《ENAP1通过H3K9乙酰化介导的ABI5正反馈调节来重新训练种子发芽-厦门杂志期刊论文发表》期刊简介
ENAP1通过H3K9乙酰化介导的ABI5正反馈调节来重新训练种子发芽-厦门杂志期刊论文发表
· 赵波，
· 王立凯，
· 邵正瑶，
· 秦凯文，
· 达维拉吉，查克拉瓦蒂，
· 虹桥
· 出版日期： 2021年12月15日
抽象
组蛋白乙酰化参与种子发芽的调节。转录因子ABI5在ABA-抑制种子萌发中起着至关重要的作用。然而，ABI5和组蛋白乙酰化在种子萌发过程中如何协调调节基因表达的分子机制仍然模糊不清。在这里，我们表明ENAP1与ABI5相互作用，它们与ABA反应基因（包括ABI5本身）共同结合。ENAP1ox种子萌发对ABA的超敏反应通过abi5空突变恢复。ABA增强了启动子区域中的H3K9Ac富集以及ENAP1和ABI5共同结合的靶基因的转录，这需要ENAP1和ABI5。ABI5基因由ENAP1和ABI5直接调控。在enap1缺陷突变体中，H3K9Ac富集和ABI5在其自身启动子区域的结合活性以及ABI5转录和蛋白质水平均降低;而在abi5-1突变体中，ABI5启动子中的H3K9Ac富集和ENAP1结合活性降低，表明ENAP1和ABI5共同作用于调节ABI5介导的正反馈调节。总体而言，我们的研究揭示了一种新的分子机制，通过该机制，ENAP1调节H3K9乙酰化并介导ABI5的正反馈调节以抑制种子发芽。
总结
为了优化自然环境的适应性，开花植物在有利的环境中启动种子发芽，并在压力条件下保持种子休眠。精确的机制已经发展到调节发芽时间，以确保植物适应不利的环境。ABA是植物中的主要应激激素，可诱导种子休眠并抑制种子发芽。已知表观遗传调控涉及ABA信号传导，其中转录因子ABI5充当调节中心。然而，表观遗传调控，如ABI5转录上的组蛋白乙酰化仍然难以捉摸。在这项研究中，我们揭示了一种新的分子机制，通过该机制，组蛋白结合蛋白ENAP1调节H3K9乙酰化，其以ABI5依赖性方式介导ABI5的正反馈调节以抑制种子发芽。
数字
引文：Zhao B， Wang L， Shao Z， Chin K， Chakravarty D， Qiao H （2021） ENAP1通过H3K9乙酰化介导的ABI5正反馈调控对种子萌发进行再训练。PLoS Genet 17（12）：e1009955。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009955
编辑 器：瞿丽佳，北京大学，中国
收到：九月 22， 2021;接受：十一月 19， 2021;发表：十二月 15， 2021
版权所有：? 2021 赵等人。这是一篇根据知识共享署名许可协议条款分发的开放获取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。
数据可用性：支持本研究结果的数据可在NCBI Gene Expression Omnibus at https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/获得，ENA1ox RNA-seq的加入号为GSE77396，用于ABA治疗RNA-seq的GSE80568，用于abi5-1 RNA-seq的GSE90004，用于ABI5 ChIP-seq的GSE60143，用于ENAP1 ChIP-seq的GSE97288。
资金：这项工作得到了美国国立卫生研究院（对总部）的资助。（NIH-2R01GM115879）.https://www.nih.gov/资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
相互竞争的利益：作者宣布不存在相互竞争的利益。-厦门杂志期刊论文发表
介绍
种子发芽对植物的生命至关重要，因为它决定了未来生长和发育的成功。种子发芽从干燥种子吸收水分开始，以胚胎轴的伸长和胚根的出现结束。该过程经过精细调节，以最大限度地提高植物对各种环境刺激的生存[1，2]。植物激素脱落酸（ABA）是种子休眠和发芽的主要调节剂，也是对许多植物物种的非生物胁迫作出反应。ABA信号传导由许多AREB / ABF（ABA响应元件 - 结合因子）转录因子（TFs）实现，包括与AREB（ABA反应元件）结合以调节下游基因表达的bZIP家族蛋白[3–5]。
bZIP转录因子ABI5在调节ABA介导的种子萌发和幼苗早期生长中起着关键作用。abi5突变体在种子发芽期间首先被定性为ABA不敏感[6，7]。ABI5的表达是由ABA在发芽后的短发育窗口内诱导的，在此期间，植物在开始营养生长之前评估环境条件[8]。据推测，ABI5对于在渗透胁迫下使发芽的种子进入静止状态是必要的，从而保护幼苗免受失水[8]。为了在相应条件下保持胚胎处于活动和静止状态的平衡，ABI5在转录和翻译后水平上受到密切调节[9]。多种转录因子和其他蛋白质参与ABI5转录的阳性或阴性调节，例如阳性调节因子ABI3和DOG1[10，11]，阴性调节因子MYB7和RAV1[12，13]。有趣的是，ABI5正在通过与其自身的启动子结合来进行自动调节。pABI5的酵母表达报告构建：lacZ和GAL4活化结构域-ABI5融合（GAL4AD-ABI5）显示出比仅表达GAL4活化结构域的酵母高得多的β半乳糖苷酶活性，表明ABI5可以在反式中靶向其自身的启动子[14]。酵母单杂交提供了进一步的证据，证明ABI5直接激活其自身表达[15]。在ABA存在的情况下，ABI5被激活并提示与一组含有AREB基序的基因的启动子结合[7，16]。ABI5结合基序在某些LEA基因家族的启动子区域中非常突出，这些基因家族对ABA对种子干燥耐受性建立有反应[17]。ABI5的表达与ABA-介导的干燥耐受性在发芽种子中的重新建立相关[18]。
据报道，组蛋白乙酰化参与种子发芽，许多研究揭示了组蛋白去乙酰化酶在这方面的关键作用[19，20]。组蛋白去乙酰化酶HDA6和HDA19在发芽后多余地抑制胚胎基因表达，hda6和hda19突变体的种子萌发对ABA过敏[21–23]。进一步的研究表明，HDA19与SNL1相互作用，以调节种子休眠中H3K14 / 18Ac的组蛋白乙酰化[24]。HDA9是另一种组蛋白去乙酰化酶，与PWR一起作用，在靶基因处对H3K9Ac和H3K14Ac进行脱乙酰化，其缺乏的突变体显示出更快的种子萌发[25，26]。最近的研究表明，HDA15通过与转录因子MYB96相互作用来参与ABA信号传导。在ABA存在的情况下，HDA15-MYB96复合物与植物RHO GTPASE（ROP）基因亚群的启动子共结合，并去除H3和H4的乙酰基团，从而导致其表达抑制。作为支持，hda15和myb96功能丧失突变体在种子发芽期间对ABA的敏感性降低[27]。此外，据报道，其他HDAC家族也可调节种子发芽。在hd2c突变体中，H3K14Ac的升高和H3K9me2的减少导致ABI1和ABI2的激活，导致在发芽过程中对ABA的敏感性增强[28];类似地，乙酰化的H3在HDC1突变体中积累，在ABA存在下显示出超敏的种子萌发表型[29]。鉴于ABI5在ABA-抑制种子萌发中的重要作用，组蛋白乙酰化介导的ABI5调控引起了人们的极大兴趣，但其分子机制仍在很大程度上是未知的。
ENAP1在其N端有一个SANT结构域，它首先被鉴定为Agrobacterium VirF蛋白的相互作用蛋白[30]。ENAP1是一种组蛋白结合蛋白，可调节组蛋白乙酰化[31–34]。ENAP1优先与与主动转录基因相关的区域结合，并产生相对松弛的染色质状态，以便对乙烯等刺激做出快速反应[33]。在这项研究中，我们证明组蛋白结合蛋白ENAP1在ABA途径中起到抑制种子萌发的积极调节剂的作用。缺乏的突变体在种子发芽过程中对ABA的敏感性降低，这与种子发芽期间对ABA过敏的ENAP1获得功能（ENAP1ox）突变体相反。 我们进一步发现ENAP1与ABI5相互作用，它们与包括ABI5本身在内的ABA反应基因共同结合，并且abi5空突变恢复了ENAP1ox种子萌发对ABA的超敏反应。此外，ENAP1和ABI5都是ABA提高其共靶向基因启动子区域H3K9Ac水平所必需的，从而调节其表达。最后，ABI5启动子中H3K9Ac的降低和enap1缺陷突变体中ABI5结合活性的降低导致ABI5转录的减少，表明在H3K9Ac中需要ENAP1介导的ABI5的正反馈调控。这些结果揭示了一种新的分子机制，通过该机制，ENAP1调节组蛋白乙酰化并介导ABI5的正反馈调节以抑制种子发芽。
材料和方法
植物材料和生长条件
本研究中使用的所有拟南芥植物都是Col-0背景，除了Ws背景中的abi5-1植物。35S：：ENAP1：YFP：HA （ENAP1ox） 和pENAP1：：ENAP1-YFP/Col-0 之前已有描述 [31]。ENAP1ox #1用于除图1中的种子发芽测定以外的所有其他实验。ENAP1ox/abi5-1是通过与abi5-1杂交ENAP1ox #1而产生的。Sanger测序证实ENAP1ox/abi5-1中的abi5-1点突变。Salk_200891，名为abi5-10，是ABI5的T-DNA插入线，它与pENAP1：：ENAP1-YFP/Col-0杂交产生pENAP1：：ENAP1-YFP/abi5-10。对于enap1 CRISPR突变体，通过PCR筛选来自农杆菌介导的转化的潮霉素抗性T1植物。随后，将截断的ENAP1基因组DNA片段克隆到pBlunt进行测序。在T1群体中获得了两种同源缺失突变体enap1-1（由gRNA1 + gRNA2产生）和enap1-2（由gRNA3 + gRNA4产生）。在T2代中，无Cas9的植物通过Cas9的PCR鉴定，并通过潮霉素筛选进一步确认。实验采用同源和不含Cas9的T3植物。从在长日照条件下（16小时光照/8小时黑暗，22°C）生长的植物中收获种子。在进行实验之前，种子在干燥条件下成熟至少一个月。
图 1.ENAP1积极调节ABA反应以抑制种子萌发。-厦门杂志期刊论文发表
(A）Col-0和ENAP1ox独立系的萌发表型。野生型（Col-0）和ENAP1ox（#1，#2）的分层种子在含乙醇（模拟）或2μMABA的1/2 MS上发芽。 照片是在分层后96小时拍摄的。棒材，0.1毫米。（B 和 C）Col-0和ENAP1ox品系中种子发芽率的定量。种子在1/2 MS下用模拟（B）和2μMABA（C）处理发芽。每12h记录一次发芽的种子（胚芽出现），直到分层后120h。（D） Col-0和enap1 CRISPR/Cas9删除系的萌发表型。在模拟（乙醇）或2μMABA处理下分层后发芽72h的种子成像。棒材，0.1毫米。（E 和 F）Col-0和enap1删除线的萌发百分比。Col-0、enap1-1和enap1-2的分层种子在补充乙醇（E）和2μM ABA（F）的1/2 MS上发芽。每12h计数发芽种子，直到分层后120h。所有量化数据都表示在三次重复中至少180个种子的±s.d.。将48h、60h和72h的种子萌发率与未配对双尾t-检验的Col-0进行了比较。* P < 0.05;** P < 0.01;P < 0.001。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009955.g001
本文中引用的基因在拟南芥基因组倡议数据库中被发现，加入编号如下：ENAP1（At3G11100），ABI5（AT2G36270），AtEM1（At3g51810），LEA4-1（At3g17520），REV3（AT1G01520），ABF1（AT1G49720），ABF2（AT1G45249），ABF3（AT4G34000），ABF4（AT3G19290）。
种子发芽测定
使用50%漂白剂和0.01%（v / v）Triton X-100对干燥的种子进行表面灭菌7分钟，并用无菌水洗涤5次。然后将灭菌的种子置于含有0.8%（w / v）植物混合琼脂（沉箱实验室）的1/2 MS培养基板上，并补充0.01%（v / v）乙醇作为模拟或2μM ABA（Sigma-Aldrich，溶解在100%乙醇中）作为处理。总共为每种基因型使用了180个种子（每个重复60个）。将所有带有种子的板在4°C的黑暗中放置3天，然后转移到长日照条件下（16h亮/8h黑暗，22°C）进行进一步分析。发芽事件定义为胚根的出现，并且每12小时计数发芽的种子，直到分层后120h。
质粒构建
CRISPR/Cas9载体构建在[35]之前已经描述过了。简而言之，在CRISPR-Plant中检索和评估了靶向ENAP1的潜在gRNA[36]。将一对引导RNA（gRNA）寡核苷酸通过PCR从pDT1T2掺入gRNA转录盒中，并克隆为pHEE401E靶向载体，用于农杆菌介导的转化。为了构建酵母双杂交载体，将ABI5和ENAP1的编码序列（CDS）扩增并分别连接到pDBLeu（Invitrogen）和pEXP-AD502（Invitrogen），从而产生了BD-ABI5和AD-ENAP1。ABF1、ABF2、ABF3和ABF4的CDS序列被克隆到pEXP-AD502以生成AD载体。 对于下拉测定，将ABI5和ENAP1 CDS连接到pET28a和pVP13（网关载体，去除了他的标签）以生成His-ABI5和MBP-ENAP1。对于BiFC实验，ABI5 CDS被克隆到pDEST-VYNE，ENAP1 CDS被克隆到pDEST-VYCE。 第八幕CDS被克隆到两个BiFC目标载体以用作对照。上述所有构造均通过测序进行了验证。使用的引物列在S1表中。
ABI5 和 ENAP1 蛋白的蛋白质印迹
将种子在黑暗中的4°C下灭菌并分层3天，并放置在含有ABA或0.01%（v / v）乙醇（模拟）的1/2 MS板上，以在长日条件下发芽指定时间。收集用于蛋白质分析的种子并快速冷冻在液态氮中2并在加工前储存在-80°C。将种子在液体N2中研磨并用2X蛋白质上样缓冲液[50mM Tris-HCl（pH6.8），2%SDS，10%甘油，0.01%溴酚蓝和新鲜加入的0.4%（v / v）β-巯基乙醇]溶解。总蛋白通过SDS-PAGE解析，转移到PVDF膜上，然后用抗ABI5抗体（Abcam）或抗HA抗体（细胞信号传导）探测。RPT5 或 H3 用作装载控制。-厦门杂志期刊论文发表
基因表达分析
使用PureLink植物RNA试剂（Invitrogen）提取总RNA。第一条cDNA链是用NEB ProtoScript II逆转录酶试剂盒合成的。qRT-PCR是通过在罗氏保温瓶循环仪中将cDNA与SYBR预混液相结合来进行的。每个样品一式三份分析。基因表达水平归一化为UBQ10。
酵母双杂交测定
酵母双杂交测定是使用ProQuest双杂交系统（Invitrogen）[34]按照先前发表的过程进行的。简而言之，与感兴趣基因融合的AD和BD载体被共同转化为酵母菌株AH109（Clontech）。转化子在SD/ -Trp-Leu或SD / -Trp-Leu-His连续稀释后生长在ShD / - Trp-Leu-His液滴培养基上。酵母在SD / -Trp-Leu-His选择性培养基上补充3'AT（Fisher Scientific）的生长表明感兴趣的蛋白质之间的相互作用。
体外下拉测定
从E中纯化空的MBP（对照）和MBP-ENAP1蛋白。大肠杆菌与直链淀粉树脂（NEB）。用柱缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.4，0.2 M NaCl，1 mM EDTA，1mM PMSF，蛋白酶抑制剂）洗涤三次后，并用含有10mM麦芽糖的柱缓冲液洗脱（Fisher Scientific）。将MBP融合蛋白用micon过滤器（EMD Millipore）透析并溶解在柱缓冲液中以进行进一步分析。用Ni-NTA琼脂糖（QIAGEN）纯化Hi-ABI5，并与透析的MBP融合蛋白在4°C下孵育1小时。 用柱缓冲液洗涤五次后，通过离心样品收集蛋白质，并将其重悬于柱缓冲液中进行蛋白质印迹分析。下拉产物由SDS-PAGE分离，并用抗His（Sigma）和抗MBP（NEB）抗体免疫印迹。
双氟碳化物测定
农杆菌浸润用于4-6周烟叶中基因构建体的瞬时表达[37]。简而言之，将用质粒转移的农杆菌在28°C下接种过夜，通过离心收集农杆菌细胞并重新悬浮在新鲜的浸润缓冲液（10mM MES / KOH pH5.7，10mM MgCl2，100μM乙酰丁酮）中。将不同的BiFC伴侣菌株以及p19菌株稀释并混合，最终OD 600为0.4。将农杆菌混合物在28°C下缓慢摇动3h，然后过滤到烟叶上。浸润后两天，在共聚焦显微镜下观察叶盘的荧光（Zesis 710）。DAPI用于染色细胞核。
共免疫沉淀测定
在用Co-IP缓冲液（50mM Tris-Cl pH 8.0，150mM NaCl，1mM EDTA，0.1%Triton X-100，1mM PMSF和蛋白酶抑制剂）分层后，从ENAP1ox种子中从ENAP1ox种子中用2μM ABA发芽24 h。抗ABI5抗体在施用前与Dynabeads蛋白G（Thermo）一起孵育5h。随后，将抗ABI5和Dynabeads蛋白G混合物与粗蛋白溶液在4°C下孵育过夜。 洗涤五次后，收集结合在Dynabeads上的蛋白质，并用2X蛋白质上样缓冲液重悬。用SDS-PAGE分离IP蛋白，并用抗ABI5（Abcam）和抗HA（细胞信号传导）抗体免疫印迹，以检测ABI5和ENAP1。
ChIP 检测
ChIP测定如前所述进行[31]。通常，收集种子并用1%甲醛固定。染色质被分离并超声处理，以产生平均大小在300-500bp之间的DNA片段。然后使用蛋白G Dynabeads（Thermo）免疫沉淀溶解的染色质，并与抗体[抗ABI5（Abcam），抗GFP（Invitrogen），抗H3Ac（EMD微孔），抗H3K9Ac（EMD微孔），抗H3K14Ac（EMD Millipore），抗H3K18Ac（EMD Millipore）和H3K27Ac（EMD Millipore）]一起孵育。回收共免疫沉淀的DNA，并通过实时荧光定量PCR进行分析。本文中使用的所有ChIP-qPCR引物都列在补充表中。S1.
RNA-seq 和 ChIP-seq 分析
ABA处理下的RNA-seq分析和ENAP1ox RNA-seq分析之前已有描述[31，38]。对于前10个TF表达变化，将不同发芽时间[39]种子RNA-seq的原始计数转换为TPM（每百万转录本）进行绘图。从GSE90004 [ 40 ]获得发芽24小时abi5-1种子的RNA-seq原始数据，并用FastQC进行质量控制（bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）。配对端读数被映射到拟南芥基因组（TAIR10），botwie2（2.4.2）具有默认参数[41]。映射的读数由每个基因的特征计数（子read 2.0.1）计数[42]。使用DESeq2（1.32.0）鉴定差异调控基因，p值<0.01，q值<0.05和|log2（折叠更改） |>1 [43]。对于ABI5和ENAP1 ChIP-seq分析[31，44]，从数据库Gene Expression Omnibus（GEO）获得原始测序数据，并使用FastQC（bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）进行质量控制。用Trim Galore（0.6.7）（bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/）去除低质量的读数，然后使用botwie2（2.4.2）映射到拟南芥基因组[41]。为了显示特定类别中每个基因的TSS周围的ChIP信号，使用默认参数[45]使用bamCompare（deepTools 3.5.1）计算了来自两个重复的合并bam文件的全基因组读取覆盖率。每个读取覆盖率被归一化为相对于输入 ChIP 信号的 RPKM。通过computeMatrix（deepTools 3.5.1）计算每个基因组区域的ChIP信号评分，并使用每个区域的评分平均值进行剖面图[45]。-厦门杂志期刊论文发表
结果
ENAP1在种子发芽期间积极调节ABA反应
ENAP1是一种组蛋白结合蛋白，介导乙烯反应中的组蛋白乙酰化[31]。在我们的研究中，我们注意到ENAP1（ENAP1ox）获得功能的种子萌发比野生型（Col-0）慢。根据我们之前的观察结果，发芽测定表明ENAP1ox种子的发芽率远低于Col-0（图1A和1B）。此外，ENAP1ox种子萌发率与ENAP1基因表达呈负相关（S1A图）。有充分的证据表明，ABA在种子发芽中起着重要作用[2]。为了探索ENAP1是否参与ABA调节的种子萌发，我们比较了ENAP1ox和Col-0在2μM ABA存在下的种子萌发率。与Col-0相比，ENAP1ox种子的发芽对ABA处理更敏感（图1A和1C）。一致地，ENAP1ox种子在其他浓度的ABA处理下对ABA表现出比Col-0更高的敏感性（S1B图）。
为了进一步研究ENAP1在种子发芽中的功能，我们首先测试了ENAP1敲除线（amiR-ENAP1）中的种子发芽，无论是否进行ABA处理（S1C图）。在没有ABA的情况下，在Col-0和amiR-ENAP1系之间的种子萌发中没有观察到差异（S1D图）。在ABA存在下，与Col-0相比，amiR-ENAP1系在种子发芽期间对ABA的敏感性较低，这表明ENAP1通过ABA途径对种子发芽进行负调节（S1E图）。为了进一步证实这一结果，我们通过CRISPR / Cas9生成了enap1突变体。我们获得了两条独立的线，enap1-1携带146bp删除和enap1-2，携带30bp删除，这两条线都引入了ENAP1翻译的早期停止，并导致C-终点的120 a.a和61 a.a截断（S1F-S1I图）。RT-PCR显示，截断的ENAP1在两条系中的表达均显著降低（S1J图）。在没有ABA的情况下，与Col-0相比，enap1-1和enap1-2的种子萌发没有观察到差异（图1D和1E）。在ABA存在下，enap1-1和enap1-2种子的发芽速度都快于Col-0（图1D和1F）。更有趣的是，enap1-1含有较长的蛋白质截断，在种子发芽中对ABA的敏感性低于enap1-2，表明ENAP1中较长的截断导致更严重的表型（图1F，S1F和S1G图）。总之，这些数据表明ENAP1通过ABA抑制种子发芽。
ENAP1参与ABA反应基因的调节
为了探索ENAP1如何参与ABA途径，我们重新审视了先前收集的EANP1ox RNA-seq数据，并将EANP1ox中差异表达的基因与ABA差异调节的基因进行了比较[31，38]。我们发现，在ENAP1ox植物中，大约47%（728/1544）的ABA反应基因也受到差异调控（图2A）。更重要的是，这些共调控基因的表达模式高度相关，约67%（485/728）均受到ENAP1和ABA的正调节（图2B中的大括号表示）。对这485个基因的基因本体（GO）分析显示，术语"对ABA刺激的反应"被显著富集（图2C），表明ENAP1与ABA反应有关。
图 2.ENAP1参与ABA反应基因的调节。
(A）维恩图显示了由ABA和ENAP1调节的基因数量。（B） 热图显示由ABA和ENAP1差异调节的基因的相关性。大括号表示由ABA和ENAP1（共485个基因）调节的基因。（C） 由ABA和ENAP1上调的基因本体分析。（D）从ABA和ENAP1上调基因中TSS上游1k bp鉴定的DNA基序。（E） 使用 Tomtom 基序比较工具 [54] 将（D）中的基序与 CIS-BP2.0 数据库中的所有植物基序进行比较，并选出前 10 个基序。根据相似性分数（-log10（E值））绘制与这些基序相关的TF。（F） 种子发芽过程中前10个TF的表达水平。来自已发表的RNA-seq数据的原始计数[39]被归一化为TPM（每百万转录本）。样品来自新鲜收获和干燥的种子，种子遵循指示的分层时间（S）和分层后（SL）。每个数据点表示三个重复的平均± s.d.。（G） ABI5 绑定基序，来自 CIS-BP2.0 数据库。Tomtom E值表示ABI5结合基序和YGMCACGTGTC基序之间的相似性。-厦门杂志期刊论文发表
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009955.g002
据报道，ENAP1通过其与乙烯反应转录因子（TFs）的关联来介导乙烯反应[31]。ENAP1在蛋白质水平上没有受到ABA的显着调节（S2A Fig），因此可能存在与ENAP1相关的ABA响应性TF来响应ABA，模仿乙烯反应中的情况。为了鉴定ENAP1-ABA调控模块中涉及的潜在转录因子，我们在ABA和ENAP1共上调基因中提取了1 kb TSS（转录起始位点）的上游DNA序列，并使用MEME基序发现软件检索保守基序[46]。主题YGMCACGTGTC以E值3.3e-40突出显示（图2D）。然后将该基序与TF结合位点数据库CIS-BP2.0匹配，以找到类似的基序和相关的TF [47]。总共发现了67个基序，p值截止值为0.01，并且AREB结合基序出现在前10个基序中（图2E）。为了进一步确定哪种转录因子可能与ENAP1一起在种子发芽中响应ABA，我们重新分析了公开的转录组数据[38，39]，发现ABA5转录本在时间序列下在ABA处理下增加最多，并且在种子发芽期间也最丰富（图2F和S2B图）。我们还发现，ABI5结合基序与YGMCACGTGTC基序（图2G）具有很高的相似性。重要的是，我们发现大约54%（263/485）的ENAP1和ABA正调控基因在其TSSs上游的1k bp中至少有一个ABI5结合基序（S2C图）。总体而言，这些数据强烈表明ENAP1可能通过与ABI5一起发挥作用而参与ABA。
ENAP1在体内和体外与ABI5相互作用
为了测试我们对ENAP1与ABI5一起起作用的推测，我们首先进行了酵母双杂交测定以检查它们的相互作用。检测到ENAP1和ABI5之间的强相互作用（图3A）。然而，在酵母双杂交测定中没有检测到ENAP1与其他ABF之间的相互作用，这表明ENAP1-ABI5相互作用的特异性（S3图）。为了进一步验证它们的相互作用，我们使用从E中纯化的重组蛋白进行体外下拉测定。大肠杆菌。和烟叶中的BiFC测定。在两种测定中都检测到ENAP1和ABI5之间的强相互作用（图3B和3C）。接下来，我们通过体内共免疫沉淀研究了ENAP1和ABI5之间的相互作用。使用在ABA存在下发芽的种子提取物进行免疫沉淀24h，当ENAP1和ABI5均充分表达时。事实上，ENAP1可以在ENAP1ox的细胞裂解中被ABI5免疫沉淀，但在Col-0或ENAP1ox/ abi5-1的细胞裂解中却不能（图3D），表明ENAP1在体外和体内都与ABI5相互作用，为ENAP1通过ABI5参与ABA信号传导提供了额外的证据。
图 3.ENAP1在体外和体内都与ABI5相互作用。
(A）酵母双杂交测定，以显示ENAP1和EIN5之间的相互作用。指示的结构被共同转化为酵母。左图：酵母在两个液滴培养基上生长作为对照;右图：在选择性三液滴培养基上生长的酵母，以评估ABI5和ENAP1之间的相互作用。（B）体外下拉显示 ENAP1 和 ABI5 之间的相互作用。重组蛋白His-ABI5和MBP-ENAP1从E中表达和纯化。大肠杆菌用于体外下拉，MBP蛋白作为对照。（C） BiFC测定显示ENAP1与ABI5相互作用。"Venus" YFP的N端和C端与ABI5和ENAP1融合。与两个终点融合的ACT8被用作阴性对照。在农杆菌浸润后两天用共聚焦显微镜观察烟叶中的荧光。条形表示 50μm。（D）体内免疫沉淀测定，以证明ENAP1和ABI5的相互作用。使用抗ABA5抗体免疫沉淀24 h从ENAP1ox、Col-0和ENAP1ox/abi5-1发芽种子中提取的总蛋白。输入用作加载控件。用抗HA和抗ABI5抗体探测印迹。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009955.g003
ENAP1通过ABI5参与ABA-抑制种子发芽
在ENAP1和ABI5相互作用的基础上，我们推测ENAP1和ABI5可能与一簇基因共结合以调节它们的表达。为了验证这一假设，我们重新分析了ENAP1和ABI5的ChIP-seq数据，并比较了它们的结合特性[31，44]。使用严格的峰值调用标准，我们发现大约38%（2255/ 5921）的ABI5结合基因也被ENAP1结合（图4A）。热图显示，ABI5和ENAP1都在其共同靶向基因的TSS区域周围达到峰值（S4A Fig）。GO分析表明，术语"对ABA刺激的反应"被过度代表，进一步表明ENAP1参与ABA途径（S4B图）。鉴于ENAP1与ABI5相互作用，然后我们询问这种相互作用是否增强了它们访问染色质的能力。为了解决这个问题，我们分别比较了来自仅由ABI5结合的基因，仅由ENAP1结合的基因或由ENAP1和ABI5结合的基因的ABI5 ChIP信号。结果表明，ABI5和ENAP1在TSS区域向其独特的靶基因显示出比非靶标基因更强的ChIP信号（图4B和4C）。值得注意的是，ABI5更喜欢与ABI5和ENAP1共同靶向的基因结合（图4B）。一致地，ENAP1显示出比ENAP1唯一靶向的基因更高的访问ABI5和ENAP1共同靶向的基因的能力（图4C）。
图 4.ENAP1参与ABA-介导的通过ABI5抑制种子发芽。
(A）维恩图比较了从 ChIP-seq 鉴定出的 ABI5 和 ENAP1 结合基因的数量。（B） ABI5 ChIP-seq 信号的平均富集 （对数2[RPKM（ChIP/Input）]）由 ABI5、ENAP1 结合或由 ABI5 和 ENAP1 共同结合的基因中 TSS 的 1kb 上下游。（C） ENAP1 ChIP-seq 信号的平均富集 （对数2[RPKM（ChIP/Input）]）由 ABI5、ENAP1 结合或由 ABI5 和 ENAP1 共同结合的基因中 TSS 的 1kb 上下游。（D） 热图显示ENAP1ox和abi5-1中差异调控基因的表达模式。（E） 在ENAP1ox中上调和在abi5-1中下调的基因中，ABI5 和 ENAP1 ChIP-seq 信号的平均富集为 TSS 的上下游 1kb（由 （D） 中的大括号表示）。（F） ABI5 ChIP-seq信号的平均富集 1kb 上下游 TSS 基因在ENAP1ox中上调，在abi5-1中下调。基于ENAP1ox v.s. Col-0中的log2（折叠变化）对基因进行分组。（G） 在有或没有2μM ABA存在的情况下分层后96h处指示基因型种子发芽的照片。棒材，0.2毫米。（H 和 I）在模拟（H）或2μMABA（I）存在下指定基因型种子的发芽百分比。每12h计数发芽种子，直到分层后120h。每个数据点表示在三次重复中至少180个种子的平均±s.d.。
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接下来，我们询问ABI5和ENAP1是否合作调节基因转录。通过重新分析abi5-1种子中已发表的RNA-seq数据，我们提取了282个基因，这些基因在ENAP1ox中上调，在abi5-1中下调（图4D中的大括号表示）。ABI5和ENAP1在这些基因上显示出相似的结合谱（图4E）。我们根据ENAP1ox与Col-0相比log2折叠变化的表达将282个基因分为三组，然后检查了这三组基因上的ABI5结合谱。我们发现ABI5结合与基因表达水平呈正相关（图4F），进一步支持ENAP1与ABI5相互作用以共同靶向ABA响应基因以协同调节其表达的结论。为了在遗传水平上验证这一假设，我们将abi5-1突变体引入ENAP1ox中以产生ENAP1ox / abi5-1植物，并且蛋白质印迹测定显示ENAP1蛋白水平在种子萌发过程中未被abi5-1突变改变（S4C图）。在没有ABA的情况下，与野生型种子相比，ENAP1ox以及ENAP1ox / abi5-1种子显示出延迟发芽（图4G和4H）。 然而，在ABA存在下，ENAP1ox的晚期种子发芽表型在ENAP1ox/aib5中被挽救，其表型与abi5-1的表型更相似（图4G和4I）。总之，所有数据强烈表明ENAP1通过ABA5调节种子发芽以响应ABA。-厦门杂志期刊论文发表
ENAP1依靠ABI5在种子发芽期间沉积H3K9Ac
由于种子发芽期间ENAP1ox对ABA的超敏反应是通过abi5空突变（图4G-4I）恢复的，我们接下来询问ENAP1介导的种子萌发如何响应ABA在分子水平上依赖于ABI5。为了解决这个问题，我们首先检查了ENAP1与靶基因的结合是否依赖于ABI5。ChIP-qPCR测定四个具有代表性的ENAP1和ABI5共靶向基因，ABI5，AtEM1，LEA4-1和REV3，表明需要ABI5来增强ENAP1的结合（图5A和S5A-S5E图）。 鉴于ENAP1影响乙烯反应中的H3Ac[31]，我们随后检查了24h发芽的Col-0和ENAP1ox种子中这些靶基因启动子区域中的H3Ac富集。我们发现ENAP1ox中H3Ac的富集率远高于Col-0中的H3Ac（S6A图）。为了确定哪些乙酰化物种有助于ENAP1ox种子中H3Ac的升高，我们比较了24h发芽种子中这些靶基因的启动子中H3K9Ac，H3K14Ac，H3K18Ac和H3K27Ac的水平。我们发现H3K9Ac，而不是其他乙酰化物种，在ENAP1ox中升高（S6B-S6E图）。进一步的ChIP-qPCR测定表明，在ABA存在下，Col-0中这些靶基因的启动子中的H3K9Ac水平升高;然而，ABA对H3K9Ac的升高在enap1-1中在很大程度上受到损害（图5B）。此外，这些靶基因的表达与模拟和ABA条件下enap1-1种子中H3K9Ac的变化呈正相关（图5C），表明ENAP1促进组蛋白乙酰化，从而在种子发芽过程中激活基因表达。
图 5.ENAP1依靠ABI5在种子发芽期间调节H3K9Ac以响应ABA。
(A） ChIP-qPCR 显示 ENAP1 与四个具有代表性的 ENAP1 和 ABI5 共靶向基因的启动子结合。采用24h定向植物种子在模拟和2uMABA处理下发芽，用于ChIP测定。（B）ChIP-qPCR用于检查靶基因启动子中的H3K9Ac富集。使用在模拟或0.5μM ABA存在下发芽24小时的Col-0和enap1-1种子进行ChIP测定。（C） qRT-PCR显示靶基因在Col-0和enap1-1种子中的表达。从处理过的种子中提取总RNA，如（B）中所述。（D-G）ChIP-qPCR用于检查ABI5（D），AtEM1（E），LEA4-1（F）和REV3（G）的启动子中的H3K9Ac富集。 ChIP测定用Col-0，ENAP1ox，abi5-1和ENAP1ox/ abi5种子中的抗H3K9Ac抗体进行，这些种子用模拟或2μM ABA处理发芽24小时。 （H-K）qRT-PCR分析ABI5（H）、AtEM1（I）、LEA4-1（J）和REV3（K）的相对表达。 从处理为（D）的种子中提取总RNA。所有数据都表示三个重复的± s.d. 的均值。在单因素方差分析检验中，不同的字母与P<0.05有显著差异。
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最后，我们比较了Col-0，ENAP1ox，abi5-1和ENAP1ox / abi5-1的24h发芽种子中靶基因启动子中的H3K9Ac水平，无论是否存在ABA的存在。在模拟条件下，ENAP1ox中的H3K9Ac水平一直明显高于Col-0，并且ABA在ENAP1ox中对H3K9Ac的升高比Col-0更明显（图5D-5G）。相比之下，在没有ABA的情况下，abi5-1和ENAP1ox / abi5-1中的H3K9Ac水平相对低于Col-0（图5D-5G）。ABA对H3K9Ac的升高在abi5-1中显著降低。值得注意的是，在ENAP1ox / abi5-1中，ABA对H3K9Ac的升高在很大程度上受损（图5D-5G）。qRT-PCR测定进一步表明，靶基因的表达与上述基因型种子中的H3K9Ac水平呈正相关（图5H-5K）。总而言之，这些数据和随之而来的趋势表明，ENAP1通过以ABI5依赖性方式升高H3K9Ac来响应ABA，从而导致靶基因表达的上调以抑制种子发芽。
ENAP1参与ABI5的正反馈调节
正如在之前的研究中观察到的[14，15]，我们注意到ABI5靶向其自身的基因启动子（S5A和S5C图），这表明ABI5的自调节参与其中。此外，我们发现ABI5的基因表达与ENAP1表达水平呈正相关（图5C和5H）。因此，我们推测，以ENAP1-为介导的H3K9Ac调控对于招募更多的ABI5以实现正反馈调控非常重要。为了验证这个想法，我们首先检查了enap1-1和ENAP1ox种子中的ABI5蛋白水平，无论是否进行ABA处理。与Col-0相比，ABI5蛋白在enap1-1突变体中减少，并且在ENAP1ox中升高，无论是否使用ABA处理（图6A和6B），这与其转录变化（图5C和5H）一致，表明ENAP1以积极的方式调节ABI5基因表达。为了进一步研究ENAP1如何调节ABI5与其自身启动子的结合，我们使用FIMO扫描了具有典型ABI5基序的ABI5基因TSS上游的1k bp，并确定了三个具有p值<0.01的ABI5基序，如前所述[15，48]（由图6C中的星号表示）。引物（P1和P2）被设计成分析ABI5在其自身启动子上的结合（图6C）。因此，ABI5倾向于结合到ABI5结合基序所在的P1区域，并且在没有ABA的情况下，与Col-0相比，其结合在ENAP1ox中显着增强，在enap1-1突变体中减少。在ENAP1ox种子中，ABA-诱导的ABI5结合的升高增强，但与Col-0相比，enap1-1的升高显着降低（图6D和6E）。更重要的是，ABI5结合活性与ABI5基因表达水平和蛋白丰度呈正相关（图5C和5H和6），为ENAP1协助ABI5靶向自身启动子提供了深刻的证据。我们还观察到，ABI5更喜欢与ENAP1在全基因组范围内结合的靶标结合，这表明在ABI5介导的正反馈调节中需要ENAP1（图4B）。综上所述，这些数据表明，ABI5需要ENAP1介导的H3K9Ac调控才能实现正反馈调控，从而促进ABI5依赖性转录调控，从而抑制种子萌发。-厦门杂志期刊论文发表
Fig 6. ENAP1 is involved in the positive feedback regulation of ABI5.
(A）蛋白质印迹检查Col-0和ENAP1ox中的ABI5蛋白水平。从种子中提取总蛋白，在模拟或2μMABA处理下发芽24h。RPT5 用作负载控制。（B） Col-0 和enap1-1中的 ABI5 蛋白水平 。从种子中提取总蛋白，在模拟或0.5μMABA处理下发芽24小时。（C） ABI5启动子区域的引物位置。沿着ABI5启动子设计了两个引物（P1和P2），用于跟踪ChIP-qPCR。星号表示 ABI5 绑定图案。（D） ChIP-qPCR 显示 ABI5 蛋白在ABI5基因上的富集。ChIP测定是在处理为（A）的种子中进行的。（E） ABI5蛋白在Col-0和enap1-1中对ABI5基因的富集。Col-0和enap1-1种子被处理为（B）用于ChIP测定。所有量化数据均表示三次重复的±s.d.平均值。在单因素方差分析检验中，不同的字母与P<0.05有显著差异。
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讨论
控制发芽时间是开花植物优化其在自然环境中的适应性的最重要策略之一。在单个种子的水平上，存在维持或破坏休眠的机制，以确保响应环境刺激的最佳发芽时间[49]。ABA是影响种子休眠和发芽的最重要的植物激素之一。鉴于种子发芽过程中ABA含量的降低以及ABI5在ABA信号传导中的积极作用，ABI5作为ABA信号的维持者在发芽中起着至关重要的作用。许多研究揭示了ABI5在转录和翻译后水平上的调控，但ABI5的表观遗传调控以及自调节在很大程度上尚未探索[9，50–52]。在这项研究中，我们提供了多条令人信服的证据，表明组蛋白结合蛋白ENAP1通过H3K9Ac介导的ABI5正反馈调节抑制种子萌发。首先，在遗传学上，我们发现ENAP1功能增益（ENAP1ox）显示出增强的ABA敏感性，而缺陷突变体在种子发芽中表现出较低的ABA敏感性（图1），并且ABI5的空突变恢复了ENAP1ox中的这种表型（图4H-4I）。其次，我们发现ENAP1直接与ABI5相互作用，但不与其他ABF相互作用，无论是在体内还是在体外（图3和S3图）。第三，我们发现ENAP1依靠ABI5来结合和调节靶基因（图5A和5H-5K）。更重要的是，我们发现ABI5和ENAP1共同靶向ABI5基因启动子，ENAP1调节ABI5基因表达及其后的蛋白质翻译，这是由于ENAP1对ABI5自调控的帮助（图5C和5H，6和S5A-S5C图）。 然而，ENAP1蛋白不受ABI5（S4C图）的调节。最后，我们发现ENAP1对调节H3K9Ac以及靶基因表达的积极作用依赖于ABI5（图5D-5K）。我们总共提出了一个模型，即在种子发芽开始时，当ABA水平较高时，组蛋白结合蛋白ENAP1升高H3K9Ac，在靶位点中产生松弛状态，导致ABI5与其靶标（包括ABI5本身）的结合和转录活性增强，从而导致种子萌发的抑制（图7）。
图 7.一个模型，用于说明ENAP1如何通过H3K9Ac介导的ABI5的正反馈调节抑制种子萌发。
ENAP1作为染色质座取者，以保持更高水平的H3K9Ac，导致靶基因转录的染色质状态允许。当ABA水平较高时，累积的ABI5更倾向于与ENAP1与更高水平的H3K9Ac结合的位点结合，并且ENAP1和ABI5之间的相互作用反过来促进H3K9Ac的升高和ABI5的募集，导致包括ABI5本身在内的靶基因的ABI5依赖性正反馈调节， 导致抑制种子发芽。
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组蛋白乙酰化以前被证明在种子发芽中非常重要。例如，HDA6和HDA19涉及去除H3K14Ac和H3K9/18Ac，在发芽后多余地抑制胚胎基因表达，其缺陷突变体的种子萌发显示出对ABA的超敏反应[21-23]。HDA15使H3和H4脱乙酰化，从而导致ROP基因的抑制以及种子发芽[27]。现在已经确定，TF在真核生物中产生的许多效应是通过与许多改变染色质状态的共调节剂的相互作用来介导的，从而导致更开放（在激活的情况下）或闭合构象（在抑制的情况下）。在这项研究中，我们发现ENAP1ox中的H3Ac水平显着高于24h发芽种子中的Col-0（S6A图）。有趣的是，与H3K14Ac和H3K23Ac升高的乙烯反应不同[31]，H3K9Ac在种子发芽期间受到显着调节（S6B-S6E图）。最重要的是，ABI5是H3K9Ac中ENAP1介导的升高所必需的（图5D-5G），这表明ABI5通过指导辅助因子的募集在调节转录中起重要作用，在这种情况下是组蛋白结合蛋白ENAP1。进一步研究确定与AIB5直接或间接相关的HAT或HDAC将为组蛋白乙酰化如何控制种子发芽提供更深入的见解。
值得注意的是，即使在aba5-1突变体中，H3K9Ac和靶基因表达的水平在ABA存在下仍然略微升高（图5D-5K），这表明在ABA存在下，存在潜在的额外的ABI5独立途径来调节H3K9Ac。此外，在我们的研究中，我们专注于H3K9Ac，但其他组蛋白修饰是否以及如何参与种子发芽尚不清楚。关于如何确定特异性组蛋白H3位点进行乙酰化的分子机制的进一步研究，以及涉及哪些其他组蛋白修饰，以及这些组蛋白修饰的组合调控如何在种子发芽期间整合到基因表达中是令人感兴趣的。
我们之前的研究表明，ENAP1通过调节组蛋白乙酰化参与乙烯反应[31，33]。此外，我们还提出ENAP1结合染色质以保持松弛状态，从而允许对乙烯产生快速反应[33]。问题是ENAP1在种子发芽中如何发挥作用。我们提到ENAP1结合靶标包括参与广泛植物活动的基因，包括对激素和应激的反应[33]。ENAP1可能作为占位符发挥作用，通过调节组蛋白乙酰化来维持放松状态。在存在不同线索的情况下，积累的特定转录因子与ENAP1相互作用，以快速激活特定反应的转录。在种子发芽过程中，植物激素ABA和GA起关键作用，乙烯起次要作用[49，53]。在种子发芽开始时，由于ABA水平高，ABI5会积累，这为ENAP1提供了与ABI5相互作用的机会。正如预期的那样，我们的结果表明，当ABA5累积时，ENAP1在ABA存在下与ABI5相互作用（图3）。ChIP-seq分析表明，ENAP1和ABI5共享相当比例的结合靶标并相互增强彼此的结合能力，进一步表明ENAP1和ABI5共同作用调节基因表达（图4A-4C）。值得注意的是，ENAP1和ABI5都与ABI5基因的启动子结合，ENAP1也促进了ABI5的基因表达（图5C和5H以及S5A-S5C图），表明涉及正反馈调控。-厦门杂志期刊论文发表
支持信息
数据和统计测试摘要。
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S1 图通过人工RNAi和CRISPR / Cas9产生enap1功能丧失突变体。
(A） qRT-PCR 显示ENAP1ox品系中ENAP1的转录水平。从在1/2 MS上发芽的种子中提取总RNA36h。数据表示平均± s.d.将ENAP1ox品系的表达水平与未配对双尾t检验的Col-0进行比较。P < 0.0001。（B） Col-0和ENAP1ox种子在不同浓度ABA下的发芽率。Col-0和ENAP1ox #1的种子在1/2 MS上发芽，补充乙醇（模拟）或2μM ABA，发芽速率为3第三分层后的第二天进行分析。数据表示三个重复的平均± s.d.。每次复制至少使用60个种子。使用不成对的双尾t检验来比较ABA浓度下ENAP1ox与Col-0的发芽率。P < 0.0001。（C） ENAP1在amiR-ENAP1敲低线中的相对表达。从两个独立系的10d幼苗中分离出总RNA。（D 和 E）在模拟（D）和2μMABA（E）处理下，enap1敲低线的发芽率。每12h记录一次发芽的种子，直到分层后120h。数据表示三个重复的平均± s.d.。每个副本至少包含 60 个种子。（F） ENAP1基因和蛋白质示意图。上图代表ENAP1基因，下图代表蛋白质。上图中的红色实线显示了通过CRISPR/Cas9生成的eanp1-1和enap1-2中的缺失。下图中的彩色形状表示蛋白质基序。（G） 凝胶电泳显示enap1中的缺失。enap1-1的删除率为 146bp，enap1-2 的删除率为 30bp。 （H） Sanger 测序以显示enap1-1和enap1-2中的缺失。（I） RT-PCR显示剩余ENAP1在enap1-1和enap1-2中的表达。从10d幼苗中提取总RNA。UBQ10被用作对照。
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S2 图表征ENAP1蛋白响应ABA的变化。
(A）ENAP1蛋白在种子发芽过程中响应ABA而改变。从ENAP1ox种子中提取总蛋白，在模拟或2μMABA处理下发芽指定时间。抗HA用于检测ENAP1蛋白，RPT5作为负载控制。（B） 在ABA处理下，Tomtom基序比较工具识别的前10个基序相关的TF的时间序列转录变化。使用10μM（±）-ABA或乙醇处理的3d龄Col-0幼苗的总RNA用于测序文库构建。（C）包括ABI5结合基序在内的基因数量的分布。在TSS上游1kb处，利用FIMO软件对ABA和ENAP1上调控的485个基因进行ABI5结合基序搜索。发现263个基因至少有一个ABI5结合基序，P<0.01。
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S3 图ENAP1 不与 ABF 交互。
指示的结构被共同转化为酵母。左图：在选择性三液滴培养基上生长的酵母，以测试ENAP1和ABF之间的相互作用;右图：酵母生长在两个液滴培养基上作为对照。
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S4 图ENAP1 参与 ABA 响应。
(A） 显示 ENAP1 和 ABI5 绑定配置文件的热图。绘制了ENAP1和ABI5共靶向基因TS上游1kb和TTS下游1kb之间的区域。（B） ENAP1和ABI5共靶向基因的GO分析。（C） Westernblot显示种子发芽过程中ABI5和ENAP1蛋白水平的变化。将ENAP1ox和ENAP1ox/abi5-1的分层种子在指定时间内发芽，并进行总蛋白提取。抗HA和抗ABI5用于检测ENAP1和ABI5。H3用作装载控制。
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S5 图四个具有代表性的靶基因显示ENAP1和ABI5结合。
(A）IGV将ENAP1和ABI5结合到ABI5、AtEM1、LEA4-1和REV3的启动子区域。 显示绑定峰值的虚线框。短实线表示 ChIP-qPCR 中使用的引物。图6D和6E中的ABI5使用了两个引物（P1和P2）。（B 和 C）ChIP-qPCR验证ENAP1（B）和ABI5（C）与代表性基因启动子的结合。从pENAP1中分离出基因组DNA：：ENAP1：YFP / Col-0种子在1/2 MS上发芽24小时，并补充2μM ABA。IgG被用作免疫沉淀基因组DNA的阴性对照。数据表示三个重复的平均± s.d.。将ENAP1或ABI5浓缩与具有不成对双尾t检验的IgG富集进行比较。P < 0.0001。（D） Westernblot在abi5-10突变体中显示ABI5蛋白。从Col-0和abi5-10的种子中分离出总蛋白，这些种子在有或没有2μM ABA存在的情况下发芽24小时。RPT5 被用作装载控制。（E） 蛋白质印迹显示pEANP1中的 ENAP1 蛋白水平 ：：ENAP1-YFP/abi5-10.用抗GFP探针从种子中分离出的种子在模拟或2μM ABA处理下发芽24 h的总蛋白质。星号表示非特异性波段。CBB染色作为装载控制。-厦门杂志期刊论文发表
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009955.s007
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S6 图ENAP1增强H3Ac和H3K9Ac对靶基因启动子的沉积。
(A-E）ChIP-qPCR显示H3Ac（A），H3K9Ac（B），H3K14Ac（C），H3K18Ac（D）和H3K27Ac（E）在ABI5，AtEM1，LEA4-1和REV3的启动子区域的富集率，在1/2 ± MS上发芽24小时。 将ENAP1ox中的组蛋白乙酰化富集与Col-0与未配对的双尾t检验进行比较。*P < 0.05;** P < 0.01;P < 0.001。
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确认
我们感谢Mona Mehdy赠送abi5-1种子，感谢Liang Song赠送abi5-10种子。我们感谢Enamul Huq为CRISPR/Cas9载体构建提供pHEE401和pDT1T2载体。我们感谢王仁厚赠送了BiFC矢量。我们感谢张帆对ChIP测定的建议。我们感谢魏宗对实验设置的建议。我们感谢Nancy Vega的工厂和实验室维护。
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