《大麦细胞色素P450基因突变增强病原体诱导的程序性细胞死亡和角质层不稳定 -厦门杂志期刊论文发表》期刊简介
大麦细胞色素P450基因突变增强病原体诱导的程序性细胞死亡和角质层不稳定 -厦门杂志期刊论文发表
· 加萨拉·阿明，
· 希亚姆·索兰基，
· 劳伦·萨格尔-比塔拉，
· 乔纳森?理查兹，
· 普拉宾塔芒，
· 蒂莫西·弗里森，
· 罗伯特·布鲁格曼
· 出版日期： 2021年12月16日
抽象
疾病病变模拟突变体（DLMMs）的特征在于坏死斑点的自发发展，其各种表型被指定为大麦中的坏死（nec）突变体。Nec突变体传统上被认为对程序性细胞死亡（PCD）途径具有异常调节，这些途径在植物免疫和发育中起作用。大多数大麦nec3突变体表现为乳膏至橙色坏死性病变，与典型的自发性 DLMM 形成对比，后者出现深色病变，提示 5-羟色胺/酚类物质沉积。在无菌条件下生长的大麦nec3突变体在接种适应病原体之前没有表现出坏死表型，这表明它们不是典型的DLMM。The F2nec3-γ1和品种Quest杂交的后代在接种后分离为单个隐性易感基因，双极性索罗基尼亚纳，这是疾病斑点斑点的致病因子。Nec3在遗传上被划分为0.14 cM，代表16.5兆碱基的物理序列，包含149个注释的高置信基因。RNAseq和对野生型和五个独立nec3突变体的比较分析确定了单个候选细胞色素P450基因（HORVU.MOREX.r2.6HG0460850），通过独立突变验证为nec3，导致预测的非功能蛋白。组织学研究确定，nec3突变体具有不稳定的角质层，破坏了正常的双极性生殖管发育。
作者简介
在病原体感染部位，植物防御机制依赖于受控的程序性细胞死亡（PCD）来隔离需要活细胞从宿主中提取营养物质的生物营养病原体。然而，这些防御机制被坏死性植物病原体劫持，这些病原体故意诱导PCD以死细胞为食，从而促进疾病的进一步发展。因此，了解PCD反应对于两类病原体的耐药性非常重要。我们表征了五个独立的疾病病变模拟大麦指定坏死3（nec3）突变体，它们在病原体激发时表现出对PCD反应的异常调节。细胞色素P450基因被鉴定为编码色胺5-羟化酶的Nec3，其在植物色氨酸途径中起着终末5-羟色胺生物合成酶的作用。我们认为nec3突变体已经破坏了血清素的生物合成，导致PCD扩大，坏死性病原体易感性和角质层不稳定。nec3突变体表现出扩大的PCD和病原体诱导的坏死病变的疾病易感性，表明5-羟色胺在隔离PCD和抑制病原体定植方面的作用。Nec3的鉴定将促进功能分析，以阐明血清素在引发或抑制PCD免疫反应对各种病原体的反应中的作用及其对角质层生物合成的影响。
数字
引文：Ameen G，Solanki S，Sager-Bittara L，Richards J，Tamang P，Friesen TL等人（2021）大麦细胞色素P450基因突变增强病原体诱导的程序性细胞死亡和角质层不稳定性。PLoS Genet 17（12）：e1009473。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473
编辑 器：Gitta Coaker，加州大学戴维斯分校，美国
收到：三月 5， 2021;接受：十一月 26， 2021;发表：十二月 16， 2021
这是一篇开放获取的文章，没有任何版权，任何人都可以出于任何合法目的自由复制，分发，传播，修改，构建或以其他方式使用。该作品在知识共享CC0公有领域奉献下提供。
数据可用性：GenBank Bio项目PRJNA666939完整提交RNAseq数据并免费提供。WT Steptoe和等位基因突变体nec3.l和nec3的外显子组捕获.m NCBI提交BioSample种质SAMN22109510，SAMN22109511，SAMN22109512。 -厦门杂志期刊论文发表
资金：作者没有为这项工作获得任何具体资金。
相互竞争的利益：作者宣布不存在相互竞争的利益。
介绍
程序性细胞死亡（PCD）是植物和动物细胞的高度进化和严格调节的生理反应，在发育，细胞分化，细胞数量稳态和免疫中发挥作用[1]。在植物中，PCD被环境线索激活，包括病原体诱导的生物胁迫，代表了防御入侵微生物或喂养无脊椎动物的主要生理反应和机制。专门的或适应的植物病原体进化为产生和利用毒力效应子，通过操纵宿主细胞机制来诱导不适当的生理反应，促进获得营养物质和生命周期完成，从而促进宿主渗透和定植[2]。
植物的先天免疫系统进化出称为pattern r ecognition receptors（PRRs）的跨膜受体，其检测中凋亡空间中入侵的病原体作为第一道防线，被称为pathogen-一种被解离的molecular patterns（PAMP）t 裂解免疫 （PTI）。PTI反应激活潜在的胞质信号级联反应，包括丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途径[3]在病原体渗透点诱导胼胝体沉积，发病机制相关（PR）基因的表达，快速瞬时活性氧（ROS），超敏反应（HR），并且在大多数反应中，在尝试病原体渗透的部位产生的坏死性病变伴随着酚类化合物的沉积。病原体施加的选择压力迫使植物先天免疫系统逆进化以识别病原体毒力效应物[4-7]，更常见的是它们对靶向宿主蛋白的操纵[8]。一个特征鲜明的例子是假单胞菌注射器效应器，它在flg22感知后抑制FLS2 PRR介导的信号传导[9]。对于需要活宿主细胞进食的生物营养病原体，这些效应器不再促进定植，而是提醒宿主它们的存在，引发PCD杀死它们所摄食的细胞，有效地阻止了定植过程。因此，HR对于植物对生物营养植物病原体（包括病毒，细菌，真菌，卵菌和无脊椎动物）的先天免疫至关重要[10]。然而，从垂死细胞中获取营养的坏死性病原体，如结节副孢子虫[11]和Pyrenophora teres[12]已经适应了通过进化坏死营养效应（NEs）来劫持这些基因对基因的免疫机制，这些效应器故意通过免疫受体激活来提醒宿主免疫系统它们的存在。这些反向基因对基因的相互作用[13]引发PCD反应，坏死性病原体利用这些反应促进疾病形成，因为它们从由此产生的垂死和死亡组织中获取营养。因此，坏死性病原体可以通过坏死效应触发的易感性（NETS）促进疾病的进一步发展，从而在宿主身上完成其生命周期;生物营养和坏死性病原体在植物中引起PCD免疫反应，其结果不同，不相容性与相容性分别取决于病原体的生活方式和反应的时间。因此，了解PCD途径对于了解作物植物与两类病原体相互作用时的抗性和敏感性机制非常重要。
自发产生PCD的疾病病变模拟突变体（DLMMs）是破译细胞死亡途径调节的重要资源[14]。然而，很少有DLMM被彻底描述。在大麦中，已经描述了几种DLMM[14]，但只鉴定出两个DLMM基因，Hvnec1和mlo。Hvnec1基因编码一个环门控离子通道蛋白[15，16]，其序列与拟南芥HLM1基因同源[17]。与HLM1一样，Hvnec1的发病机制相关（PR）蛋白表达增加，产生自发性坏死性病变和叶尖坏死，对某些病原体的易感性增加[18，19]。mlo基因对真菌病原体Erysiphe graminis f. sp. hordei（白粉病的致病因子）具有更高的抗性，该基因已在北欧部署，并作为大麦持久抗性的来源37年[20]。然而，在没有疾病的情况下，mlo由于其DLMM表型导致产量降低约4%，这导致光合潜力的丧失，因此仅在高疾病压力下具有经济优势[21]。mlo部署的第二个成本是增强对几种坏死性病原体的易感性，包括大麦病斑斑点的致病因子双极性索罗基尼阿那[22]，镰刀菌是镰刀菌头枯病的原因[23]，Ramularia collo-cygni是Ramularia叶斑病的致病因子[24]和Magnaporthe oryzae水稻瘟病的致病因子[25].Mlo基因编码一种类似ROP的G蛋白，该蛋白似乎是PCD的抑制因子，并且在其他物种中保守并被发现，包括豌豆，拟南芥和番茄[25]。
在大麦中，化学和辐照诱变已被用于诱导大量DLMM的收集[26]。一个DLMM突变体被指定为nec3，并被证明产生不同的奶油到橙色坏死病变（图1）。这里描述的nec3-γ1突变体最初是从γ辐照的M中鉴定出来的。2幼苗试图识别对B抗性的大麦突变体。Sorokiniana分离株 ND90Pr。本研究旨在鉴定推测的cv Bowman显性易感因子中的突变体[27]。先前鉴定的nec3突变体在cv Proctor和Villa背景中使用X射线诱变和在cv Steptoe背景中使用快速中子诱变进行照射[28]。该nec3. d（GSHO 1330）突变体在cv Proctor（PI 280420）和nec3中生成。e （GSHO 2423） 突变体是在 cv Villa （PI 399506） 中生成的。该nec3. l（GSHO 3605正式称为FN362）和nec3。 m（GSHO 3606正式称为FN363）突变体是在cv Steptoe（CIho 15229）背景中生成的。该nec3.d和nec3。本研究中使用的e突变体是通过反复回交到cv Bowman背景中形成的近等基因系。五种等位基因nec3突变体中有四种表现出独特的程序性细胞死亡表型，伴有棕褐色至橙色坏死性病变，没有通常与DLMM相关的深色酚类物质。先前利用形态学标记鉴定nec3的尝试将nec3定位到rob1（橙色引理1）位点远端的大麦染色体6HS~29.2 cM的着丝粒区域[26，29，30]。
图 1.nec3突变体的典型表型反应。
nec3突变体在感染双极性索罗基尼安分离株ND85F后从左到右显示（nec.m 3-γ1，nec3 .l，nec3 .l，nec3 .l，nec3 .d和nec3.e）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.g001
在这项研究中，WT和突变体中的遗传图谱和基于RNAseq的基因结构鉴定确定了候选Nec3基因（HORVU.MOREX.r2.6HG0460850），预计这将编码细胞色素P450，指定为HvCYP71-A1。对五个独立的nec3突变体的等位基因分析确定了五种对HvCYP71-A1功能有害的不同突变，并将其验证为Nec3。我们报道Nec3推测编码色胺5-羟化酶，其催化色胺转化为血清素，类似于水稻病变模拟表型产生SL基因[31，32]。此外，我们表明nec3表型不是自发的DLMM，而是由几种子囊菌病原真菌诱导的，包括坏死激素和生物营养菌以及细菌病原体黄单胞菌半透明，代表通过破坏细胞壁和质膜直接穿透宿主细胞的病原体。我们还确定nec3突变体具有不稳定的角质层，当与病原体Bipolaris sorokinina胚管接触时，该角质层可能从叶表面剥离。这种异常相互作用可能会改变病原体的发育信号传导，导致突变叶表面上真菌胚管的大量分支。我们的研究将促进进一步的Nec3功能分析，以及它在引发或抑制PCD对各种病原体的反应中的作用及其对角质层生物合成的影响。
结果
nec3 表型的病原体诱导
即使没有病原体激发，nec3病变在正常温室条件下也一致发生在5个独立的nec3突变体上，并且被认为是具有自发性病变发展的病变模拟突变体。为了验证nec3病变是自发的假设，野生型和突变植物在无菌隔离盒中生长。这些植物不表达nec3表型，并且生长到成虫阶段（Feekes 10.5;全头出苗），没有显示任何坏死性病变。在隔离箱外的温室工作台上生长的未接种的nec3幼苗在第二叶阶段表现出nec3表型，并在成虫阶段继续发展这些独特的病变（图1）。对未接种的nec3植物的病变生长的真菌结构的组织学表征表明，它们主要由Blumeria graminis定植，这是华盛顿州立大学和北达科他州立大学的温室特有的，在那里进行了这些实验。
为了确定病原体诱导的nec3表型是否依赖于病原体感染，我们用几种不同的病原体对野生型和突变植物进行挑战，这些病原体对野生型鲍曼或Steptoe植物具有毒力和病毒性反应。在生长室中无菌环境条件下进行的接种确定，典型的nec3病变是由坏死性子囊菌真菌病原体Bipolaris sorokiniana，Pyrenophorateres f. teres，Pyrenophora teres f. maculata和Pyrenophora tritici repentis以及生物营养性子囊菌真菌病原体Blumeria graminis（图2;蓝藻禾本科接种的植物未显示）。这些病原体的毒力和病毒性分离株在野生型Bowman或Steptoe上都产生了预期的易感或耐药反应，但在nec3-γ1突变体上诱导了典型的nec3病变。细菌病原体Xanthomonas translucens pv undulosa的浸润接种，导致对Bowman野生型的耐药反应，也诱导nec3-γ1突变体上的nec3表型（图2）。当nec3-γ1突变幼苗接种有担子菌生物营养真菌病原体Puccinia graminis f. sp. tritici种族QCCJB时，nec3表型未诱导nec3表型，该病原体在cv Bowman上具有毒力，其携带Rpg1茎锈病抗性基因（图2）。 -厦门杂志期刊论文发表
图 2.nec3表型由双极性苔藓、黄斑芸、黑斑芸、梅氏裂头蚴和黄单胞菌诱导。
每个面板都显示了对下面标记的病原体的典型反应，左侧为野生型Bowman（Bow），右侧为nec3-γ1突变体，如上图所示。接种禾本科小麦孢子虫、白芩和结节副孢子虫未诱导nec3表型。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.g002
当用P接种nec3-γ1突变幼苗时，也没有诱导nec3表型。 由于Rpg1提供的阻力，在cv Bowman上无懈可击的graminis f. sp. tritici种族HKHJC（图片未显示）。大麦非宿主坏死性病原体Cercospora beticola和Parastagonospora nodorum没有诱导nec3表型。
烯利主义交叉
在现场进行了等位基因杂交，以确定四个确认的nec3突变体nec3.d，nec3.e，nec3 .l和nec3.m是否与nec3-γ1等位利。 nec3-γ1和突变体nec3之间的杂交。d， nec3.e和nec3。l e是成功的，但由于nec3突变体的头部无菌效应，只有2-5 F1从每个等位素测试杂交中播下种子。F的100%1植物在接种B后显示nec3表型。温室条件下的索罗基尼亚分离物ND85F（图3）。分离B的ND85F。本研究中使用的sorokiniana是病理型1（Steptoe和Proctor易感，Bowman和Villa是耐药的），它已被广泛用于斑点斑点关联和双亲映射。The F2将每个杂交的种子种植在田间，每行含有20个单独的F2植物邻近斑点病苗圃，含有接种B的传播者行。Sorokiniana分离株 ND85F。F的100%2个体表现出nec3表型（图3），证明nec3-γ1突变与其他已知的nec3突变体是等位基因的。有趣的是，等位基因交叉（nec3.d x nec3-γ1） 与nec3.d突变体，其表达典型的酚类物质积聚的深色病变，并且与其他nec3突变体相比尺寸更小，产生F2表达一系列病变表型的后代，来自典型的nec3。d到nec3。γ1表型和两者的混合（图3）。这些结果表明，两个nec3等位基因的分离对病变表型具有混合作用。
图 3.F的典型表型1和 F2nec3等位基因试验的后代。
前三个面板显示了F的表型1来自等位基因测试的nec3突变体的后代在感染双极性索罗金亚纳分离株ND85F后杂交。等位素测试杂交的后代被推进到F2生成并测定了B后的nec3表型。 sorokiniana分离物ND85F接种。等位基因测试交叉如上所示，世代如下所示。 -厦门杂志期刊论文发表
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.g003
培养滤液渗透
使用培养浸润实验来确定是否存在nec3 elicitor以及它是否是蛋白质。WT Bowman（耐分离ND85F）和WT Steptoe（易分离ND85F）以及nec3突变体nec3-γ1，nec3。 d和nec3。e在鲍曼的背景和nec3.l和nec3。m在Steptoe背景中显示出与B渗透后的不同反应。sorokiniana分离出ND85F培养滤丝和对照物渗透到次生叶片中（S1图）。所述浸润含有培养滤液+薯条培养基、培养滤液+MOPS缓冲液、培养滤液+MOPS+蛋白酶的突变体nec3-γ1、nec3。 d， nec3.e， nec3.l和nec3。m显示典型的nec3 PCD，如前所述，病变周围缺乏明确的边缘（S1图）。含有薯条培养基+MOPS缓冲液+蛋白酶的对照浸润没有在突变体或WT叶片上引起反应。WT Bowman叶子对任何渗透，培养滤液或控制都没有反应。然而，WT Steptoe幼苗对所有含有与nec3不同的培养滤液的浸润表现出PCD反应。l和nec3。m，Steptoe背景中的nec3突变体。Steptoe通过形成具有深色边缘和深色坏死中心的坏死病变来对培养滤液做出反应，其类似于通常由坏死性病原体B诱导的易感病变。含有酚类物质积累的sorokiniana。
DAMPs的外源性补充， 和 PAMPs 和补充血清素和色胺
为了确定已知的DAMP或PMP是否引发了具有已知DAMP和PMP的nec3表型浸润。WT Bowman，nec3-γ1，WTSteptoe和nec3的渗透。l用已知的DAMP三半乳糖醛酸以三种浓度（10mg / mL，1mg / mL和0.1mg / mL）进行;与用水处理的模拟对照相比，浓度为1mg / mL和甲壳素（C9752，Sigma-aldrich）（100μg/ ml）的细菌PAMP FLG22在浸润后一周内没有观察到的反应（S2图）。为了确定血清素或色胺积累是否影响nec3表型，进行了外源根喂养实验。血清素和色胺的外源根喂养确实在nec3-γ1，nec3中nec3病变的大小和形状上产生了可见的表型差异。d， nec3.e， nec3.l和nec3。与用水处理的模拟对照相比，病原体接种后七天的m突变体。我们观察到，Serotonin喂养的nec3突变体和野生型植物显示出相对较小的病害病变，并且在次生叶片上没有观察到的绿化（S3A和S3B图）。然而，在色胺喂养的植物中观察到相反的趋势，其中病变大小相对增加（S3A和S3B图）。
DAB染色和电子显微镜
由于nec3病变扩张得更快，并且比WT基因型的病变更大，因此预计突变体将表达差异性ROS产生。DAB染色与大多数B相关。早在12 hpi在nec3-γ1接种的叶子上观察到sorokiniana渗透位点（图4）。与病原体渗透位点相关的DAB染色仅在18 hpi后在耐药WT Bowman系中观察到。在后期时间点（24-36 hpi）中，DAB染色与B相关。sorokiniana在易感的nec3-γ1突变体中的渗透和定植，迅速增加到邻近的宿主表皮细胞，以及潜在的叶肉细胞。然而，在抗性WT Bowman幼苗中，在?24 hpi处开始出现的DAB染色具有更高的强度，但仍然局限于与渗透位点相邻的几个细胞，并且在感染过程中的后期时间点没有像nec3-γ1突变体所观察到的那样在感染过程中的后期时间点扩张（图4)
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图 4.微观可视化，用于比较大麦nec3-γ1突变体和Bowman野生型，用于在感染过程中在叶面上产生ROS和病原体生长。
左边是Bowman野生型，右边是接种后6、12、18、24、48小时感染双极性分离株ND85F期间产生的nec3-γ1突变ROS，其中早在接种后12小时就观察到胚芽管的多个分支，局部HR和突变体与角质层/大麦叶的特异性相互作用。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.g004
DAB染色后B的时间过程光学显微镜检查。sorokiniana分离株ND85F接种显示WT Bowman上的孢子萌发和胚管生长正常，胚管从分生孢子的两端生长，几乎没有种管分支（图4和5）。nec3-γ1突变体上的孢子萌发似乎正常，然而，与WT Bowman上的生长相比，持续观察到异常的胚管分支（图4和5）。此外，在对nec3-γ1突变体进行DAB染色后，与WT Bowman上的生长相比，一致观察到深色碎片会沿着胚管生长的路径积聚在叶表面（图4B）上（图4A）。由于无法辨别沿着nec3-γ1突变体上的胚管生长积累的细胞碎片是宿主还是病原体衍生的，因此在早期感染过程中使用电子显微镜产生更高分辨率的图像。这些图像表明，碎片来自宿主角质层从叶表面剥离的胚管与叶表面接触的区域周围的区域（图5）。 -厦门杂志期刊论文发表
图 5.在感染过程中，病原体双极性索罗金亚纳在大麦nec3-γ1突变体和Bowman野生型的叶面上生长的电子显微镜照片。
6A.左边是鲍曼野生型，正常B。在接种后12小时分离出ND85F生长和完整的宿主角质层。6B.右边是B的异常生长。sorokiniana分离ND85F，具有生殖管的多个分支和突变体在接种后12小时与大麦叶角质层的特异性相互作用。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.g005
nec3遗传图谱开发
使用纯合F开发遗传图谱2来自nec3-γ1和Quest（γ1 x Q）之间杂交的重组后代来绘制nec3基因。纯合突变个体通过诱导具有B的nec3表型来鉴定。Sorokiniana分离株 ND85F。由于突变基因的典型隐性，预计野生类型：突变体比例为3：1。不幸的是，致命的叶绿素/白化病背景突变杀死了200 F中的54个。2后代测定。白化病突变与nec3无关，也以隐性3：1单基因方式分离（χ2= 0.32）。在考虑了死亡的白化病植物后，146株幸存植物中有33株发展出符合预期3：1比例的nec3表型（χ2= 0.17），表明nec3以隐性方式分离为单个突变基因。
为了绘制Nec3基因，染色体6H区域被分子标记饱和。根据IPK cv Morex基因组序列和POPSEQ位置[33，34]，Nec3基因与位于6H染色体49.07cM的标记GBM1212共分离。近端侧翼标志物GBM1423定位在GBM1212的49.22cM，0.15cM的近端，远端侧翼标志物GBM1053位于GBM1212的53.47cM，4.4cM远端（图6）[34]。因此，Nec3基因被划分为4.55 cM的相对较大的遗传间隔。为了进一步划分Nec3区域，另外29个SNP标记使用γ1 x Q群体遗传地锚定在大麦染色体6H的nec3区域。遗传图谱上29个SNP标记的位置与新发布的大麦基因组序列和大麦POPSEQ位置呈完美的线性顺序。物理nec3区域的两侧是SNP标记SCRI_RS_171247远端的假分子位置39.5 Mb，标记SCRI_RS_239962在6H染色体上以56.0 Mb的近端，根据大麦POPSEQ位置将该区域划分为?0.14 cM，根据新发布的大麦基因组序列和注释，该区域与跨越?16.5 Mb的物理区域相关，其中包含149个高置信基因（图6）。外显子组捕获在突变体nec3上运行。l和nec3。m以及使用捕获数组的 wildtype Steptoe 120426_Barley_BEC_D04。分析了外显子组捕获测序数据，以根据2019年发布的WGA Morex序列，确定nec3区域中149个高置信候选基因中的潜在缺失[34]。nec3区共有11个基因未在外显子组捕获探针组中表示，如S3表所示。在WT Steptoe和等位基因nec3中分析了外显子组探针集中存在并在nec3区域捕获的138个注释高置信基因（S2表）。l和nec3。m（NCBI提交BioSample种质SAMN22109510，SAMN22109511，SAMN22109512）。在来自三个独立突变体的138个基因的外显子中没有观察到缺失。
图 6.nec3区域的遗传和物理图谱。
左边是由33个纯合突变体F开发的遗传图谱。2来自nec3-γ1和Quest之间杂交的个体（代表66个重组配子）。基于重组频率的遗传距离显示，方框表示基于F的共隔离标记2地图和白色或灰色阴影表示基于POPSEQ共识位置的共隔离标记，这些标记位于最左侧。标记的相对物理位置显示在右侧，这些标记来自IPK数据库新发布的全基因组组装。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.g006
RNAseq和候选基因鉴定
对nec3-γ1突变体和WT Bowman接种B后进行了RNAseq分析。sorokiniana分离出ND85F，以分析外显子组捕获分析中缺失的分隔区域中的11个基因。RNAseq还允许对WT Bowman中转录组的全球调控以及B上Bowman背景中产生的nec3-γ1突变体进行彻底分析。sorokiniana分离物ND85F接种。为了确定候选基因，分析了获得的总读数和与Morex参考基因组的百分比对齐，以及突变体和WT Bowman读数之间的比较分析（S4表）（GenBank Bio项目PRJNA666939）。在72 hpi的RNAseq分析中，与未接种的nec3-γ1突变体（加入SRR12763054-SRR12763062）相比，在72 hpi下共鉴定出10，473个差异表达基因（DEGs），其中nec3-γ1突变体的变化大于三倍（5，171个上调和5，303个下调）。 在耐药WT Bowman中，与未接种的WT Bowman对照相比，鉴定出5，463个DEGs（2，803个上调和2，661个下调）。有趣的是，鲍曼和nec3-γ1突变转录组谱在B期间的比较。sorokiniana分离株ND85F感染过程显示3个基因在Bowman中上调，nec3-γ1突变体下调，9个基因在Bowman中下调，nec3-γ1突变体上调（S4图和S4表）。对外显子组捕获探针组中缺失的11个基因的RNAseq数据的比较分析确定了细胞色素P450基因HORVU的预测外显子1中的13个核苷酸缺失。MOREX.r2.6HG0460850中的nec3-γ1突变体（图7）。在WT Bowman或nec3-γ1突变体（S3表）的测试时间点，在对照或病原体诱导的样品中，外显子组捕获探针中缺少的11个基因中有8个未被检测到，折叠变化报告为不显着（NS）。有趣的是，候选者Nec3基因HORVU。MOREX.r2.6HG0460850在病原体接种后在易感的nec3-γ1突变体中上调1，126倍，在病原体接种后仅在WT Bowman中上调118倍（S3表）。 -厦门杂志期刊论文发表
图 7.大麦nec3突变体和鲍曼野生型的等位基因分析和蛋白质多态性。
一个。从上到下显示了鲍曼野生型和nec3突变体中大麦Nec3基因的基因组和cDNA结构（Bowman wildtype，nec3-γ1，nec3 .l，nec3 .m，nec3 .d和nec3.e），其中基因组和预测的mRNA结构用外显子（黑色），内含子（黑色Vs），起始密码子（ATG）和停止密码子（TAA）的比例表示，突变在黄色框中表示， 其中，删除由其上方的红色框表示。B.从上到下显示了鲍曼野生型和nec3突变体中的大麦Nec3蛋白质结构（Bowman wildtype，nec3-γ1，nec3 .l，nec3 .m，nec3 .d和nec3.e），其中灰色代表蛋白质长度，绿色条代表跨膜结构域（TM），黄色条代表氧结合（OB）和活化保守残基AGxDTT，蓝色条代表具有保守残基ExxR和ExxR的进化枝特征（CS） P（E）R（F）和红色条表示血红素结合（HB），其保守残基作为p450进化枝的FxxGxRxCxG。这颗恒星显示了nec3-γ1，nec3 .l，nec3.m和nec3.e突变体和nec3中的截断蛋白。d具有A308P取代，在植物中p450蛋白家族的徽标中，AGxDTT与PGxDTT的氧结合结构域的保守残基中具有红色亮符号表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.g007
细胞色素P450突变等位基因分析和功能表征 -厦门杂志期刊论文发表
候选Nec3细胞色素P450基因（HORVU.MOREX.r2.6HG0460850）是在nec3区域的RNAseq分析中发现的唯一一个含有nec3-γ1突变的基因。通过PCR扩增子测序对其他四个独立的nec3突变体进行分析，与各自的WT基因型进行比较，结果表明，所有五个nec3等位基因都含有一种突变，该突变会破坏预测的翻译蛋白的功能。Nec3基因（HORVU.MOREX.r2.6HG0460850）编码一个1，566 bp基因（由RNAseq数据支持），该基因被翻译成具有N端跨膜结构域和C端p450结构域的521 aa蛋白。p450结构域有三个保守基序，氧结合（AGxDTT），进化枝特征（ExxR）（P（E）R（F））和血红素结合（FxxGxRxCxG）基序（图7）[35]。nec3-γ1突变体在外显子1中的位置251至263 bp处具有13个核苷酸缺失，预计这将导致过早停止密码子和237 aa的截断蛋白，消除整个p450结构域（图7）。G186T核苷酸转化在nec3中。预测m会产生一个过早的STOP密码子和一个61 aa的截断蛋白，消除p450结构域（图7）。该nec3.e突变体含有单核苷酸缺失A301，预计该缺失会导致帧移位，导致过早的STOP密码子，并且预测241 aa的截断蛋白也消除了p450结构域（图7）。G1292T核苷酸转化在nec3中。l突变体被预测在aa位置430处产生过早的STOP密码子，消除了p450结构域中存在的血红素结合基序（图7）。有趣的是，等位基因nec3。d产生非典型nec3表型的突变体具有典型的DLMM病变，含有深色酚类物质，并且与其他nec3突变体相比病变尺寸相对较小，具有G923C核苷酸取代突变，这导致预测的A308P aa转化。这种aa取代存在于p450结构域的氧结合（AGxDTT）基序的保守残基中，但仍然被预测会产生全长蛋白质。因此，nec3.d突变体功能受损，但保持部分T5H功能（图7）。色胺到血清素的转化在体外反应中由酵母表达的大麦Nec3介导Δ26无法令人信服地检测到蛋白质。LC-MS分析确定了接近血清素预期峰位的伪影峰（S7图）。使用多种对照（例如仅色胺）在反应中没有Nec3等多种对照来缓解这种I型错误，这导致了类似的伪影峰值，采集时间略有变化。
讨论
细胞色素P450基因（HORVU.MOREX.r2.6HG0460850）被鉴定为Nec3（坏死3）基因。产生非典型和独特nec3表型的大麦nec3突变体，大奶油至橙色坏死病变缺乏深色色素沉着，表明先前报道的DLMM典型的5-羟色胺酚类化合物的积累，在cv Bowman，Steptoe，Proctor和Villa背景中表征。其中四个独立突变体在细胞色素P450基因中具有缺失或核苷酸取代，导致预测的非功能性截断蛋白。有趣的是，第五个被证明对nec3等位基因的独立突变体产生了典型的DLMM表型，具有较小的含有5-羟色胺或酚类物质积聚的深色坏死病变（图1）。这种具有单核苷酸取代的nec3突变体为研究5-羟色胺[32]或酚类物质在PCD坏死性病变中的积累在HR反应期间病变扩增或病原体定植的隔离中的作用提供了一个独特的机会。还发现nec3不是真正的DLMM，因为它仅在植物受到各种特化大麦病原体的挑战时才表达出来。
最初，nec3突变体被归类为LMMs[29]，在这里称为疾病病变模拟突变体（DLMM），当它们达到一定的发育阶段时，它们会自发地发展坏死性病变。然而，与这些观察结果和DLMM名称相反，我们确定nec3表型仅在由病原体的不同分类学引发时才表达。nec3表型可能通过PAMP诱导者识别触发，在真菌病原体的情况下，在病原体激发，进入和宿主定植期间具有几丁质。先前的研究和观察导致将nec3描述为DLMM是在较少受控的温室和田间环境中进行的，其中nec3表型在没有明显的生物或非生物胁迫诱导的情况下始终如一地表达[28]。然而，在同一项研究中，[28]观察到在生长室中生长的用于转录组分析的突变幼苗没有表现出nec3表型。在我们的屏幕上，各种鲍曼突变种群为突变体的显性B。sorokiniana分离株ND90Pr易感基因[36]，鉴定出nec3-γ1突变体。nec3-γ1突变体表现出与先前描述和表征的nec3突变体一致的表型[36]。然而，表型仅在接种病原体后才出现，导致我们推测nec3特征性病变是由病原体激发诱导的。为了验证nec3表型仅由病原体感染诱导的假设，进行了无菌环境条件实验。在适当对照的无菌条件下进行实验后，确定在所有nec3突变体（nec3-γ1，nec3）中诱导了nec3表型。 d， nec3.e nec3.l和nec3。m，）由坏死性子囊菌真菌病原体B。索罗基尼亚纳， P.teres f. teres， 和P.teres f. maculata，以及生物营养性子囊菌Blumeria graminis（图 2）。在宿主穿透过程中，已知这些真菌病原体会形成类似触觉的结构和穿透钉，刺穿细胞壁和质膜，导致细胞损伤[37–39]。宿主破坏和病原体穿透结构还伴有蛋白质和次级代谢物效应分子，这些分子诱导宿主免疫应答，从而诱导时间调节和空间受限的简洁PCD应答。这些诱导PTI/DTI信号传导的破坏性感染过程也导致PR蛋白的上调，从而阻止病原体定植并诱导全身获得性耐药性（SAR）[40]。
细菌病原体X。半透明体，通过利用穿透性III型分泌系统来传递毒力效应器而引起组织损伤，也诱导了nec3表型。在细菌定植期间，细胞外多糖（EPS）渗出物也会被释放，以促进细菌之间的交流，从而增加成功感染的机会。细菌病原体还利用酶和其他分子来增加细胞壁的通透性。这种泄漏性允许细菌获得营养并促进其定植。总的来说，细菌病原体诱导的细胞完整性的丧失可能诱导nec3表型或PAMP样细菌精英也触发nec3表型，然而，我们的实验确定细菌PAMP flg22没有诱导nec3表型。
有趣的是，nec3表型不是由担子菌生物营养病原体P的毒力或病毒性种族引发的。graminis f. sp. tritici，其策略是通过气孔"隐身"宿主进入。据推测，P.graminis f. sp. tritici劫持了谷物宿主的气孔孔径调节，使其在夜间通过自然开口进入而不被发现[41，42]。鲍曼背景中的nec3-γ1突变体含有茎锈病抗性基因Rpg1 [43，44]，该基因引发了有效的种族特异性免疫反应，但并未引发nec3表型。最近的研究报道，Rpg1介导的防御是非HR反应[41，45]，因此，这表明nec3表型仍然可能由HR介导的耐药反应引起。
坏死性真菌病原体产生蛋白质性、非蛋白质性和次级代谢物效应子，通过坏死性效应器触发的易感性（NETS）启动宿主PCD定植于死亡和垂死的组织[12，13，46，47]。为了确定nec3反应的elicitor/s的性质，进行了病原体培养滤液浸润测定。 B.sorokiniana粗培养滤液在突变体上引起明显的nec3 PCD表型和敏感大麦系Steptoe中的特征性深色病变，但在耐药性cv Bowman中没有（S1图）。但是，在nec3中。d突变体，培养滤液没有产生与B一样明显的深色色素病变。sorokiniana分离出ND85F接种在nec3上。d.培养物滤液的Pronase处理并没有消除浸润部位明显nec3病变的诱发。因此，我们推测，引发nec3表型的培养滤液中的病原体效应子不是蛋白质效应子，而是代表PAMP，例如甲壳素，次级代谢物，非蛋白质毒素，RNA分子或紧密折叠的小蛋白质。然而，不能排除nec3参与抑制由DAMPs引起的PCD反应，其中包括细胞壁成分，eATP，eDNA或在感染过程中被破坏的其他内源性分子，因为在所有多细胞生命中都可以看到对被破坏的自我的识别，包括藻类，真菌，鱼类，昆虫，哺乳动物和植物[48]。然而，我们的实验表明，OG没有引发nec3表型。 -厦门杂志期刊论文发表
为了鉴定nec3基因，用F生成了遗传图谱2来自nec3-γ1（鲍曼背景）和大麦品种Quest（称为γ1 x Q种群）杂交的重组后代。遗传图谱将SCRI_RS_155654侧翼标记和SCRI_RS_239962之间的大麦染色体6H上的nec3区域划分为~0.14 cM。SNP标记SCRI_RS_155654位于39，543，736-39，543，856碱基对（bp）之间，SCRI_RS_239962位于56，035，754-56，035，852 bp之间，将Nec3与含有149个高置信注释基因的大麦染色体6H的物理距离限定为~16.49 Mb。我们通过对WT Bowman和WT Steptoe以及三个独立的nec3突变体nec3-γ1，nec3-l和nec3-m进行全基因组外显子组捕获测序进一步分析了这些基因。 然而，外显子组捕获探针库仅包含基于最近改进的大麦Morex参考基因组（2019）的组装和注释，存在于遗传分隔的nec3区域中的149个注释HC基因中的138个探针[34]。因此，重要的是将可用的探针集与最新的全基因组组装相关联，以在分析中包括潜在的未注释基因，以找到任何物种的性状的因果基因。nec3区域内外显子组捕获分析中缺乏任何突变基因，nec3区域中缺失的11个注释HC基因被鉴定出来，导致Bowman WT和nec3-γ1突变体对照和B诱导的RNA测序的比较分析方法。索罗基尼亚感染（S4 表）。利用RNAseq数据进行比较分析，在HORVU中发现了13 bp缺失。MOREX.r2.6HG0460850 nec3-γ1突变体中的HC基因模型。利用PCR扩增和Sanger测序，我们进一步证实了突变，这些突变将导致所有四个独立突变体中预测的非功能性截断蛋白，这些突变体产生典型的nec3表型（nec3-γ1，nec3.e，nec3。 l和nec3。m）和nec3中的临界氨基酸取代。d表达非典型暗坏死斑点的等位基因突变体（图1和7）。
在五个独立突变体中存在辐照诱导的缺失和核酸取代证实了HORVU。MOREX.r2.6HG0460850是功能性Nec3基因。霍武。MOREX.r2.6HG0460850 HC基因模型被预测编码521氨基酸细胞色素P450家族蛋白。细胞色素P450是血红素硫代蛋白，代表具有酶活性的最大超家族之一。在超家族中，氨基酸序列守恒非常低，只有属于保守序列基序（CSM）的三个残基是绝对保守的。然而，一般的地形和结构褶皱在整个成员中高度保守[49]。只有P450的CYP51基因家族在植物、真菌和动物门中是保守的，结核分枝杆菌中存在CYP51同源物，可能是由于侧向基因转移[35]。
NEC3蛋白的序列比较和系统发育分析将其作为细胞色素P450 71A1样蛋白（http://www.p450.kvl.dk/blast.html）置于CYP71族中，表明参与植物谱系特异性代谢[50]（S5图）。在注释五个等位基因nec3突变体的推定蛋白质编码序列后，由于诱导的突变，预计有四个编码过早的停止密码子，并且一个具有单个核苷酸取代，导致保守的P450残基中预测的氧结合和活化域中的A308P氨基酸转化（图7）。数据显示，在病原体感染后，这种突变体nec3。d等位基因被诱导并预测由于单个氨基酸取代而被翻译成具有非功能性氧结合域的全长蛋白质（图7）。有趣的是，nec3.d突变体，尽管对截断的非功能性nec3等位基因的等位基因表达相对较小的深色色素病变，推测是由于较高的5-羟色胺/酚类积累。我们假设nec3的病变尺寸较小。d与典型的奶油色nec3表型相比，由nec3-γ1，nec3.e，nec3表示。 l和nec3。m突变体是由于部分功能的Nec3蛋白引起的，但由于其氧结合结构域受损而引起DLMM表型。描述这种异常的另一种可能性是由于病变中5-羟色胺/酚类物质的积累而导致的病原体隔离。我们评估了5-羟色胺和色胺的外源根喂养在这些突变体中的作用，发现人工提供5-羟色胺来补充缺乏症确实减少了nec3病变的大小，色胺的过度积累增加了野生型和突变体的病变大小。这表明，色胺到血清素的顺序转化是由Nec3介导的，Nec3预测编码色胺5-羟化酶（T5H），并且在该途径中上游或下游底物的外源应用可以调节最终的表型结果。
这些观察结果和明显的表型差异表明，氧结合域在调节PCD的NEC3蛋白功能以及导致5-羟色胺积累的途径中起着关键作用[32]。该nec3.d等位基因是进一步表征 5-羟色胺/酚类沉积在坏死性病变中的作用及其在病原体隔离或调节病变扩增中的作用的独特工具。由于5-羟色胺/酚类物质如何或为何在PCD诱导的坏死性病变中积聚的问题是一个仍然需要回答的重要问题。
有趣的是，水稻中的关口病变（sl）突变体产生橙棕褐色坏死性病变，类似于大麦nec3表型。sl基因通过基于图谱的克隆被鉴定出来，并被证明在细胞色素P450单加氧酶家族中编码CYP71P1，该家族与大麦Nec3蛋白具有90.1%的氨基酸相似性和86.7%的同一性（S6图）[32]。sl基因被证明编码一种色胺5-羟化酶（T5H）酶，该酶在Shikimic途径中将色胺转化为植物中的5-羟色胺[32]。水稻sl基因突变体对稻瘟病真菌（Magnaporthe grisea）和水稻糠斑真菌（Bipolaris oryzae）敏感，并且SL坏死性病变也由N-乙酰低聚糖（甲壳素）诱导[31]。通过在稻叶片中外源施用血清素消除了对稻瘟病的突变突变敏感性[31]。外源性施用的血清素沉积到sl病变组织的细胞壁中，并且这些具有额外5-羟色胺酚类物质的病变恢复了深色色素沉着并恢复了对坏死性病原体B的抵抗力。米稻[32]。因此，nec3.d含有部分功能性全长蛋白的突变体可能能够将色胺转化为血清素，但由于关键的A308P替代对PCD有泄漏控制，并且无法在病原体识别时对其进行检查。我们测试了Nec3蛋白的T5H功能能力，但是，我们无法令人信服地检测到酵母表达的大麦Nec3介导的体外反应中的色胺到血清素的转化。Δ26蛋白。由于根喂养而增加的血清素水平能够在体内逆转nec3表型，然而，未能确定Nec3的体外T5H活性可能归因于其对物种特异性还原酶的特异性或对尚未确定的其他体内活性成分的需求。 -厦门杂志期刊论文发表
植物在细胞壁的修饰中进化出血清素的氧化聚合，作为病原体感染期间感染部位的物理屏障和酚类物质沉积的一部分，以抑制病原体生长并将其隔离在死细胞的病灶中。该机制还可以作为隔离病变扩张的信号机制，以在对病原体挑战做出反应后保持叶子的光合能力。大麦nec3突变体无法调节PCD反应，提供没有明确边界的扩大坏死病变。nec3进一步证明了这一点。d突变体，该突变体仍然积累酚类物质，并且具有明确的病变边界，可在病原体存在的情况下隔离病变的扩张。这种现象在耐药WT Bowman中也观察到。RNAseq分析表明，大麦NEC3基因在WT Bowman和nec3-γ1突变体中高度上调，B后72小时。sorokiniana接种， 因此sl同源物的上调表明， 在大麦中将色胺转化为血清素的必要性增加， 因为它在调节 PCD 介导的免疫中具有重要意义..
坏死性真菌病原体产生蛋白质性、非蛋白质性和次级代谢物效应物，通过坏死性效应器引发的易感性启动宿主 PCD 定植于死亡和垂死组织。为了确定nec3反应的elicitor/s的性质，进行了病原体培养滤液浸润测定。B. sorokiniana粗培养滤液在突变体上引起明显的nec3 PCD表型和易感大麦系Steptoe的特征性深色病变，但在耐药性cv Bowman中没有。但是，在nec3中。d突变体，培养滤液没有产生明显的深色色素病变，如B所示。索罗基尼亚纳ND85F分离接种在nec3上。这表明，这种单一氨基酸取代允许病原体在WT Bowman背景下诱导增强的PCD诱导，但可能仍然保留部分功能，允许血清素代谢并在病变中积聚，这些病变仍然具有隔离病原体和坏死病变扩张的功能。培养滤液渗透nec3。d突变体与其他nec3突变体难以区分，在没有病原体的情况下没有深色色素沉着。这表明，在激发后，nec3。d突变体的行为与其他非功能突变体相似，但在病原体存在下，它仍然能够进行一定程度的血清素生物合成并抑制病变扩张和病原体生长。
培养物滤液的pronase处理并未消除浸润部位明显nec3病变的诱发。因此，我们可以推测病原体效应子在B中。引起nec3表型的sorokiniana培养滤液不是蛋白质效应物，但与水稻中的sl突变体相似，可由PAMP引起，可能是甲壳素，因为它引起sl表型，也可能在大麦中引起nec3。这表明nec3坏死可能由甲壳素通过细胞外LysM结构域引发，存在于水稻LysM RLK，OsCERK1和LysM RLP CEBiP的大麦同源物上[51]。然而，由于观察到nec3表型也由细菌病原体X引起。半透明体有可能被Nec3抑制诱导PCD反应的多个效应子。
在拟南芥中，CYP84A1 EMS突变体被证明改变了木质素组成[52]。因此，细胞壁组成的改变可能会影响病原体在叶面与宿主的时空相互作用，我们在nec3-γ1突变体中进行了显微镜测试。根据对B的微观观察。与WT Bowman相比，nec3突变体上的sorokiniana生长模式观察到病原体与宿主角质层的感染菌丝相互作用异常，表明角质层不稳定并且从nec3-γ1叶面剥离，那里有接触（图5B）。这种异常的相互作用显然破坏了病原体感染菌丝中的信号传导。当生长在nec3突变叶面上时，B。sorokiniana菌丝大量分支并产生表面碎片，显然是由于沿着胚管的角质层不稳定（图5）。病原体的大量分支和植物细胞表面不稳定可能导致许多宿主 - 病原体与nec3突变体的接触点，使植物能够识别更多的PAMP分子，可能是甲壳素片段。这种异常相互作用可能导致nec3 cyp71A1突变体中的ROS快速产生和由于缺乏5-羟色胺积累而导致的失控细胞死亡，这可能在PCD介导的坏死病变扩张的隔离中发挥作用，类似于水稻中的sl突变体。DAB测定支持这一结论，因为nec3-γ1突变体在被坏死性病原体B感染时产生ROS。与敏感的Steptoe和耐药Bowman中的延迟ROS相比，早在12 hpi时就检测到sorokiniana，分别在18和24 hpi时检测到（图4）。
在这里，我们报道了大麦Nec3基因作为P450 CYP71A1细胞色素氧化酶的鉴定，该氧化酶在抑制由各种适应性大麦病原体引发的PCD反应中起作用。我们假设Nec3是PCD的阴性调节剂，并且是水稻中鉴定和表征的sl基因的同源物，其在坏死性病变中5-羟色胺的生物合成和积累中起作用。大麦Nec3基因为研究PCD和HR反应的控制以及我们收集的突变等位基因（尤其是nec3）提供了宝贵的资源。d突变体将是确定5-羟色胺和可能的酚类化合物沉积在坏死性病变中的作用的极好工具，用于病原体定植或病变扩张的隔离。
材料和方法
引起 nec3 表型
对野生型（WT）cv Bowman和nec3-γ1（鲍曼背景）种子进行了一个多月的隔离盒实验，以观察独立于病原体挑战的nec3表型，详情见S1附录。
诱导 nec3 表型的病原体
为了确定不同的病原体是否可以诱导nec3表型，使用不同的真菌病原体（包括B）对突变系nec3-γ1和WT系进行了接种。苜蓿、苜蓿属、茴香属、茴香属、禾本科禾本科、黑芋属和恶毒的种族。 大麦细菌病原体黄单胞菌半透明体也用于接种植物。所遵循的材料和方法在S1附录中进行了描述。 -厦门杂志期刊论文发表
DAMP渗透
对B进行培养滤液浸润。从板中取出1mL悬浮液（10-20k孢子）的ND85F分离物并加入到75-100mL薯条培养基（56）中。含有薯条培养基和B的烧瓶。将sorokiniana孢子在26°C的黑暗中孵育三天，以100rpm振荡，然后在室温下置于黑暗中，继续振荡四天。在生长7天后，用Miracloth过滤渗出物，并使用具有3kD尺寸排除的15mL Microsep Advance离心装置浓缩渗出物以浓缩约8倍。使用没有针头的注射器浸润WT Bowman，WT Steptoe，nec3-γ1，WT Quest，nec3的四个次级叶片。l和nec3。m， nec3.d 和nec3.e.四种治疗方法包括：1）浓缩渗出物+薯条培养基，2）浓缩渗出物+ MOPs缓冲液，3）浓缩渗出液+ MOPs +Pronase（Sigma），以及4）薯条培养基+ MOPS +Pronase。所有处理，浓缩渗出物+薯条培养基和浓缩渗出物+ MOPS均与根据Liu 2004（57）进行的规格成1：1的比例。在1mg / mL下进行Pronase处理，并在浸润后4天和7天对叶子进行评分。
还用三半乳糖醛酸，Flg22和甲壳素进行浸润。Wildtype Steptoe and Bowman， nec3.l和nec3-γ1与DIMP三半乳糖醛酸以10mg/mL、1mg/mL和0.1mg/mL浸润。使用Flg22，PAMP为1mg / mL，甲壳素为2μg / ml。所有对照的渗透都是在两叶阶段进行的。浸润后，将植物保存在生长室中，在22°C下光周期为14小时，在18°C下黑暗10小时。 在渗透后七天内，每天观察植物。
DAB 染色
为了观察感染部位的ROS，从WT Bowman和接种B的nec3-γ1突变幼苗的6，12，18，24和48 hpi的次生叶片中收集了5个3 cm叶片样品。Sorokiniana分离株 ND85F。分离后，按照[53]所述的方案，立即将叶子转移到15ml管中新鲜制备的1mg / ml DAB（Sigma Aldrich，MO）溶液（pH3.6）中。
电子显微镜
在12 hpi下对从WT Bowman和nec3-γ1突变幼苗收集的叶子进行电子显微镜检查。Sorokiniana分离株 ND85F。收集叶子并用剃刀刀片切成正方形，固定在磷酸钠缓冲液（美国马里兰州罗克维尔Tousimis）的2.5%戊二醛中，并在4°C下储存过夜。用蒸馏水冲洗切片的叶片样品，然后用磷酸钠缓冲液1M溶液在7.4 pH下冲洗，然后使用8次从30%至100%乙醇的分级醇系列洗涤进行脱水，每次洗涤的增量浓度增加10%。使用Autosamdri-810临界点干燥器（美国马里兰州罗克维尔市Tousimis）以液态二氧化碳为过渡液，对叶片样品进行临界点干燥。干燥的叶子样品被附着在带有银漆的铝支架上（SPI Supplys，西切斯特，美国宾夕法尼亚州）和溅射镀金（Cressington溅射镀膜机Redding，美国加利福尼亚州）。使用JEOL JSM-6490LV扫描电子显微镜在15 kV的加速电压下工作获得图像。
烯利主义交叉
本研究中发现的nec3-γ1突变体与nec3杂交。1， nec3.m， nec3.d和nec3。e. 得到的 F1将种子种植在田间，具有WT亲本系Steptoe和Bowman，并从幼苗到成虫阶段进行表型。The F2后代被种植在温室中并接种B。sorokiniana分离物ND85F，nec3表型/病害在幼苗的次生叶片上评级。表型是在田间和温室中进行的，以利用全年。这是由于nec3表型在接种了B的敏感传播者行附近生长时诱导的一致性而成为可能。sorokiniana在田间分离ND85F，并在温室中用B接种时。Sorokiniana分离株 ND85F。 -厦门杂志期刊论文发表
Nec3 地图开发
原nec3-γ1 M2在cv Bowman背景中生成的植物被用作与六排cv Quest杂交的女性父母，该副本最初是为麦芽而开发的，由明尼苏达大学发布（59）。200 nec3-γ1 x 任务 F2在接种B后，在温室中对个体进行nec3表型筛查。如前所述，sorokiniana分离出ND85F，并使用卡方检验来确定拟合的优度。烯丙试验确定nec3-γ1是nec3突变体。因此，为了更精确地绘制基因的简单序列重复（SSR）和单核苷酸多态性（SNP）标记，这些标记跨越先前划定的nec3区域靠近大麦染色体6HS的着丝粒，用于对F进行基因分型2显示纯合nec3突变表型的个体。不幸的是，致命的叶绿素/白化病背景突变杀死了200 F中的54个。2后代测定。该背景叶绿素/白化病突变以隐性3：1单基因方式分离（χ2= 0.32）。这种突变与nec3无关，我们考虑了死亡的植物和形成nec3表型的剩余植物的数量，以计算遗传比率。从nec3-γ1、Quest和33个纯合子nec3-γ1 F中提取基因组DNA2后代代表66个重组配子。使用从GrainGenes开采的公开可用探针序列设计的寡核苷酸引物对四个指定为Bmag0807，GBM1053，GBM1212和GBM1423的微卫星标记进行PCR扩增[54]。
PCR-GBS 文库制备、离子洪流测序和 SNP 调用
PCR基因分型-通过测序（PCR-GBS）小组是使用从T3数据库[55]中挖掘的SNP源文件序列开发的，如前所述[56]。利用IPK大麦爆炸服务器[33]的POPSEQ位置来识别43个SNP标记，这些标记映射到SSR标记GBM1053和GBM1423之间的nec3位点。父母线nec3-γ1 （cv Bowman） 和 cv Quest 加上 33 F2测定纯合子nec3突变重组物。PCR-GBS文库制备，离子激流测序和SNP调用如前所述[56，57]。然而，由于行和标记的数量很少，该库是在Ion Torrent PGM 314芯片上进行测序的。手动生成分隔区域中的遗传图谱，并从IPK基因组浏览器中挖掘每个标记的POPSEQ位置。
物理图谱开发和候选基因鉴定
将43个SNP标记锚定在基于IPK大麦BLAST服务器（https://webblast.ipk-gatersleben.de/barley_ibsc/viroblast.php）的序列上，并对2019年大麦cv Morex序列的全基因组组装进行物理位置搜索，以创建最小平铺路径（MTP）物理图谱。侧翼标记GBM1053和GBM1423以及nec3-γ1（cv Bowman）和cv Quest和33 F上的43个SNP标记数据2重组体（66个重组配子）用于开发遗传图谱，并将其锚定在大麦的WGS上以确定分隔的Nec3区域的物理图谱。使用带有侧翼标记的分隔Nec3区域列出该区域中所有高置信注释的基因，这些基因被认为是基于2019年大麦cv Morex全基因组组装的候选基因[34]。
外显子组捕获和分析
从WT Bowman，WT Steptoe，nec3-γ1（Bowman背景），nec3的五个发芽种子的切除胚胎中提取DNA。l（步趾背景）和nec3。m（步趾背景）突变体。使用PowerPlant Pro DNA分离试剂盒（Qiagen，CA）在机械裂解样品上进行DNA提取，遵循Solanki等人描述的方案[57]。
新酶
将WT Bowman和nec3- γ1幼苗生长约14天，直到次生叶在22°C下14小时光照和19°C下10小时黑暗的生长室中完全膨胀。 将幼苗接种B。按照前面描述的程序分离出ND85F，并将对照幼苗接种与两滴Tween20混合的水。在接种后72小时（hpi）从未接种和接种的幼苗的三个生物重复（一个个体幼苗被认为是生物重复）中收集次生叶组织，并使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen，CA）提取总RNA。RNAseq文库是使用TruSeq RNA文库制备试剂盒v2（Illumina，CA）构建的，并在Illumina NextSeq 500（S1附录）上测序。然后通过使用绘制的Nec3物理区域中的候选基因产生最终列表，在病原体相互作用期间WT Bowman和nec3-γ1突变DEG之间存在差异表达。来自差异表达的候选基因的读数堆积自WT Bowman和nec3-γ1突变体（Bowman背景），并且在CLC基因组工作台上堆积的基因特异性读数中观察到缺失。 -厦门杂志期刊论文发表候选nec3基因等位基因分析和蛋白质功能表征
候选nec3基因HvCYP71-A1从nec3-γ1（鲍曼背景），WT Bowman，nec3扩增。1 （步趾背景）， nec3.m （Steptoe background）， WT Steptoe， nec3.d （监考员背景）， WT 监考员， nec3.e（别墅背景）和WT别墅使用底漆对Nec3_p450_F1和Nec3_p450_R1;Nec3_p450_F3和Nec3_p450_R2;Nec3_p450_F4和Nec3_p450_R4，旨在产生重叠的扩增子，其各自的片段大小为1075，563和404bp（S4表）。纯化的PCR扩增子使用Sanger测序（Genscript，NJ）进行测序。对重叠的PCR扩增子序列进行排列，并确定每个nec3突变体与其各自野生类型相比的特定突变。
Nec3蛋白可能的T5H活性将色胺转化为血清素在体外测试，如Fujiwara等人（2010）所述。部分 Nec3 蛋白 （Nec3Δ26） 在 X33 菌株的Pichia pastoris中表达，带有 c 端 6x His 标签。最初的26个氨基酸编码预测的跨膜结构域，因此被去除用于分泌的蛋白表达。分泌的蛋白质通过His-NTA柱纯化，并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹测定（S7图）进行分析。150μl体外反应由20mM磷酸钾（pH 7.25），50 pmol / ml重组Nec3蛋白，兔肝NADPH还原酶和100μM色胺组成。通过加入1mm NADPH并在30°C下孵育30分钟来启动反应。三种对照，即仅色胺（1ng / μl），没有Nec3和没有NADPH的完全反应是并行进行的。孵育后，将样品加入氘化的血清素作为内部对照，用冰冷的甲醇以1：5稀释并以最大速度离心15分钟以获得上清液，其在速度真空中浓缩过夜。最终样品在安捷伦 6495 三重四极杆体系上进行 LC-MS 分析，以进行色氨酸到血清素转化分析。
外源性补充血清素和色胺
在三组处理中，从5天龄幼苗开始，每隔一天向nec3突变体及其各自的野生型喂食50Μm，色胺5mM和水，以40ml /株的水通过根部从5天龄的幼苗开始，每隔一天喂食10次。这些植物接种了B。在14天龄的幼苗上以2000 / ml的速度分离ND85F孢子，方法是遵循先前描述的方案并在第21天进行表型分析圣疾病感染 7 天后。
支持信息
材料和方法。
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S1 附录。
材料和方法
引起 nec3 表型
实验使用60x30x30厘米（H / W / L）的有机玻璃盒进行
尺寸，盒子的两侧有两个7.5厘米的孔，以允许气流。这
通风孔用干酪布填充，以保护盒子内的植物免受病原体的侵害
孢子或昆虫。野生型（WT）cv鲍曼和
nec3-γ1
（鲍曼背景）种子
种植并观察1个月。两个六英寸的花盆，每个花盆种植两棵树苗
将基因型放置在温室的隔离箱内和两个对照罐内
在同一温室长凳上的隔离箱外进行维护。这些植物是
根据需要使用蒸馏高压灭菌水浇水。隔离箱内的生长条件
（无菌条件）在~26时光周期为16小时
o
C +/- 3
o
C由于温室效应
有机玻璃室与隔离箱外的正常温室条件分别为16-
~22 小时光周期
o
C +/- 3
o -厦门杂志期刊论文发表
C.盒子外的对照植物要么没有接种
或接种
B. 索罗基尼亚纳
使用下述步骤隔离ND85F。
在观察到
nec3
未接种和
B. 索罗基尼亚纳
隔离 ND85F 接种
nec3-γ1
温室中的植物，对叶子进行分析以确定是否
病变部位存在/定植一种可识别的病原体。以下摄影
记录，去除含有病变的叶子，使用10%漂白剂对表面进行灭菌
一分钟，冲洗并铺在琼脂平板上，在光下生长16小时/天
3-5天。对于
B. 索罗基尼亚纳
接种植物
nec3
病变主要由以下因素定植
B. 索罗基尼亚纳.
但是，未接种疫苗的
nec3
植物具有典型的
nec3
病变
主要殖民者
禾本科
疾病白粉病的致病因子。
诱发病原体
nec3
表现型
十个WT鲍曼和十个
nec3-γ1
植物生长在生长室中，具有14
小时光周期在 22.5
o -厦门杂志期刊论文发表
C 和 10 小时黑暗期在 19
o
C.接种物由
放置一个 PDA 插头
B. 索罗基尼亚纳
从V8- 上受感染的叶子中分离出ND85F
马铃薯葡萄糖琼脂（V8-PDA）平板，然后在室温下孵育十天
在恒定的光线下。将分生孢子重悬于无菌H中
2
O使用无菌环和
调节至~2，000个孢子/mL的浓度，加入10ul吐温20以减少孢子
聚类。当次生叶完全扩大时，大约十天龄的幼苗
将叶子接种
B. 索罗基尼亚纳
分离出ND85F，大麦斑点病原体，具有
雾化器（坎贝尔豪斯菲尔德空气涂料喷雾器，Dh580000av），带有50mL分生孢子
~2，000 个孢子/mL，使用 34.47 kPa 的压力。接种后，将幼苗放置在
深雾室，每12分钟雾化一次，持续30秒，持续16小时。经过一夜的喷雾，
将植物放置在生长室中，并每天观察标准 -厦门杂志期刊论文发表
nec3
表型与WT感染类型和典型病变发展10天进行比较（图10）
2).
两种形式的网状斑点病原体，
Pyrenophora teres
f.
泰雷斯
和
P. 特里斯
f.
黄斑，
分别接种网状和斑点状网状斑点的致病因子
在
nec3-γ1
和WT Bowman幼苗。接种物生产和接种程序
用于
鳞翅目
f.
泰雷斯
按照Shjerve等人（2014）[所述进行[
1]
.这
接种物生产和接种程序用于
Pyrenophora teres
f.
黄斑
是
如Neupane等人，2015年所述
[2]
.
接种后7天后，继发性
对叶子进行观察并按标准评分
nec3
表型与WT进行比较
感染类型和典型网状网状斑点和斑点形成网状斑点病变。
这 -厦门杂志期刊论文发表
禾本科
接种是通过轻轻敲击叶子来进行的
实验品种上方的白粉病病变，以分散来自
受感染的叶子。因为
B. graminis
是一种专性生物营养，
B. graminis
受感染的大麦叶
从温室被用作接种源。孢子施用后，植物
留在温室中（24时16小时光周期
o
C 明暗 16
o
C） 直到出现症状
发展，在WT感染类型和病变之间进行比较
在
nec3-γ1
突变系（图2）。
Pyrenophora tritici-repentis
在V8-PDA培养基上通过在黑暗中孵育
5-6天，然后在室温下在光照下孵育24小时，然后24小时
在黑暗中 15
o
C
[3]
.然后将分生孢子在灭菌的蒸馏水（约30ml）中收获。
通过用灭菌的接种环轻轻刮擦培养物的表面。最终孢子
将浓度调节至~3000孢子/mL，每100 mL含2滴吐温20
接种。遵循Friesen和Faris（2004）描述的程序进行接种
病症和疾病评估
[4] -厦门杂志期刊论文发表
.潜伏期 7 天后，WT 感染类型
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https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.s001
（文档）
S1 表。用于在6H染色体上开发大麦nec3遗传和物理图谱的标记列表。
标记的名称，序列和物理位置基于2019年大麦品种Morex的全基因组组装。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.s002
（XLSX）
S2 表。大麦基因组中分隔的nec3区域中的高置信候选基因列表。
基因名称，物理位置，它们在外显子组捕获探针上的存在和注释基于2019年大麦品种Morex的全基因组组装。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.s003
（XLSX）
S3 表。进一步分析了大麦基因组中未在外显子组捕获实验中捕获的分隔nec3区域中的高置信候选基因列表，以在接种后72小时的斑点斑点感染期间表达。
基因名称和注释基于大麦品种Morex的2019年全基因组组装，在斑点斑点感染的Bowman野生型和nec3-γ1转录组图谱中报告了相对归一化表达，其中NS表示与对照相比没有显着变化。 -厦门杂志期刊论文发表
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.s004
（XLSX）
S4 表。Nec3研究中使用的引物列表。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.s005
（XLSX）
S1 图双极性索罗基尼安分离物ND85F培养滤液在nec3突变体和野生型（wt）亲本系上的典型反应。
大麦系次生叶渗透 Bowman wt， nec3-γ1， nec3.d， nec3.e.， Steptoe wt， nec3.l和nec3。m（从左到右）与双极性索罗基尼安分离物ND85F培养滤液（CF）。从上到下（左图所示）的处理是用薯条培养基（FM）培养滤液（CF）;带 MOPS 缓冲区的 CF （M）;CF与M和蛋白酶（P）;在两叶阶段进行含有FM，M和P.渗透的对照，并在渗透后4天和7天记录。显示的照片是在渗透后7天拍摄的。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.s006
（TIF）
S2 图nec3表型不是由nec3突变体及其各自的野生型大麦植株上的甲壳素浸润诱导的。
（一）该图显示了从左侧nec3对nec3突变体上2μg/ ml的甲壳素浸润的反应。d， nec3.γ1， nec3.e， nec3.l和nec3。m，其次是鲍曼，斯特普托，普罗克特，维拉野型。（二）该图显示了对控制缓冲液从左侧nec3突变体上的渗透的反应。d， nec3.γ1， nec3.e， nec3.l和nec3。m，其次是鲍曼，斯特普托，普罗克特，维拉野型。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.s007
（TIF）
在nec3突变体（A.）及其各自的野生型大麦植物（B.）的次生叶上接种双极性sorokiniana诱导的nec3表型，其中植物被提供40ml /盆水;血清素150μg/ml和色胺5mM，从5天龄幼苗开始，每隔一天进行一次，总共10次根部喂养。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.s008
（TIF）
S4 图鲍曼野生型和nec3-γ1突变体在接种双极性索罗基尼亚分离株ND85F后72小时后的转录组谱。
维恩图表示给定类别中唯一基因的数量，其中蓝色和绿色椭圆形分别代表Bowman下调和上调基因，红色和黄色椭圆形分别代表nec3-γ1突变体上调和下调基因（上图）。条形图显示了每个类别Bowman和nec3-γ1突变体上调和下调基因中存在的总基因数（下图）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.s009
（TIF）
S5 图大麦Nec3蛋白的NCBI爆炸系统发育树，其中分支代表了单子叶植物中蛋白质的紧密同源物之间的关系。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.s010
（TIF）
S6 图大麦Nec3和大米sl蛋白之间的相似性，其中点代表相同，字母代表两种蛋白质中不同的氨基酸差异。 -厦门杂志期刊论文发表
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.s011
（TIF）
S7 图如 Fujiwara 等人 （2010） 所述，在体外测试纯化的 Nec3Δ26 蛋白可能将色胺 5-羟化酶活性转化为血清素的 LC-MS 分析，使用三种对照，即仅色胺 （1 ng/μl），在没有 Nec3Δ26 的情况下进行完全反应，在没有 NADPH 的情况下在 Agilent 6495 三重四极杆体系上并行进行。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009473.s012
（TIF）
确认
该nec3.d和nec3。e变种人由Jerry Franckowiak博士善意地提供。该nec3.1和nec3.m突变系由华盛顿州立大学的Andris Kleinhofs博士提供。我们感谢明尼苏达大学质谱和蛋白质组学中心的LC-MS设施。
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