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《田间采集猪口鼻分泌物作为标本进行日本脑炎病毒病毒学监测的可行性-厦门杂志期刊论文发表》

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《田间采集猪口鼻分泌物作为标本进行日本脑炎病毒病毒学监测的可行性-厦门杂志期刊论文发表》期刊在线投稿系统

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《田间采集猪口鼻分泌物作为标本进行日本脑炎病毒病毒学监测的可行性-厦门杂志期刊论文发表》期刊简介

田间采集猪口鼻分泌物作为标本进行日本脑炎病毒病毒学监测的可行性-厦门杂志期刊论文发表

· 邱贤松，

· 陈乔梅，

· 陈毅英，

· 谢敏元，

· 范毅

· 出版日期： 2021年12月03日

抽象

过去，日本脑炎病毒（JEV）的病毒学监测依赖于收集猪血标本和成年蚊子。从猪血标本中提取的病毒RNA通过逆转录PCR（RT-PCR）检测阳性率低。该病毒的口鼻传播已在实验感染的猪中得到证实。这一观察结果表明，口鼻标本可能是病毒监测的有用来源。然而，这种不寻常的传播途径的作用在运营中的养猪场中仍未得到证实。在这项研究中，我们探讨了使用通过咀嚼绳索收集的猪口鼻分泌物来提高商业养猪场检测阳性的可行性。本研究使用多重基因型特异性RT-PCR来确定和比较在猪口鼻分泌物和血液标本以及主要蚊子载体中检测JEV病毒RNA的阳性率。尽管所有血源性标本均为阴性（n = 2442），但口鼻样本在传播期间对JEV的总体阳性率为6.0%（95%CI 1.3%-16.6%）（3/50%）（3/50）。有趣的是，从同一养猪场采集的猪口鼻分泌物和雌性三角龙库蚊样本显示出相似的病毒RNA阳性率，分别为10.0%（95%CI 2.1%-26.5%）（3/30）和8.9%（95%CI 2.5%-21.2%）（4/45），分别（p>0.05）。基于猪口鼻分泌物的监测揭示了病毒活动的季节性，并鉴定出来自蚊子分离株的密切相关的基因型I型病毒。这一发现表明，基于口鼻分泌的RT-PCR检测可能是一种非侵入性的替代方法，用于在病毒阳性蚊子传播之前在流行地区实施JEV监测。

作者简介

蚊媒日本脑炎病毒（JEV）在亚洲和澳大利亚有地方性或季节性传播模式。大多数被病毒感染的宿主仍然没有症状，但可导致人类和马匹的严重脑炎，以及怀孕母猪的流产或死产。在成年蚊子或猪血清转换中分离病毒已被用作即将在人类中暴发的日本脑炎的早期指标。病毒的基因型鉴定很重要，因为目前的人类和家畜疫苗都是基因III型（GIII）特异性的。GIII疫苗引发的免疫力降低了对GIII以外基因型的交叉保护。我们使用猪口鼻分泌物的病毒学监测分别检测到比使用猪血和蚊子更高的患病率和更早的基因I型病毒活性。这项拟议的监测工具可能更有效，使公共卫生机构能够适当实施预防措施，例如实施蚊虫控制，鼓励加强疫苗接种，并鼓励使用驱蚊剂，以减少即将爆发的疫情的影响。收集猪的口鼻分泌物对猪没有侵入性，对操作人员的技术要求也较低。因此，我们建议使用猪口鼻分泌物作为病毒学监测标本的新来源，以取代传统的猪血或成年蚊子标本，以监测和控制未来的日本脑炎爆发/流行。

数字

引文：Chiou S-S， Chen J-M， Chen Y-Y， Chia M-Y， Fan Y-C （2021）田间采集猪口鼻分泌物作为日本脑炎病毒病毒病毒学监测标本的可行性。PLoS Negl Trop Dis 15（12）：e0009977。https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009977

编辑器：格雷戈里·格罗莫夫斯基， WRAIR，美国

收到：八月 13， 2021;接受：十一月5，2021;发表：十二月 3， 2021

数据可用性：所有相关数据均在稿件及其支持信息文件中。所有序列都可以根据其加入号从国家生物技术信息中心的数据库资源中下载。本研究中使用的所有序列的加入号都在S1表中。

资金：这项工作得到了台湾科技部（https://www.most.gov.tw/?l=en）的支持，根据MOST 108-2313-B-002-007和MOST 109-2314-B-002-163-MY3到YCF和MOST 106-2313-B-005-050-MY3到SSC。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

相互竞争的利益：作者宣布不存在相互竞争的利益。

介绍

日本脑炎病毒（JEV）是一种人畜共患的蚊子传播的黄病毒。大多数病毒感染仍然无症状，但可导致死胡同宿主（如人类和马）的严重脑炎，以及妊娠母猪流产或死产[1]。据估计，每年有68，000例人类脑炎病例，病死率为20-30%，30-50%的幸存者患有神经系统后遗症[2]。目前尚无针对日本脑炎的特异性治疗。疫苗接种被认为是减轻人类和母猪的日本脑炎负担的最有效策略[2，3]。

JEV可以在热带地区全年传播，也可以在亚洲和澳大利亚的温带地区引起季节性暴发[4]。最近有报道称该病毒可能向非洲和意大利扩展 [5–7]。该病毒主要在6-7月在猪和三毛茛库蚊之间传播，传播到人类和马后传播减少[1]。与人类病例相关的猪JEV感染率在亚洲流行地区被普遍接受[8，9]。经典监测确定猪的血清转换或血清阳性率，以监测流行或流行地区的病毒活动[10，11]。人类暴发通常在50%的猪血清转换后1至2个月开始[10，12]。由于猪病毒血症持续时间短，病毒血症或病毒RNA阳性率很少使用[13，14]。因此，与猪血标本相比，收集蚊子样本进行病毒学监测的频率更高[15]。热视阳性蚊子出现于首例人类病例的更早或同月[12，16]。因此，目前的监测使用猪血清转换或JEV阳性蚊子作为即将到来的人类流行季节的早期指标[1]。

系统发育将JEV分离株分为五种基因型。每种基因型都有一个独特的，有时重叠的地理分布[4]。对病毒的系统发育分析表明，基因I型（GI）病毒取代了基因III型（GIII）病毒，并说明了亚洲流行地区新兴GI病毒的地理扩张[17，18]。然而，GII、GIII和GIV病毒分别在新加坡、菲律宾和印度尼西亚流行[19，20]。新出现的胃肠道病毒已被证明它能够增强实验感染猪的复制，并且对当前GIII疫苗诱导的抗体不太敏感[21]。这表明猪的分子监测和基因型跟踪对于提供控制JEV的重要信息至关重要。基于猪的血清阳性率研究对于日本北海道等地区仍然至关重要，在没有证据表明循环的JEV阳性蚊子的情况下，在猪中观察到高血清阳性率[22]。

实验感染的猪证明，JEV可以在猪扁桃体中持续25天，并通过比病毒血症持续时间更长的口鼻途径传播给幼稚的共同居民[13，23–26]。这些研究表明，猪口鼻标本可用于JEV监测。较长的病毒持久性可能会克服基于猪血的监测中病毒血症短暂的问题。然而，这种不寻常的传播途径在农场饲养的猪中的作用仍未得到证实。本研究旨在评估和比较使用猪口鼻分泌物，猪血标本和蚊子样本的分子监测性能。

方法

道德声明

我们从一个从分娩到完成的农场收集了猪的口鼻样本，该农场是半开放的，自然通风，周围环绕着稻田。该实地研究方案已获得国立台湾大学医学院和公共卫生学院机构动物护理和使用委员会的批准（方案号：20180260）。-厦门杂志期刊论文发表

样品收集和处理

繁殖母猪每年在台湾接受日本脑炎疫苗接种，因此我们根据之前的研究，从12周龄以上的仔猪身上采集了血液和口鼻标本，这些仔猪具有检测不到的JEV特异性母体抗体[27]。血液标本于2009年从台中运营的养猪场或2010年和2014年的猪屠宰场收集。在以3，000rpm离心15分钟后，从含有终浓度为0.33%柠檬酸钠（Sigma-Aldrich）的血液样品中回收血浆和外周血单核细胞（PBMC）。从2018年4月到2020年4月，我们从台中运营的养猪场收集了12周以上未接种疫苗的仔猪[27]和雌性三尖锥虫的口鼻分泌物。我们在可高温高压灭菌的塑料袋中准备了50厘米的无漂白棉绳（直径2厘米）。在高压灭菌器中灭菌后，将绳索干燥并在室温下冷却。我们为每支猪圈每8至10头猪提供一根咀嚼的无菌棉绳，咀嚼10-15分钟。我们通过拧干绳索从咀嚼的棉绳中收获口鼻分泌物，并在4°C下以4，500 rpm离心10分钟后收集上清液。每月在不同的围栏内收集80至100头猪的猪口鼻分泌物。我们每月收集一次蚊子，与口鼻样本收集相吻合，从2018年5月至2018年11月，2019年5月至2019年7月，以及2019年9月至2020年1月。从下午5：00到晚上8：00，养猪场附近的蚊子被光圈捕获，并将50只雌性三角库蚊汇集到一个管中。所有标本均储存在?80°C冰箱中直至使用。

多重基因型特异性逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

我们提取了病毒RNA并进行了RT-PCR，如前所述[28，29]。简而言之，通过使用病毒RNA提取试剂盒（Viogene）并遵循制造商提供的方案，从血浆，PBMC和猪口鼻分泌物的上清液中提取病毒RNA，并匀浆化库蚊三甲烯蜈香蚊子。使用上标III逆转录酶（Invitrogen）将回收的病毒RNA反向转录成随机六聚体引发的cDNA。JEV多重PCR在GoTaq预混液（Promega）中使用GI特异性，GIII特异性和JEV通用引物进行[29]。

系统发育分析

如前所述，我们用JEV引物扩增和测序了病毒包膜（E）基因[28]。在系统发育分析中使用包膜蛋白（1，500 nt）的完整核苷酸序列。采用最大似然法和一般时间可逆模型对系统发育树进行了推断。使用 1，000 个引导复制评估了树拓扑的可靠性。这种进化分析是在MEGA X [30]中进行的。

统计学

计算了JEV和二项式精确95%可信区间（CI）的口鼻分泌物和蚊子的阳性率，并使用Fisher精确测试与R版本4.0.5（https://www.R-project.org/）进行比较。

结果

使用多重RT-PCR检测农场饲养猪血浆和PBMC中的JEV RNA

我们进行了一项纵向研究，以监测2009年3月至8月期间在运营养猪场饲养的18头仔猪的JEV感染情况，每两周一次。在日本脑炎传播和非传播季节，共分别采集了154份和72份血浆或PBMC标本（表1）。我们用多重基因型特异性RT-PCR[29]测试了所有标本，发现所有标本均为阴性。然而，这些猪在2009年6月被血清转换（S1图），并且在之前的研究中描述了这一观察结果的一部分，当时在同一农场发现了JEV阳性的蚊子[28]。为了增加识别病毒血症猪的可能性，我们在台湾台中市的猪屠宰场收集了血液标本[10]。2010年和2014年，从一家猪屠宰场共采集了550份血浆样本和1390份PBMC样本。同样，我们发现所有收集的血浆和PBMC标本在RT-PCR下都是阴性的，无论何时在JEV传播或非传播季节进行收集（表1）。我们之前的研究在2010年与猪屠宰场位于同一地区的养猪场中发现了JEV阳性蚊子[28]。这些结果表明，基于血浆和PBMC的RT-PCR检测猪中JEV感染的阳性率较低。

表 1.在台湾台中市的一家养猪场和一家猪屠宰场采集的猪血浆和PBMC标本中检测JEV。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009977.t001

现场采集的口鼻分泌物与血液样本作为猪中JEV RNA检测来源的比较

先前的研究表明，在实验感染的猪中，JEV的口鼻脱落[13，23]。这些研究表明，猪口鼻分泌物可用于JEV监测的潜力。我们首先通过对从操作农场收集的猪口鼻分泌物进行多重JEV基因型特异性RT-PCR来验证这种潜力。JEV RT-PCR能够从传播季节收集的两个口鼻样本中扩增GI特异性产物（图1）。我们随后比较了在养猪场使用口鼻分泌物和血液标本进行RT-PCR的性能和阳性，台中，2018年。我们观察到6.0%（95%CI 1.3%-16.6%）（3/50）的口鼻样本呈病毒阳性，而血液样本中的所有阴性结果（表2）。这些结果表明，在农场饲养的猪中，使用口鼻分泌物的RT-PCR比血液标本更敏感。

表 2.从养猪场采集的猪口鼻分泌物和血浆中JEV的检测，台湾台中市，2018年。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009977.t002

野外采集口鼻分泌物与蚊池的比较，以确定台湾JEV的季节性

三牛库蚊是养猪场的主要媒介，也是最常见的蚊子[16]。JEV特异性RT-PCR是检测病毒RNA和确定JEV季节性的最常用方法。表2表明，对于基于RT-PCR的分子监测，口鼻分泌物比猪血更好的病毒RNA来源。因此，我们进一步比较了使用口鼻分泌物和雌性三苜蓿库蚊的分子检测的积极性和性能，以确定运营养猪场中JEV的季节性（表3）。在日本脑炎传播期间，胃肠道病毒于5月首次在猪口鼻分泌物中被发现，但没有证据表明存在循环的热视阳性蚊子。到6月，该病毒出现在猪口鼻分泌物和蚊子池中。猪口鼻分泌物的总体阳性率为10.0%（95%CI 2.1%~26.5%），与蚊子池中的8.9%（95%CI 2.5%~21.2%）（p>0.05）相当。与使用蚊子标本相比，使用猪口鼻分泌物的病毒学监测可能更早地检测到JEV活性。-厦门杂志期刊论文发表

表 3.从台湾台中市收集的猪口鼻分泌物和雌性三尖线虫蚊子池中JEV的检测。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009977.t003

在从养猪场收集的口鼻分泌物中检测到的JEV的季节性

预测即将到来的日本脑炎季节的传统监测由猪血清转换和病毒阳性蚊子池决定[1]。用于收集猪口鼻分泌物的咀嚼绳是一种非侵入性、有效的方法。在这里，我们旨在评估使用这种方法通过JEV基因型特异性RT-PCR检测病毒RNA以取代传统监测方法的潜力。口鼻分泌物在2018年4月至2020年4月期间每月从运营的养猪场收集（图2）。在这25个月期间，猪的口鼻分泌物在2018年6月[10%（95%CI 2.1%-26.5%），3/30]，2019年5月[20%（95%CI 2.5%-55.6%），2/10]和2019年6月[10%（95%CI 0.3%-44.5%），1/10]为病毒RNA阳性。从剩余的22个月中收集的标本是病毒RNA阴性。该结果表明，JEV季节分别于2018年和2019年5月或6月开始。从7月到次年4月，猪口鼻分泌物中的病毒恢复到检测不到的水平。也观察到JEV活动的季节性，并与猪血清转换重合（S1图）。

下载：

图 2.台湾养猪场中JEV阳性猪口鼻分泌物的季节性，2018-2020。

阳性率的计算方法是将JEV阳性笔（分子）的数量除以接受标本收集的笔的总数（分母）。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009977.g002

使用猪口鼻分泌物的JEV系统发育

猪血、蚊子和人源性JEV的系统发育分析表明，该分析在确定传播周期、病毒流行性和基因型扩展方面具有实用性[4，15，17，19]。在这项研究中，我们确定了14个病毒RNA阳性集合（6个来自口鼻分泌物，8个来自蚊子池）（S1表）。如前所述，我们扩增、测序和分析了所有14个病毒阳性标本的E蛋白序列[28]。所有14个病毒阳性集合被分类，并通过系统发育分析分为密切相关的GI亚群I（subI）和II（subII）（图3和S2）。口鼻分泌序列和蚊子来源序列之间密切的系统发育关系支持养猪场维持猪和蚊子之间的胃肠道病毒循环。本研究中检测到的病毒与2009-2012年台湾分离株的相关性更接近于最近来自其他亚洲国家的JEV分离株。该证据支持JEV在台湾流行。

下载：

Fig 3. Maximum-likelihood tree of JEV detected in pig oronasal secretions (empty triangle) and mosquitoes (filled circle) in Taiwan, 2018–2019, and reference E gene for phylogeny.

The bootstrap value (%) ≥70 is indicated on the node. Scale bar indicates the number of substitutions per site. The source, country, and year of isolation is noted in parentheses. M, mosquito; P, pig; H, human. GI-V, genotype I-V; SubI and SubII, subcluster I and II.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009977.g003

Discussion

猪-蚊子-猪周期是维持亚洲和澳大利亚流行地区JEV循环的主要机制（1）。新出现的胃肠道病毒显示增强的病毒复制，并降低了对疫苗诱导的猪中和抗体的敏感性[21，27]。因此，监测猪的JEV基因型循环和进化非常重要。然而，由于猪的病毒血症时间短且血清阳性率较高，JEV分离株经常从蚊子中发现，特别是在日本脑炎流行地区[13– 15，19，23]。以往使用猪血标本的病毒学监测报告称，哨猪阳性率为3.4%（1/29），随机选择猪的阳性率为0.5%（5/945）[14，19]。这些研究进行了10天的短出血间隔或在进行RT-PCR之前在细胞中扩增标本。在没有事先扩增的情况下，我们的研究表明，在病毒传播季节，猪口鼻分泌物中胃肠道分泌物的患病率高于猪血样[18头哨猪的6%（95% CI 1.3%-16.6%）至10%（95%CI 2.1%-26.5%）（95%CI 0%-2.3%）（1143头随机选择猪）]。口鼻脱落时病毒的持续时间更长，比感染猪的2-3天病毒血症长6天[13，23]。我们能够从血清阳性或阴性口鼻分泌物中检测到病毒（S2表）。这一观察结果可能是由于即使在血清转换后病毒仍在猪扁桃体中继续复制[23]，因此，表明口鼻分泌可能会增加在流行区血清反应阳性猪中检测JEV的阳性[19]。同样，在JEV确诊病例中，人咽拭子检测日本脑炎病毒RNA的阳性率高于脑脊液和血清标本[31]。同一属的病毒，如登革热和寨卡病毒，也可以在人类呼吸道标本中检测到[32，33]。与收集猪的血液标本相比，收集口鼻分泌物的咀嚼绳方法需要较少的技术需求，并且对猪的压力较小。

猪口鼻分泌物和蚊子监测都揭示了JEV GI病毒在当前和台湾先前研究中的相同季节性[16]。我们发现该病毒比蚊子更早出现在猪的口鼻分泌物中。检测到JEV阳性口鼻分泌物的出现与台湾2018年和2019年首例确诊的人间病例相吻合（从台湾疾病控制中心国家传染病统计系统获得;https://nidss.cdc.gov.tw/en/）。

基因型鉴定对于两种或多种基因型共同传播的地区非常重要，因为目前的人类和家畜疫苗都是GIII特异性的[34–37]。GIII疫苗引发的免疫力对GIII以外的基因型的保护作用较小[38]。系统发育也可用于监测病毒的流行、引入和扩增[5，19，39]。我们的数据显示，猪的口鼻分泌提供了与在养猪场附近收集的蚊子相似的病毒学信息[16]。我们的研究还表明，口鼻分泌和蚊子病毒是台湾基因型替代发生后系统发育密切相关的胃肠道病毒[16，28，40]。蚊子监测需要繁琐的工作来收集、分类和分离充血的雌性三重库蚊，以提高监测效果[16]。相比之下，使用咀嚼绳收集猪口鼻分泌物的病毒学监测可以在传播周期开始时（台湾的4月，5月和6月）进行，并广泛适用于许多养猪场。此外，与收集鼻拭子的物理限制猪相比，这种方法在技术上要求较低，对猪造成的压力也较小[13，23]。口服液已被用作常规监测其他猪呼吸道疾病的标本[41]。因此，口鼻分泌物可能有助于常规JEV监测，特别是对于流行地区，例如日本北海道，在那里识别流行的病毒阳性蚊子一直非常具有挑战性[22]。然而，蚊子监测在某些地区仍然至关重要，例如新加坡，那里的养猪业尚未得到广泛实施[20]。

通过系统发育分析确定的密切相关病毒在时间和地点上的聚类支持了本研究中病毒的本土传播，以及在寒冷月份蚊子数量低而冬季无法检测到JEV阳性蚊子的流行国家[4，16，17]。实验证明，受感染的猪在血清转换后，JEV仍可在扁桃体中持续25天[13，23]。已怀疑持续感染和口鼻传播可维持热肠结肠炎越冬。然而，我们仅在5月和6月在运营养猪场进行为期两年的监测期间观察到口鼻传播。这种传播方式对于支持温带地区JEV GI越冬可能不太重要。商业养猪的运营模式，全包管理实践，可以防止病毒在猪群中的持续存在。应进一步验证病毒在农场饲养的血清阳性猪扁桃体中的持久性。此外，可能需要进行全面的生态学研究，以确定流行国家JEV的越冬机制。

我们得出结论，猪的口鼻分泌物是基因型特异性RT-PCR病毒学监测的理想标本。它是一种非侵入性且技术要求较低的替代猪血和蚊子池，用于JEV分子监测。我们的结论受到样本量不足的限制，无法估计血液样本中的病毒阳性率，以及从运营中的养猪场收集的口鼻分泌物和蚊子的小样本量。未来，我们计划增加从猪场收集标本的数量，这些标本正在进行产仔到完成操作。使用口鼻分泌物进行抗热脱酮抗体检测（如IgA）或日本脑炎疫苗评估的可行性需要进一步研究。-厦门杂志期刊论文发表

支持信息

2018-2019年在台湾养猪场检测到的GI JEV菌株。

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S1 表。2018-2019年在台湾养猪场检测到的GI JEV菌株。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009977.s001

（文档）

S2 表。JEV RT-PCR阳性和阴性猪口鼻分泌物对胃肠道病毒的中和活性一个.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009977.s002

（文档）

S1 图2009年台湾养猪场18头哨猪的血清转化率。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009977.s003

（TIF）

S2 图2018-2019年在台湾猪口鼻分泌物（空三角形）和蚊子（填充圆圈）中检测到的JEV E基因最大似然树。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009977.s004

（TIF）

确认

我们感谢你嘉钦、黄元清、黄成英和高成宇帮助收集猪口鼻分泌物和蚊子。

引用

00001. 1.van den Hurk AF， Ritchie SA， Mackenzie JS.日本脑炎病毒的生态学和地理扩张。Annu Rev Entomol.2009;54:17–35.pmid：19067628

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