预畸形和表观发生收敛以指定早期果蝇胚胎中原始生殖细胞的命运
梅根·科隆内塔，约格什·戈亚尔，希思·约翰逊，萨普纳·西亚尔，保罗·舍德尔，吉里什·德什潘德
出版日期： 2022年01月05日
抽象
动物发育的一个关键步骤是原始生殖细胞（PGC）的规范，这是种系的前体。在整个动物王国中实施了两种看似相互排斥的机制：表观发生和形成。在表观发生中，PGC规范是非自主的，取决于外在信号通路。BMP途径为哺乳动物提供了关键的PGC规范信号。预成型是自主的，由PGC内定位的决定因素介导。在果蝇中，一个典型的变形例子，局限于胚胎后部的生殖质的成分被认为是正确测定PGC的必要和足够的。与这个长期存在的模型相反，在这里我们表明这些局部决定因素本身不足以指导胚芽期胚胎中的PGC规范。相反，我们发现BMP信号通路在规范过程中的多个步骤中是必需的，并且与种质的组分一起起作用以协调PGC命运。
作者简介
原始生殖细胞（PGCs）的正确规范至关重要，因为PGC是种系干细胞的前体。为了确定PGC的命运，无脊椎动物依赖于涉及母体沉积的生殖质的细胞自主变形。在果蝇黑糖r中，为了使新形成的PCC免受细胞 - 细胞信号通路的不利影响，种质决定因素沉默转录并减弱细胞周期。然而，我们关于BMP信号通路的数据挑战了这种长期持有的PGC规范观点，并表明胚胎PGC的适当规范对BMP配体，十戊瘫痪（dpp）及其同源受体厚脉敏感。我们发现PGC不仅能够响应来自体细胞的BMP信号，而且这些信号也会影响生殖细胞的正确测定。基于哺乳动物和苍蝇之间这些意想不到的相似性，我们提出了一个模型，该模型整合了PGC测定过程中细胞自主（变形）和非自主（表观发生）途径的贡献。与该模型一致，我们观察到PGC命运的母体决定因素oskar与BMP途径配体dpp之间的显性遗传相互作用。
数字
Fig 10Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Fig 9Fig 10Fig 1Fig 2Fig 3
引文：Colonnetta MM，Goyal Y，Johnson HE，Syal S，Schedl P，Deshpande G（2022）变形和表观发生收敛以指定早期果蝇胚胎中原始生殖细胞的命运。PLoS Genet 18（1）：e1010002。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002
编辑 器：Giovanni Bosco，美国达特茅斯盖泽尔医学院
收到：七月 30， 2021;接受：十二月 17， 2021;发表：一月 5， 2022
版权所有：? 2022 Colonnetta et al.这是一篇根据知识共享署名许可协议条款分发的开放获取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。
数据可用性：所有相关数据均在稿件及其支持信息文件中。
资金：这项工作得到了美国国立卫生研究院（HD093913）对PS和G.D.的资助，以及（GM126975）对PS.M.M.C.的资助，得到了NSF研究生研究奖学金（DGE-1656466）的支持。Y.G.获得了世界羽联CASI奖的支持。H.E.J.得到了Ruth Kirschstein奖学金（F32GM119297）的支持。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
相互竞争的利益：作者宣布不存在相互竞争的利益。
介绍
有性繁殖使多细胞生物能够将遗传信息从一代传递到下一代。该过程由雄性和雌性种系干细胞（GSC）不对称分裂产生的成角细胞的分化开始，并以雄性（精子）和雌性（卵）配子的融合达到高潮以产生胚胎受精卵。性成熟动物的GSCs不会从头开始出现。相反，它们来自一组特殊的细胞，即原始生殖细胞（PGC），这些细胞在胚胎发育的早期阶段与剩余的体细胞分开。由于PGC的正确规范对于生殖周期的进展至关重要，因此其形成和命运规范背后的机制一直是研究的主要焦点[1–6]。
PGC规范的许多特征在动物王国中被广泛保存。大多数动物的关键PGC规范步骤之一是转录的下调。然而，建立和/或维持转录静止的机制是多种多样的[6–10]。例如，在哺乳动物中，最终产生种系的细胞的祖细胞像胚胎中的其他细胞一样经历受精基因组激活（ZGA）;然而，在PGC规范的初始步骤之后，体细胞基因的转录在很大程度上被终止，这些细胞开始恢复到更早的多能状态[6–8]。在蠕虫中，产生生殖系的细胞谱系在第一次分裂时被搁置，并且，当在3-4个细胞阶段的剩余体细胞中开始转录时，它在转录上保持静止，谱系中的子细胞注定会成为种系[9，10]。
在苍蝇中，PGC是在ZGA的小波开始后形成的，该小波始于核循环（NC）8。在它们的形成过程中，正在进行的转录被无生殖细胞（gcl）[11，12]关闭，而在ZGA（NC14）主波期间激活的基因则通过极性颗粒成分（pgc）[13–15]和纳米（否）的组合作用而保持关闭[16–18 ].转录的广泛下调反映在RNA聚合酶II CTD结构域的磷酸化状态上。PhosphoSer2是一种与转录伸长率相关的修饰，在新形成的PGC中基本上不存在，而与起始相关的修饰PhosphoSer5则大幅减少[14，17，19，20]。 第二个常见特征是组蛋白修饰配置文件的改变。在蠕虫和苍蝇中，组蛋白H3meK4（一种与活性转录相关的修饰）在年轻PCC中基本上不存在。在这两种生物体中，种系决定因素nos有助于抑制这种组蛋白修饰[21]。除了nos之外，抑制苍蝇体内H3meK4修饰需要H3meK4脱甲基酶，Su（var）3-3，Swi/ Snf染色质重塑复合物亚基，osa [14]和转录调节剂pgc [13，14]。 异色组蛋白修饰也有改变，H3meK9 [21]。像蠕虫和苍蝇一样，小鼠PGC也显示出组蛋白修饰的变化[20，22，23]。 第三个共同特征是暂停细胞周期。在蠕虫，苍蝇和哺乳动物中，PGC在G2中阻止细胞周期[17，20，24 –26]。 除了这些共同特征之外，模型无脊椎动物（苍蝇或蠕虫）中与PGC规范有关的基因，如nos，vasa和piwi，在高等动物（小鼠，人类等）中也是保守的。 [1， 8， 9]
虽然PGC的许多特征将它们与体细胞区分开来，但在不同的动物物种中广泛共享，但有一个惊人的二分法，即机制驱动规范是"表观"还是"预成型"。在表观发生中，规范是非自主的，取决于细胞 - 细胞信号传导。在预成型中，规范是自主的，并且由定位于推定PCC中的决定因素驱动。哺乳动物利用表观发生。在植入前胚胎中，来自胚胎外外胚层和内脏内胚层的感应信号的组合作用于诱导后外胚层内的细胞成为PGC[6，7，27]。 信号传导似乎至少是一个两步过程，其中Wnt3（Wingless 3）首先在外胚层中引物细胞。一旦启动，细胞可以响应BMP（骨形态发生蛋白）配体Bmp4和Bmp8b，它们由胚外外胚层分泌，Bmp2由内脏内胚层分泌[28–31]。这些信号激活Smad转录因子，这些转录因子设置了PGC规范所需的转录程序[32–34]。相比之下，蠕虫和苍蝇被认为采用一种涉及局部细胞自主因子的排他性预成型机制。在蠕虫中，在每次卵裂球细胞分裂期间，局部的PGC决定因素仅分离到一个子细胞，最终产生两个PGC创始人Z2和Z3 [9，35]。在苍蝇胚胎中，受精之后是一系列快速同步的核分裂，最终在NC14结束时达到细胞化[36]。然而，早些时候，在NC9期间，几个细胞核迁移到胚胎的后极并诱导极芽的形成[37]。在芽形成过程中，与每个传入细胞核相关的中心体/微管网络触发从后皮质细胞骨架释放局部PGC决定因素，然后在细胞化过程中将这些因素掺入新形成的PGC中[37，38]。 当这些因素未在新形成的PGC中正确隔离时，PGC规范就会失效[12，38–40]。
在苍蝇中协调PGC形成和随后规范的主要决定因素是oskar（osk）[41]。 osk mRNA在卵发生过程中定位于卵母细胞的后极，并在卵发生中期翻译[42]。然后，Osk蛋白介导种质关键组分的募集和组装，包括瓦萨蛋白、都铎蛋白、瓦卢瓦蛋白和茄子蛋白以及pgc、gcl和nos mRNA。 一旦在卵子的后部组装，种质就足以诱导PGCs的形成。Illmensee和Mahowald表明，在胚胎前部注射极状质可诱导异位PGC的形成[43]。Ephrussi和Lehmann总结了这一发现，他们用双面体（bic）3' UTR取代了osk 3' UTR[44]。他们发现，由异位Osk蛋白组装的极质足以诱导胚胎前部全功能PGC的形成。此外，osk的过表达会增加PGC的数量，并且还可以在胚胎的背侧诱导异位PGC[45]。
这些和其他发现强化了这样一种观点，即完全依赖于局部决定因素的预成型机制负责果蝇中的PGC规范。然而，在胚胎发生的后期，PGCs既不冷漠也不对细胞外信号免疫。与其他生物体一样，苍蝇PGC必须从后极的形成部位通过胚胎迁移，与体细胞性腺前体细胞（SGP）合并[46]。它们通过中胚层的迁移是由刺猬（Hh）信号通路介导的，并且它们由SGP产生的增强型Hh配体引导[47–49]。在大致相同的时间范围内（胚胎发生的10-14阶段），苍蝇PGC不仅对BMP信号做出反应，而且依赖于BMP信号来维持其身份。当使用种系特异性nos-Gal4驱动物敲低BMP受体厚脉（tkv）时，PGC中的血管蛋白积累被破坏，而种系特异性光谱的组装受到损害[50]。虽然hh定向PGC迁移似乎是由一种新的非转录途径介导的[49，51]，但9-14期胚胎中PGC命运的维持取决于BMP下游的规范转录因子。 Nos-Gal4依赖性RNAi敲低Smad辅助因子美狄亚破坏瓦萨蛋白积累。类似地，蓝精灵（一种靶向磷酸化（和活性）Smad进行降解的泛素E3连接酶）的过表达会引起瓦萨积累和光谱体组装的缺陷[50]。
这些发现表明，在胚胎发生中期，在性腺合并之前的时期，BMP途径不仅有助于维持PGC身份，而且还有助于促进PGC分化为GSCs。这表明，至少在这个时间框架内，仅凭孕产妇决定因素不足以维持PGC身份或促进分化。如果是这种情况，一个相关的问题是，局部的母体决定因素本身是否足以满足细胞前胚泡胚胎中PGCs的规范，或者即使在发育的这个阶段，它们是否也需要来自BMP信号通路的输入。在这里，我们解决了这个问题。
结果
早期胚胎过表达dpp由于有丝分裂增强，导致 PGC 数量适度增加
Dorfman和Shilo的研究表明，合胞体和细胞胚胚中新形成的PGC不能免疫BMP信号通路[52]。像胚胎背侧的体细胞一样，活化的pMad在PGC细胞核中积累到高水平，这种吸积取决于tkv受体及其配体，十五肢瘫痪（dpp）[53–55]。正如pMad在PGC细胞核中的积累所预期的那样，先前对dpp mRNA和Dpp配体表达的研究表明，尽管早期胚胎中的dpp表达结构域仅限于胚胎的背侧，但它包括胚胎的整个后极（和前极]）。在生殖系克隆胚胎中纯合为tkv突变（FRTtkv8称为tkvm-从此以后），pMad在soma和新成立的PGC中完全消失了。当tkvm-胚胎由 WT tkv精子受精，受表达可以部分减轻体细胞和新形成的 PGC 中 pMad 积累的缺陷。这表明，与许多其他在PGC中特异性关闭转录的基因不同，tkv的转录不是[52]。tkv是已知在新形成的PGC中被转录的少数基因之一，这一事实表明pMad积累可能具有重要功能。另一方面，也有可能pMad依赖性诱导下游靶标被下调新形成的PGC中全局转录的母体决定因素所阻断。在这种情况下，PGC将对核pMad的正常活性免疫。
为了测试新形成的PGC是否对来自BMP信号通路的输入有响应，我们使用twist-Gal4来驱动胚胎腹侧UAS-dpp转基因的表达，从而产生了过量的Dpp。与PGC保留对BMP信号传导的反应能力的想法一致，可能是通过pMad的磷酸化和核定位，我们发现过量的Dpp导致PGC的数量适度但显着增加，无论是在第4阶段合胞胚层（S1A和S1B图和S1表）还是在5/6阶段，即晚期合胞体/细胞胚层胚胎（S1C和S1D图）（26.4个PGCs/twi-Gal4/UAS-dpp中的胚胎）， n = 16;与每个胚胎21.9个PGC相比，n = 20对照;p = 0.0019 通过 t 检验）。当使用母体微管蛋白-Gal4提高Dpp水平时，在合胞体/细胞胚芽孢子阶段胚胎中也观察到PGC计数的类似升高（S1表;p = 0.027通过t检验）。
由于WT PGC在形成后仅分裂0-2次，然后在胚胎细胞化时停止分裂[57]，因此PGCs数量的增加可能是由于未能完全退出细胞周期。如果这个想法是正确的，那么在twi-Gal4/UAS-dpp胚胎中，有丝分裂中PGC的频率应该升高。为了测试这种可能性，我们使用磷酸化组蛋白3（pH3）抗体鉴定了有丝分裂中的PGCs[58，59]。 在WT中，pH3在PGC形成和NC14结束之间的时间内相对较少地被检测到（图1A和S2表;每个胚胎0.7个极点细胞，n = 18）。相比之下，在twi-Gal4/UAS-dpp胚胎中，这个数字显着升高（?4倍），如图1B所示（每个胚胎2.8个极性细胞，n = 18;p = 1.6e-5通过t-test）（图1B和S2表）。这表明Dpp信号通路促进了新形成的PGC的增殖。
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图 1.使用twist-Gal4的dpp的异位表达增强了有丝分裂，导致PGC计数适度增加。
（空调）twi-Gal4（B / D）或twi-Gal4 / UAS-dpp胚胎被染色为PGC标记Vasa（A-D，红色）和pH3（A'-B'）或Cyclin B（C'-D'）（蓝色）以评估极点细胞的有丝分裂状态。与 PGC 中的 WT 水平相比，过量的有丝分裂标志物由星号 （pH3） 或脱字符号 （细胞周期蛋白 B） 表示。比例尺表示 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g001
为了进一步分析过量的Dpp如何促进PGC分裂，我们检查了Cyclin B（CycB）的表达。在WT PGC中，细胞周期蛋白B mRNA的翻译专门针对Nanos：Pumilio复合物的抑制[25，26]。 因此，在WT PGC中仅检测到非常低水平的CycB（图1C）。相比之下，在twi-Gal4/UAS-dpp胚胎中，CycB很容易在许多PGC中检测到（图1D和S2表）（对照的0.3个PGC，n = 9，而twi-Gal4/UAS-dpp胚胎中的2.2个PGC，n = 9; p = 0.0045通过t检验）。twi-Gal4/UAS-dpp胚胎中CycB水平的增加表明细胞周期蛋白B翻译的Nos依赖性抑制被破坏。然而有趣的是，我们没有观察到twi-Gal4/UAS-dpp PGC中Vasa水平的任何明显降低（S2图和S3表;p = Fisher精确测试的p = 1.0）。
PCC 在存在过量 BMP 信号传导的情况下保持转录静止
伴随着新形成的PGC中mRNA转录的关闭，大Pol II亚基的CTD（C端结构域）中庚骨中Ser2和Ser5的磷酸化显着减少[13，14，19，21，60]。 然而，在PGC中上调转录后，两种CTD修饰的水平增加[19]。由于pMad的磷酸化和核定位调节了体细胞中的转录[61]，我们想知道过量的Dpp是否破坏了通常在WT PGC中观察到的转录的全局下调。由于pSer2的积累忠实地报告了转录伸长率，我们检查了twi-Gal4/UAS-dpp和WT PGC中pSer2的水平。然而，twi-Gal4/UAS-dpp和WT胚胎之间没有可检测到的差异（S2图和S3表;通过Fisher的精确测试，p = 0.676744）。因此，过量的Dpp不会检测到PGCs中的PolII转录增加。
新形成的 PGC 中的血管积累取决于 BMP 信号通路
过量Dpp诱导的有丝分裂活性的增加表明PGC既不冷漠也不对BMP信号传导免疫。从这一发现中得出的合理推论是，与哺乳动物的情况一样，BMP信号传导有助于在胚芽阶段苍蝇胚胎中指定PGC身份。为了开始探索这种可能性，我们首先检查了两种不同遗传背景的PGC中的Vasa蛋白积累。第一种是 dpp 配体dpp的可行部分功能丧失 （LOF）等位基因hr92 [62]，而第二个是tkv受体的活偏LOF等位基因，tkv427 [pMad水平已被证明在因dpp信号传导的成分而受损的胚胎中降低，包括dpp本身[52]。伴随着pMad的减少，瓦萨的减少，这是种系身份的标志物（图2B）。对于dpphr92，我们发现38%的dpphr92PGC的Vasa水平显着降低（n = 63），而WT（n = 49）仅为8%（S4表，p = 0.00325通过Fisher的精确测试）。在tkv的情况下427胚胎中，32%的瓦萨水平降低（n = 53），而瓦萨在WT合胞胚芽胚中的含量仅降低7%（图2C和S4表;通过Fisher的精确测试，p = 0.00304）。当我们分析tkv产生的胚胎的PGC中的Vasa时，也获得了类似的结果。m-种系克隆母亲与WT父亲交配（tkvm-z+).我们找到了 32.8% 的tkvm-z+PGC（n = 48;通过Fisher的精确测试p = 3.4e-5）显示与对照合胞体胚胚中的2.1%的PGC相比，瓦萨水平降低（n = 47，S4表）。
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图 2.因BMP信号传导而受损的胚胎表现出瓦萨的丧失。
对指示基因型的胚胎进行极点细胞标志物Vasa（白色）染色，以可视化PGC数量和Vasa水平。（A） WT （B） DPPhr92（三）断续器427（D） dppi33618（五）断续器4.比例尺表示 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g002
这些结果表明，BMP途径成分在胚胎发生早期会影响PGC特异性标志物Vasa的积累。虽然这一观察结果表明BMP信号传导会影响PGC规范，但存在潜在的复杂性。在所有三个实验中，母亲或母体种系都是dpp或tkv突变的纯合子。虽然BMP途径在卵生过程中功能性极质的组装中没有已知的作用，但这仍然是一种形式上的可能性。出于这个原因，我们采取了两种不同的方法来确定对Vasa的影响是否是严格的合子，而不是BMP信号传导在极质组装/功能中的一些未记录的作用的结果。在第一个中，我们使用了两个UAS：dppRNAi转基因（dppi） 33618和dppi25782）敲低胚层阶段胚胎中dpp的表达。在这些实验中，我们将携带垫-微管蛋白-Gal4转基因的母亲与每个UAS-dpp RNAi转基因的父亲纯合子交配。在细胞前胚芽中敲低dpp会破坏新形成的PGC中的Vasa积累（图2D）。我们发现，31.7%的PGC（n = 145）减少了Vasa，而对照胚胎中的PCC（n = 136）减少了2.9%（n = 136），其中mat-tublin-Gal4母亲与携带UAS的父亲交配：egfpi转基因（S4表;根据Fisher的精确测试，p = 0.0）。虽然效果稍差，但dppi25782转基因给出了类似的结果（21.1%的PGC，n = 180）的Vasa水平降低（S4表;通过Fisher的精确测试，p = 1.0e-6）。
在第二种方法中，我们检查了纯合子胚胎PGC中的Vasa积累，以确定dpp，dpp的强功能丧失突变。 4.为了鉴定纯合子dpp4胚芽孢子阶段的胚胎中，dpp突变与扭曲蛋白空复原。从杂合子dpp之间的杂交收集的胚胎4用Vasa和Twi抗体的组合探针twi / CyO父母。正如在颧合RNAi敲低中观察到的那样，纯合子dpp的PGC中的瓦萨水平降低4twi胚胎。我们发现，在没有可检测到的Twi蛋白的胚胎中，27.8%的PGC（n = 248）的Vasa水平降低，而Twi阳性兄弟姐妹中PGC的PGC（n = 216）降低（S4表;Fisher的精确测试p = 0.0）。
当BMP途径中断时，转录静止部分受损
新形成的PGC中Vasa的损失表明BMP途径在PGC规范的早期阶段起作用。如果是这样，新成立的PCC的其他标志也可能被破坏。其中之一是建立转录静默。为了评估BMP途径对下调RNA Pol II转录的影响，我们使用了几种方法。在WT中，在合胞胚胚层胚胎PGC中不存在转录伸长（pSer2）的特征，而在体细胞核中很容易检测到。如图所示，对于两个不同的胚胎（图3B和3C），dpp中新形成的PGC（由瓦萨蛋白标记）hr92胚胎积累的pSer2水平接近周围体细胞核的水平。pSer2 阳性 PGC 的定量表明，合胞体胚层为dpp的 23.9%hr92tkv的 PGC（n = 67;p = 0.000597，通过 Fisher 的精确检验）和 30%（n = 120;p = 1.0e-6，通过 Fisher 的精确检验）427PGC具有核pSer2，而WT PGC的pSer2为5.1%（n = 98）（图3和S3和S5表）。
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图 3.BMP信号传导成分的缺失导致PGC中活性转录标记物水平升高。
（A） WT， （B） dpphr92， （C） tkv427和 （D） tkvm-z+对胚胎进行极点细胞标记Vasa（红色）和phosphoSer2（转录激活的指示剂，绿色）染色。星号表示 PGC 中存在 phosphoSer2。比例尺表示 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g003
为了进一步测试BMP途径对RNA聚合酶II活性的影响，我们检查了tkv种系克隆母亲（tkv）产下的胚胎的PGC。m-z+).虽然WT对照中的PGC（图3）很少具有可检测的pSer2水平（4.6%，n = 43），但tkv中超过40%（41.2%，n = 51）的PGCm-z+胚芽阶段的胚胎具有pSer2（S5表;通过Fisher的精确测试，p = 2.70e-5）。此外，那些tkvm-z+pSer2水平最高的PGC通常显示血管耗竭的证据（插入符号，图3B和3C）。
pSer2并不是当BMP途径的成分未完全活跃时在PGC中改变的唯一转录活性标志物。在WT中，活性转录的染色质标记，组蛋白H3修饰，H3meK4，在合胞体胚芽孢子胚的体细胞核中上调，而在PGC细胞核中几乎完全不存在。相比之下，该标记在tkv中很容易检测到。427PCC（占tkv的51.7%）427PGC， n = 56;p = 0.0 通过费舍尔的精确检验），而不是2.9%的WT PCC（n = 69）（S4图）。此外，在dpp的PGC中也观察到H3meK4信号较弱但显着升高hr92胚胎（22.2%，n = 54; p = 0.001077通过费舍尔的精确测试）（S5表）。综上所述，这些观察结果表明，早期胚胎中BMP信号传导的丧失会破坏PGC中转录的适当下调。
在新形成的PGC中通常沉默的基因在BMP途径受损时异位表达
先前的研究表明，已知负责抑制新形成的PGC转录的三种母体因子，Gcl，Nos和Pgc，在不同时间起作用，并靶向一组重叠的基因。gcl在 PGC 细胞化过程中起作用。Gcl负责关闭在ZGA小波中被激活的基因的转录。它的目标包括scute （sis-b）、sis-a和runt [11， 12]。 它还在压制Sxl建立发起人Sxl-Pe方面也发挥了作用。 Pgc和Nos在PGC形成后起作用，但具有不同的活性和基因靶标。pgc抑制激酶pTFb，该激酶磷酸化Pol II CTD结构域中的Ser2残基。它已知的目标包括无尾（tll）和缓慢的糖蜜（slam）[13，14]。 虽然尚不清楚nos如何抑制Pol II转录，但其已知靶标包括fushi-tarzu，偶数跳过和Sxl-Pe启动子[17]。
为了测试损害BMP信号传导对转录活性的影响，我们选择了tll，slam和Sxl-Pe，并使用荧光原位杂交（FISH）和单分子FISH（smFISH）的组合检查它们的表达。 tll和slam探针针对相应mRNA中的序列，而Sxl-Pe探针与Sxl-Pe转录本中的大内含子同源，因此仅检测新生的mRNA。如图4所示，我们发现tll mRNA在dpp的一个子集中表达。hr92PGC（图4）。虽然所有WT胚胎在PGC中没有tll转录（n = 19），但dpp的70.4%hr92胚胎显示异位tll转录（n = 27;p = 1.0e-6通过Fisher的精确测试）。进一步定量dpp中tll mRNA的表达hr92与WT相比，PGC相对于相邻体细胞对PGC的tll染色强度进行了归一化。如图所示，dpp中tll信号的平均值显著增加hr92PGC与WT的比较（图4H）。在WT胚胎中，slam转录本开始出现在合胞体胚泡阶段，并且在细胞胚粒期胚胎中水平显着升高。满贯RNA还与Slam蛋白相关，Slam蛋白装饰膜[64]。因此，针对mRNA的slam探针标记体细胞核/细胞的延伸膜室。然而，slam不会在PGC中被转录，它们通常没有slam mRNA。使用smFISH，我们在dpp的一个子集中检测到了slam表达。hr92PGC（图5B：见星号）。大约26.3%的 dpphr92（n = 38; p = 0.000991通过Fisher的精确测试）胚胎具有一个或多个表达slam mRNA的PGC（S6表）。我们还检查了携带dpp RNAi系dppi的胚胎中的PGC。33618 (图5C：见星号）。我们发现 35.7% 的dppi33618快速大满贯（n = 14;p = 0.000852通过Fisher的精确测试）与WT胚胎的0%（n = 37）相比。对于Sxl-Pe，dpp的频率hr92具有可检测转录本的胚胎低于tll和slam。我们发现 18.2% 的dpphr92胚胎（n = 11;通过Fisher的精确测试，p = 0.47619）具有Sxl-Pe转录本，而在WT胚胎中未观察到Sxl-Pe转录本（n = 10）（S6表）。似乎我们在dpp中检测Sxl-Pe转录本的频率要低得多。hr92PGC，因为Sxl-Pe探针仅杂交到新生转录本，并且转录爆发相对较少。此外，我们发现异位Sxl-Pe表达确实在gcl胚胎中显示出轻微的性别偏倚[12]。与性别非特异性体细胞基因（例如slam，tll）相比，类似的偏差可能会使Sxl转录本的检测相对罕见。
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图 4.dpp受损胚胎显示PGC特异性异常转录的末端图案化基因无尾（tll）。
（A-C）WT和 （D-G） dpphr92胚胎同时染色为Vasa（红色）并使用FISH探针tll RNA（绿色）。细胞核使用Hoescht（白色/蓝色）进行标记。图E和G分别显示了图块D'和F'的放大区域。比例尺表示 10 μm。H）下面的图显示了PGC中tll转录本相对于同一胚胎中体细胞的归一化密度值（有关定量的详细信息，请参见材料和方法）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g004
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图 5.来自dpp受损胚胎的PGC显示出体细胞化基因的异位表达，如PGC中的糖蜜（slam）一样缓慢。
smFISH是使用特定于（A / C）egfpi，（B）dpp上的slam（红色）探针进行的hr92和 （D） dppi33618胚胎。细胞核是用Hoescht（蓝色）标记的。星号突出显示表达slam RNA的dpp受损胚胎中的PGC核。比例尺表示 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g005
受损的 BMP 信号传导与极质基分量分布不当相关
在分析因BMP信号传导而受损的胚胎中的PGC时，我们注意到Vasa蛋白并不总是完全隔离在新形成的PGC中（S5 Fig，脱字符号）。这导致我们怀疑在PGC形成过程中极质基成分的分布是否存在缺陷。为了探索这种可能性，我们使用smFISH来检查dpp中两极质mRNA，pgc和gcl的定位。 hr92和dppi33618胚胎。图6显示了PT（egfpi），dpp中pgc mRNA的最大强度投影hr92和dppi33618胚胎。在对照胚胎中，pgc mRNA在细胞化时被有效地掺入PGC中，并且几乎没有（如果有的话）逃逸到周围的体细胞（图6A）。相比之下，在两个dpp中hr92和dppi33618细胞前胚芽孢子胚胎，将pgc mRNA掺入PGC似乎效率较低，并且在周围体细胞中观察到pgc mRNA，它与体细胞核相关（图6B和6C）。未能在新形成的PGC中正确隔离pgc mRNA的记录在单个胚胎的图中（图6D）。gcl mRNA也不能被dpp中的PGC有效捕获hr92和dppi33618.
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图 6.dpp的损失导致种质RNA极性颗粒组分（pgc）从后极扩散。
使用pgc（绿色）特异性探针在0-4小时多聚甲醛固定（A）egfpi（B）dpp上进行smFISH hr92和 （C） dppi33618胚胎。细胞核是用Hoescht（蓝色）标记的。显示的图像是具有代表性的最大强度投影。比例尺表示 10 μm。（D）显示极质（使用pgc可视化）远离后盖的错位的图谱（有关定量的详细信息，请参见材料和方法）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g006
PGC形成过程中固有极质组成成分的缺陷可能源于极质RNA和蛋白质锚定到后皮层和/或这些因子过早释放的缺陷。在核迁移到极质之前，这种缺陷在合胞前胚胎中应该很明显。为了评估这种可能性，我们分析了极点细胞形成前年轻胚胎中pgc和gcl RNA的定位。与后期阶段不同，我们发现在杆芽形成之前，pgc和gcl mRNA与所有年轻胚胎的后皮层紧密相关（每种基因型n = 5;S6 图）。综上所述，这些数据认为，BMP信号传导是PGCS中极质组分的适当螯合所必需的，在极质从后皮质表面释放期间或更可能是在极质释放之后。
需要BMP信号来抑制终端通路的功能
来自gcl突变母亲的胚胎的特征表型之一是在PGC细胞化过程中未能正确隔离极点质体组分。正如当Dpp的表达被破坏时所观察到的那样，pgc mRNA和Vasa蛋白未正确掺入gcl突变PGCs中[12]。在PGC形成过程中未能正确隔离极性质浆似乎是由于GCL突变体中末端信号通路的不适当激活。Pae等人的研究。（2017） [65] 表明，Gcl靶向终末通路受体躯干进行蛋白水解降解，从而关闭了胚胎后极的通路。当终末信号级联在后极被激活时，无论是在gcl突变体中还是通过躯干受体或其下游激酶中的功能增益突变激活时，极质细胞组分在细胞化时未正确掺入PGC中[12]。这些观察结果提出了一种可能性，即可能需要BMP途径来帮助抑制终端信号通路。为了直接测试这一点，我们探测了WT和dpp。hr92具有针对下游ERK激酶的二磷酸化形式的抗体的胚胎，dpERK已被用作途径激活的诊断标志物。WT PCC几乎没有dpERK，如果有的话。相比之下，DPP中的PGChr92胚胎积累了易于检测的dpERK水平（S7图）。我们发现合胞胚层dpp中PGC的66.0%（n = 47;p = 0.0）合胞胚层阶段dpphr92胚胎具有dpERK，而dpERK仅存在于等效分期WT胚胎的9.8%的PGC中（n = 51）。
后部末端通路的激活诱导血管丢失
当BMP信号通路受损时，PGC中存在dpERK，这表明它在PGC规范中的功能之一是抑制终端信令。为了提供进一步的证据，我们检查了PGC中的Vasa积累，其中末端信号通路被异位激活。为此，我们使用光激活的SOS蛋白optoSOS打开胚胎后极的末端通路[66，67]。 图7显示，在optoSOS激活后，PGC中的Vasa蛋白水平显着降低。对WT（n = 30）和optoSOS（n = 41）晚期合胞体和细胞胚泡胚中的Vasa的平均水平的定量表明，光激活后几乎有2倍的减少。这一发现，与之前的研究（67）一起表明，pgc和gcl mRNA不能正确掺入PGC中，除非末端信号通路在细胞化过程中被关闭，这将为该通路是PGC规范中BMP信号通路的重要靶标的观点提供额外的支持。另一方面，似乎末端通路不是唯一的BMP靶标：我们发现，通过光遗传学激活或表达构成活性形式的上游激酶积累dpERK不会导致体细胞靶基因（如tll）的不适当和/或早熟激活[68]。
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图 7.胚胎后部ERK信号传导的光遗传学激活导致PGC中瓦萨的损失。
多聚甲醛固定和蓝光暴露（A）WT（n = 30）和（B）OptoSOS（n = 41）NC12-14胚胎染色为极点细胞标记Vasa（白色）。 显示的图像是具有代表性的最大强度投影。比例尺表示 10 μm。（C）测量归一化的总血管强度。红线表示平均值，红色框表示 95% 置信区间，蓝线表示标准偏差（有关量化的详细信息，请参见材料和方法）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g007
DPP丢失导致PGC的性早熟侵袭性迁移
已知晚期合胞体或早期细胞胚泡中末端途径的过度激活会诱导PGC行为的异常变化。而不是在胚胎表面的单层中保持彼此粘附，PGC的子集失去粘附并开始侵入潜在的体细胞。由于BMP信号传导的丧失在PCC中诱导ERK磷酸化，人们可能会期望观察到侵入性迁移的证据。如S7表所示，侵入性迁移在dpp中很少被观察到。hr92胚胎。在仅13.3%的dpp中观察到入侵的PGChr92胚胎（S7 Table; p = 0.484127 通过 Fisher 的精确测试）。另一方面，在强次等位基因的情况下， dpp4，在近一半的dpp中观察到侵入性迁移4胚胎（图8和S7表，p = 0.014907通过费舍尔的精确测试）。
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图 8.dpp功能丧失导致浸润性迁移和 PGC 缺乏依从性。
0–4 小时多聚甲醛固定 （A） osk/+ （B/C） dpphr92/+;osk/+ （D） WT 和 （E） dpp4胚胎被染色为Vasa（A-E，绿色）和Twist（D-E，红色）。星号显示 PGC 的扩散/dpp中缺乏依从性hr92/+;osk/+胚胎，而脱衣物突出了dpp中的侵入性迁移hr92/+;osk/+和dpp4胚胎。图像是具有代表性的最大强度投影。比例尺表示 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g008
osk和dpp之间的显性遗传相互作用
我们的研究结果表明，当BMP信号通路的功能受损时，PGC规范的早期步骤会被破坏。对规范过程至关重要的因素未正确隔离到新形成的PGC中，并且建立PGC身份的关键步骤（例如关闭终端途径和施加转录静止）被破坏。已知这些步骤也依赖于osk基因，osk基因编码母体决定因素，该决定因素在卵生的后期阶段协调极质的组装[44，45]。 在这种情况下，人们可能会预料到osk和BMP途径之间会有协同的遗传相互作用，即使它们的关键功能在不同的环境中是必需的 -osk在母体中，BMP信号传导在受精卵中。
为了验证这一预测，我们通过交配osk减少了母亲的osk活性和受精卵中的BMP信号传导。答87/+ 杂合子妈妈到dpphr92纯合子的父亲。所有来自这个十字架的胚胎，即"dpphr92/+; osk/+"具有WT dpp基因反式到低态（和纯合子可行）dpphr92等位基因。作为对照，我们使用从osk获得的胚胎答87/ + 母亲（osk / +）与 WT 雄配。我们预计，如果dpp信号传导功能与osk依赖性规范通路协同工作，则两者活性的同时降低可能会影响形成和/或规范过程。
我们没有发现任何证据表明PGC的形成在dpp中被改变。hr92/+; osk/+ 胚胎。在dpp中观察到的 PGC 的平均数量hr92/+; osk/+ 与osk/+ 中没有显著区别。循环 14 dpphr92/+; osk/+ 胚胎有 11.7 个 PGC （n = 49），而osk/+ 胚胎有 11.1 个 PGC （n = 37） （S8 表; p = 0.49 通过 t 检验）。
虽然PGC的形成似乎是正常的，但在规格上存在缺陷。而瓦萨的积累和分布在osk/+ 和dpp中都受到干扰hr92/+; osk/+，在dpp中缺陷的频率更大hr92/+; osk/+ （图 8A、8B 和 8C）。在osk/+胚胎中，42.3%（n = 26）的Vasa水平降低，而在dpp中hr92/+;osk/+ 胚胎，瓦萨的减少在69.2%（n = 26）的PGC中很明显（S9表;p = 0.092935通过Fisher的精确测试）。Vasa的损失可能是由于，至少部分是由于在细胞化过程中未能将种质组分正确分离到PCC中。在这种情况下，我们期望观察到其他种质组分到周围体细胞中的异常定位。图 9显示了osk/+ 和dpp中pgc mRNA 的定位hr92/+;osk/+胚胎。在这个实验中，将pgc mRNA掺入osk/+ PGC的效率（图9A，9C和9E）似乎与WT（图6A）相似。相反，pgc mRNA没有被dpp中的PGC正确捕获hr92/+;osk/+ 胚胎（图9B，9D和9F）并扩散到体细胞中。为了扩展这些观察结果，我们同时混合了osk/+ 和dpp。hr92/+;osk/+ 胚胎与slam和pgc mRNA 探针。如图10B和10D所示，pgc mRNA被发现与表达猛击mRNA的体细胞核有关（见星号）。在这个实验中，我们还偶尔观察到pgc mRNA与在osk/+对照胚胎中表达slam mRNA的体细胞核相关（图10A和10C，脱字符号））。然而，这种情况发生的频率要低得多，这表明pgc mRNA的错位因dpp活性的适度降低而大大加剧。
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图 9.同时损害母体和颧骨水平的oskar和dpp分别导致种质的异常定位。
使用pgc（绿色）特异性探针在0-4小时多聚甲醛固定（A / C）osk / +和（B / D）dpp上进行smFISHhr92/+;osk/+胚胎，用于评估杆状质从后部的扩散。图像是具有代表性的最大强度投影 比例尺代表 10 μm。（E-F）图谱显示极质（使用pgc可视化）远离后盖的错误定位（有关定量的详细信息，请参见材料和方法）。每个图显示了一个代表性的实验，每条线描绘了单个胚胎的极点质分布。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g009
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图 10.异常地传递的pgc RNA与体细胞标记共定位，在oskar和dpp的同时受损时猛烈抨击。
使用特定于pgc（绿色）和slam（洋红色）的探针在0-4小时多聚甲醛固定（A / C）osk / +和（B / D）dpp上进行smFISHhr92/+;osk/+胚胎，用于评估杆状质从后部的扩散。Caret表明一些体细胞核暴露于osk / +胚胎中的pgc。星号突出显示了更严重的pgc错位以及dpp中pgc和slam信号的重叠hr92/+;osk/+胚胎。图像是具有代表性的最大强度投影 比例尺代表 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g010
在PGC形成及其初始规格之后，它们仍然彼此粘附并聚集在相对均匀的单层中，覆盖在合胞体和细胞胚芽的后极上。虽然对于大多数osk/+对照胚胎也是如此，但我们观察到dpp后极的PGC分组存在显着缺陷。hr92/+;osk/+ 胚胎，大概是由于失去粘附力（图8B和S8）。这些胚胎中有56.7%（n = 78;根据Fisher的精确测试，p = 0.000151）具有一个或多个与PGC后簇分离的PGC，相比之下，只有略多于四分之一的osk/+胚胎（26.7%（n = 75））（S10表）。除了缺乏集群之外，dpphr92/+;osk/+ PGC并不总是停留在胚胎的表面。相反，它们开始入侵潜在的躯体。DPP中PGC侵入性迁移的一个例子hr92/+;osk/+ 胚胎如图8C所示。侵袭性表型在dpp的38.5%（n = 78;通过Fisher的精确测试p = 0）中观察到hr92/+;osk/+ 胚胎。相比之下，在只有5.3%的osk/+对照胚胎（n = 75）中检测到侵入性PGC（S10表）。
讨论
黑果蝇是使用PGC规范的"变形"机制的生物体的经典和最彻底研究的例子之一[1]。苍蝇中PGC通过预成型指定的第一个迹象之一来自近100年前的实验，其中种系决定因素通过紫外线照射胚胎后部而失活[69–71]。局部和紫外线敏感决定因素的存在随后得到了移植实验的支持。冈田等人.表明紫外线照射胚胎的不育可以通过将未辐照胚胎的细胞质注射到紫外线处理胚胎的后部区域来挽救[72]。重要的是，他们发现救援活动是局部的，它存在于后极，但不存在于前极。在补充实验中，发现来自后极的细胞质在注射到前部时诱导PGC[43]。此外，这些异位PGC如果重新注入类似分期受体的后极，能够产生功能性种系。随后的实验表明，PGC形成和腹部模式都需要在卵发生过程中在母体中活跃的基因，并且形成极质的关键母体因子由osk编码[41，42，44，73]。 通过将osk mRNA与bcd 3' UTR连接起来而设计的osk mRNA的异位定位足以在卵母细胞前部组装极质[44]。在细胞前胚芽孢子胚胎中，异位极质诱导前端PGC的形成。此外，正如Illmensee和Mahowald[43]首次观察到的那样，如果移植到受体胚胎的后部，这些PGC能够填充成虫种系。
虽然这些和其他研究[45]清楚地表明，母体决定因素定位于果蝇胚胎的后极，并协调PGC规范，但它们并没有确定该机制完全是预成型的。实验表明，在前部诱导的PGC（通过注射极质或osk-bcd 3' UTR）能够产生功能性的成虫种系：异位PGC被移植到受体胚胎的后部，因此受到与正常机制形成的PGC大致相同的环境。这留下了表观发生可能在PGC规范中发挥作用的可能性。为了解决这个问题，我们询问了BMP信号通路是否参与苍蝇PGC的规范，当它们在胚胎发生的细胞前胚层阶段形成时。我们选择这条途径有四个原因。首先，已知该途径在依赖表观发生的动物的PGC规范中起作用[1]。其次，尽管受精卵中的dpp表达被背向形态原限制在胚胎的背侧，但原位杂交和抗体染色实验都表明dpp表达包括整个后极[56]。第三，Dorfman和Shilo的实验表明，通过BMP信号通路在接收细胞中诱导的转录激活剂pMad存在于细胞前胚芽细胞PGC的细胞核中[52]。此外，pMad的积累不仅取决于Dpp配体，还取决于Tkv受体的母体和受精激素来源。最后，在之前的研究中，我们发现BMP信号传导是维持PGC身份及其分化所必需的，在胚胎发生中期导致胚胎性腺合并的时期[50]。
我们的结果表明，母体决定因素本身不足以正确规范PGC，并且该过程并不像长期以来所认为的那样完全是细胞自主的。相反，部署了预成型和表观发生的混合体来产生完整的功能性PGC。我们发现，当BMP途径在细胞前胚芽孢子虫胚胎中被破坏时，新形成的PGC表现出各种缺陷，表明PGC测定失败。此外，在胚胎的PGC中观察到相同的表型，这些胚胎的母亲在三种母体因子中的一个或多个中突变，gcl，pgc和nos，已知这是适当的PGC规范所必需的。 同样值得注意的是，在我们的实验中，BMP途径的功能并没有完全被破坏。因此，在细胞前胚芽细胞胚胎中完全没有BMP信号传导的情况下，可能会观察到更戏剧性甚至一些额外的表型效应的可能性仍然存在。（例如，dpp活性可能会影响PGC细胞化。如果BMP途径受损，评估杆状质锚定在胚芽前胚中是否完全正常也是有趣的。
观察到的缺陷包括Vasa蛋白的部分损失，未能下调Ser2 CTD磷酸化，组蛋白修饰谱的变化以及末端（和EGFR）信号通路蛋白ERK的磷酸化。在WT PGC中，pTfb在大PolII亚基的CTD结构域中Ser2的磷酸化被Pgc蛋白阻断[13–15]。该阻滞在纯合胚胎中被覆盖，用于部分功能丧失dpphr92等位基因和tkv种系克隆母亲产生的胚胎。此外，Pgc镇压的两个已知目标，tll和slam，以dpp表示。-hr92PGC。然而，Pgc的失灵并不是建立转录静止的唯一缺陷。我们还观察到Sxl建立启动器Sxl-Pe的激活。 先前的研究表明，Sxl-Pe转录在gcl和nos母亲的后代的PGC中被不恰当地打开，但在pgc母亲的后代中没有[12，13，17]。 因此，损害BMP信号传导似乎会广泛影响转录静止，导致通常由几种不同因素的活性抑制在PGC中抑制的基因的错误表达。例如，在tll的情况下，Pgc并不是唯一有望在其抑制中发挥作用的极性等离子体成分。tll转录通过末端途径在胚胎前后端的体细胞核中被激活。然而，在WT PGC中，终末通路通常被Gcl蛋白关闭，其介导躯干受体的降解[65]。当BMP信号通路受损时，gcl功能也必须直接或间接地被破坏，因为我们发现dpERK在PGC细胞核中积累，就像在gcl突变体中一样。
这些并不是BMP通路，Gcl和终端信号通路之间的唯一连接。在gcl胚胎中，极质的组分（包括Vasa和pgc）在细胞化时没有被PCC正确捕获。相反，它们扩散到胚胎的后部区域，并被发现与体细胞核相关。当末端通路通过阻断躯干降解或下游MEK激酶的构成等位基因上调时，在PGC细胞化过程中发现杆状质的适当分布的类似破坏[12]。此外，如图所示，我们发现当末端通路在胚胎后部被光遗传学激活时，血管从PGC中丢失。事实上，由SOS的光遗传学激活诱导的Vasa损失表型与我们通过dpp的RNAi敲低以及dpp和tkv突变体破坏BMP途径时所看到的非常相似。综上所述，这些发现认为PGC规范中BMP通路的功能之一是阻断终端信号通路。在这种情况下，值得注意的是，抑制EGFR依赖性信号传导对于哺乳动物的PGC规范可能很重要。当ESC细胞在促进中胚层谱系形成的条件下培养时，可以通过向培养基中添加上游激酶MEK的抑制剂来诱导PGC样身份[74]。
在苍蝇中，BMP和EGFR信号通路之间存在复杂的关系。在躯干依赖性终末通路的情况下，前体和后体细胞中Capicua的dpERK磷酸化抵消了背侧对dpp的抑制[75，76]。 在其他发育背景下，BMP信号传导与同源EGFR途径之间的关系很复杂。例如，在翼盘中，据报道BMP和EGFR信号传导建立了正反馈环路，通过促进其各自配体的合成来相互加强[77]。然而，在其他情况下，两种途径之间的相互作用是不同的。胚胎发生过程中背侧模式的全基因组研究表明，BMP信号传导在胚胎发生过程中对EGFR信号通路成分的表达进行负和正调节[78]。反过来，EGFR被提出通过dpERK依赖性的dSmad磷酸化来缓和而不是增加BMP途径，从而导致其降解。在果蝇眼野和头部表皮的图案研究中，Chang等人。还提出了BMP和EGFR信号传导之间的拮抗关系[79]。发现高水平的Dpp通过抑制dpERK积累来阻断EGFR信号传导，而功能突变体的EGFR增益抑制Dpp信号传导。虽然抑制dpERK积累的机制尚未被发现，但可以部署相同的机制来阻断细胞前胚芽中PGC规范期间末端途径的激活。或者，抑制机制可以特定于PGC规范的过程。例如，Pae等人的研究。（2017）将预测Gcl的躯干降解本身应足以消除PGC中末端信号通路的规范和非规范活性[65]。因此，BMP通路可能通过直接或间接增强Gcl活性来抑制终末信号传导。
在PGC规范期间，BMP信号通路是母体沉积的极点质细胞组分的正常功能所必需的，osk和dpp之间的显性遗传相互作用也表明了这一点。在这些实验中，用于osk突变的雌性杂合子与携带弱活dpp等位基因dpp的雄配。hr92.减少母亲体内的osk剂量本身似乎会导致其后代极质固存的轻微扰动;然而，当后代对于dpp也是杂合子时，这种缺陷会大大增强。hr92.除了未能完全捕获极性等离子体外，dpphr92/+;osk/+PGC表现出其他异常，包括细胞：细胞粘附的新型丧失和侵入性迁移。这种协同相互作用将证明BMP途径在PGC规范过程中与osk合作，并且这样做有助于将预成型与表观发生相结合。
一个经典的预成型模型部署了一个信号通路，该信号通路已知在依赖于表观发生的物种的PGC规范中起着关键作用，这一事实似乎支持了表观发生是产生这种特殊细胞身份的祖先模式的论点。这种观点得到了osk和nos的进化历史的支持，这些基因在果蝇的PGC规范中自主地在细胞中起作用。前者仅限于在PGC规范中使用变形的昆虫子集，并且被认为是由细菌和真核序列的融合引起的[80]。相比之下，nos从蠕虫到人类都是保守的，并且跨越了经典地被识别为使用PGC规范的预变形或表观发生。
材料和方法
苍蝇种群和遗传学
以下苍蝇库存用于本手稿中报告的分析。白1 (w1）被用作WT库存。民进党4twi重组股票是从Eric Wieschaus获得的。egfp RNAi （BDSC #41552），dpp RNAi系（BDSC #33618或25782）和UAS-dpp（BDSC #1486）由twi-GAL4驱动库存（BDSC #2517）或母体 - 微管蛋白-GAL4（67）驱动。15）驱动库存，携带4份母体 - 微管蛋白-GAL4拷贝（从Eric Wieschaus获得）。BMP 信号也因使用dpp而受到损害hr92（BDSC #2069）， tkv427（从Kristi Wharton获得），或FRTtkv8股票（从迈克尔·奥康纳获得）。奥斯克答87股票是Liz Gavis的礼物。
对于胚胎染色，我们使用白色1在大多数情况下，胚胎作为对照。无论实验涉及RNAi敲低策略，我们都会通过将母体 - 微管蛋白 - GAL4处女与UAS- egfpi雄性杂交并使用这些胚胎作为对照来产生egfpi胚胎。
免疫染色
胚胎是甲醛固定的，并且如前所述，使用标准的免疫组化方案进行荧光或DAB可视化免疫染色[17]。使用的一抗是兔抗瓦萨（1：2000;保罗·拉斯科的礼物），大鼠抗瓦萨（1：1000;保罗·拉斯科的礼物），兔子抗pH3（1：1000;Upstate Biotechnology），兔子抗CycB（1：500;Jordan Raff的礼物），小鼠抗H5检测pSer2（1：250;Research Diagnostics， Inc.）、H3meK4（1：500;C. David Allis的礼物）、大鼠抗扭曲（1：500;Eric Wieschaus的礼物）、兔子抗dpERK（1：100;细胞信号传导技术），绵羊抗GFP（1：1，000;Bio-Rad），绵羊抗地高辛（DIG）（1：125;罗氏）和小鼠抗生物素（1：125;杰克逊免疫研究）。荧光免疫染色采用1：500（ThermoFisher）使用的Alexa-Fluor二抗，并使用DAPI（10 ng / mL，ThermoFisher Scientific）或Hoescht（3μg / ml，Invitrogen）标记DNA。对于DAB染色，使用马萝卜过氧化物酶（HRP）二抗（Jackson Immunoresearch）1：1000。染色的胚胎使用Aqua Poly/mount（Polysciences）安装在载玻片上。每个实验至少使用三个独立的生物重复。
荧光原位杂交（FISH）和单分子FISH（smFISH）
FISH是使用特定于tll的探针[68]进行的，如前所述。为了量化tll水平，我们使用每个胚胎内部的对照来规范强度。使用ImageJ，我们测量并平均了三个随机选择的PGC的强度，并且我们还收集了无尾体细胞中每个胚胎的三次测量的平均强度。归一化是根据以下内容完成的：归一化强度=来自PGC的平均强度/来自体细胞的平均强度。这种归一化是分别针对每种情况进行的。图4绘制了单个胚胎的这些标准化强度并呈现。
smFISH如前所述使用甲醛固定胚胎进行[12]。所有探针组均使用Stellaris探针设计器（20-核苷酸寡核苷酸，2-核苷酸间距）设计。pgc和gcl，smFISH探针（与atto565或ato647染料，Sigma耦合）是Liz Gavis的礼物。Sxl-Pe内含子探针（与atto565染料耦合）是Thomas Gregor的礼物，而slam探针（与Quasar 670偶联）由Biosearch Technologies生产。所有样品均使用Aqua Poly/mount（Polysciences）安装在载玻片上。每个实验至少使用三个独立的生物重复。
ERK的光遗传学激活
OptoSOS和Hist-GFP WT对照胚胎在黑暗中收集2小时，然后用蓝光刺激。蓝光刺激在450nm处以~1mW / cm2进行2小时，使用定制的30个LED面板，放置在距离胚胎约5cm处并封闭在箔片中。刺激后，立即将Hist-GFP WT对照组和OptoSOS胚胎合并，去甲化并置于固定剂中。在固定过程中，胚胎在蓝光下保持10分钟，以确保持续激活。固定后，胚胎被染色为瓦萨。对NC12-14胚胎进行Z-stacks（WT n = 30，OptoSOS n = 41）。在MATLAB中处理图像，将4个箱子的k均值聚类应用于最大投影的Vasa图像以分割血管阳性细胞（使用最高箱）。使用中间2个箱的平均强度计算胚胎的背景染色。从分割的血管阳性细胞的平均强度中减去该背景。计算光遗传学组和组织GFP组中每个胚胎的这些平均值，然后通过组织-GFP组的平均值对两个平均值进行归一化。
显微镜和图像分析
NIKON-Microphot-SA显微镜用于捕获DAB染色胚胎的图像（40X）。所有其他smFISH和荧光免疫染色实验的成像都是在尼康A1倒置激光扫描共聚焦显微镜上进行的。
使用ImageJ（NIH）和Adobe Photoshop和Illustrator软件组装图像，以裁剪感兴趣的区域，调整亮度和对比度，生成最大强度投影以及分离或合并通道。为了评估与对照组相比，不同遗传背景中RNA或蛋白质的错位，我们使用ImageJ生成了图谱。绘制每个胚胎的最后75μm进行比较，并且来自单个生物复制的胚胎绘制在数字中，因为如果将来自所有重复的胚胎绘制在一起，则重复之间的荧光之间的差异掩盖了极点质分布趋势。
统计分析
使用NC13 / 14胚胎，通过以2微米间隔捕获的整个z体积，从第1个Vasa阳性细胞到最后一个细胞对每种基因型的PGC进行计数。这些PGC计数使用学生的t检验进行分析。在计数单个胚胎中的pH3或CycB阳性PGC以获得功能实验的dpp增益时，应用了相同的分析。
为了比较具有高水平或低水平上市标记物（Vasa，pSer2，H3meK4，dpERK）的PGC数量，从每个胚胎的所有可识别的PGACs中计算每个标记物的阳性或阴性。标记物水平的差异是一致的，PGC可以很容易地分为每个类别。通过浏览Z堆栈的每个切片并对每个细胞进行分类（在所有相关切片中查看）来计算单个PGC，并使用Fisher's Exact检验对这些群体进行每种基因型的成对比较。对于 FISH/smFISH 实验，计算 PGC 中表达tll、slam或Sxl-Pe的胚胎总数，并使用 Fisher's Exact Test 来测试 PGC 中转录阳性的胚胎比较比例的显著性。同样，使用 Fisher 精确测试将表现出异常 PGC 行为（缺乏粘附/侵袭）的胚胎比例与对照胚胎进行比较。使用 Microsoft 绘制数据并进行统计分析 Excel 或 R 项目软件。
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功能胚胎的dpp增益增加了PGC的数量。
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S1 图功能胚胎的dpp增益增加了PGC的数量。
对0-4小时多聚甲醛固定（A / C）twi-Gal4（B / D）或twi-Gal4 / UAS-dpp阶段4（A-B）或阶段5（C-D）胚胎进行极点细胞标志物Vasa（红色）染色以评估极点细胞数量和增殖。星号表示其他除法。比例尺表示 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s001
（JPG）
S2 图来自功能胚胎的dpp增益的PGC数量升高，但保留转录静止。
对0-4小时多聚甲醛固定（A）twi-Gal4（B）或twi-Gal4 / UAS-dpp胚胎进行极点细胞标志物Vasa（红色）和phosphoSer2（转录激活，绿色）染色。星号表示由更多数量的瓦萨阳性细胞显示的过度分裂。插入记号显示 PGC 中缺乏 pSer2，提示转录静止。比例尺表示 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s002
（JPG）
S3 图年轻的tkv种系克隆胚胎在PGCs中显示出转录激活的标志物。
0–4 小时多聚甲醛固定 （A） WT和 （B/C） tkvm-对胚胎进行极点细胞标记Vasa（红色）和phosphoSer2（转录激活，绿色）染色。插入记号强调 pSer2 信号缺失，提示转录静止，而星号表示 Vasa 丢失与转录激活的获得相关。比例尺表示 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s003
（JPG）
S4 图BMP 信号传导中断导致 PGC 中 H3meK4 的斑片积累。
0–4 小时多聚甲醛固定 （A） WT和 （B） tkv421胚胎被染色为极点细胞标志物Vasa（蓝色）和H3meK4（红色）。插入记号显示不存在 H3meK4，而星号则突出显示了 PGC 中 H3meK4 信号的异常存在，PGC 是转录活性染色质的标志物。比例尺表示 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s004
（JPG）
S5 图损害dpp水平会导致血管从胚胎后极异位定位。
0–4 小时多聚甲醛固定 （A） egfpi和 （B） dpphr92胚胎被染色为极点细胞标志物Vasa（绿色）。细胞核是用Hoescht（蓝色）标记的。星号表示远离后极的血管定位和PGC的侵入性迁移。比例尺代表10μm。（C）显示极质（使用Vasa可视化）远离后盖的错位的图谱（有关定量的详细信息，请参见材料和方法）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s005
（JPG）
S6 图dpp的损失不会影响PGC萌芽前生殖质RNA在后极锚定。
使用pgc（绿色）和gcl（洋红色）特异性探针在0-4小时多聚甲醛固定（A）egfpi（B）dpp上进行smFISH hr92和 （C） dppi33618胚胎。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s006
（JPG）
S7 图dpp受损的胚胎在PGC中显示dpERK。
0–4 小时多聚甲醛固定 （A） WT和 （B） dpphr92胚胎被染色为dpERK（红色）。细胞核是用Hoescht（蓝色）标记的。插入记号表示 WT PCC 中缺少 dpERK，而星号突出显示dpp中的异位 dpERKhr92PGC。比例尺代表 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s007
（JPG）
S8 图oskar和dpp同时受损会降低 PCC 之间的依从性。
0–4 小时多聚甲醛固定 （A） osk/+和 （B） dpphr92对胚胎进行染色，以检测极点细胞标志物Vasa。比例尺表示 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s008
（JPG）
S1 表。PGC计数增加，使功能胚胎的dpp增益增加。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s009
（XLSX）
S2 表。有丝分裂标志物在功能胚胎的dpp增益的PGC中增加。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s010
（XLSX）
S3 表。PGC 标记 Vasa 和转录激活 pSer2 的标志在功能 PGC 的dpp增益中保持不变。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s011
（XLSX）
S4 表。BMP信号传导成分受损的胚胎的PGC中的瓦萨水平降低。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s012
（XLSX）
S5 表。BMP信号传导受损的胚胎中活性转录的标志物增加。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s013
（XLSX）
S6 表。dpp受损胚胎中slam和Sxl的异位PGC转录的发生率。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s014
（XLSX）
S7 表。DPP受损胚胎中PGC的侵入性迁移。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s015
（XLSX）
S8 表。胚胎中的PGC计数同时受到osk和dpp的影响。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s016
（XLSX）
S9 表。血管水平在胚芽孢子胚胎中osk和dpp同时受损时降低。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s017
（XLSX）
S10 表。胚胎中的PGC规范和行为同时受到osk和dpp的影响。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s018
（XLSX）
确认
作者感谢Eric Wieschaus和Trudi Schupbach在这项工作过程中所做的许多讨论，有用的建议和试剂。Liz Gavis，Stas Shvartsman和Jared Tottcher感谢他们的持续支持。Chris Ng和Gordon Grey分别提供了技术援助和飞行食物。我们感谢Gary Laevsky博士和普林斯顿大学分子生物学系的尼康卓越中心共聚焦成像设施使用仪器。G.D.感谢他在浦那IISER生物系的朋友的慷慨款待。
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