引文：Smith JJ，Xiao Y，Parsan N，Medwig-Kinney TN，Martinez MAQ，Moore FEQ等人（2022）SWI / SNF染色质重塑组装体BAF和PBAF差异性地调节细胞周期退出和体内细胞入侵。PLoS Genet 18（1）：e1009981。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009981
编辑 器：杰里米·南斯，纽约大学医学院，美国
收到：十月 3， 2021;接受：十二月 7， 2021;发表：一月 4， 2022
版权所有：? 2022 Smith et al.这是一篇根据知识共享署名许可协议条款分发的开放获取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。
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资金：D.Q.M.是由Damon Runyon癌症研究基金会[DRR-47-17]支持的Damon Runyon-Rachleff创新者。这项工作还得到了美国国家普通医学科学研究所（NIGMS）对D.Q.M.的研究资助[R01GM121597]的支持。J.J.S.得到了W. Burghardt Turner奖学金的支持。J.J.S. [3R01GM121597-02S1]， 马萨诸塞州Q.M [3R01GM121597-03S1] 和 F.E.Q.M. [3R01GM121597-04S1] 通过 NIGMS 多样性补充支持 R01GM121597。M.A.Q.M.还得到了美国国家癌症研究所（NCI）1F30CA257383-01A1的支持。A.Q.K. 由 NIGMS [F31GM128319] 支持。R.C.A. 由 NIGMS [F32GM1283190] 支持。T.N.M-K.由 NICHD [F31HD100091] 支持。N.J.P.得到了美国癌症协会[132969-PF-18-226-01-CSM]的支持。P.K.得到了国家神经疾病和中风研究所[R01NS118078]的支持。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
相互竞争的利益：作者宣布不存在相互竞争的利益。
介绍
通过基底膜（BMs）的细胞入侵是后生动物发育的关键步骤，对人类健康和健身很重要。在原始人发育的早期，滋养层细胞必须侵入母体子宫内膜才能进行适当的囊胚植入[1]。在免疫方面，白细胞在损伤或感染时变得具有侵袭性，在血流和间质组织之间传播[2，3]。 侵袭性行为的非典型激活与多种疾病有关，包括类风湿性关节炎，其中成纤维细胞样滑膜细胞采用侵袭性细胞行为，导致关节炎损伤向先前未受影响的关节扩大[4，5]。 细胞侵袭的异常激活也是癌症转移的标志之一[6]。
已经开发了各种体外和体内模型来研究遗传和细胞水平上的细胞侵袭过程。体外侵袭测定通常涉及3D水凝胶晶格，例如基质胶，通过该晶格培养的转移性癌细胞将响应于化学引诱剂而侵入[7]。最近，微流体系统已与胶原基质相结合，以改善这些细胞侵袭的体外研究[8]。虽然体外侵袭模型为研究细胞侵袭的机械方面提供了一种有效的手段，但它们目前无法复制细胞在动物发育和疾病期间必须侵入的复杂微环境。已经研究了多种体内入侵模型，包括小鼠[9–11]和斑马鱼[12，13]中的癌症异种移植模型，每种模型都有各自的优点和缺点。在过去的大约15年中，秀丽隐杆线虫锚细胞（AC）侵袭由于其视觉上易于处理的单细胞性质而成为一种强大的替代模型（图1A）[14]。
先前的工作证明了BM侵袭背后的细胞自主机制的高度进化保守性[3，15]，包括F-肌动蛋白细胞骨架/细胞骨架调节剂的基底外侧极化和基质金属蛋白酶（MMPs）的表达[16–21]。此外，为了破坏BM，AC需要转录因子（TFs）的表达，其人类同源物是转移性癌症常见的，包括egl-43（EVI1 / MEL），fos-1（FOS），hlh-2（E /无子）和nhr-67（TLX / Tailless）[22]（图1B）。 除了促侵袭基因的表达外，越来越多的证据表明，细胞也必须在细胞周期中停滞才能采用侵入性表型[23]。我们之前的工作已经证明，AC必须在G中最终区分和阻止0/G1细胞周期的相位侵入BM并与下面的原发性外阴前体细胞（1°VPC）接触[22，24]。 耦合G的监管机制0/G1细胞周期停滞与细胞侵入BM的能力仍然不清楚。
细胞外源性和细胞内在因子，如染色质重塑复合物和TF，控制着细胞命运的许多方面，从可塑性到末端分化和细胞周期停滞。可塑性和规格之间的这种决定部分是Polycomb组（PcG）转录抑制和Trithorax组（TrxG）转录激活之间复杂的全基因组拮抗的结果[25–27]。这方面的一个例子是先驱TF OCT4和SOX2与靶向DNA的结合，以保持小鼠胚胎干细胞中的多能性;这些TF与其靶标的关联已被表征为这些靶区染色质可及性的间接结果[28]。最近的一项研究表明，促进G的关键细胞周期基因中增强子的染色质可及性1/S转变，包括Cyclin E和E2F转录因子1，在果蝇黑色素蛹翅形态发生过程中被发育限制为加强末端分化和细胞周期退出[29]。在C中。秀丽隐杆线虫的肌原，SWItching缺陷/蔗糖非发酵（SWI / SNF）ATP依赖性染色质重塑复合物，TrxG家族复合物的成员，既调节MyoD转录因子（hlh-1）的表达，又多余地作用以促进分化和G0使用几种核心细胞周期调节剂进行细胞周期停滞，包括库林 1（CUL1/cul-1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 1（cki-1）、FZR1（fzr-1）和 RB 转录核压缩子 （RBL1/lin-35） [30]。染色质状态的动态调节对于获得和实施差异化行为的重要性也反映在C中。秀丽隐杆线虫AC，如先前的研究表明，组蛋白去乙酰化酶had-1（HDAC1 / 2）是促侵袭性基因表达所必需的，因此是细胞侵袭的分化行为[24]（图1B）。
对控制 AC 侵袭的调节机制的全面调查应包括全面描述 G 所需的染色质试剂和染色质调节因子套件0/G1AC中的细胞周期停滞和侵入性分化。在这项研究中，我们在C中进行了RNA干扰（RNAi）筛选。秀丽隐杆线虫，特别关注参与染色质结构和重塑或组蛋白修饰（统称为"染色质因子"）的基因。我们鉴定了82种染色质因子，其转录耗尽导致明显的AC侵袭缺陷。在屏幕中恢复的82次点击中，SWI / SNF复合物成为最具代表性的单染色质重塑复合物。RNAi敲低SWI / SNF核心特异性亚基（swsn-1和snfc-5 / swsn-5）和两个BAF（BRG / BRM相关因子;swsn-8/let-526）和PBAF（Polybromo Associated BAF;pbrm-1和swsn-7）组件导致AC入侵的渗透剂损失。我们使用CRISPR/Cas9介导的基因组工程生成了核心亚基（GFP：：swsn-4）和SWI/SNF复合物的BAF（swsn-8：：GFP）组装的荧光报告基因敲入等位基因。这些等位基因与内源性标记的PBAF（pbrm-1：：eGFP）组装亚基结合使用，使我们能够确定SWI / SNF ATP酶和组装特异性亚基的发育动力学，测量各种SWI / SNF敲低策略的效率，并评估复合物内和组装间调节。使用改进的RNAi构建体和抗GFP纳米体降解策略[31]，我们证明了SWI / SNF复合物对AC侵袭的细胞自主贡献是剂量依赖性的。这一发现与癌症[32–35]和C的类似研究相似。秀丽隐杆线虫梅苏母细胞发育 [36]。令人惊讶的是，使用CDK活性传感器[37]进行的检查揭示了组装特异性对AC侵袭的贡献：BAF以细胞周期依赖性方式促进AC侵袭，而PBAF以细胞周期无关的方式促进侵袭。最后，我们利用生长素诱导的degron（AID）系统与PBAF RNAi相结合，在AC中实现了强烈的组合PBAF亚基消耗，这导致AC侵袭和粘附的丧失。
结果
包含 269 种染色质因子的 RNAi 筛选可将 SWI/SNF 确定为 AC 侵袭的关键调节因子
为了鉴定与had-1一起导致AC入侵的染色质因子套件，我们从完整的Vidal RNAi文库中生成了269个RNAi克隆的RNAi子库，以及Ahringer RNAi文库的一个子集[38，39]靶向与染色质状态，染色质重塑或组蛋白修饰有关的基因（图1B和S1表).由于染色质调节因子在全球范围内控制基因表达，因此我们通过高分辨率差分干涉对比（DIC）和落荧光显微镜在含有标记BM（层粘连蛋白：：GFP）和AC报告者（cdh-3p：：PH：：mCherry）的子宫特异性RNAi超敏背景中筛选每个RNAi克隆（图1A和S1表）[14，22，24，40 ].这种遗传背景使我们能够限制染色质因子的RNAi转录敲低对AC和邻近子宫组织的影响，并且仅在AC规范之后的一段时间内[40]。由于邻近的子宫细胞对侵袭计划没有贡献[14]，在此背景下RNAi治疗后的AC侵袭缺陷表明细胞自主的促侵袭基因功能[24，40]。 在野生型动物中，当1°注定的P6.p外阴前体细胞分裂两次（P6.p 4细胞阶段）时，100%的AC已经成功突破了潜在的BM并与P6.p孙女接触[14]。同样，我们发现所有AC都侵入了RNAi筛选中使用的子宫特异性RNAi超敏菌株，尽管我们观察到AC的外显率较低，并且侵袭时间延迟，因此在P6.p 4细胞阶段，当我们评分入侵时，2%（2/100动物）仍然具有完整的BM。因此，我们使用这个基线缺陷作为这个遗传背景的统计参考点。我们将RNAi处理后入侵中显着缺陷的临界阈值定义为那些导致至少约13%的治疗动物（4/30动物，Fisher的精确测试= 0.0252）中丧失入侵的RNAi克隆。通过这个阈值，我们回收了82种染色质因子（占总筛选的30.5%），这些因子显着调节AC侵袭（S2表）。RNAi筛选中近三分之一的染色质因子的损失导致显着的AC侵袭缺陷，这一发现表明在获得侵袭行为时需要调节染色质状态。有趣的是，广泛保守的SWI / SNF染色质重塑复合物的五个亚基被恢复为AC侵袭的重要调节因子：swsn-1（SMARCC1/ SMARCC2;23%AC侵袭缺陷），swsn-5 / snfc-5（SMARCB1;20%AC侵袭缺陷），swsn-7（ARID2;23%AC侵袭缺陷），swsn-8 / let-526（ARID1A / ARID1B;23%AC侵袭缺陷）和pbrm-1（PBRM1;20%AC侵入缺陷）（S2表）).因此，SWI/SNF在屏幕中确定的AC入侵的重要调节器名单中占有一席之地，代表了核心（swsn-1和swsn-5），BAF（swsn-8）和PBAF（pbrm-1和swsn-7）组件。鉴于在我们的RNAi筛选中，SWI / SNF亚基作为AC侵袭的重要调节因子而恢复的患病率，以及SWI / SNF在调节动物发育[41-46]，肿瘤发生[33，47-49]和细胞周期控制[30，36，50-52]方面发挥的关键作用，我们选择将精力集中在表征SWI / SNF复合物在促进AC侵袭中的作用上。
为了证实我们的RNAi结果将SWI / SNF复合物作为AC侵袭的激活剂，我们获得了两个温度敏感的次态等位基因，swsn-1（os22）和swsn-4（os13）[ 42]，并对含有BM（层粘连蛋白：：GFP）和AC（cdh-3p：：mCherry：：moeABD）的遗传背景中的AC侵袭缺陷进行了评分。）记者。虽然我们在允许温度（15°C）下生长的动物中观察到AC侵袭没有缺陷（S1A图），但在限制温度（25°C）下培养的含有核心亚基swsn-1和swsn-4的低态等位基因的动物分别在20%（10/50）和24%（12/50）的动物中显示出缺陷（S1B图）。这些带有swsn-1（os22）等位基因的数据证实了我们来自染色质因子RNAi筛选的swsn-1（RNAi）数据。此外，由于本研究中用于组成染色质因子筛选的RNAi文库（见上文）均不包含swsn-4（RNAi）克隆，因此swsn-4（os13）等位基因的结果也补充了来自我们RNAi筛选的数据，表明AC侵袭取决于唯一C的表达。秀丽隐杆线虫SWI / SNF ATP酶亚基以及屏幕中鉴定的5个亚基。
改进的RNAi载体揭示了SWI/SNF亚基对AC侵袭的独特贡献
尽管许多SWI/ SNF组件已经在哺乳动物和其他系统中进行了描述，包括BAF，PBAF，esBAF，GBAF，nBAF和npBAF [53]，但迄今为止，BAF和PBAF是唯一在C中描述的SWI / SNF组件。秀丽隐杆线虫。两种组件均由核心亚基（SWSN-1、SWSN-4、SWSN-5）和附属亚基（DPFF-1、SWSN-2.1/HAM-3、SWSN-2.2、SWSN-3、SWSN-6 和 PHF-10）组成，统称为共同因子[47，54]。 这些共同因素以相互排斥的方式被组件特定的子基所束缚，这赋予了两个组件中每个子单元的独特特征（图2A）。由于缺乏对C中的SWI / SNF复合物进行彻底的生化研究。秀丽隐杆线虫，以前的出版物已经根据同源性和表型分析将亚基分类为SWI / SNF核心，附件或BAF / PBAF组装的一部分[30，36，44，55]。 C中两个SWI / SNF组件的流行模型。秀丽隐杆线虫是SWSN-8亚基与共同因子结合形成BAF组装，或SWSN-7，SWSN-9和PBRM-1亚基与共同因子结合形成PBAF组装[44，55，56]。 先前对SWI / SNF的研究揭示了广泛的发育环境，其中BAF和PBAF组装体在细胞周期控制，分化和分化行为的调节中具有重叠和不同的作用[30，36，55，57- 61]。
为了研究单个SWI / SNF亚基对AC侵袭的贡献并区分BAF和PBAF组装的潜在不同作用，我们利用T444T载体[62]生成了改进的RNAi结构，以靶向核心和SWI / SNF组件的代表性亚基（S3表）。在用T444T RNAi载体处理后，全身RNAi敏感动物的SWI/ SNF亚基被敲低，导致渗透性丧失侵袭。大多数AC在用RNAi靶向核心SWI / SNF ATP酶亚基swsn-4或核心亚基swsn-1（分别为90%和94%;n = 50只动物）处理后未能侵入（图2B和2E）。敲低 SWI/SNF 组装特有的亚基导致 AC 侵袭缺陷的外显率降低。RNAi介导的BAF组装亚基swsn-8的敲低导致32%的处理动物（n = 50只动物）的AC侵袭损失（图2C和2E）。用pbrm-1（RNAi），swsn-7（RNAi）或swsn-9（RNAi）敲低PBAF组装亚基导致AC侵袭的渗透性损失较小（分别为18%，20%和12%;n = 50只动物）（图2D和2E）。 重要的是，在所有针对单个SWI / SNF亚基的RNAi治疗中，腹侧子宫背侧至原发性外阴的至少一个细胞表达荧光AC报告基因，这表明SWI / SNF复合物的丢失不会影响AC规格。
有趣的是，除了单一的非侵入性AC表型外，RNAi介导的swsn-1，swsn-4或swsn-8的敲低也导致了第二种表型，其特征在于多个表达AC报告者的子宫细胞（cdh-3p：：mCherry：：moeABD）未能侵入BM（层粘连蛋白：：GFP）（分别为32%，30%和8%）（图2B，2C和2E）。 ).在多个细胞表达AC报告基因的所有情况下，在P6.p 4细胞阶段没有检测到基础BM的破坏。相反，只有单一的非侵入性AC表型是由针对PBAF组装亚基的RNAi处理引起的（图2D和2E）。这些结果表明，SWI / SNF组装BAF和PBAF可能通过不同的机制促进AC侵袭，可能分别通过调节细胞周期依赖性和独立机制。
内源性GFP报告等位基因的表征及改进的SWI/SNF RNAi载体的疗效
接下来，为了确认SWI / SNF亚基在AC中的表达并定量评估我们增强的SWI / SNF RNAi载体的效力，我们利用CRISPR / Cas9基因组工程生成Swsn-4和swsn-8的GFP标记等位基因，将密码子优化的GFP标签插入swsn-4和swsn-8位点的5'端和3'端， 分别（图3A和3B，顶部）[63]。GFP标记的内源菌株在整个C中显示出GFP：：SWSN-4和SWSN-8：：GFP的普遍和核局限表达。秀丽隐杆线虫发育生命周期（图3A和3B，底部）。我们还从Caenorhabditis遗传学中心（CGC）获得了一种含有内源性eGFP标记的PBAF亚基（pbrm-1：：eGFP）的菌株。我们量化了L3和早期L4阶段外阴发育期间AC中SWI / SNF核心ATP酶（GFP：：SWSN-4），BAF（SWSN-8：：GFP）和PBAF（PBRM-1：：eGFP）亚基的荧光蛋白表达，由1°命运的VPC[14]（每个阶段n≥28只动物）的分裂模式定义（图3C，3D，3E，3C'，3D'和3E'）。相对于邻近的腹侧子宫（VU;swsn-4： 18%， swsn-8： 21%， pbrm-1： 17% 增强） 和 1° VPC （swsn-4： 30%， swsn-8： 38%， pbrm-1： 23% 增强） 谱系在 AC 侵袭期间 （P6.p 2-cell– 4-cell 阶段） （图 3C'， 3D' 和 3E'）。在P6.p 8细胞阶段的外阴发育后期，GFP：：SWSN-4和PBRM-1：：eGFP的表达在1°VPC中增加，并且在统计学上不再与AC中的表达分离（图3C'和3E'），而VPC中SWSN-8：：GFP的表达也增加，但仍然显着低于AC（图3B'）。
我们用改进的RNAi载体处理了SWI / SNF内源性标记的GFP标记菌株，以精确量化RNAi介导的靶SWI / SNF复合亚基的敲低效率，并将这种损失与由此产生的AC表型相关联。使用swsn-4（RNAi）或swsn-8（RNAi）载体处理导致AC（S2A，S2B和S2D图）中GFP：：SWSN-4（94%耗竭）和SWSN-8：：GFP（81%耗尽）的荧光表达的稳健耗尽（S2A，S2B和S2D图）和渗透性入侵损失（分别为90%和30%;n = 每种情况30只动物）（S2E图）).我们还注意到多个细胞表达AC报告器的情况（分别为23%和10%;n = 每种条件为30只动物）（S2E图）。用pbrm-1（RNAi）处理PBRM-1：：eGFP菌株显示PBRM-1蛋白的敲低较弱但显着（49%耗尽）（S2D图），并且侵袭缺陷的外显率较低（17%; n = 30只动物）（S2C，S2D和S2E图）。目前尚不清楚为什么与用各自的RNAis处理含有swsn-4或swsn-8报告等位基因的菌株相比，用增强型pbrm-1（RNAi）处理的动物AC中的PBRM-1：：eGFP内源性蛋白水平仍然相当高。 我们假设这可能是PBRM-1蛋白不同蛋白耐久性的结果。我们注意到，通过对RNAi处理的内源性SWI /SNF：：GFP菌株的定量荧光分析确定的RNAi克隆的强度与我们在全身敏感RNAi菌株（图2E）和内源菌株本身（S2E图）中观察到的AC侵袭缺陷的相对外显率有关。).总之，这些结果证实了SW / SNF核心，BAF和PBAF亚基在侵袭前，侵袭期间和之后在AC中的动态表达，并证明了我们改进的SWI / SNF靶向RNAi载体的有效性。
秀丽隐杆线虫SWI/SNF 亚基表现出复合物内和低水平的组装间交叉调控
细胞培养工作表明，哺乳动物SWI/SNF（mSWI/SNF）复合物以逐步的方式组装，复合物整体稳定，单个亚基的关联取决于其他亚基的先前表达和关联[64]。迄今为止，是否在C中尚不清楚。秀丽隐杆线虫个体 SWI/SNF 亚基激活其他 SWI/SNF 亚基。目前还不清楚C中两个组装体的亚基是否。秀丽隐杆线虫- BAF和PBAF - 稳定核心蛋白亚基，反之亦然。因此，我们使用内源性标记的SWI / SNF：：GFP菌株来询问核心，BAF或PBAF的单个亚基的转录敲低是否在AC侵袭时诱导其他亚基的蛋白质表达变化（S3图）。
首先，为了确定SWI / SNF组装体的代表性亚基是否促进或稳定复合物的ATP酶，我们用swsn-8（RNAi）或pbrm-1（RNAi）（S3A图）处理GFP：swsn-4动物。 在P6.p 4细胞阶段，swsn-8（RNAi）处理动物AC核中的荧光表达的定量显示，相对于对照组，GFP：：SWSN-4水平显着降低（34%GFP：：SWSN-4耗尽）（S3A和S3D图）。PBAF亚基pbrm-1的RNAi敲低也导致AC中ATP酶表达的显着但较弱的损失（11%GFP：：SWSN-4耗尽）（S3A和S3D图）。这些结果表明，SWI / SNF组装的单个亚基表现出复合物间调控，并且可能有助于蛋白质稳定性和/或SWI / SNF ATP酶在C中的表达。秀丽隐杆线虫AC，其中BAF复合物相对于ATP酶起着潜在的主导激活作用。
接下来，我们用增强的RNAi处理含有swsn-8或pbrm-1内源性GFP-报告基因的动物，以敲低SWI / SNF ATP酶或替代SWI / SNF组装的代表亚基的表达。有趣的是，虽然不受PBAF组装亚基pbrm-1的敲低的影响，但ATP酶swsn-4的RNAi敲低导致SWSN-8：：GFP在AC中的表达增加了42%（S3B，S3C和S3D图）。最后，相对于对照动物AC中内源性PBAF亚基的表达，用swsn-4（RNAi）处理的PBRM-1：：eGFP动物的AC核的蛋白质表达水平显着降低（38%PBRM-1：：eGFP消耗），而swsn-8（RNAi）处理动物的AC表达PBRM-1：：eGFP多表达13%（S3C和S3D图）。
由于对swsn-4或swsn-8亚基的敲低导致两种不同的AC表型 - 具有单个非侵入性AC的个体动物和具有多个表达AC报告基因的非侵入性细胞的动物 - 我们接下来试图确定这两种表型在SWI / SNF亚基表达方面是否不同。为此，我们将来自复合物内RNAi实验系列（S3A，S3B，S3C和S3D Fig）的数据分档到两种非侵入性表型中，并比较了SWI / SNF RNAi条件下内源性蛋白的荧光表达水平。鉴于多AC表型的频率不高，统计比较必然仅限于动物种群包含至少10个多非侵入性AC事件的治疗。SWSN-8：：GFP用swsn-4（RNAi）治疗共产生24个多非侵入性AC（共53个AC;n = 41只动物），在SWSN-8：：GFP中检测到单个非侵入性AC表型和多个非侵入性AC表型组核之间的GFP表达没有显着差异（S3E图）。第二项统计学比较是在用swsn-8（RNAi）（S3E图）处理的PBRM-1：：eGFP动物的两种表型之间进行的，其中检测到14个多非侵入性AC（总共51个AC;n = 42只动物）。在这种情况下，内源性PBRM-1：：eGFP荧光表达的定量显示，与单个非侵入性表型相比，多非侵入性表型组AC细胞核中PBAF亚基的表达略有增加（12%）（S3E图），反映了在非分箱数据中检测到的PBRM-1水平的普遍增加（S3D图）。
基于这些结果，可以为AC组成SWI/SNF ATP酶、BAF和PBAF组装亚基之间上位相互作用的暂定模型（S3F图）。我们的数据表明，在AC中发生了一定程度的SWI/SNF复合物内和组件间调节。我们发现，SWI / SNF复合物内调节的最重要方面是由ATP酶对组装特异性亚基进行的，其中swsn-4敲低导致BAF / SWSN-8显着增加并显着降低PBAF / PBRM-1。SWI/SNF在AC中的组件间调节似乎较弱，因为pbrm-1的敲低不影响SWSN-8：：GFP表达，而swsn-8的敲低导致PBRM-1：：GFP表达略有增加。
SWI/SNF ATP酶SWSN-4提供AC侵袭的剂量依赖性调节
SWI / SNF复合物在临床环境中对肿瘤发生的贡献程度与癌前和转化细胞中功能性SWI / SNF ATP酶的剂量有关[33，35，65]。 以前的C.秀丽隐杆线虫已经证明SWI / SNF与细胞周期控制之间存在相似的剂量依赖关系[36]。此外，我们在SWI / SNF：：GFP内源性菌株（S2图）中增强的SWI / SNF RNAi的结果表明，SWI / SNF亚基的更强敲低可能与侵袭缺陷外显率增加相关。确定表型剂量敏感性是否见于癌症和C。秀丽隐杆线虫中胚层（M）细胞发育确实是SWI/SNF在促进AC侵袭方面的特征[31]，我们使用RNAi介导的敲低和AC特异性GFP靶向纳米体技术的组合来调节GFP：：SWSN-4的表达。
虽然针对内源标记菌株中swsn-4亚基的RNAi处理导致AC中GFP：：SWSN-4的荧光表达显着降低，但在处理过的动物的其他组织中观察到一些表达丧失，包括1°VPC，这有助于AC非自主入侵[14，66]（S2图1 ).因此，为了限制对AC的表达损失，我们使用抗GFP纳米体融合到含有泛素连接酶适配器的SOCS盒中，用组织特异性启动子驱动以实现谱系限制性蛋白质耗竭[31]（图4）。为了跟踪抗GFP纳米体转基因的表达，我们还包括一个荧光组蛋白标签，该标记由p2a病毒自裂肽（ACp：：抗GFP-纳米体：：p2a：：his-58：：：mCherry）从抗GFP纳米体序列中分离出来。我们使用来自cdh-3和egl-43启动子[22，24，40，67，68]的保守顺式调节元件生成了两个抗GFP纳米体构建体，并将它们引入含有内源性GFP的菌株中：：swsn-4等位基因以及AC和BM报告基因（图4B和4C）。cdh-3驱动的纳米体转基因（cdh-3p：：antiGFP-nanobody：：p2a：：his-58：：mCherry）导致GFP：：SWSN-4水平的弱降低，与野生动物相比，AC中的荧光表达没有显着差异（6%耗竭;n = 80只动物）（图4F）;然而，与cdh-3启动子的野生型表达[22，40]一致，它在AC中特异性表达并导致有缺陷的AC侵袭，表明部分功能丧失（21%AC侵袭缺陷; n = 102）（图4B和4G）。 egl-43p：：antiGFP-nanobody transgene （egl-43p：：antiGFP-nanobody：：p2a：：his-58：：mCherry）表达模式也与先前工作[22， 67– 69]中表征的野生型表达一致，如HIS-58：：mCherry在AC和邻近腹侧子宫和背子宫（VU/ DU）细胞中的核表达所示（图4C;星号表示HIS-58：：m樱桃在非AC腹侧子宫细胞中的表达）[22，40，67]。 重要的是，由于AC独立于VU / DU细胞侵入[14]，因此这些组织中的抗GFP表达不应影响AC侵袭。与用swsn-4（RNAi）（图4D）处理的动物类似，egl-43p：：抗GFP-纳米体介导的GFP：：SWSN-4导致AC中荧光表达的显着丧失（71%GFP消耗;n = 80只动物）（图4C和4F）以及具有多个子宫细胞的个体动物的侵袭和发生率的渗透性丧失，这些动物与腹侧BM接触并表达AC 报告基因（88%AC侵袭缺陷，3%多种AC表型;n =101只动物）（图4G）。这些结果支持我们的子宫特异性SWI / SNF RNAi结果，并为SWI / SNF复合物在促进细胞侵袭和细胞周期停滞中的细胞自主作用提供了强有力的证据。
为了进一步消耗Swsn-4在AC中的表达，我们用swsn-4（RNAi）处理转基因egl-43p：：抗GFP纳米体动物（图4E）。引人注目的是，在这种组合敲低策略中，AC侵袭缺陷是完全渗透的，并且相对于用swsn-4（RNAi）或egl-43驱动的抗GFP纳米体条件（83%多个AC表型;n = 41只动物）进行治疗，表达AC规格报告基因的多个细胞的频率急剧增加（图4G）。总之，这些结果证明了对应于AC中swsn-4的连续损失的表型谱.ATP酶的适度损失导致含有cdh3p的动物中的单个非侵入性AC：：抗GFP-纳米体。在egl-43p中强烈的表达丧失：：抗GFP-纳米体背景或用swsn-4（RNAi）处理后导致动物具有单一和多个非侵入性AC。最后，在最强的敲低条件下 -egl-43p：：用swsn-4（RNAi）处理的抗GFP纳米体动物 - 每只动物存在多个非侵入性AC，具有接近完全外显率。虽然swsn-4（RNAi）和抗GFP-纳米体介导的耗竭的组合导致SWI / SNF复合物的核心ATP酶表达的强烈丧失，但荧光表达与单独使用swsn-4（RNAi）处理没有显着差异（分别为93%与92%GFP耗竭;每种处理为n≥41动物）（图4F ).我们从理论上推断，在这些条件下，荧光值超出了我们根据成像系统的荧光检测限进行量化的阈值能力。总之，这些数据表明，在AC中，SWI / SNF复合物的ATP酶以剂量依赖性的方式自主地促进细胞侵袭。
改进的 swsnn-4（RNAi）载体足以概括 M 谱系中的空表型
最近的一项研究专注于整个C中SWI / SNF的细胞周期控制。秀丽隐杆线虫肌肉和上皮分化显示，在核心SWI/SNF亚基丧失较弱或较强后，组织和谱系特异性表型[36]。在产生后体壁肌肉（BWMs），腔骨细胞（CCs）和生殖肌肉或性肌母细胞（SMs）后代的M谱系中，不同的细胞类型对SWI / SNF的丧失有不同的反应。在BWM中，SWI / SNF的强烈损失导致过度增殖，就像我们在AC中检测到的表型一样。在SM谱系中情况正好相反，其中swsn-4的适度敲低导致过度增殖，而swsn-4表达的完全丧失导致N为空表型，其中SMs在S期未能分裂和停滞[36]。接下来，我们试图通过检查SM增殖状态来验证增强型swsn-4（RNAi）载体的强度。为了实现这一点，我们用swsn-4（RNAi）（S4A图）处理含有谱系限制性细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）活性传感器（unc-62p：：DHB：：2xmKate2）的动物。在这种遗传背景下，我们确定了SM细胞的数量（S4B图）和细胞周期状态（S4C图），当时对照动物中的大多数SM已经完成循环并随后分化（晚期P6.p 8细胞阶段;16个SM细胞阶段）。用swsn-4（RNAi）处理的动物的SM细胞明显少于对照组（平均SMs/动物= 5;n = 31只动物）（S4B图），许多SMs实例未能进入单轮细胞分裂（n = 43只动物中的20只单一SMs）。有趣的是，用swsn-4（RNAi）处理的动物中，28%（12/43）的动物左侧或右侧没有SMs，而100%（30/30）对照动物的两侧都有SM，这可能表明规格，早期细胞分裂和/或SMs迁移存在缺陷。为了量化细胞周期状态，我们测量了SM特异性CDK传感器的定位，该传感器使用哺乳动物DNA解旋酶B（DHB）片段融合到两个拷贝的mKate2 [37，70]。 在静止或有丝分裂后CDK活性低的细胞中，成比例的CDK传感器具有强烈的核定位[37，68，70]。 在CDK活性增加的循环细胞中，CDK传感器逐渐从细胞核转位到细胞质，S期的比率接近1.0，G细胞中的比率>12 [因此，DHB：：2xmKate2的细胞质：核（C / N）比可以作为识别细胞周期状态的代理。到控制条件下的大多数SM在G中区分和停止时0细胞周期状态（平均C / N比= 0.320; n = 90SMs）（S4C图），许多用swsn-4（RNAi）处理的动物具有无法分裂的单个SMs和平均DHB C / N比值，表明S期长时间停顿或停滞[37]（平均.C/N比= 0.803;n = 20 SMs）（S4C图）。总之，这些结果表明，我们增强的swsn-4（RNAi）靶向载体的强度足以概括SM谱系中的swsn-4空条件，因为我们检测到使用谱系限制的催化非活性SWI / SNF ATP酶观察到的低增殖表型和S相停滞[36]。
BAF组件通过调节G有助于AC入侵0细胞周期停止
在确定SWI / SNF复合物的强消耗导致AC侵袭的完全渗透性缺陷，并且具有多个非侵入性AC的个体动物比例很高（图4）之后，我们接下来研究了观察到的额外AC是否是不适当的AC增殖的结果[22，68]。 确定 G 是否需要 SWI/SNF 复合物0/G1在AC中，我们使用普遍表达的rps-27p：:D HB：：GFP转基因与AC配对（cdh-3p：：mCherry：：moeABD）和BM（层粘连蛋白：：GFP）报告者在RNAi介导的SWI / SNF核心（swsn-4），BAF（swsn-8）和PBAF（pbrm-1）亚基（图4）之后，在活体动物中定量CDK活性).在野生型侵入性AC中，我们观察到CDK传感器的强核定位，并量化了指示G的细胞质/核（C / N）比值0/G1停滞（平均C / N比率：0.226 + / -0.075，n = 67只动物）（图5A和5F）。为了区分野生型 AC C/N 比率是否实际指示 G0而不是 G1停滞后，我们量化了P6.p 8细胞1°VPC阶段相邻子宫Pi细胞在末端分裂后的CDK活性，以建立G0参考点[ 71，72]（平均C / N比：0.206 + / -0.078，n = 30动物）（图5E和5F）。我们发现末端Pi细胞的CDK活性与野生型入侵AC之间没有显着差异，这表明野生型AC存在于CDK中。低G0，促侵入状态（图5A，5E和5F）。在用pbrm-1（RNAi）处理的动物中，CDK传感器也主要局限于未能入侵的AC的原子核（平均C / N比：0.157 + / -0.063，n = 41只动物），并且每只动物仅观察到一个非侵入性AC（图5D和5F）。相反，在用swsn-8（RNAi）处理后，大多数未能侵入BM的AC都在G中。1细胞周期的/S相（平均C/ N比：0.636 + / -0.204，n = 21只动物）（图5C和5F）。最后，与swsn-8（RNAi）条件一样，在具有单个或多个非侵入性AC的动物中，通过用swsn-4（RNAi）处理，SWI / SNF复合物的核心ATP酶的表达丧失导致广泛的C / N比值（C / N比最小值：0.240，C / N比最大值：1.140，平均C / N比值：0.566 + / -0.205; n = 40动物）的C / N比值（图5B和5F）。有趣的是，swsn-4（RNAi）治疗导致非侵入性G的比例更高。0相（C / N比<0.3）ACs（14%，n = 48个细胞）比存在于swsn-8（RNAi）处理的群体中（8%，n = 25）（图5B和5C，上图）。这些发现再次强调了SWI / SNF BAF和PBAF组装体对复合物核心ATP酶的功能依赖性，因为swsn-4（RNAi）处理后AC中细胞周期状态的分布分别代表了在缺乏swsn-8或pbrm-1亚基的AC中观察到的细胞周期依赖性和细胞周期无关的表型。
强制 G0通过异位 CKI-1 阻滞可挽救 BAF 缺陷但未 PBAF 缺陷型 AC 的侵入潜力
我们之前已经提出并描述了AC中入侵和扩散之间存在的二分法[22，24]。 作为证据，三个TF中的两个以细胞周期依赖性方式起作用，以维持AC处于细胞周期停滞状态（nhr-67/ Tlx和hlh-2/ Daughterless）的丢失可以通过诱导表达细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂cki-1（p21 / p27）来挽救[22]。这些结果表明，至少在某些情况下，可以通过维持G来完全绕过TF活性以促进AC侵袭。0通过直接细胞周期操作阻止。为了确定BAF组装通过调节细胞周期停滞对AC侵袭的贡献程度，我们使用热休克诱导的转基因在SWI / SNF缺陷AC中异位表达CKI-1：：mTagBFP2（图6）。由于热休克诱导的转基因无处不在，并且在个体动物内的不同动物和不同组织之间表达不同，因此我们将分析限制在具有明显mTagBFP2荧光表达的AC的动物身上。在G中强制逮捕时0不足以显著挽救用swsn-4（RNAi）（图6B，6B'和6E）或pbrm-1（RNAi）（图6D，6D'和6E）处理的动物的AC侵袭，异位cki-1（CKI-1：：mTagBFP2）表达在AC中显着挽救了用swsn-8（RNAi）处理的动物的细胞侵袭（图6C，6C'和6E） ).引人注目的是，在86%（6/7）的AC在异位CKI-1表达之前增殖的病例中，迫使G0逮捕导致多个AC违反BM（图6F），这是我们之前使用CKI-1过表达与NHR-67丢失配对的表型。这表明有丝分裂AC如果被重新逮捕到G中，它们仍然具有入侵能力。0状态，即使没有SWI / SNF BAF亚基[24]。为了证实我们的CKI-1热休克数据，我们使用AC特异性CKI-1转基因（cdh-3p：：CKI-1：：GFP）来诱导G0swsn-4-和swsn-8-耗尽的AC中的细胞周期停滞（S5图）。与热休克结果类似，CKI-1：：GFP的谱系限制表达未能挽救缺乏swsn-4的动物的入侵（S5A和S5B图）。然而，转基因cdh-3p：：CKI-1：： 用swsn-8（RNAi）处理的GFP动物，其侵袭缺陷明显低于用swsn-8（RNAi）处理的对照动物，后者缺乏G0救援转基因（S5B 图）。总而言之，这些数据证实了我们基于DHB的CDK传感器数据（图4），表明SWI / SNF组件与G特别需要的BAF不同地有助于AC侵袭。0细胞周期停止。
SWI/SNF 染色质重塑促进 AC 中的侵袭性 GRN
先前的工作已经证明，促进AC侵袭的基因调节网络（GRN）由细胞周期依赖性和细胞周期无关的TF子电路组成[22，68]（图1B）。 在TF-GRN的细胞周期依赖性子回路中，egl-43（EVI1 / MEL），hlh-2（E /无子）和nhr-67（TLX / Tailless）在1型相干前馈回路中合作，该回路通过正反馈得到加强，以将AC保持在有丝分裂后侵入状态[22，68]。 AC TF-GRN的细胞周期无关的子电路由fos-1（FOS）TF控制，其反馈来自egl-43和hlh-2 [22]。由于SWI / SNF ATP酶的转录敲低导致单一和有丝分裂的非侵入性AC表型，因此我们使用渗透性最强的SWI / SNF RNAi克隆swsn-4（RNAi）处理GRN中每个TF的内源性GFP标记菌株- swsn-4（RNAi） - 以确定SWI / SNF染色质重塑是否有助于调节其中一个或两个AC GRN亚电路（图7 ).在细胞周期依赖性亚回路中，SWI / SNF ATP酶的敲低导致AC中EGL-43：：GFP和NHR-67：：GFP的蛋白质表达显着丧失（分别为39%和26%GFP消耗;n≥41动物）（图7A，7C和7E）。在swsn-4被敲低后，GFP：：HLH-2融合蛋白在AC中的平均荧光表达没有显著差异，但swsn-4（RNAi）处理后表达范围很广（GFP增加约2%;n≥50动物）（图7B和7E）。在细胞周期无关的亚回路中，fos-1处理后SWI / SNF复合物的损失：：具有swsn-4（RNAi）的GFP动物导致AC中表达的更中度消耗（11%GFP消耗;n≥50动物）（图7D和7E）。虽然我们不能说SWI / SNF是否直接结合这些TF的调节区域，但这些结果表明SWI / SNF复合物广泛地重塑染色质以促进促侵入性AC GRN的两个亚电路。
PBAF 组件调节与底层 BM 的交流接触
先前对SWI / SNF的研究已经证明PBAF组装在细胞周期调节中的不同作用。在酵母中，重塑染色质（RSC）的结构（PBAF的同源复合物）是有丝分裂进展所必需的[73，74]。 在果蝇中，同源复合物PBAP似乎不是有丝分裂进展所必需的。相反，骑自行车和G2/M 转换仅由 BAF/BAP 组件 [52] 调节。在C中。秀丽隐杆线虫M谱系，RNAi介导的BAF亚基丢失导致发育中的组织过度增殖，而PBAF亚基的敲低对细胞周期控制几乎没有影响[36]。同样，在这项研究中，RNAi介导的PBAF亚基pbrm-1，swsn-7或swsn-9的损失仅导致单个非侵入性细胞表达AC报告者，并且DHB：：GFP C / N比率表明G0停滞（图2和5）。 然而，鉴于增强的pbrm-1（RNAi）导致内源性蛋白敲低比增强的RNAis弱得多，靶向AC中的SWI / SNF ATP酶（swsn-4）或BAF组装亚基（swsn-8）（S2C和S2D图），以及核心ATP酶丢失后的剂量依赖性表型（图4 ），由于PBAF亚基敲低不足，我们可能无法观察到有丝分裂非侵入性AC表型。为了排除这种可能性，我们接下来询问PBAF亚基表达的强烈丧失是否有助于有丝分裂非侵袭性AC表型。为了实现这一点，我们使用了生长素诱导的degron（AID）-RNAi组合敲低策略[75，76]。 我们用prm-1内源性标记了mNeonGreen和生长素诱导地格龙（AID）（pbrm-1：：：mNG：：AID）在含有AC（cdh-3p：：mCherry：：moeABD）和BM（层粘连蛋白：：GFP）记者的遗传背景中产生了一个菌株。然后，我们量化了该菌株中AC中的荧光表达。当在标准条件下生长时，6%的AC在P6.p 4细胞阶段没有侵入BM，表明pbrm-1（n = 30）的部分功能丧失（图8A和8G）。这种功能表型的部分丧失可能是由于将mNG：：AID标签插入基因组位点，导致假定的低态等位基因。接下来，我们将一种无处不在的，mRuby标记的TIR1转基因（eft-3p：：TIR1：：mRuby）引入动物体内，并在标准条件（aux（-））或生长素激素（aux（+））存在下评估AC侵袭（图8B）。
我们观察到PBRM-1：：mNG：：AID蛋白在AC中的荧光表达没有统计学上的显着差异，也没有观察到缺乏TIR1转基因的菌株与在辅助（-）培养基上生长的含有TIR1的菌株之间的AC侵袭缺陷有任何差异（TIR1 +：3%耗尽，17%侵袭缺陷; n = 30;图8A、8B和8F）。然而，在这两种情况下，一些侵入的AC似乎只是部分地这样做，正如我们注意到动物在AC下方缺乏性腺BM的情况，但腹侧表皮BM保持完整（图8B，黑色箭头）。这种独特的部分侵袭表型似乎对PBAF具有特异性，因为我们未能观察到在所有其他治疗（包括BAF RNAi治疗）中只有一个BM（表皮）留在P6.p 4细胞阶段的情况。
在aux（+）条件下，含有TIR1转基因的动物AC中的PBRM-1：：mNG：：AID蛋白水平显着降低，相对于在aux（-）条件下生长的相同菌株或没有TIR1转基因的菌株（分别为49%和51%耗尽;n = 30）（图8B和8F）。该结果表明，pbrm-1中的生长素诱导性degron：：mNG：：AID菌株对TIR1介导的降解仍然敏感。尽管PBRM-1表达显着降低，但用生长素治疗的动物AC侵袭缺陷的外显率没有显着差异（17%侵袭缺陷; n = 30）（图8G）。与我们之前对pbrm-1（RNAi）处理动物的结果一样，我们使用AID系统在AC中PBAF表达丧失后没有额外的细胞表达AC报告基因。
接下来，我们在辅助（-）和辅助（+）条件下用pbrm-1（RNAi）处理含有无处不在的TIR1的pbrm-1 ：：mNG：：AID动物。正如预期的那样，用pbrm-1（RNAi）处理pbrm-1 ：：mNG：：AID菌株导致即使在没有生长素的情况下，AC中亚基的表达也非常低，并且Aux（-）和Aux（+）条件之间的表达没有显着差异（图8C和8F）。有趣的是，与在生长素存在下用pbrm-1（RNAi）处理的菌株相比，用对照处理的AID菌株之间的AC侵袭缺陷的外显率也没有显着差异（图8G）。 由于对低态性pbrm-1等位基因的联合治疗，生长素-AID介导的内源性PBRM-1：：mNG：：AID和pbrm-1（RNAi）的消耗不会导致AC侵袭缺陷或非侵入性有丝分裂AC的显着增加，这些结果表明，与剂量依赖性贡献对swsn-4的侵袭不同，pbrm-1强敲低或无效表型可能只是部分/不完全地丧失AC侵袭。
由于 PBAF 组装在C.秀丽隐杆线虫由几个亚基组成，pbrm-1（PBRM1），swsn-7（ARID2）和swsn-9（BRD7 / BRD9），我们接下来研究了PBAF亚基的组合敲低是否会增强AC侵袭缺陷的外显率或导致有丝分裂非侵袭性AC表型。 在没有生长素的情况下，与空载体对照处理的动物相比，用swsn-7（RNAi）处理的动物的AC中PBRM-1：mNG：：AID表达没有显着差异（n = 30）（图8D和8F），但是AC侵入的损失显着增加（50%侵入缺陷; n = 30）（图8G）。引人注目的是，在一种情况下，AC与BM完全分离，因为我们没有检测到与性腺腹侧表面接触的AC膜突起（cdh-3p：：：mCherry：：moeABD）（图8H）。与在辅助（-）条件下用swsn-7（RNAi）处理的动物相比，用swsn-7（RNAi）和aux（+）处理的动物在AC中PBRM-1：：mNG：：AID的表达显着降低（49%消耗; n = 30）（图8F）。虽然在辅助（+）（48%AC侵袭缺陷）的AC侵袭损失方面没有显着差异，但该处理中16%（5/31）的动物的AC与腹侧BM完全分离（n = 31）（图8G和8H）。与用swsn-7（RNAi）处理相比，在swsn-9（RNAi）辅助（-）条件下，ABC中的PBRM-1：：mNG：：AID表达显着低于用空载体对照aux（-）处理的动物的AC（39%耗尽; n = 30）（图8F）。目前尚不清楚为什么swsn-9的转录敲低特异性导致AC中PBRM-1蛋白表达的降低，我们推测这可能是SWSN-9和PBRM-1蛋白之间潜在稳定相互作用的结果。尽管如此，与swsn-9（RNAi）aux（-）条件（19%耗尽;n = 30）相比，我们确实检测到Swsn-9（RNAi）aux（+）中AC中PBRM-1：mNG：：AID的表达进一步降低（图8F），但是，我们看到两种条件之间AC侵袭缺陷外显率没有统计学显着差异（30%对43%; n = 30）（图8G）。 我们还注意到一只动物在swsn-9（RNAi）辅助（-）条件下具有分离的AC，在辅助（+）条件下为零（图8G）。重要的是，我们在所有组合治疗中只观察到每只动物一个AC，支持PBAF组装对G没有贡献的假设。0交流电中的细胞周期停止。
swsn-7（RNAi）和swsn-9（RNAi） AID 组合敲低条件下的分离 AC 表明 PBAF 组件调节与腹侧表皮 BM 的交流接触。先前的研究表明，AC-BM附着由AC GRN的fos-1 / egl-43细胞周期无关的子电路通过调节lamellipodin /mig-10b进行调节，并通过netrin /unc-6信号传导非自主调节[77]。当指定时，缺乏该途径成分的AC附着在腹侧表皮BM上，并随着时间的推移逐渐失去接触，接触的峰值损失发生在P6.p 4细胞期的AC侵袭时[77]。为了确定PBAF组装是否重塑染色质以促进AC GRN的该亚电路的激活，我们用pbrm-1（RNAi）处理内源标记的fos-1：：GFP[22]动物，并在显示侵袭缺陷的AC中定量荧光表达（S6A和S6B图）。用pbrm-1（RNAi）处理的动物在非侵入性AC中FOS-1：：GFP蛋白水平有适度但显着的损失（34%耗尽; n = 20）（S6B图），表明PBAF组装部分调节介导与基础BM附着的fos依赖性途径。
由于PBAF组件的耗尽导致AC中FOS-1：：GFP的中度损失，我们接下来研究了FOS-1和PBRM-1之间的功能相互作用。鉴于PBRM-1：：mNG：：AID等位基因略具有低态性，在TIR1背景中具有~17%的侵袭缺陷，我们使用含有TIR1的菌株作为致敏背景。我们发现，即使没有添加生长素，与fos-1（RNAi）的共消耗也导致几乎完全丧失AC侵袭（97%侵袭缺陷; n = 31）（S6C和S6D图）。最后，我们研究了RNAi介导的pbrm-1消耗是否与FOS-1（基质金属蛋白酶（MMPs））下游靶标的丧失具有协同作用。此前，已经表明，在C中编码的六个MMP中的五个中，动物携带零突变的动物。秀丽隐杆线虫基因组（zmp-1、-3、-4、-5和-6）显示延迟的AC入侵[21]。在这种背景下，五联MMP突变体中pbrm-1的RNAi消耗显着且协同增强的后期侵袭缺陷（在P6.p 8细胞阶段评分）（24%侵袭缺陷; n = 33）（S6E和S6F图）与单独pbrm-1（4%;n = 52）或MMP（0%;n = 35）的损失相比。总之，这些结果表明，PBAF组件与FOS-1协同作用以调节AC入侵。
讨论
以前的工作在C.秀丽隐杆线虫AC和癌细胞侵袭强调了动态染色质状态和染色质调节因子在促进细胞侵袭方面的必要性[24，78–82]。 在这项研究中，我们使用了C。秀丽隐杆线虫AC作为单细胞，在体内系统鉴定一套有助于细胞侵袭过程的染色质因子。我们进行了组织特异性RNAi喂养筛选，以评估与染色质结合，染色质重塑复合物或组蛋白修饰有关的269个基因。我们并不声称我们未能在屏幕中确定为细胞入侵调节因子的基因对于该过程不重要;然而，RNAi介导的荧光网中大多数染色质因子的丢失确实导致AC侵袭缺陷的一些外显率（S1表）。这一发现是意料之中的，因为我们筛选的许多基因都是基因组的全球调节因子，并且广泛地为各种细胞生物学过程做出了贡献，包括内务管理和一般维护。我们从更广泛的列表中提取了细胞侵袭中渗透性最强的调节因子列表（S2表）。我们恢复的许多基因和基因类别作为AC侵袭的重要调节因子，与先前在细胞侵袭和肿瘤发生的背景下研究过的人类基因同源，包括cec-6/ CBX1 / CBX8 [81，83 ]，cfi-1/ ARID3A / ARID3C [84 ]，psr-1/ JMJD6 [85 ]，skp-1/ SNW1 [86]，以及几种TAF（taf-1/ TAF1 / TAF1L，taf-5/ TAF5/TAF5L， taf-7.1/TAF7/TAF7L） [87–89]。此外，我们恢复了线虫特异性基因，包括nra-3和cec-2，以及据我们所知，人类同系物以前在细胞入侵的背景下尚未被研究过的基因，例如cec-3（同源人类蛋白质未表征）和gna-2/ GNPNAT。有趣的是，来自RNAi筛选的"命中"名单包括预测具有激活（例如mrg-1/ MORF4L1，2和mys-2/ KAT8）以及抑制（例如set-9/ SETD5和unc-37/ TLE3）转录作用的基因。由于我们确定为AC侵袭的重要调节因子的大多数基因先前已经在人类发育和癌症转移的侵袭背景下进行了研究，因此这些结果证明了C的效用。秀丽隐杆线虫AC侵袭系统作为遗传和光学上可处理的体内环境，以证实和表征先前确定的染色质因子，这些染色质因子促进类风湿性关节炎和癌症等人类疾病中的细胞侵袭。
在本研究的大部分时间里，我们专注于表征SWI / SNF依赖性染色质重塑复合物对细胞侵袭的贡献，因为它在我们的AC侵袭的重要调节因子列表中具有很高的代表性（S2表），并且在各种动物模型和人类癌症的细胞侵袭和细胞周期控制的背景下进行了广泛的研究[32， 36， 41， 43， 49， 56， 58， 59， 82， 90–94].先前的全外显子组研究已经确定，超过20%的人肿瘤在SWI / SNF复合物的一个或多个亚基中存在突变[33，49，95]。 在整个SWI / SNF缺陷癌症中，染色质重塑复合物中最常突变的亚基是核心ATP酶亚基BRG1 / SMARCA4[49，96]和相互排斥的ATP酶对BRG的寄生[33，80，95，97]。 先前的研究已经确定BRM是BRG1缺陷癌症的有效合成致死靶标，反之亦然[98，99]。 尽管BRG1/BRM在许多致瘤性病例中具有代偿性，但转移性小鼠模型和患者来源的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系中已经描述了伴随的ATP酶表达丧失，并且与患者生存率低有关[90，100，101]。 在秀丽隐杆线虫中，唯一的SWI/SNF ATP酶swsn-4与哺乳动物BRG1和BRM具有高度的同源性，为BRG1/BRM的双重丧失与NSCLC预后不良结果和AC中的细胞侵袭之间的联系提供了一个独特的机会。
在这里，我们使用了C。秀丽隐杆线虫AC侵袭系统作为模型，用于研究SWI / SNF ATP酶和分化表型之间的剂量依赖性关系是否延伸到细胞侵袭。为此，我们报告了AC中相对于相邻VU和VPC组织的所有内源性标记亚基的增强（S4图）。虽然将AC中SWI / SNF亚基表达的增强解释为细胞侵袭对SWI / SNF活性依赖的证据是很诱人的，但这种表达差异也可能是末端分化的结果，因为在侵袭时，AC是终末分化的（与VU不同）。根据这一论点，从P6.p 1细胞阶段到4细胞阶段SWSN-4，SWSN-8和PBRM-1蛋白水平在VPC中相对于它们在AC中的表达较低，但是当原代外阴细胞最终分化时，所有三个SWI / SNF亚基的表达在8细胞阶段在VPC中上升（图3C'， 3D' 和 3E'）。
通过评估SWSN-4野生型水平以及中度和重度ATP酶敲低条件下的AC侵袭表型（图4），我们发现细胞侵袭和细胞周期控制取决于AC中存在的功能性SWI / SNF的剂量。通常，在我们的实验中，AC有丝分裂表型的增强通过AC中ATP酶的平均表达逐渐下降来统计跟踪。对这些SWI / SNF：：GFP菌株的进一步分析表明，在侵袭时，AC中存在复合物内和组装间调节，两个SWI / SNF组件协同激活ATP酶的表达（S3D图）。这种增加的复杂自动调节水平可能以细胞和上下文特异性的方式有助于ATP酶的"最佳"剂量。
除了反映癌症中SWI / SNF ATP酶的剂量依赖性外，我们在AC中的数据与C中所做的工作一致。秀丽隐杆线虫早期中胚层发育，其中使用催化死亡突变体和谱系特异性敲除策略完全丧失swsn-4 ATP酶导致细胞周期停滞的丧失[36]。虽然我们不能确定将swsn-4（RNAi）与抗GFP靶向纳米体联合以消耗SWI / SNF ATP酶会导致蛋白质表达的完全丧失，但我们表明，仅用改进的swsn-4（RNAi）载体进行治疗就足以对先前在生长母细胞（SM）开发后期报道的无效表型进行表镜检查（S4图） ).总而言之，这些数据支持SWI / SNF细胞自主地以剂量依赖性方式促进细胞周期控制的假设，并提供第一线证据将SWI / SNF ATP酶剂量与侵袭和增殖之间的二分法联系起来（图9）。
虽然我们实验室先前的工作基于DNA许可因子CDT-1的定位，但间接证明了AC必须在G中被捕。0/G1细胞周期状态[22，24]，我们缺乏足够灵敏的工具来区分这两种相间状态。 从我们最近利用CDK传感器检查C中的扩散静止决策的工作中。秀丽隐杆线虫，我们可以区分G体腺中的前终末期细胞1（平均 C/N 比：0.67+/-0.10）和末端微分 G0子宫细胞（平均 C/N 比值：0.30+/-0.11）[37]。在这里，我们将对照动物AC中的CDK活性测量值与末端Pi谱系的CDK活性测量值进行了比较，以提供AC在CDK中停滞的首次定量证明。低G0状态入侵（图5A，5E和5F）。此外，通过将CDK传感器与SWI/SNF亚基的损耗相结合，我们的数据表明SWI/SNF BAF组件专门负责调节G。0交流电中的细胞周期停止。在这里，使用CDK传感器[37，70]，我们表明，核心或BAF组装亚基的损失特别导致有丝分裂AC未能侵入BM。 我们的细胞周期传感器数据表明，BAF组件对交流侵入的主要贡献是通过维护G0停滞，因为许多未能侵入BM的AC具有增加的CDK活性，表明G中的细胞循环1、S 或 G2.或者，在复合物的swsn-4/ ATP酶丢失后未能侵入BM的AC中，有14%具有表明G的CDK活性比0细胞周期停滞，提示细胞周期无关缺陷。为了支持这一点，强制G0对缺乏BAF的AC的阻断足以显着挽救入侵，而CKI-1诱导未能挽救RNAi介导的swsn-4/ ATP酶损失的AC中的入侵。总之，我们的结果表明，SWI / SNF复合物通过调节G有助于AC侵袭。0通过BAF组件阻止细胞周期。进一步的研究将需要生化技术来识别BAF组装的细胞周期调节剂和TF靶标，以便为BAF究竟如何调节染色质景观以促进入侵提供机制解释（图9，蓝色箭头）。靶向DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定（TaDa）是一种有吸引力的生化方法，可能适用于AC侵袭系统，因为该方法已被表征为鉴定C中TF靶标序列相互作用的有效组织特异性方法。秀丽隐杆线虫表皮 [102]。
以前的C.秀丽隐杆线虫尚未揭示PBAF组装与细胞周期停止之间的联系。我们最初使用针对PBAF亚基的改进RNAi载体进行的实验导致相对于核心或BAF亚基的损失，AC侵袭缺陷的外显率较低。此外，我们的CDK传感器数据表明，缺乏pbrm-1的非侵入性AC仍保留在G中。0.因此，我们的数据显示，PBAF对AC中的细胞周期控制没有贡献。为了证实这一点，我们使用生长素诱导性脱氢（AID）系统，通过结合内源性PBRM-1：：mNG：：AID的损失和RNAi介导的对其他两个PBAF组装亚基swsn-7或swsn-9中的任何一个的敲低，来稳健地耗尽PBAF组装。这种组合击倒策略证实了我们之前的结果，因为我们没有看到额外AC的显着外显率。相反，在这里，我们将引人注目的AC脱离表型与PBAF组装亚基的强联合敲低联系起来。我们还注意到一些缺乏PBAF亚基的AC中的异常BM形态，两个BM中只有一个被移除，这表明该组装调节野生型AC中的附着和细胞外基质（ECM）重塑以促进入侵。我们假设PBAF组件正在通过调节HIM-4 / Hemicentin来调节腹侧BM附着和ECM重塑，HIM-4 / Hemicentin是一种细胞外免疫球蛋白样基质蛋白，在AC中起作用，通过形成新的BM-BM粘附，B-LINK[103]来融合两个BM。最后，尽管RNAi介导的PBAF组装亚基的转录敲低仅部分耗尽了FOS-1：：GFP的水平，FOS-1：：GFP是负责MMPs和其他促侵袭靶标表达的关键TF，但我们在假定的低态pbrm-1背景中耗尽fos-1时检测到入侵缺陷的显着增强。相反，pbrm-1的消耗增强了五次MMP突变体的侵袭缺陷。由于我们注意到PBAF组装亚基耗尽后AC-BM脱离的多个实例，因此我们提出PBAF部分与FOS-1一起发挥作用，以促进BM附着所需的原侵袭基因调节区域的激活染色质状态。
总而言之，我们强调，这里提供的数据的主要见解应该根据SWI / SNF复合物在调节C的动态分化和细胞行为方面具有的各种多效性效应进行评估。秀丽隐杆线虫发育。先前的研究已经表征了发育中动物中许多细胞类型中特异性SWI / SNF亚基丢失的影响，例如在雌雄同体特异性神经元（HSN）迁移和5-羟色胺表达的背景下[59]。目前的研究证实了C调查中一个新兴的主题。秀丽隐杆线虫SWI / SNF复合物，通常损害C中SWI / SNF亚基的功能或功能剂量。秀丽隐杆线虫影响动态细胞行为。除了证实SWI / SNF在线虫发育中的一般作用外，对复合物在促进AC侵袭中的作用的研究揭示了每个SWI / SNF组装在表型水平上对细胞侵袭过程的独特贡献，为单细胞SWI / SNF组装特异性侵袭机制提供了证据，并建立了一个视觉上易于处理的平台，用于研究SWI / SNF和其他染色质的保守需求 细胞侵袭的因素。
材料和方法
秀丽隐杆线虫菌株和培养条件
所有动物均在标准条件下维持，并在20°-25°C下培养，但含有温度敏感等位基因swsn-1（os22）、swsn-4（os13）和含有rrf-3（pk1426）等位基因的染色质重塑筛选中使用的子宫特异性RNAi超敏菌株除外，这些菌株保持在15°C或20°C[104]。 热休克诱导的cki-1：：mTagBFP2转基因通过在32°C下在P6.p 2细胞VPC阶段开始的水浴中孵育2-3小时来表达。通过对妊娠成虫进行碱性次氯酸盐处理，同步对动物进行实验，以分离卵子[105]。在文本和图表中，我们通过使用a（p）指定与启动子的链接，并通过a（：:)注解。
分子生物学和显微注射
SWI/SNF亚基swsn-4和swsn-8在各自的内源位点使用CRISPR/Cas9基因组编辑，通过显微注射到早期成年雌雄同体合体性腺中[63，106]。 修复模板作为合成DNA从集成DNA技术（IDT）作为基因块（gBlocks）或Twist Biosciences作为DNA片段生成，并由新英格兰生物实验室Gibson组装克隆到pDD282中的ccdB兼容位点[107]。同源臂的范围为690-1200 bp（参见S5表了解更多详细信息）。通过 EcoRV 和 NheI 酶切质粒 pDD122 构建了 sgRNA.生成230 bp扩增子，用新的sgRNA替换pDD122的sgRNA靶向序列，并使用NEB Gibson组装来产生新的sgRNA质粒（参见S5表了解更多详情）。将雌雄同体成虫与引导质粒（50ng / μL），修复质粒（50ng / μL）和染色体外阵列标记物（pCFJ90，2.5ng / μL）共同注射，并在25°C下孵育数天，然后筛选和与SEC系统相关的絮凝方案[107]。
核糖核酸干扰
在染色质重塑器筛选中评估的所有269个RNAi克隆均来自市售的Vidal或Ahringer RNAi文库。通过对染色质重塑剂筛选中使用的所有L4440载体进行集落PCR扩增，确认了L4440 RNAi载体中存在插入物。还对导致渗透性入侵丧失的载体进行了测序（见S2表），以确认在石溪大学基因组学核心设施中使用Sanger测序，以确认L4440载体中靶向染色质重塑基因的插入片段的身份。通过将基于WormBase上可用的cDNA序列的950-1000 bp合成DNA克隆到高效的T444T RNAi载体[108，109]中，构建了SWI / SNF亚基www.wormbase.org 的RNAi子库（见S3表）。Twist Biosciences将合成DNA作为DNA片段生成，并使用NEB Gibson组装克隆成限制性消化的T444T。对于所有实验，同步L1阶段的动物通过用表达dsRNA的细菌进食直接暴露于RNAi[110]。
生长素介导的降解
为了将RNAi与AID标记蛋白的消耗相结合，使用了1mM K-NAA，并如前所述分析了其效果[111]。简而言之，首先通过次氯酸钠处理同步L1动物，并将其转移到用目标RNAi载体播种的NGM板中。在P6.p 1细胞阶段，AC已经经历规范的开发时期，动物被转移到用K-NAA处理的RNAi种子板中。动物由DIC分期。
活细胞显微镜检查
本手稿中包含的所有显微照片均收集在滨松逆戟EM-CCD相机上，该相机安装在直立的蔡司AxioImager A2上，该相机具有北欧化工改性的CSU10 Yokagawa旋转盘扫描头，使用405nm，488 nm和561 nm Vortran激光器，采用VersaLase合并和Plan-Apochromat 100x / 1.4（NA）油DIC物镜。MetaMorph软件（分子设备）用于显微镜自动化。几个实验和所有RNAi筛选都是使用在蔡司Axiocam MRM相机上可视化的附射荧光进行评分的，该相机也安装在直立的蔡司AxioImager A2和Plan-Apochromat 100x / 1.4（NA）油DIC物镜上。将动物安装在含有约10 mM叠氮化钠麻醉剂的5%Noble琼脂垫上的M9液中，并在上面盖上盖玻片。
AC侵袭的评估
无论是出于染色质因子RNAi筛选还是大多数其他实验的目的，AC侵袭均在P6.p 4细胞阶段评分，当时100%的野生型动物表现出BM的破坏[14]。在P6.p 8细胞阶段对AC侵袭进行评分，以评估用pbrm-1（RNAi）处理时五次MMP突变体的侵袭延迟增强（S6E和S6F图）。在具有层粘连蛋白：：GFP转基因的菌株中，使用AC下的完整绿色荧光屏障来评估侵袭。野生型侵袭被定义为与AC的基底外侧表面一样宽的突破[14]。原始评分数据在S1和S4表中可用。
图像量化和统计分析
使用斐济/ImageJ （v.2.1.0/1.53c） [112] 处理图像。GFP：：SWSN-4，SWSN-8：：GFP，PBRM-1：：eGFP和PBRM-1：：mNG：：AID的表达水平通过量化AC核的平均灰度值来测量，AC核定义为在表达cdh-3p：：mCherry：：moeABD转基因的原发外阴附近的体细胞。背景减法是通过滚动球背景减法（大小 = 50）执行的。对于SWI/SNF内源性标签和AC GRN TFs：：GFP在L3阶段处理的SWI/SNF内源性标签和AC GRN TFs：：GFP实验的表征，仅纳入了在侵袭中表现出缺陷的动物。数据被归一化为图4和S6中图的负对照（空向量）值。如前所述，CDK细胞周期传感器（DHB：：GFP或DHB：：2xmKate2）的定量是手动进行的[37]。图像被叠加，图形分别使用Adobe Photoshop 2020（v. 21.1.2）和Adobe Illustrator 2020（v. 24.1.2）进行组装。使用RStudio进行统计分析和数据绘图（v. 1.2.1335）。使用双尾学生 t 检验或 Fisher 精确概率检验确定统计显著性。图例指定使用每个测试的时间和 p 值截止值。
支持信息
S1 图AC侵袭在温度敏感的SWI/SNF变形中被破坏。
在swsn-1（os22）和swsn-4（os13）温度敏感突变体中代表AC侵袭的单面共聚焦z-堆栈，荧光标记AC（洋红色，cdh-3>mCherry：：moeABD）和BM（绿色，层粘连蛋白：：GFP）在允许温度（A）和限制温度（B）下评分。在swsn-1（os22） （20%的侵袭损失）和swsn-4（os13） （24% 的侵袭损失） 中均出现显著的入侵损失ts菌株在限制性温度25°C下生长并在P6.p 4细胞1°VPC阶段（B）进行评估。白色箭头表示 AC。A 中的黄色箭头表示 BM 中的突破边界。A 中荧光覆盖面板右下角的数字表示野生型 AC 侵袭的外显率。B中荧光覆盖面板右下角的数字表示侵袭缺陷的外显率。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009981.s001
（英文）
S2 图改进的SWI / SNF RNAi显着降低了AC中的SWI / SNF表达。
荧光显微照片描绘了BM（层粘连蛋白：：GFP）和SWSN-4：：GFP（A），SWSN-8：：GFP（B）和PBRM-1：：eGFP（C）在AC喂养的动物中对照的空载体（左）或针对内源性等位基因的RNAi（右）的表达。 白色箭头表示 AC，黄色箭头表示 BM 中的违规边界，白色括号表示 1 个 VPC。比例尺，5μm。（D）荧光表达的相应定量。使用学生t检验对照组AC中每个SWI / SNF亚基的表达与RNAi处理的动物进行统计比较（每个阶段和亚基的n≥30;p值显示在比较数据上方）。（E）堆叠条形图，显示对应于每种治疗的AC侵袭缺陷百分比，按AC表型分箱（每种情况≥30只动物）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009981.s002
（英文）
S3 图SWI/SNF亚基表现出复合物内和组装间调节。
（A-C）代表性荧光显微照片，描述在用针对每个SWI/SNF组装（A）的RNAi处理后，在AC（cdh-3p：：mCherry：：moeABD）或核心ATP酶和替代SWI/SNF组装（B-C）中代表核心（swsn-4，A），BAF组装（swsn-8，B）和PBAF组装（pbrm-1，C）的单个SWI / SNF亚基的内源性GFP表达.白色箭头表示 AC，黄色箭头表示 BM 中的违规边界，白色括号表示 1 个 VPC。比例尺，5μm。（D）定量每种条件下内源性亚基的荧光表达（平均灰度值）。数据被规范化为每个菌株的空载体控制。使用学生t检验对照组AC中每个SWI / SNF亚基的表达与RNAi处理的动物进行统计比较（每个阶段和亚基的n≥30;p值显示在比较数据上方）。不重要。（E）在替代SWI/SNF亚基表达丧失后，对非侵袭性AC的内源性GFP标记亚基的荧光表达进行定量，通过表型将每个RNAi处理分箱成单个非侵入性AC（1AC）和有丝分裂无创AC（2 + AC）。统计比较（学生的t-test;p值显示在比较数据上方）仅限于每种表型中n>10个AC的条件。 不重要。（F） SWI/SNF内核和组件自动和交叉调节原理图摘要。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009981.s003
（英文）
S4 图改进的swsn-4 RNAi概括了性肌母细胞中的SWI / SNF ATPase空表型。
（A）在P6.p 8细胞阶段的外阴和SM细胞中描绘DIC（左）和谱系受限CDK传感器（unc-62>DHB：：2xmKate2，右）表达的单共聚焦z平面，对应于野生型SM细胞分化并退出细胞周期的阶段。用空载体对照（上图）或swsn-4（RNAi）（下图）处理动物。每个处理中的所有代表性图像都来自相应 z 平面（左上角）中同一动物的同一 z 堆栈。平均或单个 C/N CDK 传感器比率列在相应面板的右下角。白色箭头表示单个 SM 单元格。白色括号表示1°VPC.（B）定量在对照和swsn-4（RNAi）处理的动物中存在的P6.p 8细胞阶段存在的SM细胞数量。（C）每次处理中SM细胞的C/N CDK传感器比值。梯度量表描绘了通过量化所有治疗中每个AC（每次治疗n≥30动物）确定的细胞周期状态，深黑色描述分化为G0/G1和描绘G的浅红色2细胞周期状态。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009981.s004
（英文）
S5 图CKI-1的AC特异性表达可挽救BAF耗尽的AC中的入侵。
（A）DIC（左）和荧光（右）图像，描述在空载体对照动物（上图）和用swsn-4（RNAi）（中）或swsn-8（RNAi）（中）或swsn-8（RNAi）（下图）处理的动物中，BM（层粘连蛋白：：GFP）和AC特异性CKI-1（cdh-3>CKI-1：：GFP）的DIC（左）和荧光（右）图像。比例尺，5μm。（B）堆叠条形图显示对应于每种处理的AC侵袭缺陷百分比的量化（每种条件n≥30动物，Fisher精确测试的p值比较了对照动物和动物的侵袭外显率与救援转基因（+CKI-1：：GFP）显示在黑色括号上方）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009981.s005
（英文）
S6 图PBAF部分调节FOS-1转录因子。
（A）代表性DIC（左）和荧光（右）显微照片，描述内源性GFP：：FOS-1a和BM（层粘连蛋白：：GFP）在对照（上）和pbrm-1（RNAi）处理（下）动物中的表达。白色箭头表示AC，黄色箭头表示BM中突破的边界。 （B）GFP：：FOS-1a在对照组和pbrm-1（RNAi）处理动物中的表达的定量，归一化为对照组的平均表达。使用学生t检验对照组AC中的表达和RNAi处理的动物进行了统计比较（每种条件为n≥20;p值显示在黑色括号上方）。（C）DIC-荧光覆盖层（左）和PBRM-1：：mNG：：AID和BM（LAM：：GFP）（右），在用空载体对照（上图）或fos-1（RNAi）（下图）处理的动物中。（D）堆叠条形图显示C中对应于每种处理和遗传背景的AC侵袭缺陷百分比（每种条件n≥30动物，Fisher精确测试的p值比较了用fos-1（RNAi）和pbrm-1处理的野生型动物的侵袭缺陷外显率：：mNG：：用fos-1（RNAi）处理的AID动物显示在黑色括号上方）。（E）代表DIC（左上角），BM（LAM：：GFP，右上），AC（cdh-3>PH，左下角）和P6.p 8细胞外阴的覆盖层（右下角）在用pbrm-1（RNAi）处理的MMP缺陷（-）动物中。（F）堆叠条形图显示了E中对应于每种处理和遗传背景的AC侵袭缺陷百分比（每种条件n≥30动物，Fisher精确测试的p值比较了用pbrm-1（RNAi）处理的野生型动物和用pbrm-1（RNAi）处理的MMP（-）动物的侵袭缺陷外显率显示在黑色括号上方）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009981.s006
（英文）
S1 表。评估AC侵袭贡献的染色质因子（见excel文件）。
RNAi针对AC侵袭缺陷的270种染色质调节因子。每个RNAi克隆的n≥30动物。对于测试的每个RNAi克隆，给出了来自www.wormbase.com的相应基因序列名称，公共名称，蛋白质注释和人类同源物（HUGO基因命名法）。每个侵袭缺陷的外显率给出为评估的动物总数（阻断/侵袭+部分）中在P6.p 4细胞阶段未能侵入BM的AC动物的百分比。部分是指动物的BM突破小于入侵AC的基底外侧表面宽度的情况。以粗体显示的基因被恢复为AC入侵的重要调节因子（S2表）。注释是从STRING联盟 www.string-db.org 中挖掘出来的。人类同源物列中的星号表示具有>5个检测到的人类同源物的基因，其中仅列出了前5个返回的直系同源物。N.A.表示不存在人类同源物的基因。列表根据基因序列名称按字母顺序组织。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009981.s007
（XLSX）
S2 表。AC入侵的重要调节器（参见excel文件）。
41种染色质和染色质调节因子（CRF）被确定为AC侵袭的重要调节因子。对于列出的每个RNAi克隆，都会列出相应的基因序列名称，公共名称和人类同源物。在P6.p 4细胞阶段为每个克隆提供AC侵袭评分数据。如果RNAi靶向导致P6.p 4细胞阶段≥20%的入侵损失（n≥30动物），则基因被确定为显着的AC侵袭调节因子。粗体基因是SWI / SNF复合物的组成部分。星号表示先前发表的用于调节C的基因。秀丽隐杆线虫交流电入侵。N.A.表示不存在人类同源物的基因。列表根据基因序列名称按字母顺序组织。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009981.s008
（XLSX）