）染色，DAPI补充在ProLong Gold试剂（Invitrogen，卡尔斯巴德，德国）中。
抑制 TH
通过用不同浓度的3-碘-L-酪氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：18250）处理B细胞来抑制TH活性，在用抗IgM / CpG激活前30分钟。
流式细胞术
将脾B细胞在室温（RT）下用2%PBS /甲醛固定20分钟，并用FcR封闭试剂（Miltenyi Biotec，目录号：130-092-575）处理10分钟以抑制非特异性Fc受体结合。对于细胞表面染色，将B细胞与抗NET，抗VMAT-1和抗VMAT-2一抗一起孵育30分钟以检测儿茶酚胺转运蛋白，或与抗ADRA1A，抗ADRA1B，抗ADRA2B和抗ADRB2一起孵育30分钟以评估ADR的表达。此外，加入PE偶联抗CD19抗体10分钟，之后，将B细胞与二抗Alexa488偶联山羊抗兔（1：2，000）在4°C下孵育30分钟。 对于所有其他表面染色，使用未固定的B细胞，并且仅在染色额外的细胞内标志物时固定。
对于儿茶酚胺转运蛋白和TH的细胞内染色，B细胞另外用Inside Perm（Miltenyi Biotec）进行透化，并用未标记的一抗抗NET，抗VMAT-1和抗VMAT-2或直接抗TH-PE或抗TH-Alexa488偶联抗体染色。30分钟后，将细胞与继发性山羊抗兔Alexa488标记的抗体（1：2，000，用于儿茶酚胺转运蛋白）孵育30分钟，或者使用MacsQuant分析仪10（Miltenyi Biotec）直接分析（TH）。对于细胞内细胞因子染色，在5mg / mL brefeldin A（BFA，Sigma，目录号：B6542）存在下用抗IgM / CpG激活或非活化B细胞以防止细胞因子释放。4小时后，将B细胞与抗CD19-VioBright FITC抗体在4°C下孵育10分钟，在室温下用2%PBS /甲醛固定20分钟，并在4°C下用InsidePerm（Miltenyi Biotec）进行透化，然后与抗IL-10-PE偶联抗体（Miltenyi Biotec）孵育。
为了检测活化标记物，将未固定的B细胞与抗CD86-APC-Vio770，抗MHC-II-PE和抗CD40-APC结合抗CD19-VioBright FITC孵育10分钟。
对于所有一抗，均使用相关同种型对照抗体。使用MACSQuant分析仪10（Miltenyi Biotec）研究染色的B细胞，并使用FlowJo和Flowlogic软件进行分析。
酶联免疫吸附
酶联免疫吸附测定（小鼠IL-10 ELISA套装;BD OptEIA，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国，目录号：555282），2-CAT（N-D）研究ELISA（ImmuSmol，Talence，法国，目录号：BA-E-5500）和肾上腺素/肾上腺素ELISA（LSBio，西雅图，华盛顿州，美国，目录号：LS-F5372）是根据制造商的说明进行的。
T细胞抑制测定
来自免疫DBA / 1J小鼠的脾细胞用细胞增殖染料eFluor 450（10μM;eBioscience，Thermo Fisher Scientific，目录号：65-0842-90）标记，并用1μg/ mL可溶性抗CD3e（eBioscience，Thermo Fisher Scientific，Clone：eBio500A2）和1μg/ mL可溶性抗CD28（eBioscience，Thermo Fisher Scientific，Clone：37.51）抗体激活。用CpG（1.25μg/ mL）预活自体B细胞4小时，或在存在或不存在?-ADR激动剂NE（10μM）或异丙肾上腺素（10μM）的情况下保持未活化。预活化后，用PBS洗涤B细胞两次，然后将其用于共培养和转孔实验。在96孔板（Greiner Bio-One，德国索林根）中以1：2的比例在cRPMI培养基中以1：2的比例在cRPMI培养基中共培养活化和eFluor450标记的脾细胞，在37°C和5%CO下共培养72小时2.
为了测试IL-10和PD-L1和FasL在抑制CD4 + T细胞中的作用，B细胞要么与脾细胞共同培养，要么通过进行转孔实验将其分离。对于转孔实验，将预活化的B细胞放入96孔插入物的上腔中，并将活化的eFluor450标记的脾细胞加入下腔室，用膜（孔径：3μm，Sigma-Aldrich）分离，并且两者都含有cRPMI培养基。为了评估IL-10对CD4 + T细胞增殖的直接影响，将抗IL-10耗尽抗体（5μg/ mL）和大鼠IgG kappa（5μg/ mL）同种型对照抗体用于共培养和转孔实验。72小时后，将细胞与抗CD19-VioBright-Fitc，anti-PD-L1-PE / Cy7和anti-FasL-APC孵育以分析参与T细胞抑制的B细胞上的表面标志物，并与CD4-APC-Vio770一起通过流式细胞术（MACSQuant分析仪10，Miltenyi Biotec）研究T细胞增殖。在分析之前，将碘化丙啶（PI，Miltenyi Biotec）添加到细胞中。通过相对定量对照组的平均荧光强度（MFI）来确定CD4 + T细胞增殖的抑制。与对照组相比，较高的MFI表明CD4 T细胞增殖受到抑制，而较低的MFI显示CD4 T细胞增殖增加。
B 淋巴细胞与 CII 的脉动
通过MACS分离来自CIA小鼠的脾B细胞和B细胞耗尽的脾细胞。用细胞增殖染料eFluor 450（10μM）标记脾细胞，并用可溶性抗CD3e（1μg/ ml）和可溶性抗CD28（1μg/ ml）抗体活化。在CII抗原或肽（50μg/ ml和100μg/ ml）存在下培养自体B细胞。24小时后，用PBS洗涤两次CII脉冲B细胞，并与活化的B细胞耗尽的脾细胞在37°C和5%CO下共培养72小时2在96孔板中以1：2的比例。通过流式细胞术监测CD4 + T细胞增殖。将CII抗原在56°C下孵育30分钟，得到CII肽。
膜联蛋白 V-FITC 结合测定
根据制造商的说明，使用膜联蛋白V Fitc细胞凋亡检测试剂盒（德国海德堡BD）标记未经处理（对照）和3-碘-L-酪氨酸处理的B细胞。在分析之前，将PI（Miltenyi Biotec）添加到B细胞中，然后通过流式细胞术（MacsQuant分析仪10;Miltenyi Biotec）。双重标记程序可以区分活细胞（膜联蛋白 V -/PI-）、早期凋亡细胞（膜联蛋白 V +/PI-）、晚期凋亡细胞（膜联蛋白 V+/PI+）和坏死细胞（膜联蛋白 V -/PI+）。
蛋白质印迹分析
将来自幼稚DBA1 / J小鼠的分离的脾B细胞在裂解缓冲液（50mM Tris-HCl，pH 8.0;150mM NaCl;2mM EDTA;1%NP-40;0，1%SDS;1%脱氧胆酸钠;1mM正当酸钠;1mM PMSF;50mM氟化钠;蛋白酶抑制剂鸡尾酒（1x））中匀浆，在冰上5分钟，在液氮中速冻（冷冻/解冻循环2x），并在4°C下离心10分钟，10，000 g。 在细胞上清液中测定蛋白质浓度，与Rotiload（1：4，Bio-Rad，Feldkirchen，德国）混合，并在95°C下煮沸5分钟。 通过12.5%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离总B细胞蛋白（10μg），并在硝酸纤维素膜（Bio-Rad）上以30mA转印90分钟。在室温下用5%（w / v）吸墨级脱脂奶粉（Bio-Rad）封闭1小时后，用TBST洗涤膜并在4°C下孵育过夜，然后与一抗：抗TH（1：1，000，默克微孔，AB152）孵育。用TBST洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗（1：2，000，德国汉堡Dako，目录号：P0448）在室温下孵育2小时。作为参考，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）来计算靶蛋白的水平。对于可视化，使用蛋白质ECL溶液（鲁米诺，对羟基香豆蔻酸，DMSO）和ChemiDoc触摸成像系统（Bio-Rad）。使用图像实验室5.2.1软件（Bio-Rad）分析蛋白质斑点。
统计学
使用Prism 8（GraphPad Software，La Jolla，California，USA）进行统计分析。应用2尾学生t检验对2组样本的差异进行统计学意义检验。比较涉及2组以上的样本，通过单向方差分析（ANOVA）评估统计学意义。如果 2 组数据集之间的方差显著不同，则进行学生t检验或具有韦尔奇校正的单因素方差分析。对于每个实验，图形图例中都提到了具体的统计检验。如果没有另行说明，每个数据点表示来自单个小鼠的B细胞。样本数量（n）在图例中表示。数据来自至少2个独立实验，除非在图例中另有说明。数据以平均±SD表示。统计显著性水平设定为n.s.，不显著;*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 或****p < 0.0001。
道德声明
根据德国动物保护法，在德国"北莱茵-威斯特法伦州北部地区-威斯特法伦州地区"（LANUV）的批准下进行了动物实验（批准号：84-02.04.2016.A281和84-02.04.2016.A283）。动物护理和文献由德国杜塞尔多夫杜塞尔多夫海因里希-海涅大学（ZETT）的"Zentrale Einrichtung für Tierforschung und wissenschaftliche Tierschutzaufgaben （ZETT）"监督。
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图 1B图例.1C图例.1D图例.1E图 2A图 2B图 2C图 2D图 3A图 3B图 4A图 4B图 4C图 4D图 4E图 4F图 4G图 5A图例.5B图 5C图 5D图 5E图 5F图 6A图 6B图 6C图 6D图例 7B图例.7C图例.7D图例.7E图7F图7GS2Fig.AS2Fig.BS3Fig.AS3Fig.BS4Fig.AS4Fig.BS5Fig.AS5Fig.BS5Fig.CS7Fig.AS7Fig.BS10Fig.AS10菲格.BS11飞S12Fig.
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S1 图用抗 IgM/CpG 活化可增加 B 细胞中的 TH 和 PNMT 表达。
( A，B）B细胞用抗IgM / CpG活化24或48小时或保持未活化（0小时）。通过蛋白质印迹分析TH（A）和PNMT（B）的表达。显示 3 张具有代表性的全免疫印迹图像之一，具有 TH （A）、PNMT （B） 和 GAPDH （A， B） 表达（n = 3）。有关基础数据，请参 阅S1 数据。GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶;PNMT， 苯乙醇胺 N-甲基转移酶;TH，酪氨酸羟化酶。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.s002
（英文）
S2 图来自C57BL / 6和BALB / c小鼠的B细胞在激活后提高TH和IL-10表达。
( A，B）来自C57BL / 6和BALB / c小鼠的脾B细胞用抗IgM / CpG激活24小时或48小时或保持未活化（0小时）。TH（A）和IL-10（B）的表达通过流式细胞术（n = 4）测量。显示每个时间点的门控策略和一个代表性点图。使用普通单因子方差分析，然后进行Tukey多重比较检验（BALB / c）和Brown-Forsythe和Welch ANOVA，然后进行Tamhane T2多重比较检验（C57BL / 6）。*p < 0.5;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。有关基础数据，请参 阅S1 数据。方差分析，方差分析;TH，酪氨酸羟化酶。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.s003
（英文）
S3 图较高浓度的TD-/TI刺激可增加B细胞活化。
( A，B）B细胞用不同浓度的TD丝裂原（A：抗CD40 / IL-4）或TI丝裂原（B：Poly I：C，TLR3;LPS，TLR4）24小时。作为对照组，使用未活化的B细胞。通过流式细胞术测定B细胞活化标志物MHC-II，CD86和CD40的MFI在B细胞表面（A;n = 6 和 B;n = 4）。对于实验，使用来自幼稚DBA / 1J小鼠的B细胞。使用普通单因素方差分析进行比较。不重要;*p < 0.5;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。有关基础数据，请参 阅S1 数据。方差分析，方差分析;LPS，脂多糖;MFI，中位荧光强度;MHC-II，主要组织相容性复合物-II;聚I：C，聚蚯：聚胞苷酸;TD，T细胞依赖性;TI，T细胞独立;TLR，Toll样受体。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.s004
（英文）
S4 图较高浓度的 TD-/TI 刺激可提高 TH 和 IL-10 表达。
( A，B）B细胞用不同浓度的TD有丝分裂原抗CD40 / IL-4或不同浓度的TI丝裂原TLR3（Poly I：C）或TLR4（LPS）活化24小时。作为对照组，使用未活化的B细胞。（A） 通过流式细胞术测定CD19 + TH + B细胞的表达（TD：n = 6; TI： n = 4）和（B）通过ELISA分析了IL-10的产生（TD：n = 6; TI： LPS： n = 6;Poly I：C： n = 4）。使用来自幼稚DBA / 1J小鼠的B细胞进行实验。统计学意义由Brown-Forsythe和Welch方差分析测试确定，然后是Dunnett T3多重比较（A，B：IL-4，ANTI-CD40和IL-4 / ANTI-CD40）或普通单因子方差分析，然后是Dunnett多重比较测试（A，B：LPS和Poly I：C）。*p < 0.5;**p < 0.01;p < 0.0001。有关基础数据，请参 阅S1 数据。酶联免疫吸附测定;LPS，脂多糖;聚I：C，聚蚯：聚胞苷酸;TD，T细胞依赖性;TH，酪氨酸羟化酶;TI，T细胞独立;TLR，Toll样受体。
-厦门畜牧期刊杂志论文发表
（英文）
S5 图CpG-ODN 1826增加活化标志物，TH和IL-10表达。
(A–C）B细胞被不同类别的CpG-ODNs激活：ODN 1585（A类）;ODN 1826（B类）和ODN 2395（C类）24小时，使用用C-ODNs处理的非活化B细胞作为对照。B细胞活化标志物MHC-II，CD86和CD40（A;n = 4）和CD19 + TH + B细胞的表达（B;n = 4）通过流式细胞术测定。细胞培养物上清液中IL-10的量通过ELISA（C;n = 8）。对于实验，使用来自幼稚DBA / 1J小鼠的B细胞。数据来自4个实验（C）。学生t检验（A-C）用于比较。不重要;*p < 0.5;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。有关基础数据，请参 阅S1 数据。C-ODNs，控制寡脱氧核苷酸;酶联免疫吸附测定;MFI，中位荧光强度;MHC-II，主要组织相容性复合物-II;ODNs，寡脱氧核苷酸;TH，酪氨酸羟化酶。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.s006
（英文）
S6 图B细胞表达ADR和转运蛋白。
( A，B）B细胞用抗IgM / CpG活化24小时和48小时，未活化的B细胞用作对照组（0小时）。图中显示了用于检测ADRA1B（A）以及ADR和TH表达的门控策略，包括所有研究ADR（B）的代表性点图。（C）未活化的B细胞用于检测单胺转运蛋白。图中显示了用于检测 VMAT-1 的门控策略。ADRA1B，肾上腺素能受体α1b;TH，酪氨酸羟化酶;VMAT-1，囊泡单胺转运蛋白1。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.s007
（英文）
S7 图来自DBA / 1J小鼠的B细胞在激活后增加IL-10表达。
(A， B） 2.5 × 105将来自DBA / 1J小鼠的脾B细胞用抗IgM / CpG活化24小时和48小时或保持未活化（0小时）。通过流式细胞术测量IL-10的表达（A;n = 4）和培养的B细胞（B;n = 4）。显示每个时间点的一个代表性点图（A）。统计学显著性由普通单因子方差分析确定，然后进行Tukey多重比较检验（A，B）。*p < 0.5;p < 0.0001。有关基础数据，请参 阅S1 数据。方差分析，方差分析;IL，白细胞介素。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.s008
（英文）
S8 图Bregs和MZ B细胞在抗IgM / CpG激活后扩增。
( A、B）B细胞被抗IgM/CpG激活或未经处理。48 h后，通过流式细胞术分析Bregs（CD19 + CD1d +，Tim-1 +，CD5 +和CD5-）（A）和MZ B细胞（B220 +，CD1d +，CD21 / 35 + / CD9 +和CD9-）（B）的TH和IL-10表达，并与对照B细胞（0 h）进行比较。将显示门控策略。布雷格，调节B细胞;MZ，边缘区;TH，酪氨酸羟化酶。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.s009
（英文）
S9 图T2-MZP细胞和浆母细胞在抗IgM / CpG激活后扩增。
( A、B）B细胞被抗IgM/CpG激活或未经处理。48小时后，T2-MZP（CD19+，CD1d你好， CD24你好， CD23你好和CD23-）（A）和浆母细胞（B220 + CD44 + CD138 +和CD138-）（B）通过流式细胞术分析TH和IL-10表达，并与对照B细胞（0小时）进行比较。门控策略是 shown.TH 酪氨酸羟化酶。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.s010
（英文）
S10 图TH抑制剂对B细胞存活没有影响。
( A，B）B细胞用0.5mM的TH抑制剂3-碘-L-酪氨酸处理30分钟，然后用抗IgM / CpG活化24小时。作为对照组B细胞未得到处理。（A）用流式细胞术（n = 6）分析活细胞（PI-膜联蛋白V-），早期凋亡（PI-膜联蛋白V+），晚期凋亡（PIAnnexin V）和坏死细胞（PI +膜联蛋白V-）的表达。图中显示了 6 个具有代表性的点图之一。（B）活B细胞的频率是通过流式细胞术（n = 6）确定的。对于实验，使用来自幼稚DBA / 1J小鼠的B细胞。学生t检验 （B） 用于比较。不重要。有关基础数据，请参 阅S1 数据。PI，碘化丙啶;TH，酪氨酸羟化酶。++
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.s011
（英文）
S11 图CII抗原引发的B细胞抑制CD4 T细胞增殖。
通过MACS分离来自CIA小鼠的脾B细胞和B细胞耗尽的脾细胞。用细胞增殖染料eFluor 450（10μM）标记脾细胞，并用可溶性抗CD3e（1μg/ ml）和可溶性抗CD28（1μg/ ml）抗体活化。在CII抗原或肽（50μg/ ml和100μg/ ml）存在下培养自体B细胞24小时，然后与活化的B细胞耗尽的脾细胞在37°C和5%CO下共培养72小时2在96孔板中以1：2的比例（B细胞：脾细胞）进行。通过流式细胞术监测CD4 + T细胞增殖（n = 6）。图中显示了一个具有代表性的直方图。使用普通单因素方差分析进行比较。不重要;*p < 0.5;**p < 0.01;p < 0.0001。有关基础数据，请参 阅S1 数据。Ag，抗原;方差分析，方差分析;CII，II型胶原蛋白;中央情报局，胶原蛋白诱导的关节炎;MACS，磁性激活细胞分选;肽，肽。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.s012
（英文）
S12 图?-ADR衍生的IL-10增加对CD4 T细胞增殖的抑制。
来自WT和IL-10的B细胞?/?小鼠通过MACS分离。用细胞增殖染料eFluor 450（10μM）标记脾细胞，并用可溶性抗CD3e（1μg/ ml）和可溶性抗CD28（1μg/ ml）抗体活化。B细胞用CpG活化或用NE或Isopr额外处理。4小时，然后与活化的自体脾细胞共同培养。未活化和未处理的B细胞作为对照组。通过流式细胞术监测CD4 + T细胞增殖（n = 5）。PI是使用在每个除法峰值中测量的事件数来计算的。使用普通单因素方差分析进行比较。不重要;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。有关基础数据，请参 阅S1 数据。方差分析，方差分析;异丙肾上腺素，异丙肾上腺素MACS，磁性活化细胞分选;NE，去甲肾上腺素;PI，扩散指数。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001513.s013
（英文）
确认
我们感谢Katharina Krebber为qRT-PCR设计引物。
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