烟碱乙酰胆碱受体调节剂杀虫剂作用于具有不同亚基组成的不同受体亚型-厦门论文发表网
卢万军 ，刘志涵 ，范鑫宇 ，张新忠 ，乔晓木，黄佳
出版日期： 2022年01月19日
抽象
昆虫烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）是五聚体配体门控离子通道，主要在昆虫的中枢神经系统中表达。它们是许多杀虫剂的直接目标，包括新烟碱类杀虫剂，这是世界上使用最广泛的杀虫剂。然而，害虫耐药性的发展和对蜜蜂授粉媒介的负面影响影响了杀虫剂的应用，并产生了对替代品的需求。因此，了解这些杀虫剂的作用模式非常重要，这在分子水平上尚不完全了解。在这项研究中，我们系统地研究了10种果蝇黑色素食菌nAChR亚基突变体对11种作用于nAChRs的杀虫剂的易感性。我们的结果表明，nAChRs有几种亚型具有不同的亚基组成，负责不同杀虫剂的毒性。其中至少有三个是体内结构相似的新烟碱类化合物的主要分子靶标。此外，spinosyns可能只作用于α6同源五聚体，但不能作用于任何其他nAChRs。使用热遗传学工具的行为测定进一步证实了生物测定结果，并支持受体激活而不是抑制导致新烟碱类药物的杀虫作用的观点。本研究结果揭示了天然nAChR亚基与各种杀虫剂的相互作用，对耐药性的管理和开发针对这些重要离子通道的新型杀虫剂具有重要意义。
作者简介
新烟碱类和棘皮苷分别占世界杀虫剂市场价值的约24%和3%。然而，新烟碱类药物对传粉媒介的负面影响导致了新型杀虫剂的发展，如磺胺嘧啶、氟吡呋酮和三氟虫嘧啶。虽然它们都通过昆虫烟碱乙酰胆碱受体起作用，但它们的作用模式尚不完全清楚。我们的研究表明，这些杀虫剂作用于具有不同亚基组成的不同受体亚型。这一发现可能导致开发更具选择性的杀虫剂来控制害虫，而对有益昆虫的影响最小。
数字
Fig 4Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 1Fig 2Fig 3
引文：Lu W， Liu Z， Fan X， Zhang X， Qiao X， Huang J （2022） 烟碱乙酰胆碱受体调节剂杀虫剂作用于具有不同亚基组成的多种受体亚型。PLoS Genet 18（1）：e1009920。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009920
编辑 器：Subba Reddy Palli，肯塔基大学，美国
收到：十一月2，2021;接受：十二月 23， 2021;发表：一月 19， 2022
版权所有：? 2022 卢等人。这是一篇根据知识共享署名许可协议条款分发的开放获取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。
数据可用性：所有相关数据均在稿件及其支持信息文件中。
资金：公司获得国家自然科学基金（32072496、https://www.nsfc.gov.cn）和浙江省杰出青年基金（LR19C140002，http://zjnsf.kjt.zj.gov.cn/portal）资助。X.M由国家自然科学基金（31802019，https://www.nsfc.gov.cn）资助。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
相互竞争的利益：作者宣布不存在相互竞争的利益。-厦门论文发表网
介绍
化学杀虫剂已被广泛用于控制农业，园艺和林业以及家庭和城市的害虫。它们在预防人类和动物病媒传播疾病的传播方面也发挥了至关重要的作用。然而，杀虫剂耐药性是无脊椎动物害虫控制的一个严重的世界性问题，600多种不同的昆虫和螨虫物种已经对至少一种杀虫剂产生了抗药性。此外，至少有一例对超过335种杀虫剂/杀螨剂具有抗药性的病例已被记录在案[1]。因此，对有效的杀虫剂耐药性管理（IRM）和开发新的害虫控制化合物有很大的需求。为了解决这两个问题，我们需要确定杀虫剂的作用模式，这是杀虫剂效果背后的分子水平过程[2]。
要完全了解杀虫剂的作用方式，就需要了解它如何影响生物体内的特定目标位点。虽然大多数杀虫剂具有多种生物效应，但毒性通常归因于单一的主要效应。然而，对于一些杀虫剂，确切的分子靶标仍然难以捉摸。为了确定候选蛋白是否确实是体内杀虫作用的靶标，仅仅证明杀虫剂和蛋白质之间的体外生化相互作用是不够的。在将给定的蛋白质鉴定为杀虫剂靶标之前，必须获得证明由于候选靶标突变而产生效应的遗传证据。
新烟碱类药物（啶虫脒、噻虫胺、呋虫胺、吡虫啉、硝酮吡喃、噻虫啉和噻虫嗪）在控制农业害虫、外寄生虫和节肢动物载体方面非常有效[3]。由于高内吸活性，它们被根或叶吸收并转移到植物的所有部位，使它们对各种进汁和叶面进食昆虫有效有毒。因此，新烟碱类药物占全球杀虫剂市场的24%，这是所有化学类别中最大的市场份额[1]。与哺乳动物选择性尼古丁相比，它们选择性地作用于昆虫烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）作为激动剂。Spinosyns是一种天然来源的，独特的大环内酯家族，以变构的方式作用于昆虫nAChR。此外，亚砜亚胺磺胺氟，丁烯内酯氟吡呋酮和中胚层三氟虫嘧啶是三种新开发的杀虫剂，也是nAChR竞争调节剂[4]。预计上述所有针对具有优异昆虫对哺乳动物选择性的杀虫剂的nAChRs的市场将继续增长。然而，新烟碱类化合物和其他nAChR调节剂的分子靶标仍不清楚，主要是因为昆虫中天然nAChRs的结构和组装尚未得到澄清[5]。
阳离子选择性nAChRs是Cys环配体门控离子通道超家族的成员，负责快速兴奋性神经传递。功能nAChRs是围绕中心离子传导孔排列的结构相关亚基的同构或异构体五聚体[6]。每个亚基都有一个细胞外N端结构域，其中包含六个参与配体结合的不同区域（环A-F），四个C端跨膜段（TM1-TM4）以及TM3和TM4之间的细胞内环。nAChRs分为α亚基，在环C中具有两个相邻的胱碱残基，而那些没有该基序的亚基称为nonα亚基。在脊椎动物中，已经鉴定出17个nAChR亚基，它们可以共聚以产生具有不同药理学性质和生理功能的多种nAChR亚型家族。根据现有的基因组数据，昆虫具有较少的nAChR亚基（10-12个亚基）。尽管共免疫沉淀研究表明了几个亚基的潜在关联，但天然昆虫nAChRs的确切亚基组成仍然未知[5]。与脊椎动物不同，真正的节肢动物α和β亚基的异源表达并不成功，直到最近两组发现三种辅助蛋白对于节肢动物nAChR异构体的稳健表达至关重要[7，8]。 因此，长期以来，研究人员一直使用昆虫α亚基和哺乳动物/鸟类β亚基的杂交受体来研究杀虫剂和受体的相互作用。但是，这些替代方案可能无法忠实地反映本机nAChRs的所有特征[9]。
在这项研究中，我们系统地检查了11种nAChR靶向杀虫剂对10种（7种α和3种β）果蝇黑色素胃亚基突变体的影响。我们发现，具有不同亚基组成的受体有多种亚型，它们负责不同杀虫剂的毒性。表达亚基的神经元的人工激活/抑制也模仿了害虫中的杀虫剂中毒症状。阐明这些具有重要经济意义的农用化学品的分子靶标和本地nAChRs的组装将非常有助于对捕食者和传粉媒介等有益昆虫的抗性管理和生态毒理学评估。
结果
nAChRβ1 的生成R81T突变体
我们从Yi Rao的实验室获得了所有10个nAChR敲除突变体，发现α4和β1的KO是纯合致死的。先前的研究[10，11]和我们的研究结果（S1文本中的表A-K）都表明，nAChRs中的靶位点抗性大多是隐性至半隐性的，野生型等位基因占主导地位。 因此，我们在所有实验中使用了α4和β1的点突变等位基因，而不是杂合子KO苍蝇。α4T227M突变体（红眼黑麦）是一种显性阴性等位基因，可导致果蝇睡眠表型减少[12]。在耐新烟碱类桃蚜虫和后来的棉蚜虫中发现了nAChR β1的R81T突变[13，14];因此，我们用CRISPR-Cas9介导的同源定向修复（HDR）将同源突变引入黑腹果蝇的β1位点。报道了gRNA靶位点和HDR模板的设计，在吡虫啉选择压力下筛选成功进行R81T敲入，并通过直接DNA测序确认（S1文本中的图1和图A）。
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图 1.nAChRβ1 的生成R81T通过CRISPR / Cas9基因组编辑突变体。
（A）nAChRβ1位点示意图和供体结构的序列。这些框表示外显子，编码区域以蓝色显示。gRNA序列以红色表示，用于氨基酸取代（CGT到ACT）的密码子以绿色突出显示。在PAM区域（黄色）中也引入了一个同义突变（G到A），以防止成功整合后Cas9的重新清除。（B）野生型苍蝇和点突变苍蝇的序列比较。被替换的核苷酸在绿色和黄色框中突出显示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009920.g001
nAChR突变体对多种杀虫剂表现出明显的耐药性
我们测试了10个nAChR突变体和一些杂合突变体对11种杀虫剂的影响（图2和S1文本中的表A-K）。α1突变体对吡虫啉、噻虫啉、啶虫脒和三氟甲嘧啶表现出中等水平的抗性，LC50电阻比（RR）约为13.5–88.0。其杂合突变体对这些杀虫剂的抗性水平也很低。此外，它显示噻虫嗪，噻虫胺，呋虫胺，呋虫胺和尼腾吡喃的RR（2.7-3.7）的降低但具有统计学意义。α2突变体还对吡虫啉，噻虫啉和三氟甲嘧啶表现出相似的耐药性水平（RR为17.2-48.5）。α3突变体对噻虫嗪、噻虫胺、呋替替兰、硝酸、硝酸吡喃、磺胺呋喃和氟吡呋酮的RR小有增幅（2.7~5.5）。α4、α5、α6、α7 和 β3 突变体对几乎所有经过测试的杀虫剂都敏感。明显的例外是α6纯合突变体，它对脊椎动物具有抗性，RR为42.8，尽管杂合突变体接近野生型（RR 1.2）。除脊椎虫外，β1突变体对所有杀虫剂均表现出中高耐药性（RR为23.9~398.3），其杂合突变体对大多数杀虫剂的RR呈小的增高性。β2突变体的耐药性特征与α1突变体相似，对吡虫啉、噻虫啉、啶虫脒和三氟甲嘧啶的RR增加了13.0~84.3倍。
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图 2.针对 10 个果蝇nAChR 纯合突变体（包括 8 个空等位基因和 2 个点突变等位基因 （α4）的测试杀虫剂的非线性对数剂量死亡率数据T227M和β1R81T).
在暴露于浓度不断增加的杀虫剂48小时后，对照组和突变雌性成年个体的死亡率（0-1表示百分比为0-100%）。误差线表示标准偏差。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009920.g002
α1和β1突变体对多种杀虫剂表现出可变的抗性;因此，我们生成了一个具有重组的α1 / β1双突变体。然而，这种组合突变体产下的卵不能孵化，因此没有用于进一步的实验。最近的一篇论文还产生了β1 R81T果蝇，发现它在繁殖和运动方面存在严重缺陷[15];然而，我们在这里制造的β1突变体没有显示出任何显着的适应性成本（S1文本中的图B）。α5、α6和α7的序列非常接近，与脊椎动物nAChR α7亚基具有高度相似性;然而，只有α6突变体表现出对spinetoram的抗性。我们进一步生成了一个对脊椎动物仍然敏感的α5/α7双突变体（S1文本中的表K），表明α6同聚体通道可能是棘突的唯一目标。
过度激活/沉默nAChR表达神经元模仿杀虫剂中毒症状-厦门论文发表网
昆虫在暴露于新烟碱类、磺胺嘧啶类、氟吡呋酮和棘皮苷时会出现类似的反应。早发性行为包括多动、抽搐、运动不协调、腿部伸展和震颤。在较高剂量下，这些兴奋性症状可诱发严重震颤和完全瘫痪，最终导致死亡[16–18]。然后，我们想知道人工激活表达nAChR的神经元是否会诱发类似杀虫剂的中毒症状。因此，我们使用热敏阳离子通道果蝇TRPA1用所有可用的nAChR KI-Gal4菌株急性过度刺激这些神经元[19]。我们发现在nAChRα1中表达trpA12A-加仑4， nAChRα22A-加仑4， nAChRα32A-加仑4， nAChRα62A-加仑4和nAChRβ22A-加仑4神经元在32°C时强烈诱导多动行为，最终导致瘫痪（图3A和S1视频），这与上述症状相似。然而，nAChRβ3的激活2A-加仑4神经元没有表现出任何行为缺陷。这些结果与上述生物测定数据相吻合，表明α1、α2、α3、α6和β2的缺失导致对这些杀虫剂具有中高耐药性。因此，在短时间内对一些表达nAChR的神经元进行热遗传学激活，可以对目标害虫中的杀虫剂的作用进行现象学检查，这表明这些含亚基的nAChRs的体内药理学激活会导致毒性并最终死亡。
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图 3.人工神经元激活和抑制对各种表达nAChR的神经元的影响。
（A）使用UAS-trpA1诱导麻痹行为的5个nAChR表达神经元的热遗传学激活。（B）使用UAS-Shibire对五个表达nAChR的神经元进行热遗传学沉默ts活动减少。n = 30–50。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009920.g003
与三氟甲嘧啶相关的中毒症状不同于作用于nAChRs的其他杀虫剂，因为它抑制而不是激活昆虫nAChRs。用三氟甲嘧啶治疗后没有神经兴奋症状;相反，三氟甲嘧啶诱导嗜睡中毒，其特征是腿部运动缓慢但协调，并且昆虫随着时间的推移对刺激的反应变慢[20]。因此，我们选择使用UAS-Shibirets抑制表达nAChR的神经元[21]。不出所料，nAChRα12A-加仑4， nAChRα22A-加仑4 和 nAChRβ22A-加仑4神经元产生"迟钝"行为而不是多动症（图3B）。苍蝇几乎没有平移或旋转的身体运动（S1视频）。nAChRα3的沉默2A-加仑4和nAChRα62A-加仑4神经元也产生了类似的行为，进一步证实了含有α3和α6的nAChRs不能被三氟甲嘧啶阻断;否则，两个突变体都会在生物测定中表现出耐药性。
ko突变体中nAChRs的表达模式
我们确认KO编码区域未检测到或几乎无法通过实时PCR定量检测到（S1文本中的图C）。除了β3之外，这些突变蝇中每个亚基的表达水平没有太大差异，β3的转录量相对低于其他基因。对于α 1杂合突变体，所有亚基的mRNA水平几乎与野生型对照相同。
讨论
杀虫剂耐药性行动委员会（IRAC）根据其化学相似性关系将新烟碱类、亚砜亚胺、丁烯醇化物和介子类药物分别分类为4A、4C、4D和4E亚组。然而，我们的研究结果表明，磺胺嘧啶和氟嘧啶呋喃可能主要作用于相同的nAChR亚型，该亚型由α3和β1亚基组成（图4），尽管考虑到遗传冗余，其他亚基也可能参与其中。更重要的是，我们发现新烟碱类物质作用于不同的nAChR亚型，并且这种选择性不依赖于芳族杂环（A）或吸电子硝基或氰基部分（X-Y），这被认为是关键的毒素团。有趣的是，环系统和R2开链结构中的取代基是决定因素（图4）。例如，α1，α2，β1和β2突变体对吡虫啉和噻虫啉表现出相似的抗性水平（两者都有一个五元环），表明它们主要作用于相同的α1 / α2 / β1 / β2五聚体（图4B）。这一发现与之前的离体记录结果[22]和最近两项重组研究一致，这些研究显示这两种药物在α1/α2/β1/β2 nAChR上起部分激动剂的作用[7，8]。 西他脒在结构上与噻虫啉相似，具有氰基亚胺药效团，尽管无环构型改变了其在体内的分子靶标。它可能作用于α1/β1/β2 nAChR，电生理学研究已经表明，啶虫脒几乎是一种完整的激动剂[22]。此外，其对重组虱子α1/α2/β1/β2 nAChR的效力比噻虫啉低约860倍[8]。虽然噻虫嗪具有六元环，但它是一种没有内在nAChR活性的前体药物，直到在植物和昆虫中代谢为活性形式的噻虫胺[23]。因此，噻虫嗪、噻虫胺、呋虫胺和硝酸可被认为是同一类型，其在R中具有N-甲基取代。2位置主要作用于α1/α3/β1 nAChR（图4B）。新烟碱类药物传统上分为硝基亚胺（NNO2），硝基亚甲基（CHNO2）或氰基亚胺（NCN），尽管我们的研究结果表明，它们应该根据其主要的nAChR亚型靶标进行分类。
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图 4.测试杀虫剂对不同nAChR突变体的耐药模式（A）以及新烟碱类化合物和其他（B）的靶受体亚型。
各种电阻比被分组，并在热图中表示为不同的颜色。噻虫嗪被认为是噻虫胺的前体药物，因此未列在结构式中。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009920.g004
尽管新烟碱类药物被广泛使用近30年，但2011年报道了第一个也是唯一一个田间进化的靶位位抗性突变（nAChRβ1中的R81T），迄今为止仅在两个物种中发现[13，14]。 这种不寻常的现象与我们的发现一致，即七种新烟碱类物质实际上作用于体内的多种受体类型，并且只有β1突变体对所有新烟碱类药物引起高抗性。新的模仿尼古丁的杀虫剂，如磺胺嘧啶和氟吡呋喃，主要作用于另一种与新烟碱类药物不同的nAChR亚型（图4），表明它们在杀虫剂耐药性管理中的潜在用途。
对天然组织或重组受体的电生理学研究表明，低浓度的新烟碱类药物可以阻断nAChR，而较高浓度可以激活受体[7，24]。因此，目前尚不清楚杀虫活性是否是nAChR抑制或体内活化的结果。我们发现，短暂的人工激活而不是抑制表达nAChR的神经元足以在果蝇中诱导新烟碱类药物样中毒症状（图3）。因此，新烟碱类药物的总体作用是通过激活nAChR实现神经元去极化，这在生理上更具相关性。
三氟甲嘧啶是一类新型介观杀虫剂的第一个成员，其通过抑制nAChR的正立构结合位点起作用[20]。我们发现α1/ α2 / β1 / β2 nAChR可能是其主要靶标，类似于吡虫啉和噻虫啉，并且所有这些突变体都对三氟甲嘧啶表现出高抗性（图4A）。这一发现与放射性配体结合结果一致，该结果显示三氟甲嘧啶有效移位[3H]吡虫啉，Ki值为43nM，基于蚜虫的膜制备[20]。表达α1，α2和β2的神经元的热遗传学抑制也模仿了嗜睡中毒症状（图3B）。因此，为了保持这种用于控制水稻料斗物种的新型强大工具的持久性和有效性，避免重复使用三氟甲嘧啶与吡虫啉和噻虫啉至关重要。
Spinosyns，包括 spinosad 和 spinetoram，已被证明作用于非新烟碱类物质靶向的 nAChRs 群体，并且结合位点也与正立构位点不同[4]。α6亚基已被提议作为棘皮虫的主要靶标，因为田间进化的对棘皮虫的抗性与许多害虫昆虫α6位点的功能丧失突变有关[25–32]。然而，其他亚基（如α5和α7）的参与在系统发育上接近α6，尚未得到澄清（S1文本中的图D）。先前的报道表明，α5和α7可以在体外形成功能性同聚体和异构体通道，而α6只能与α5或α5/α7一起形成异构体通道[33，34]。 然后，我们想知道这些进化保守的亚基之间是否存在遗传冗余。我们发现α5，α7和α5 / α7双突变体都对spinetoram敏感（S1文本中的表K），表明spinosyns可能只作用于α6同聚体nAChR，这与最近使用spinosad的报告一致[35]。表达α6-的神经元的热遗传学激活也在果蝇中诱发棘突样中毒症状。
我们目前对昆虫nAChRs的亚基组成的了解非常有限。亚基特异性抗体的免疫沉淀数据显示，果蝇α 3和β1在同一受体复合物内共聚[36]。来自同一组的进一步研究表明，α 1/α 2/β2和β1/β2可能共聚成相同的受体复合物[37]。使用棕色飞虱的类似研究表明，有两个nAChRs群体含有果蝇等效亚基组合α 1/α 2/β1和α 3/β1/β2[38]。 这些先前的发现被目前的结果部分证实，因为α3 / β1，α1 / α3 / β1，α1 / β1 / β2和α1 / α2 / β1 / β2可能是测试杀虫剂的主要受体亚型，表明β1亚基可能是所有异组五聚体不可或缺的成分（图4）。此外，我们注意到，对于某些杀虫剂，不同的亚基突变以不对称的方式对抗药性做出贡献（图4A）。因此，一些α型亚基之间可能存在功能冗余，我们不能排除其他潜在受体亚型的存在，例如α1/ β1和α3 / β1 / β2。昆虫nAChRs的多样性及其可药性使其成为杀虫剂开发中极其重要的靶标。
越来越多的证据表明，亚致死剂量的新烟碱类药物，如吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺，对野生和受管理的蜜蜂产生负面影响，这些蜜蜂是生态系统和农业中重要的传粉媒介[39–41]。它们会减少繁殖和蜂群发育，可能是通过损害蜜蜂的觅食，归巢和护理行为[42]。这些严重的亚致死作用导致欧洲对使用上述三种新烟碱类药物来保护蜜蜂传粉媒介受到严格限制[43]。Sulfoxaflor和氟吡呋喃酮是新烟碱类药物的潜在替代品;然而，它们对蜜蜂的风险是有争议的[44–46]。因此，了解这些杀虫剂在蜜蜂体内的作用方式至关重要。nAChR亚基的核心群在进化约3亿年的不同昆虫中高度保守[47]，这可能是由于它们在神经系统中的重要作用。大多数果蝇nAChR亚基基因（α 5和β3除外）在其他昆虫中具有一对一的同源物，包括蜜蜂和大黄蜂（S1文本中的图D），并且同源物之间的序列同一性也很高（S1文本中的表L）。因此，这些受体的表达，组装和功能可以在苍蝇和蜜蜂之间保守，这表明我们的研究结果将使对这些nAChR调节剂的生态毒理学和风险评估进行进一步研究。
材料和方法
杀虫剂
以下产品在商业上购买：吡虫啉（600克/LSC，拜耳作物科学，德国），噻虫嗪（70%GZ，先正达，中国），噻虫胺（48%SC，河南汉斯作物保护，中国），呋虫胺（20%SG，三井化学，日本），硝烯吡喃（30%WG，ZinGrow，中国），乙酰咪脒（20%SP，Noposion，中国），噻虫啉（40%SC，利民化学，中国），磺胺氟（22%SC，陶氏农业科学，美国），氟吡呋酮（17%SC， 拜耳作物科学，德国）、三氟甲嘧啶（10%SC，杜邦，美国）、spinetoram（60克/LSC，陶氏农业科学，美国）和Triton X-100（Sangon Biotech，中国）。
苍蝇菌株-厦门论文发表网
在25±1°C和60%±10%湿度下，在常规玉米粉琼脂糖蜜培养基上维持和饲养苍蝇，光周期为12小时光：12小时。用于使用UAS-trpA1和UAS-Shibire的实验ts转基因，苍蝇在21°C下饲养。 以下菌株来自布卢明顿股票中心（印第安纳大学）：vas-cas（#51323），UAS-trpA1（#26263）和UAS-Shibire。 ts所有nAChR KO突变体和KI-Gal4菌株都是Yi Rao博士（Deng等人，2019）（北京大学）的礼物。W1118用于异型杂交的菌株被用作杀虫剂生物测定的野生类型。
我们生成了nAChRβ1R81T通过CRISPR / Cas9基因组编辑突变体。gRNA序列（3 L：4433329~4433352，ATCAAACGTTTGGTTAACTTTAG）是用flyCRISPR靶标查找器（https://flycrispr.org/target-finder/）设计的，并克隆到pDCC6质粒（Addgene #59985）中。定制合成110 bp ssODN（单链寡脱氧核苷酸）作为供体模板以取代靶向基因组区域。该ssODN包含三个核苷酸变化，其中两个（CG至AC）赋予R81T突变和一个同义突变（G至A），以防止Cas9在掺入后重新清除。gRNA质粒和ssODN都被微注射到输精管蝇的胚胎中（BL #51323）。交叉和选择方案如图 A 中的S1 文本所示。
杀虫剂生物测定
将三至五天大且大小均匀的成年雌性用于杀虫剂生物测定，以评估不同苍蝇菌株的易感性。该测试方法由IRAC敏感性测试方法026（https://irac-online.org/methods/）修改而成。简而言之，使用配制的杀虫剂在200 g / L蔗糖中制备所需的连续稀释的杀虫剂溶液。每种浓度需要约5ml杀虫剂溶液。将一块牙线（1厘米）置于标准果蝇小瓶中，并用800μL含或不加杀虫剂的20%蔗糖水溶液处理。将每种基因型的10只苍蝇转移到小瓶中，每种浓度为3-6个小瓶，每种基因型对于每种测试的杀虫剂重复至少3次。小瓶被倒置，直到所有苍蝇都变得活跃，以避免苍蝇被困在牙芯中。生物测定在48小时后进行评估，死苍蝇和严重受影响的苍蝇没有表现出协调运动，无法走上小瓶或站起来，累积评分为"受影响"。信用证50使用Polo Plus软件（LeOra Software，Berkeley，CA，USA）通过概率分析计算值。在GraphPad Prism 8.21（GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA，USA）中生成了非线性对数剂量 - 响应曲线。
热遗传学活化和消音检测
在闭合时收集用于TRPA1介导的热遗传学活化和Shibire介导的沉默实验的苍蝇，并在含有标准食品培养基的小瓶中在21°C下饲养5-8天。为了使用UAS-trpA1转基因进行热遗传学活化，通过温和的吸气将10只苍蝇转移到新的空小瓶中，然后在23°C和32°C下进行测定10分钟。每种基因型重复至少5次。测量了动物仰卧，腿部和翅膀几乎没有有效运动的瘫痪行为百分比。对于沉默测定，UAS-Shibirets使用转基因，并将苍蝇转移到23°C和32°C的苍蝇小瓶中10分钟。
实时荧光定量 PCR
使用CFX96TM实时荧光定量PCR系统（Bio-Rad，Hercules，USA）进行实时定量PCR检查不同KO突变体中nAChRs的相对转录水平。根据制造商的说明，用TRIzol试剂分离总RNA。残留的基因组DNA被RQ1 RNase-Free DNase（Promega，Madison，USA）去除。总RNA通过EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（Transgene，北京，中国）反向转录为cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCR预混液（Vazyme，南京，中国）进行qPCR基因特异性引物，以研究不同nAChRs的相对表达水平。RpL32（核糖体蛋白L32）被用作内部对照。nAChRs的相对表达被归一化为参考（RpL32），使用2-ΔΔCT方法。所使用的引物列于S1文本的表M中。
繁殖力和发育测定
十对新出现的野生型对照和β1对R81T将突变体转移到含有正常食物的小瓶中72小时。然后将这些文件转移到用于产蛋测定的新培养皿中。在24小时后记录每个培养皿中产下的卵的数量。为了计算幼虫对蛹的速率，收集60个二龄幼虫并将其作为一组转移到一个新的小瓶中。在培养箱中7天后记录每个小瓶中的蛹数量。每种基因型至少重复三次，一式两份。
攀岩检测
收集约3天龄的雄蝇与CO2麻醉成10组，然后恢复2天。爬升管由两个高90毫米，直径20毫米的小瓶组成。这些苍蝇是用索尼HDR-CX900E相机拍摄的30秒。爬升指数（小瓶上半部分的苍蝇百分比）是在苍蝇被敲打到小瓶底部后以5秒的间隔确定的。
系统发育分析
从各种目中选择了以下代表性物种：蜜蜂（蜜蜂），三叶甲虫（红面粉甲虫），Myzus persicae（绿桃蚜虫），Bombyx mori（蚕），Bombus terrestris（大黄蜂）和Drosophila melanogaster（果蝇）。要识别D的直系同源数。黑色素胃xAChR亚基，我们使用BLASTP搜索NCBI非冗余蛋白质数据库。我们更名为M.Persicae和B.terrestris nAChR亚基蛋白根据其最接近的直系物。所有氨基酸序列均由Clustal X对齐。MEGA 11使用默认参数，1000个引导复制和JTT模型替换执行邻居连接树，并由Evolview可视化（https://www.evolgenius.info//evolview/）。
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热遗传学激活和抑制对表达nAChRα1的神经元的影响.
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S1 视频。热遗传学激活和抑制对表达nAChRα1的神经元的影响.
使用以下转基因：nAChRα12A-加仑4 > 无人机系统-trpA1;nAChRα12A-加仑4 > 无人机-希比雷ts.其他nAChR KI-Gal4菌株，如nAChRα22A-加仑4， nAChRα32A-加仑4， nAChRα62A-加仑4 和 nAChRβ22A-加仑4在32°C下刺激时也产生类似的行为。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009920.s001
（MP4）
S1 文本。
S1 文本中的图 A。建立nAChRβ1的交叉方案R81T敲门线。通过吡虫啉选择分离出HDR事件，并通过PCR确认。由于眼睛中没有红色荧光，因此消除了vas-Cas9（3XP3 RFP）。S1 文本中的图 B。nAChRβ1的影响R81T产卵数量（A）、幼虫化蛹率（B）和负地理出租车行为（C）上的点突变。S1 文本中的图 C。nAChR基因在不同KO突变体中的表达模式.S1 文本中的图 D。来自蜜蜂（蜜蜂）、红粉甲虫、绿桃蚜虫、蚕蚯（蚕丝虫）、大黄蜂（果蝇）等6种代表性昆虫的nAChR亚基核心群的系统发育关系。 分支节点上的彩色点表示每个分支的引导支持值。D.黑腹股FMRFamide受体（DmFR）被用作外组。序列加入号如S1文本中的表N所示。S1 文本中的表 A。对照剂量概率死亡率数据和吡虫啉耐药性比值。S1 文本中的表 B。对氯吡啶的剂量概率死亡率数据和耐药性比率进行对数。S1 文本中的表 C。对乙酰脒的剂量概率死亡率数据和耐药性比率进行对数。S1 文本中的表 D。对硫虫嗪的剂量概率死亡率数据和耐药性比率进行对数。S1 文本中的表 E。对照剂量概率死亡率数据和噻虫胺耐药性比值。S1 文本中的表 F。呋虫胺的剂量概率死亡率数据和耐药性比。S1 文本中的表 G。对硝酸的剂量概率死亡率数据和耐药性比率进行对数。S1 文本中的表 H。对氯吡呋喃酮的剂量概率死亡率数据和耐药性比率进行记录。S1 文本中的表 I。对数剂量概率死亡率数据和磺胺嘧啶的耐药性比。S1 文本中的表 J。对三氟甲嘧啶的剂量概率死亡率数据和耐药比对数。S1 文本中的表 K。对数值剂量概率死亡率数据和脊柱抗性比值进行记录。S1 文本中的表 L。果蝇nAChR亚基与其他昆虫中相应的同源物之间的序列身份。S1 文本中的表 M。qPCR分析中使用的引物。S1 文本中的表 N。图D在S1文本中使用的序列的加入数。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009920.s002
（文档）
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我们感谢Yi Rao（北京大学）和Bloomington Drosophila Stock Center的苍蝇股票。
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