用于量化单细胞空间和时间动力学的深度学习管道

欧文?奥康纳，拉赞·阿尔纳哈斯，让-巴蒂斯特·卢加涅 ，玛丽·邓禄普

出版日期： 2022年01月18日

抽象

显微镜软件和硬件的改进大大加快了图像采集的速度，使分析成为生成定量单细胞数据的主要瓶颈。虽然存在用于在延时图像中分割和跟踪细菌的工具，但大多数需要人工输入，专门用于实验设置，或者缺乏准确性。在这里，我们介绍DeLTA 2.0，这是一个纯粹的Python工作流程，可以快速准确地分析二维表面上单个细胞的图像，以量化基因表达和细胞生长。该算法使用深度卷积神经网络从延时图像中提取单细胞信息，训练后不需要人工输入。DeLTA 2.0保留了原始版本的所有功能，该版本针对母机微流体装置中生长的细菌进行了优化，但将结果扩展到二维生长环境。二维环境代表了一类重要的数据，因为它们在实验中更直接地实现，它们为使用细胞共培养物的研究提供了潜力，并且它们可用于量化空间效应和多代现象。然而，由于细胞数量的指数级增加，分割和跟踪在二维空间中更具挑战性。为了展示这一新功能，我们分析了抗生素耐药性和易感细胞的混合群体，并跟踪了几代人的极性年龄和生长速度。除了二维功能之外，我们还对代码进行了几项重大改进，以提高可访问性，包括能够接受许多标准显微镜文件格式作为输入，并引入了Google Colab笔记本，以便用户可以试用该软件而无需在其本地计算机上安装代码。DeLTA 2.0速度很快，对于具有数百个细胞的完整电影，运行时间不到10分钟，并且非常准确，错误率约为1%，使其成为分析延时显微镜数据的强大工具。

作者简介

延时显微镜可以生成大型图像数据集，跟踪单细胞特性，如基因表达或随时间推移的生长速率。深度学习工具对于分析这些数据非常有用，可以识别细胞的位置并跟踪它们的位置。在这项工作中，我们引入了用于延时分析（DeLTA）的深度学习软件的新版本，该软件包括稳健地分割和跟踪在二维空间中生长的细菌的能力，例如在琼脂糖垫上或在微流体环境中。这种能力对于空间和位置效应很重要的实验至关重要，例如微生物共培养的条件，细胞间相互作用或空间模式。该软件还跟踪极地年龄，可用于分析复制老化。这些新功能加入了其他改进，例如能够直接使用许多常见的显微镜文件格式。DeLTA 2.0可以可靠地跟踪数百个低错误率的细胞，使其成为显微镜数据高通量分析的理想工具。

数字

图1图2图 3图1图2图 3图1图2图 3

引文：O'Connor OM，Alnahhas RN，Lugagne J-B，Dunlop MJ （2022）DeLTA 2.0：用于量化单细胞空间和时间动力学的深度学习管道。PLoS Comput Biol 18（1）：e1009797。https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797

编辑 器：路易斯·佩德罗·科埃略，复旦大学，中国

收到：八月 10， 2021;接受：十二月 25， 2021;发表：一月 18， 2022

版权所有：? 2022 O'Connor et al.这是一篇根据知识共享署名许可协议条款分发的开放获取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。

数据可用性：代码、安装说明和数据集位于 Gitlab 上：https://gitlab.com/dunloplab/delta。有关该软件的文档，请访问： https://delta.readthedocs.io/en/latest/。Google Colab笔记本允许用户使用自己的数据测试DeLTA 2.0，而无需在其本地计算机上安装代码，可在以下位置获得：https://colab.research.google.com/drive/1UL9oXmcJFRBAm0BMQy_DMKg4VHYGgtxZ。

资金：这项工作得到了美国国家科学基金会（https://www.nsf.gov/）2032357和1804096以及美国国立卫生研究院（https://www.nih.gov/）对MJD的资助。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

相互竞争的利益：作者宣布不存在相互竞争的利益。

介绍

显微镜硬件和软件的自动化使研究人员能够随着时间的推移生成包含细胞图像的大量数据集。例如，在最近的一项高通量实验中，Bakshi等人。图片 108 大肠杆菌通过每隔几分钟获得705个视野来几天内[1]。此外，最近的研究使用闭环显微镜和光遗传学平台来实时控制单细胞中的基因表达[2–4]。显微镜的这些改进激发了对自动图像分析的需求，因为需要手动纠错的传统方法无法跟上这些新数据集的大小或获取它们的速率。更一般地说，分割和跟踪历来需要大量的用户输入以及自定义图像处理代码或实验修改，例如使用专用荧光团[1，5–8]。这些要求限制了通量，并可能引入繁琐的实验约束。

为了解决这个问题，研究人员需要快速、准确的工具，并且需要用户最少的输入。这种需求组合非常适合基于深度学习的方法，深度卷积神经网络已经实现了对图像的快速和准确的分析。具体来说，U-Net架构已经成为用于生物医学应用的最先进的卷积神经网络[9]。U-Net使用具有收缩路径的"U"形网络架构，其中连续的卷积层应用于逐渐下采样的特征图，然后是对称扩展路径，其中输入图像的低分辨率但高级编码被上采样回原始分辨率。此外，跳过连接用于将收缩路径中使用的更精细的细节特征图与扩展路径中的上采样特征图连接起来。跳过连接允许网络保留在网络末端构建掩码所需的高分辨率信息。这种方法在细胞分割[10–14]和在延时图像中从帧到帧跟踪细胞[11，13]方面已经取得了广泛的成功。

在这里，我们专注于分析二维环境中的细菌延时显微镜数据，例如琼脂糖垫或微流控芯片内。凭借快速的细胞周期时间，小细胞尺寸和高通量微流体装置，研究人员可以在数小时或数天内生成包含数千个单细胞的大型数据集。因此，研究人员可以使用统计分析来研究等基因群体中细胞间异质性，基因表达动力学和细胞间相互作用的微妙而复杂的影响[1，6]。这导致了与抗生素耐药性相关的基本发现[8，15]，并允许对遗传部分和电路进行准确表征[16]。此外，单细胞延时分析揭示了E中的细胞分裂。大肠杆菌是不对称的，其中接受"旧"极的子细胞比接受"新"极的子细胞生长得更慢[17]。然而，这些效应是微妙的，需要测量许多除法事件来确定统计学上显着的效应[18]。直到最近，这些研究还需要对显微镜数据进行艰苦的半手动分析和管理。基于传统图像分析技术的软件，如Schnitzcells [19]，Oufti [20]和SuperSegger [21]都需要大量的用户输入和后处理。最近的一些研究提出了用于细菌细胞分割的深度学习模型，如MiSiC [10]，DeepCell [22]和Cheetah [14]，以及酵母网[12]和Cell-DETR [23]中的酵母细胞分割，但是据我们所知，没有集成的深度学习分割和跟踪管道用于细菌的二维延时分析。

在之前的工作中，我们开发了用于延时分析（DeLTA）的深度学习管道，以分析显微镜图像中的单细胞生长和基因表达[11]。DeLTA使用U-Net模型的两个实例来分割和跟踪单元。这样可以对延时短片进行快速而强大的分析。DeLTA的原始版本专注于"母机"微流体装置[24]中细胞的分割和跟踪，其中细菌被限制在狭窄的腔室中，在那里它们在单个文件行中生长。这种强大的设计简化了图像分析，并可实现运行数小时或数天的实验。然而，这种受约束的几何形状并不适合研究二维效应，例如化学信号的扩散，基于接近的效应或具有混合细胞群的共培养物。二维配置，从琼脂糖垫上生长的微克隆到微流体生长室，可用于测量细胞间相互作用的空间动力学。例子包括群体感应[25]和外排泵在抗生素存在下对邻近细胞的影响[26]。与受限于母机内的单元相比，在二维空间中分割和跟踪单元更具挑战性。随着微克隆的增长，分割变得更加困难，因为图像可以包含数百个细胞，其中任何给定的细胞可能在四面都有邻居。与跟踪相关的复杂性也急剧增加。与母机数据相比，帧到帧的分配可以限制为腔室内的少量单元（通常<10个单元），二维环境需要考虑数百个可能的分配。此外，单元格可以向任何方向移动，并且可以移动很远的距离，例如，如果在电影过程中存在漂移。

在本手稿中，我们介绍了DELTA 2.0，这是DELTA的新版本，可在二维空间中分割和跟踪单元格。DeLTA 2.0保留了原始版本的所有功能，并且与主机数据完全兼容。为了使我们的方法适应不同的用例，我们最大限度地减少了预处理和后处理步骤的数量，以便大部分分析由可训练的模型执行。新版本是开源的，并使用完全Python实现。我们还对代码进行了其他改进，以提高可访问性，例如能够处理任意大小的图像并接受许多常见的显微镜文件格式作为输入。我们表明，DeLTA 2.0可以分割和跟踪琼脂糖垫上和微流体室中生长的细菌的共培养物。除了荧光和细胞长度，DeLTA 2.0还记录了极点年龄。我们用它来记录复制老化，并比较几代人的增长率。DeLTA 2.0在拥挤的图像上表现良好，不需要人为干预。代码、安装说明和数据集可在 Gitlab 上以开源方式获得。我们还提供了一个Google Colab笔记本，供用户在自己的数据上快速测试DeLTA 2.0。

结果

DeLTA 2.0可以跟踪在二维微克隆中生长的细胞的细胞长度，生长速率，荧光和后代随时间的变化。该算法将显微镜图像作为输入。然后，它使用两个U-Net卷积神经网络模型，一个用于分割，一个用于跟踪，执行谱系重建，并输出单细胞数据（图1A）。分割生成有关细胞形态的信息，可用于识别正常和丝状细胞（图1B和1C）。跟踪步骤可以跨帧可靠地跟踪细胞，记录发生分裂事件时（图1D）。谱系重建决定了细胞如何跨代关联并记录诸如极点年龄之类的特征（图1E）。该算法输出视场内所有细胞的单细胞分辨率信息（图1F）。无需人工干预即可指定任何输入参数。这与其他方法形成鲜明对比，其他方法通常需要输入，例如像元大小或像元类型[10，19–21，27]。

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图 1.微克隆内细胞的分割和跟踪。

（A） DeLTA 管道由分割、跟踪和沿袭重建组成。（B）包含E的相差图像的分割示例。大肠杆菌微克隆，将其输入到U-Net卷积神经网络中以获得分割结果。（C）细胞长度的直方图。插图显示包含异常值的缩小版本。（D）帧之间的细胞追踪。有和没有分割的细胞追踪的代表性示例如图所示，左侧是"前一帧"的相差图像，中间是"当前帧"的相差图像，右侧是"预测"的灰度图像。"当前帧"还显示叠加的跟踪预测。"预测"显示了覆盖了地面实况的U-Net输出（S1图）。（E）谱系重建跟踪细胞谱系并记录极点年龄。（F）随时间推移的单元格长度图。黑线是一个单元格在生长和分裂时长度的代表性示例;微克隆中的所有细胞都以灰色显示。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797.g001

DeLTA 2.0可以快速而可靠地处理各种维度的数据集。为了评估其速度和准确性，我们使用了文献中的一部电影，该电影已经过分割，并通过DELTA尚未经过训练的手动校正进行了跟踪（方法）。花了8分49秒对这部包含69帧的延时电影进行了全面分析，其中最后一帧包含232 E。大肠杆菌细胞 （S1 电影）.此分析是在配备Nvidia Quadro P4000显卡的台式计算机上进行的。除了速度快之外，DeLTA还具有较低的错误率。对于测试集中分割的3，286个细胞，分割错误率为0.01%。我们将正确的分割预测定义为模型预测中的像元注释具有超过四分之三的像素与地面实况数据重叠的任何情况。这使得预测和基本事实之间的细微差异被认为是可以接受的，例如像元周长的确切位置的微小差异。此外，如果模型进行了预测，其中它错误地将两个单元格连接在一起，我们将此定义为两个错误。错误地预测分裂的单元格被计为一个错误。由于很难评估像元分裂的确切帧，因此我们没有将模型确定的除法事件比基本事实中晚或早三帧的预测计为误差。用于评估分割错误的其他指标也与我们的错误率低的发现（S2A图）很好地一致。分割模型倾向于略微细分不足，因为强调正确分类细胞边界（S2B图）。为了评估跟踪错误率，我们处理了6部E的电影。大肠杆菌生长在琼脂糖垫上，该模型尚未经过训练。在17，622个跟踪事件中，我们测量的平均错误率为1.02%。我们将正确预测定义为从一个时间点到下一个时间点的单元格分配与基本事实匹配的情况。模型将两个单元格指定为前一帧中单元格的子项，而实际上没有分裂事件，而模型在单元格实际上仍在视野内时分配了任何单元格的情况，则计为跟踪错误。

DeLTA 2.0 算法对原始版本的 DeLTA [11] 进行了多项改进。新代码是一个纯粹的Python工作流程;电影不需要在 Matlab 中进行预处理和后处理。这种转换允许整个管道存在于开源框架中。我们确实提供了可用于将输出转换为Matlab文件的代码，这些代码适用于在此环境中更愿意处理数据的用户。此外，在DELTA 2.0中，我们利用了Python的Bio-Formats工具箱[ 28，29]。这允许用户直接处理通过显微镜软件输出的许多常见格式的图像，包括nd2，czi，ome-tiff文件等等，而无需任何预格式化。我们还对代码进行了更新，以提高其灵活性，同时优化性能。例如，DeLTA 2.0 可以接受各种大小的输入图像。对于大图像（>512x512 像素），DeLTA 2.0 会自动将图像裁剪到较小的窗口中进行分割，然后将输出拼接在一起。我们注意到，大型电影可能会导致内存问题，但是发生这种情况的大小限制将取决于运行它的系统的配置。例如，在我们的配置中，对 865 个时间点上 1024x1024 像素的图像进行延时实验的分析使用了 14GB 的计算机内存。

由于原始的DeLTA代码针对来自母机的图像进行了优化，其中细胞被限制在一维腔室中，因此跟踪相对简单。在二维空间中，跟踪是一项更复杂的任务，需要同时跟踪的单元格数量急剧增加。确定哪些细胞与哪个谱系相关联可能具有挑战性。为了提高跟踪速度，我们在感兴趣的单元格周围裁剪了一个256x256像素的区域。这种方法之所以有效，是因为单个像元应保持在前一帧中的位置附近，因此将子像元的搜索限制为局部区域是合理的。然后，这些坐标用于裁剪其他三个输入（以前的相差图像、当前相衬图像和电流分割）。可以在配置文件中更改这些裁剪窗口的尺寸。

为了减少过度拟合，DeLTA 2.0 在训练时使用了几个新的数据增强操作。除了原始软件中存在的随机移位、缩放、旋转、翻转和照明等操作外，我们还添加了三个新功能，两个用于分割，一个用于跟踪。为了帮助处理偶尔失焦的帧，我们添加了一个模糊函数，该函数在图像上滑动高斯核（方法）。此外，在处理生物样品时，电子噪声是另一个问题，其中最小化对激发光的总暴露量会降低相机传感器的信噪比。为了解决这个问题，我们添加了一个添加高斯噪声（方法）的函数。为了模拟跟踪过程中夸大的细胞运动，例如当琼脂糖垫变干并导致视野随时间移动时，我们编写了一个新的增强函数，该函数引入了不同时间点之间的图像转换（方法）。这些操作有助于扩展训练数据集，并允许模型推广到实际条件。

由于图像中单元格的漂移是某些应用的常见问题，因此我们进一步表征了该算法在不同大小偏移下的性能（S3图）。当细胞密度较低时，DeLTA可以可靠地处理我们图像中每个时间点高达约30像素的偏移，相当于约4μm。在框架被细胞挤满的情况下，这个问题会加剧。当细胞密度很高时，性能在约15像素或约2μm的偏移后开始下降。因此，优化实验条件以最大限度地减少漂移对于高质量分析非常重要。

为了展示DELTA 2.0的实用性，我们进行了几个实验，其中我们种植了E。琼脂糖垫上的大肠杆菌微克隆并分析了输出。首先，我们使用DELTA 2.0来区分在同一视野中生长的抗生素耐药细胞和易感细胞之间的生长速率差异。在这个实验中，我们混合了两种E菌株。大肠杆菌，一个含有四环素抗性基因和一个组成性表达的红色荧光蛋白（RFP）报告基因，另一个没有抗性基因，含有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因。我们在含有抑制浓度的四环素（0.5μg/ ml）的琼脂糖垫上共培养细胞。DeLTA 2.0可靠地分割图像内的细胞（图2A）。四环素抗性基因允许表达RFP的细胞生长良好，而表达四环素的GFP敏感细胞生长非常缓慢（图2B）。单个细胞的RFP和GFP荧光可以随时间绘制，并显示两个不同的菌株（图2C）。通过提取延时图像中所有细胞的平均荧光水平，我们发现两个群体的荧光水平很好地分离并随着时间的推移而保持，正如对本构报告者的预期一样。我们还使用DeLTA 2.0来计算相对于荧光的单个细胞生长速率。我们观察到两个不同的簇，对应于正常生长的RFP细胞和生长缓慢或不生长的GFP细胞（图2D）。这些结果突出了在同一部电影中同时跟踪具有不同属性的单元格的能力。

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图 2.抗性和易感性E菌株 。含有抑制浓度的四环素的琼脂糖垫上的大肠杆菌。

（A）相差图像和相关荧光覆盖。RFP表达细胞含有四环素抗性基因，而GFP表达细胞不含。荧光覆盖层中的洋红色和绿色细胞轮廓分别代表耐药细胞和易感细胞。感兴趣区域框显示 （B） 中表示的区域。（B）随着时间的推移追踪抗生素耐药性和易感细胞的代表性例子。（C）RFP和GFP荧光随时间跟踪单个细胞。（D）GFP荧光与RFP荧光的单细胞的对比与生长速率的关系。荧光值是该细胞所有帧的平均值。对于生长速率计算，仅跟踪在t = 150 min时存在的细胞，这是电影中中后期的时间点。分析会省略那些在 t = 150 分钟后进入视野的像元，因为数据越少，生长速率会变得更嘈杂。此视图中省略了生长速率约为 1.4 1/小时的三个抗性细胞异常值。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797.g002

DeLTA 2.0非常适合测量图像中许多细胞的生长和基因表达。因此，另一个潜在的应用是研究细菌微克隆内的复制衰老。最近的研究表明，非遗传差异可能会遗传给后代，导致生长速率的适度但可测量的变化[7，17，18，30，31]。这可以通过记录杆龄随时间的变化来跟踪。杆状细菌有两个极点，如果细胞的一端是从母亲那里传下来的，则称为"旧"极。除法后形成的极点被称为"新"极（图3A）。

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图 3.极龄及其对生长速率的影响.

（A）示意图，显示极点在分割过程中如何传递。当一个细胞分裂时，新形成的极点被定义为"新"极点（白点），而从母体传递下来的极点被定义为"旧"极点（黑点）。比例尺，2 μm。（B）极分配原理图。当具有已知极点的母细胞分裂时，继承母亲旧极点的子细胞表示为"O"，而继承母亲新极点的子细胞为"N"。（C）每一代的增长率。单个细胞的生长速率是在母亲分裂后直到细胞再次分裂之前的一段时间内计算的。为了降低噪声，分析中仅包括至少存在三帧的细胞。子代（n = 11，246个细胞;两个尾部不成对的t检验;p值***≤0.001），孙女（n = 10，726个细胞;单因子方差分析，带有用于统计分析的事后Tukey检验。统计显著性："OO"和"NO"与"NN"和"ON";p 值 ** ≤ 0.01）和曾孙女（n = 10，217 个细胞;具有用于统计分析的事后 Tukey 检验的单因素方差分析。统计显著性："OOO"和"NOO"与"ONN"、"NNN"、"NON"和"OON";p 值 * ≤ 0.05）。误差线显示均值的标准误差。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797.g003

迄今为止，由于易于跟踪细胞，许多研究极龄的实验已经在母机微流体装置中进行[7，17，24]。然而，这种方法的局限性在于，它只能跟踪少数几代的细胞，因为老一代被扫出成像室，而母细胞的旧极点停留在腔室的死胡同。出于这个原因，最初的DELTA算法没有跟踪极点年龄信息，并且在分裂事件中，该算法只是将最接近腔室死胡同的细胞分配为母亲，另一个细胞为子细胞。然而，在二维表面上，细胞可以在任何方向上对齐，因此DeLTA 2.0根据隔膜的位置在分割后分配新旧极点。为了突出跟踪杆龄随时间变化的能力，我们分析了E的电影。大肠杆菌在无压力条件下生长。在t = 0时，我们不知道细胞的历史，因此极点最初是未分配的（图3B）。分割后，流传下来的母亲的杆子成为"旧"杆，新分割的杆子是女儿的"新"杆子。这在后代中一直延续下去。为了跟踪这一点，我们将接收旧极点的子项表示为"O"，将新极点表示为"N"。当这些子细胞分裂时，它们形成的细胞是原始母细胞的孙女。我们在极点序列的末尾附加一个O或N来记录这一点。例如，继承原始旧极点的单元格表示为 OO，其同级单元格为 ON。这种情况会延续几代人，因此原始母亲的曾孙女在其极点序列中有三个字母（例如OON）。

首先，我们比较了E的延时电影中新旧极点女儿的增长率。大肠杆菌在无压力条件下生长。与先前的文献[17，18，30]一致，我们发现旧极（O）女儿比新极（N）女儿生长得更慢（图3C）。接下来，我们使用DELTA 2.0提供的丰富世代信息来测试孙女和不同极龄的孙女之间的生长速度差异。我们发现，生长速率差异取决于细胞最近接收的极点。例如，OO和NO的增长率低于NN和ON（图3C）。因此，新旧极点对增长率的影响主要由仅向后延伸一代的影响主导。这一结果也与曾孙女一致，其中最近接受旧极点（OOO，NOO，ONO，NNO）的细胞的生长速度往往比接受新极点的细胞（ONN，NNN，NON，OON）慢。这些结果展示了如何使用DeLTA 2.0跟踪极点年龄信息，从而能够研究复制衰老。

最后，为了测试算法的普遍性，我们分析了>1，000 B的延时电影。枯草细胞在微流体装置中生长。这部电影是在与训练集中包含的任何数据不同的实验室中生成的，并且该电影的数据未包含在训练中。使用之前训练的模型，没有修改，我们分析了新电影并获得了出色的结果（S2电影）。DeLTA 2.0在尚未接受过训练的条件下的性能证明了其适应性。裁剪以移除腔室边缘和训练以忽略设备功能（如支撑柱）可以进一步提高性能。这一结果凸显了DeLTA 2.0在二维细菌培养物图像分析中的广泛影响潜力。

讨论

在这项工作中，我们开发了一种深度学习管道，可以处理细菌微克隆的延时图像并输出单细胞数据。利用U-Net卷积神经网络架构，该模型可以快速分割和跟踪单元帧到帧，错误率低。我们应用它来成功地区分敏感菌株和耐药菌株E的生长速率。大肠杆菌生长在琼脂糖垫上。这证明了DELTA测量共培养动态的新能力，这些动态很难在母机等设备中捕获。DeLTA 2.0保留了DeLTA原始版本的所有功能，现在可以用于母机数据或二维细菌的微克隆。

分析管道以两个可训练的模型为中心，用于细分和跟踪。我们尽可能避免硬编码临时规则，例如预处理和后处理步骤或沿袭重建规则。目前的模型在标准杆状细菌（如E）上效果很好。大肠杆菌（S1电影）和B。枯草杆菌（S2 电影）.这表明，对具有相似形态的细胞的分析，如其他芽孢杆菌、假单胞菌和沙门氏菌种类将是直截了当的。DeLTA 2.0 可能需要进一步训练，以防单元格的外观偏离训练当前模型所依据的数据。例如，尽管这些模型可以处理一些细长的细胞（图1B和1C），但它们目前尚未针对具有高丝状形态的细胞或经历应力的细胞进行优化。但是，由于我们避免在代码中嵌入特定于我们用例的规则，因此我们预计DeLTA不仅可以在重新训练后适应新的形态，还可以适应不同的生物体。例如，福克斯等人。使用DeLTA 1.0训练模型以高精度分割酵母细胞[2]。

尽管分割工作有效且错误率低，但模型有时会对连接的不同单元做出不正确的预测（S4图）。特别是，如果以高频率（例如每分钟或更短时间）获取电影帧，则分割模型在决定分割正在分裂的细胞时可能会波动，从而使跟踪复杂化。在孤立的图像中，这些错误可能很难捕获，即使对于人类也是如此。但是，通过查看早期和后期的帧，通常可以识别此类错误，因为单元格无法分裂然后合并在一起。作为潜在的未来方向，使用时间序列信息（如递归神经网络）的深度学习架构可以与我们的模型相结合，通过结合时间上下文来改善分割。

跟踪模型运行稳健，但当图像中有数百个单元格时，跟踪模型可能会变慢。由于帧中的每个单元都为跟踪模型创建一个输入，因此随着细菌微克隆的增长，该输入呈指数级增长。目前，对于具有许多单元格的电影，跟踪是当前处理的瓶颈，而分割相对较快。例如，S2 Movie，它具有100帧，每帧中有超过1000个单元格，使用我们的系统配置处理总共需要大约1个小时的时间，其中超过50分钟归因于计算跟踪事件。未来优化跟踪算法的努力可以通过避免随细胞数量线性扩展的方法来帮助解决这个问题。此外，初步测试表明，可以通过删除层来减小卷积神经网络的大小，尽管这可能需要针对特定应用进行定制（S5图）。这可以应用于细分或跟踪模型。

总体而言，DeLTA现在可以准确地处理二维电影，并以高吞吐量的方式捕获空间动态，而无需人工干预。它适用于许多常见的显微镜文件格式，并自动提取单细胞特征，如细胞极，长度，谱系和荧光水平，并将数据保存为Python和Matlab兼容格式。由于许多微生物学研究人员使用这些类型的数据，我们设想该软件可用于提高显微镜图像分析的通量。

方法

实施和网络架构

代码、安装说明和数据集位于 Gitlab 上：https://gitlab.com/dunloplab/delta。有关该软件的文档，请访问： https://delta.readthedocs.io/en/latest/。我们还提供了一个Google Colab笔记本，允许用户使用自己的数据测试DeLTA 2.0，而无需在本地计算机上安装代码：

https://colab.research.google.com/drive/1UL9oXmcJFRBAm0BMQy_DMKg4VHYGgtxZ.

U-Nets是在TensorFlow/Keras中实现的。我们开发了一个完全集成的管道，可以从Bio-Format兼容文件或TIFF图像序列编译单细胞数据，但我们也提供更简单的脚本和数据，说明我们算法的核心原理，以便于适应不同的用例。在S1 表中，我们列出了在环境中使用的运行 DeLTA 2.0 的包和确切版本。分割和跟踪模型都实现了U-Net神经网络架构。跟踪模型从当前帧和前一帧输入相差图像和分割，并输出预测跟踪事件的灰度图像（S1图）。在DeLTA [11]的原始版本中，跟踪模型使用softmax函数作为最终激活层和分类交叉熵损失函数来生成三个灰度输出图像，每层1分别代表母细胞，子细胞和背景。在 DeLTA 2.0 中，跟踪模型使用 sigmoid 函数作为最终激活层和像素加权二进制交叉熵损失函数来生成单个灰度输出图像，其中 1 表示跟踪的细胞（母子），0 表示背景和不跟踪到输入单元格的单元格。

损失函数和训练

为了训练这两个模型，我们实现了一个像素加权二进制交叉熵损失函数，就像在原始的U-Net论文[9]中一样。该损失函数改编自Tensorflow/Keras中的二进制交叉熵函数，该函数测量样本的像素损失。损失与权重图逐元素相乘，以放大或减少损失（S6图）。最后，我们根据总权重图的总和对损失进行了归一化，以均匀分布每个样本更新模型的量。总体而言，损失函数确定模型输出与地面实况之间的差异，然后用于更新模型中的权重。如Ronneberger等人。[9]，我们的损失函数将权重图作为额外的输入，以便在训练期间为地面实况中的某些像素分配更多的重要性。我们使用自定义权重图，通过增加细胞中心和细胞之间边界的权重来改善杆状细菌的分割。我们还最小化了背景上的权重，其中背景被定义为图像中不是单元格或边框的任何内容（S7图）。更具体地说，我们最大化了单元格和边框骨架的权重，它们是图像中二进制对象的像素范围表示[32]。用眼睛确定细胞的确切边界是困难的，部分是任意的。为了防止模型学习这些任意的单元格边界接口，我们减少了这些区域的权重（S7图）。此外，背景权重设置为可变的，其中权重相对于不正确的预测而增加（S8图）。该模型输出一个介于 0 和 1 之间的数字，其中 0 表示背景，1 表示单元格。由于我们对背景的基本事实有很高的信心，因此我们能够将背景的权重图的值设置为等于背景的实际预测。如果模型错误地预测了作为背景的像素的像元，则权重地图中该像素的值会很高。或者，如果模型正确预测了作为背景的像素的背景，则该像素在权重贴图中的值将较低。这种方法使模型能够有效地识别和丢弃碎屑，并减少背景上的过度拟合。我们的代码包含一个函数，用于从地面实况分割自动生成这些权重图。还为跟踪模型实施了自定义权重图，尽管发现它们对于训练成功的模型不太重要。权重图同样是通过将形态学操作应用于当前帧中所有细胞的分割和基本事实而生成的。地面实况像元的骨架设置为最高权重，而其他像元的像素设置为根据与跟踪像元的距离递减权重（S1B 图）。生成这些地图的功能也在我们的软件中提供。

除了原始版本的DeLTA [11]中描述的数据增强操作外，在训练分割模型时还使用了两种新的数据增强。我们使用了 OpenCV 包中的模糊函数 GaussianBlur，它在图像上卷积了一个 5x5 高斯核。对于噪声函数，我们使用来自numpy包的random.normal函数，该函数将来自高斯分布的随机样本输出到与图像大小相同的数组中。这将添加到原始图像中，并重新缩放回 0 到 1 之间的范围。模糊和噪声功能都应用于具有用户指定标准偏差的所有输入图像。我们将 1 和 0.03 分别设置为模糊和噪声函数的默认标准差。

为了模拟跟踪过程中夸大的细胞运动，例如当琼脂糖垫变干并导致视野随时间移动时，我们添加了一个函数，该函数可以随机移动包含当前帧的输入（当前帧的显微镜图像，当前帧中所有细胞的分割掩码，地面事实， 和权重映射），最多为用户指定的像素数（例如 5 个像素）。这些操作有助于扩展训练数据集，并允许模型推广到实际条件。

用于量化错误率的分割模型针对 600 个 epoch 进行了训练，每个 epoch 有 300 个步长，批大小为 1。Adam 优化器的学习率为 10?4.用于量化错误率的跟踪模型针对 500 个 epoch 进行了训练，每个 epoch 有 300 个步长，批大小为 2。Adam 优化器的学习率为 10?5.在所有情况下，模型在这些训练期间都收敛。例如，S9 图显示了分割模型训练的收敛结果。

训练集生成和测试

对于分割训练数据集，初始分割由专家使用交互式学习和分割工具包Ilastik [33]半自动生成。这占最终训练集的11%。一旦细分模型在测试数据上表现良好（我们将其定义为准确率超过95%），我们就会使用它来生成更多的训练数据。手动更正了不正确的 DeLTA 2.0 输出（如将两个不同的单元格连接在一起的分割）。处理的 DeLTA 输出占训练集的 36%。此外，我们还纳入了van Vliet等人发表的细分数据。[34]其中细胞被分割和跟踪以测量细菌微克隆中基因表达的空间动态。我们从ETH档案中获得了细胞分割和跟踪数据： https://doi.org/10.5905/ethz-1007-77。在此数据集上，我们执行了操作以提高数据质量，包括平滑过滤器、膨胀、侵蚀和骨架化函数。这些数据占训练集剩余的53%。最终的训练集有来自60部电影的307个训练示例，每部电影最多10帧，以增加样本多样性。每个训练示例由相衬图像作为输入，相应的分割地面实况以及损耗函数中使用的预先生成的权重图（S7图）组成。用于评估分割模型的测试电影是来自van Vliet等人的trpL数据zip文件的殖民地150310-05。[34] 在ETH档案中。

对于跟踪训练数据集，我们使用 DeLTA 1.0 中使用的 Matlab 脚本的修改版本来生成初始训练示例。修改后的脚本不是在图形用户界面中显示整个帧，而是在感兴趣的单元格周围显示一个放大的 75x75 像素框。此外，修改后的脚本有一个由母单元格和子单元格组成的输出，而原始脚本有三个输出，分别用于母单元格、子单元格和背景。Matlab 脚本用于生成 15% 的训练集。每个训练示例由四个输入、一个输出和一个权重映射组成。输入是前一帧的相差，前一帧中感兴趣的单元的分割，当前帧的相差以及当前帧中所有单元的分割（S1A图）。输出是前一帧中感兴趣的单元格跟踪到的单元格的分割掩码。权重映射用于损失函数。一旦跟踪模型在测试数据上以超过 99% 的准确率执行，我们就使用它来生成更多的训练数据。使用DeLTA 2.0处理间隔5分钟拍摄的图像的电影，然后通过在更长的时间间隔内跟踪细胞来生成新的训练示例。单元格不是从当前时间点之前的帧进行跟踪，而是从之前的两个或三个时间点的帧中跟踪。这使我们能够推广到更长的采集间隔以及细胞生长更快或在帧之间进一步移动的情况。这些经过处理的 DeLTA 输出占训练集的 20%。此外，van Vliet等人公布的跟踪数据。合并以增加训练集的大小，占所有训练示例的65%。最终的跟踪训练集有23，655个示例。用于评估跟踪模型的测试影片是来自cib数据zip文件的殖民地140408-01;rpsM 数据 zip 文件中的菌落151029_E1-1、151029_E1-5 和 151101_E3-12;和殖民地150309-04和150310-05，来自van Vliet等人的trpL数据zip文件。[34]。

延时显微镜实验

E的过夜培养物 。大肠杆菌将MG1655稀释1：100，并在LB培养基中生长1-2小时。对于共培养实验，我们纳入了30μg/ mL卡那霉素用于维持质粒。我们通过将0.5μL耐药菌株和0.5μL易感菌株与4μLLB培养基混合，以1：5稀释创建共培养物。对于极龄实验，在MGC培养基（M9盐中补充2mM MgSO4，0.2%甘油，0.01%卡萨米氨基酸，0.15μg/ ml生物素和1.5μM硫胺素）中以1：100稀释培养物。使用1：100稀释液来降低细胞密度。对于这两个实验，将1-1.5μL稀释的样品加入到用MGC培养基制成的预热的1.5%低熔点温度琼脂糖垫中。制备样品并成像，如Young等人所述。尼康Ti-E显微镜与100x油物镜一起用于所有显微镜实验。

在共培养实验中，E.大肠杆菌MG1655用单个质粒转化，具有四环素耐药性或无四环素抗性。两种质粒均源自BioBrick质粒库（pBbA7k）[35]。抗性细胞的质粒同时含有四环素耐药基因和红色荧光蛋白基因（rfp）（pBbA7k-RFP-tetA），而敏感细胞仅含有绿色荧光蛋白（gfp）（pBbA7k-sfGFP）。垫子含有30μg/ mL卡那霉素用于维持质粒和0.5μg/ mL四环素。每5分钟拍摄一次相差，GFP和RFP荧光图像。

在极地时代实验中，E.大肠杆菌使用MG1655，培养物中没有抗生素。每5分钟拍摄一次相差图像。

我们将增长率计算为：

其中Lt是时间t 、L处的单元格长度t-1是时间t-1的长度，Δt是 t 和t-1之间的时间差（在我们的电影中，5 分钟 = 0.083 小时）。 测量了一代人的增长率。例如，为了测量 OO 的增长率，测量从 O 划分为 OO 时开始，到 OO 划分为 OON 和 OOO 时结束。但是，没有关于O的增长率的信息用于计算OO的增长率。增长率是这一代中各个时间点的平均值。为了降低噪声，只有在细胞存在至少三帧的情况下，才在分析中记录生长速率。

测试帧偏移对跟踪的影响

我们考虑了三种代表性条件，并在人为帧偏移下执行跟踪（S3图）。条件是"低"，"中"和"高"细胞密度的情况，我们将其定义为在视野中具有<5，20-25和>200个细胞。我们计算了模型预测与所有跟踪事件的基本事实之间的重叠百分比，因为帧被人为地移动了。对于每个跟踪事件，视野在11个不同的距离上移动，范围从1到100像素，对应于0.129到12.9μm，并且每个距离在所有四个基本方向上应用，以产生总共48个偏移和一个未移位的版本。用于此分析的延时电影是来自van Vliet等人的rpsM zip文件的殖民地151101_E3-12。[6]。

支持信息

示意图显示了跟踪模型如何使用输入进行预测。

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S1 图示意图显示了跟踪模型如何使用输入进行预测。

（A）四个输入被连接成一个数组并由模型处理，该模型输出被跟踪的单元格（在分裂事件的情况下或单元格）的灰度图像。（B）地面实况和自定义重量图进行跟踪。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797.s001

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S2 图细分模型的准确性。

（A）对于电影中的每一帧，我们绘制了交集过度并集（IOU）/杰卡德指数，骰子分数/F1系数。稿件中定义的错误率也随即显示。（B）影片中每一帧的真阳性 （TP） + 真阴性 （TN）、误报 （FP） 和漏报 （FN） 像素的比例。请注意，这些是像素预测，而不是每个单元格的预测。TP 和 TN 表示帧中正确像素预测的速率。FP 表示当地面实况将像素报告为背景时，像素作为像元的一部分的错误预测速率。FN 表示将像素作为背景的错误预测率。测试集（S1电影）被用来计算这些评估指标。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797.s002

（每股收益）

S3 图帧偏移对跟踪模型性能的影响。

对于绘制为偏移距离函数的 20 个代表性跟踪事件，在四个基本方向上对地面实况的平均预测重叠。当（A）单元密度较低（帧中< 5 个细胞）、（B）中等（帧中为 20–25 个细胞）或 （C）高（帧中> 200 个细胞）时，跟踪模型性能。随着换档距离的增加，性能也会降低。该模型通常性能更好，每帧要跟踪的单元格更少。黑线表示每个移位距离的平均值。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797.s003

（每股收益）

S4 图分割的局限性。

E的两张相差图像。大肠杆菌微克隆及其各自的分割。红色箭头指向模型错误地将两个单元格合并为一个的错误。这种类型的错误很难断章取义地纠正。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797.s004

（每股收益）

S5 图减小模型的大小以提高速度。

显示不同网络架构的逻辑示意图。（A）我们在整篇论文中使用的原始U-Net架构。（B）没有底层的U-Net架构。（C）没有底层两层的U-Net架构。该模型已经过分段以及跟踪这些减少的网络的训练。（C）中的网络运行速度是（A）中原始网络的两倍，并且牺牲的精度非常低。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797.s005

（每股收益）

S6 图用于训练分割和跟踪模型的像素化二进制交叉熵损失函数的示意图。

图中显示了损耗函数的输入和输出。输入包括地面实况 （GT）、模型所做的预测 （Pred） 以及关联的权重图。输出是像素加权损失，即灰度图像。在步骤 1 中，使用基本事实和预测来计算二进制交叉熵损失。等式的前半部分测量与模型预测背景（当基本实况为像元）相关联的像素损失。等式的后半部分测量与模型预测像元相关的像素损失，当基本事实为背景时。在步骤2中，通过执行权重图的元素乘法和在步骤1中计算的损失来计算加权损失。权重图可帮助模型了解更重要的特征，例如像元边界。此损失函数原理图已简化，以用于可视化目的。为清楚起见，我们还展示了像素加权损失如何映射到预测值上，其中青色区域突出显示了强调损失的区域，以提高示例图像中这些区域的模型性能。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797.s006

（每股收益）

S7 图使用自定义权重图在分割上训练模型。

示意图显示了在同一数据集上使用不同权重映射训练的两个模型。在此示例中，两个 U-Net 模型都训练了 600 个 epoch，每个 epoch 300 步，批大小为 2。训练模型所需的输入包括相差图像、相关的分割地面实况和权重图。（A）使用源自U-Net原始纸张的重量图训练的模型。绿色椭圆显示错误示例。（B）使用自定义权重图训练的模型，这些权重图是通过将形态运算应用于分割的地面实况而生成的。在新权重图上训练的模型性能更好，如测试图像上的输出所示。（C）为了帮助可视化，"叠加层"显示叠加在相差图像上的自定义权重图。叠加显示权重在单元格的核心（用红线显示）和边框（用黄线显示）处强调。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797.s007

（每股收益）

S8 图利用可变背景重量图在碎片上训练模型。

一个简化的原理图，显示了如何使用权重图计算单个输入的损耗。（A）示意图显示了传统使用的重量图。（B-C）显示可变权重地图使用的示意图。预测用于更新权重图。（B）背景权重映射值将替换为预测中的背景值。这种方法迫使模型快速学习过滤掉碎片，因为当模型将碎片预测为细胞时，背景的重量图值显着增加。（C）相反，当模型正确地将碎片分类为背景时，背景的重量图值仍然与原始值相似。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797.s008

（每股收益）

S9 图训练超过 600 个 epoch 的分割模型的丢失历史。

训练期间模型的丢失与纪元总数的函数关系。仅显示模型性能提高且损失达到新最小值的点。在过去的85个时代中没有改善，显示出趋同。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797.s009

（每股收益）

S1电影。使用DeLTA 2.0分析细菌微克隆的延时视频。

含有E的相差图像。大肠杆菌细胞用代表独特细胞的不同颜色勾勒出来。可以通过在整个电影中遵循它们各自的颜色来跟踪单元格。白色箭头表示细胞分裂事件。白色和彩色圆点分别指新极和旧极点。这部延时短片是用于计算跟踪和分割错误率的测试集的一部分。时间戳以 HH：MM 格式显示时间。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797.s010

（MP4）

S2电影。DeLTA 2.0分析的微流体装置中生长的致密细菌微克隆的延时电影。

相差图像显示B。枯草细胞以不同的颜色勾勒。可以通过在整个电影中遵循它们各自的颜色来跟踪单元格。白色箭头表示细胞分裂事件。白色和彩色圆点分别指新极和旧极点。帧速率为每分钟一帧。原始电影数据由Avigdor Eldar教授和Jordi van Gestel博士提供。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797.s011

（MP4）

S1 表。环境中用于运行 DeLTA 2.0 的特定版本。

软件包名称和用于本手稿中介绍的分析以及其他工作安装的版本编号。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009797.s012

（文档）

确认

我们感谢 Virgile Andreani 仔细评估代码，Michael Sheets 测试 DeLTA 2.0 的初始版本，感谢 Dunlop Lab 的成员进行有益的讨论。Avigdor Eldar教授和Jordi van Gestel博士慷慨地提供了S2电影中呈现的原始图像。我们感谢Simon van Vliet博士关于他的数据集的有益讨论。

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