细胞竞争由Xrp1介导的真核起始因子2α的磷酸化驱动-厦门杂志期刊论文发表
· 大地直孝，
· 中村舞，
· 永田丽娜，
· 若狭直树，
· 中野凉介，
· 伊垣县
· 出版日期： 2021年12月06日
抽象
细胞竞争是通过细胞 - 细胞相互作用进行上下文依赖的细胞消除，当面对更健康的细胞（"赢家"）时，不合适的细胞（"失败者"）从组织中消除。尽管进行了广泛的研究，但驱动失败者死亡的机制及其生理触发因素仍然难以捉摸。在这里，通过果蝇的遗传筛选，我们发现内质网（ER）应激引起细胞竞争。从机制上讲，ER应激上调bZIP转录因子Xrp1，其通过激酶PERK促进真核翻译起始因子eIF2α的磷酸化，从而导致细胞消除。令人惊讶的是，我们的遗传数据显示，不同的细胞竞争触发因素，如核糖体蛋白突变或RNA解旋酶Hel25E突变，收敛于Xrp1的上调，这导致eIF2α的磷酸化，从而导致全球蛋白质合成的减少和面对野生型细胞的凋亡。这些发现不仅揭示了细胞竞争的核心途径，而且还为理解细胞竞争的生理触发因素开辟了道路。
作者简介
细胞竞争是一种进化保守的质量控制过程，当与生长组织中的更健康的细胞（"赢家"）共存时，选择性地消除活的不合适细胞（"失败者"）。失败者突变体的一个共同特征是蛋白质合成速率降低。最近的研究表明，bZIP转录因子Xrp1导致核糖体蛋白质突变体失败者的蛋白质合成减少，而Xrp1减少蛋白质合成的机制仍然未知。在这里，通过果蝇中的遗传筛选，我们发现导致ER应激的突变使细胞在被野生型细胞包围时失败。从机制上讲，经历ER的细胞上调Xrp1，其通过激酶PERK促进真核翻译起始因子eIF2α的磷酸化，从而减少全局蛋白质合成并诱导细胞死亡。至关重要的是，这种机制还驱动由核糖体蛋白或Hel25E突变引发的细胞竞争，这两者都会导致蛋白质合成速率降低。我们的研究结果表明，细胞竞争通常由Xrp1介导的eIF2α磷酸化驱动，而ER应激或其他环境应激激活综合应激反应信号，其收敛于eIF2α的磷酸化，可能是细胞竞争的生理触发因素。
引文：Ochi N，Nakamura M，Nagata R，Wakasa N，Nakano R，Igaki T （2021） 细胞竞争是由Xrp1介导的真核起始因子2α的磷酸化驱动的。PLoS Genet 17（12）：e1009958。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009958
编辑 器：诺伯特·佩里蒙，哈佛医学院，霍华德休斯医学研究所，美国
收到：四月 17， 2021;接受：十一月 19， 2021;发表：十二月 6， 2021
版权所有：? 2021 Ochi et al.这是一篇根据知识共享署名许可协议条款分发的开放获取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。
数据可用性：所有相关数据均在稿件及其支持信息文件中。-厦门杂志期刊论文发表
资金：这项工作得到了MEXT / JSPS KAKENHI（批准号20H05320，21H05284和21H05039）对日本医学研究开发机构T.I（阐明和控制衰老和长寿机制的项目;授予编号20gm5010001）给T.I，武田科学财团给T.I，内藤财团给T.I。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
相互竞争的利益：作者宣布不存在相互竞争的利益。
介绍
细胞竞争是一种进化保守的质量控制过程，当与生长组织内的更健康的细胞（"赢家"）共存时，选择性地消除活的不健康细胞（"失败者"）[1-3]。例如，在核糖体蛋白基因中具有杂合突变的细胞，称为Minute/+（M /+）突变，可以自行存活，但是当被野生型细胞包围时，它们会从果蝇假想上皮中消除[4]。类似地，果蝇细胞纯合突变为麻将/VprBP（Mahj）[5]或RNA解旋酶Helicase25E（Hel25E）[6]是可自行存活的，但在面对野生型细胞时被细胞凋亡所消除。其他一些因素也导致果蝇的细胞竞争，包括癌基因Myc的高级表达[7，8]，JAK-STAT或Wnt / Wg信号传导活性升高[9，10]，河马途径失活[11]，以及蜂基 - 基底细胞极性丧失[12，13]。然而，细胞竞争的生理触发因素仍不清楚。
果蝇的一项遗传学研究已经确定，碱性亮氨酸拉链结构域（bZIP）转录因子Xrp1对于驱动M/ +细胞竞争至关重要[14]。Xrp1在M/+细胞克隆中被上调，并导致其细胞死亡[15] [16]。有趣的是，M/ +细胞也需要Xrp1上调来降低蛋白质合成水平[15]。然而，Xrp1如何减少蛋白质合成以及它如何导致失败者死亡的机制仍然未知。我们最近发现，与M/+克隆类似，与邻近的野生型赢家[6]相比，Hel25E或Mahj突变克隆等失败者克隆降低了蛋白质合成水平，这表明蛋白质合成的减少与输家死亡的诱导之间存在潜在的机制联系。
在各种应激条件下，细胞通过激活综合应激反应（ISR）信号来适应环境，这是一种进化保守的细胞内信号网络，可恢复细胞稳态[17，18]。这些应激包括内质网 （ER） 应激、营养剥夺、病毒感染和氧化应激。应力由四种专门的激酶（PERK，GCN2，PKR和HRI）感知，它们收敛于真核翻译起始因子2（eIF2α）的α亚基的磷酸化。例如，在ER中积累未折叠的蛋白质后，ER驻留的伴侣BiP / Hsc70-3从PERK中释放出来，导致eIF2α激酶PERK的同源二聚化和活化。eIF2α磷酸化导致全局蛋白质合成减少，同时允许翻译选定的基因，包括激活转录因子4（ATF4）[17，19]。四种eIF2α激酶中的两种，PERK和GCN2，在果蝇中是保守的，它们分别被ER应激和氨基酸剥夺激活[20]。ER应激是由各种细胞内因素引起的，这些因素导致ER中未折叠蛋白质的积累，这导致未折叠蛋白质反应（UPR）信号传导的激活以恢复ER功能。在果蝇UPR途径中，PERK磷酸化eIF2α，从而抑制全局蛋白质合成以降低ER容量的负担，而需要内切核糖酶肌醇的酶-1（Ire1）通过特定的mRNA剪接激活转录因子Xbp1，这导致各种基因的上调，有助于恢复ER功能[19，21]。
在这里，通过果蝇的遗传筛选，我们发现导致ER应激的突变使细胞在被野生型细胞包围时成为细胞竞争的失败者。从机制上讲，ER应激以及其他细胞竞争触发因素（如M/ +和Hel25E突变）上调Xrp1，其通过PERK促进eIF2α的磷酸化，从而导致蛋白质合成减少和细胞死亡诱导。我们的数据表明，ER应激或其他激活ISR信号传导的环境胁迫，收敛于eIF2α的磷酸化，可能是细胞竞争的生理触发因素。-厦门杂志期刊论文发表
结果
ER应激导致细胞竞争
为了研究细胞竞争的机制和生理触发因素，我们在果蝇中进行了大规模的基于甲磺酸乙酯（EMS）的遗传筛选，以分离导致细胞竞争的突变。使用Flippase（FRT）/ Flp识别靶点（FLP）介导的遗传镶嵌技术，我们在果蝇眼触角盘的野生型组织中诱导纯合突变克隆，并在约12，500条突变染色体中分离出87个细胞竞争诱导（ccp）突变，这些染色体是细胞存活的，但在面对野生型细胞时被消除[6]（将在其他地方发表）。有趣的是，在这些ccp突变体中，我们的全基因组测序分析发现了几个突变系，这些突变系在涉及ER应激的基因中具有突变。例如，互补基团ccp-2、ccp18和ccp-29突变系在伸长复合蛋白3（Elp3）（S1A图）中携带无意义或火焰移位突变，这是一种赖氨酸乳糖基转移酶，其功能丧失被证明可以激活UPR信号传导[22]。 ccp-21携带钙网蛋白的无意义突变（S1A图），这是一种ER伴侣，其突变被证明会导致ER应激和UPR[23]。此外，ccp28在基因wolknaeuel（wol）（S1A Fig）中携带无意义突变，这是一种多利基磷酸葡萄糖基转移酶，参与ER中的N连锁蛋白糖基化。 鉴于明确的细胞竞争表型，我们随后将分析重点放在ccp28突变体上。
· 当被野生型克隆（红色）包围时，在眼盘中产生的ccp28突变克隆（白色）在发育过程中被消除（图1A和1B），而ccp28的眼睛完全突变发育成几乎正常大小（图1C），表明当面对野生型细胞时，ccp28细胞的上下文依赖性消除。半胱天冬酶抑制剂p35的过表达抑制了眼盘中ccp28克隆的消除（图1D，1E和1F，在图1H中量化）。 此外，ccp28突变克隆在眼盘和翼盘中突变型和野生型克隆之间的边界处诱导细胞死亡（图1I，1J，1J'和S1B，在图1K中量化）。在ccp28突变克隆中Wol被过度表达的拯救实验强烈抑制了它们的消除，而Wol过表达本身并不影响组织生长（图1G，在图1H中量化）。这些数据表明，当面对野生型细胞时，wol突变体的克隆作为细胞竞争的失败者被淘汰。
图 1.ER应激引起细胞竞争。
（A 和 B）成年眼睛携带eyFLP诱导的野生型（A）或沃尔马赛克ccp-28-/-（B） 克隆。（C） 成人眼袋ccp-28-/-克隆，其周围野生型组织被GMR隐藏和细胞致死突变去除。（D-G）眼盘携带eyFLP诱导的野生型（D）的MARCM克隆，wolccp-28-/-（E），沃尔ccp-28-/-+ UAS-p35 （F） 电池或电池ccp-28-/-+ UAS-wol （G） 电池。（H）定量D-G中显示的GFP标记克隆的相对大小。误差线， 标清;p<0.001 通过 Steel-Dwass 测试。（I-J'）带有UbxFLP诱导的野生型（I）或狼的MARCM克隆的翼盘ccp-28-/-（J）用防裂Dcp-1染色。J 中插图的放大图像以 J' 显示。（K）定量野生型和狼型边界处的死亡细胞数量ccp-28-/-机翼盘中的克隆。误差线， 标清;p<0.001 由韦尔奇的 t 检验。（L 和 M）眼盘承载eyFLP诱导的UAS-Xbp1-GFP（L）或WOL的MARCM克隆ccp-28-/-+ 用抗 GFP 染色的 UAS-Xbp1-GFP （M） 细胞。比例尺，50μm。详见S1文本，了解详细的基因型。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009958.g001
与之前的报告[24]一致，wol突变克隆诱导了Xbp1的特定mRNA剪接，Xbp1是ER应激的标志物[25]，如Xbp1-GFP报告者所可视化的那样（图1L和1M）。此外，其他失败者突变体的克隆，ccp-2（Elp3）或ccp-21（钙网蛋白），也升高了Xbp1-GFP信号（S1C和S1D图）。狼眼的尺寸略小（图1C）可能是由于整个眼盘的ER应力广泛增加（S1E图）。有趣的是，在整个wol眼盘中，细胞死亡没有显着增加（S1F图），这表明较小的眼睛是由于ER应激升高引起的生长缺陷。总之，这些数据表明，当被野生型细胞包围时，引起ER应激的细胞克隆被细胞竞争所消除。-/--/-
细胞竞争由eIF2α的磷酸化驱动
接下来，我们研究了失败者细胞中ER应激的后果。正如预期的那样，免疫染色分析显示，大多数wol突变克隆会升高eIF2α的磷酸化（图2A，在图2C中量化），这是UPR激活的迹象[25]。通过敲低上游激酶PERK（图2B，在图2C中量化）来取消wol克隆中的eIF2α磷酸化。引人注目的是，阻断PERK也显著抑制了wool克隆的消除（图2B，与图2A相比，在图2D中量化），而PERK本身的敲低并不影响组织生长（图2D）。通过敲低另一种eIF2α激酶GCN2[26]（S2A图），没有观察到这些效应，表明wool克隆通过UPR途径的激活被消除。当另一个wol突变等位基因wol的纯合克隆时，观察到类似的 PERK 依赖性消除和 eIF2α 磷酸化升高1 [24]，分别进行了分析。鉴于已知eIF2α磷酸化会减少全球蛋白质合成，我们使用O-炔丙基嘌呤霉素（OPP）标记测定法分析蛋白质合成速率[27]。事实上，与野生型邻居相比，wol克隆表现出蛋白质合成的减少（图2E），这被PERK敲低（图2F）取消。这些数据表明，WOL克隆中PERK介导的eIF2α磷酸化导致蛋白质合成减少和细胞竞争诱导。-厦门杂志期刊论文发表
图 2.细胞竞争是由eIF2α的磷酸化驱动的。
（A 和 B）眼盘承载eyFLP诱导的马尔克姆克隆ccp-28-/-（A） 或wolccp-28-/-+ 用抗磷酸化eIF2α染色的PERK-RNAi（B）细胞。（C）A和B所示克隆中抗磷酸化eIF2α染色的相对强度的定量。p<0.001 通过邓内特测试。（D） 量化A和B中所示的GFP标记克隆的相对大小。p<0.001 由韦尔奇的 t 检验。（E 和 F）眼盘承载eyFLP诱导的马尔克姆克隆ccp-28-/-（E） 或wolccp-28-/-+ 用OPP标记染色的PERK-RNAi（F）细胞。比例尺，50μm。详见S1文本，了解详细的基因型。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009958.g002
ER 应激上调 Xrp1，从而导致 PERK 介导的 eIF2α 磷酸化
到目前为止，我们提出的数据表明M/ +和ER应激诱导的细胞竞争之间存在有趣的相似性，因为M/ +输家细胞也表现出蛋白质合成减少[15]。已经表明，M/+克隆中转录因子Xrp1的上调对于减少蛋白质合成及其细胞死亡至关重要[15]。因此，我们分析了Xrp1在ER应激诱导的细胞竞争中的作用，并有趣地发现Xrp1表达在Xrp1-lacZ报告者[15]（图3A）可视化的wol克隆中升高。 此外，在wool克隆中敲低Xrp1显着抑制了它们的消除（图3B，在图3C中量化），而单独敲低Xrp1不影响组织生长（图3C）。引人注目的是，Xrp1敲低也阻断了wol克隆中eIF2α的磷酸化（图3B"，与图2A"相比，在图3D中量化）。另一方面，wol克隆中的Xrp1敲低没有抑制Xbp1-GFP信号（S3A图），表明在没有Xrp1的情况下仍然会发生ER应力。这些数据表明，ER应激上调Xrp1，导致eIF2α磷酸化，从而减少蛋白质合成。事实上，wol克隆中的Xrp1敲低抵消了蛋白质合成的减少（图3E）。此外，Xrp1的过表达足以诱导eIF2α的磷酸化（图3F，与图3H中量化的S4A图相比;S4C 图）。此外，Xrp1诱导的eIF2α磷酸化被PERK敲低取消（图3G，与S4B图相比，在图3H中量化;S4D图）。总之，这些数据表明ER应激上调Xrp1，这导致PERK介导的eIF2α磷酸化，从而导致蛋白质合成和细胞消除的减少。
图 3.ER应激上调Xrp1，导致PERK介导的eIF2α磷酸化。
（A） Xrp1-lacZ/+眼盘携带 eyFLP 诱导的 MARCM克隆ccp-28-/-沾有抗β- gal。（B） 眼盘携带eyFLP诱导的马尔克姆克隆体ccp-28-/-+ 用抗磷酸化eIF2α染色的Xrp1-RNAi细胞。（C） 量化A和B所示的GFP标记克隆的相对大小。p<0.001 由韦尔奇的 t 检验。（D）定量A和B所示克隆中抗磷酸化eIF2α染色的相对强度。p<0.001 由韦尔奇的 t 检验。（E） 眼盘携带eyFLP诱导的马尔克克隆体ccp-28-/-+ Xrp1-RNAi细胞用OPP标记染色。（F 和 G）眼盘承载eyFLP诱导的UAS-Xrp1的MARCM克隆短（F） [46] 或 UAS-Xrp1短+ 用抗磷酸化eIF2α染色的PERK-RNAi（G）细胞。（H）定量F，G和图4B所示的克隆中抗磷酸化eIF2α染色的强度。误差线， 标清;p<0.001 通过 Steel-Dwass 测试。比例尺，50μm。详见S1文本，了解详细的基因型。-厦门杂志期刊论文发表
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Xrp1介导的eIF2α磷酸化通常推动细胞竞争
最后，我们询问Xrp1介导的UPR途径激活是否在其他因素引发的细胞竞争中也起着关键作用。为此，我们研究了两种不同的细胞竞争模型，即消除RpL14 / +突变克隆（M / +细胞竞争）[28]和Hel25E突变克隆[6]，与野生型获胜者相比，两者都表现出蛋白质合成减少。如前所述[15，16]（图4A和4B，在图4D中量化），并且值得注意的是，PERK敲低（图4C，图4D中量化）显着抑制了RpL14/+克隆中RpL14/+克隆的消除。 此外，通过敲低Hel25E克隆中的Xrp1或PERK，也强烈抑制了从眼盘中消除Hel25E克隆（图4E，4F和4G，图4H中量化）。这些数据表明，Xrp1-PERK途径在这些细胞竞争模型中也起着关键作用。
图 4.Xrp1-PERK途径通常是细胞竞争所必需的。
（A-C）翼盘带有hsFLP诱导的RpL14 / +，salE>GFP（A），RpL14 / +，salE> GFP + Xrp1-RNAi（B）或RpL14 /+，salE> GFP + PERK-RNAi（C）细胞的GFP标记克隆。（D）A-C中所示GFP标记克隆的相对大小的定量。误差线， 标清;p<0.001 通过邓内特测试。（电子-G）带有eyFLP诱导的Hel25E（E），Hel25E + Xrp1-RNAi（F）或Hel25E + PERK-RNAi（G）细胞的MARCM克隆的眼盘。 （H）量化E-G中所示的GFP标记克隆的相对大小。误差线， 标清;p<0.001 通过 Steel-Dwass 测试。比例尺，50μm。详见S1文本，了解详细的基因型。-/--/--/-
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009958.g004
然后，我们检查了这些细胞竞争模型中发生的信号传导事件。与上述数据一致，Xrp1表达和eIF2α磷酸化在RpL14/+和Hel25E突变克隆中均显著上调（图5A、5B、5C和5D，在图5E、5F、5G和5H中定量）。 在失败者克隆中，Xrp1表达的诱导没有被PERK敲低（S5A和S5B图，在图5E和5G中量化）抑制，表明Xrp1在这些克隆中作用于PERK的上游。另一方面，当PERK或Xrp1在这些失败者克隆中被击倒时，eIF2α磷酸化的升高被消除（图5I，5J，5K和5L，在图5F和5H中量化）。总之，这些数据表明，诱导细胞竞争的不同因素通常会激活Xrp1-PERK-eIF2α轴，从而导致蛋白质合成减少和诱导失败者细胞凋亡。
图 5.Xrp1介导的eIF2α磷酸化通常驱动细胞竞争。
（A-A"）Xrp1-lacZ/+ 背景翼盘，带有 hsFLP 诱导的 RpL14/+、salE>GFP 细胞克隆，用抗β-gal 染色。（B-B"）野生型背景翼盘，带有hsFLP诱导的RpL14 / +的GFP标记克隆，用抗磷酸化eIF2α染色的salE>GFP细胞。（C-C"）Xrp1-lacZ/+背景眼盘，带有eyFLP诱导的Hel25E-/-细胞的MARCM克隆，用抗β-gal染色。（D-D"）野生型背景眼盘携带eyFLP诱导的Hel25E-/-细胞的MARCM克隆，用抗磷酸化eIF2α染色。（E） 量化A和S5.A.中所示克隆中抗β-gal染色的强度。p<0.001 由韦尔奇的 t 检验。（F）B-D所示克隆中抗磷酸化eIF2α染色强度的定量。误差线， 标清;p<0.001 通过邓内特测试。（G） 量化E和S5所示克隆中抗β-gal染色的强度.B误差条，SD;p<0.001 通过邓内特测试。（H）定量F-H所示克隆中抗磷酸化eIF2α染色的强度。误差线， 标清;p<0.001 通过邓内特测试。比例尺，50μm。（I-I"）野生型背景翅盘，带有hsFLP诱导的RpL14 / +的GFP标记克隆，salE>GFP + PERK RNAi细胞用抗磷酸化eIF2α染色。（J-J"）野生型背景翼盘，带有hsFLP诱导的RpL14 / +，salE>GFP + Xrp1 RNAi细胞的GfP标记克隆，用抗磷酸化eIF2α染色。（K-K"）野生型背景眼盘携带eyFLP诱导的Hel25E-/- + PERK RNAi细胞的MARCM克隆，用抗磷酸化eIF2α染色。（L-L"）野生型背景眼盘携带eyFLP诱导的Hel25E-/- + Xrp1 RNAi细胞的MARCM克隆，用抗磷酸化eIF2α染色。详见S1文本，了解详细的基因型。-厦门杂志期刊论文发表
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009958.g005
讨论
我们的遗传数据显示，Xrp1介导的eIF2α磷酸化在驱动由M/+突变，Hel25E突变或ER应激引发的细胞竞争中起着关键作用。已经表明，与野生型赢家相比，M/+或Hel25E诱导的细胞竞争中的失败者细胞通常表现出较低的蛋白质合成水平，但它们减少蛋白质合成的机制仍然未知[15，29]。我们目前的数据提供了一个机制解释，即它是由eIF2α磷酸化对翻译的全局抑制引起的。
重要的是，我们的数据显示，eIF2α磷酸化也是诱导失败者死亡所必需的。同样，最近的研究表明，M/ +细胞经历蛋白质毒性应激，从而诱导eIF2α的磷酸化，其作为M/+细胞竞争的驱动因素[30–33]。蛋白质合成的全局抑制或eIF2α磷酸化的其他下游事件（例如UPR激活转录因子ATF4的上调）是否与其凋亡有关，这是一个突出的重要问题。值得注意的是，Xrp1被认为是哺乳动物CHOP的功能同源物，这是一种由ATF4诱导的转录因子[29]。我们一致地发现，PERK的过度表达会导致Xrp1表达的上调（S6图）。此外，最近的研究表明，PERK或ATF4的过表达会上调Xrp1 [32，34]。这些观察结果表明，Xrp1在正反馈回路中同时作用于PERK-eIF2α轴的上游和下游。上游Xrp1可以通过PERK表达的上调来激活PERK-eIF2α轴[33]。或者，Xrp1上调可能导致ER应激，从而诱导PERK激活。这些也是今后研究中应解决的重要问题。
澄清Xrp1-PERK-eIF2α轴与迄今为止报道的其他细胞竞争调节剂之间的机制关系也很重要，其中包括自噬[6]，Toll相关受体信号传导[28，35]，Flower[36]和Azot[37]。此外，在未来的研究中了解Xrp1如何通常被不同的细胞竞争触发器上调是至关重要的。尽管如此，我们目前的研究确定了一个关键的信号转导轴，该轴通过Xrp1的上调将各种细胞应激信号传导收敛到共同的细胞竞争途径。
虽然对果蝇的研究已经发现了细胞竞争的几个触发因素和细胞消除所必需的下游分子[1]，但动物体内细胞竞争的生理触发因素仍然未知。我们的基因筛选确定了一系列导致ER应激的突变作为细胞竞争的触发因素。ER应激是由在生理和病理条件下通过各种细胞内因素在ER中积累未折叠或错误折叠的蛋白质诱导的[38–41]，导致进化保守的PERK-eIF2α途径的激活[19，42]。PERK-eIF2α通路也被细胞外在因素（如氨基酸剥夺、葡萄糖剥夺、缺氧和病毒感染）触发的保守ISR信号传导激活。此外，Xrp1表达是由基因毒性应激诱导的，例如辐照[43]。因此，我们发现Xrp1-PERK-eIF2α轴通常驱动细胞竞争，这为理解细胞竞争的生理和病理作用开辟了道路。有趣的是，与肌萎缩性侧索硬化症（ALS）相关的肉瘤融合（FUS）基因突变引起ER应激[40]，果蝇FUS直系cabeza与Xrp1遗传相互作用[41]。此外，已经证明细胞竞争在神经退行性疾病中起作用[44，45]，这些疾病被认为是由ER应激驱动的。对Xrp1-PERK-eIF2α信号传导的生理和病理调节的进一步研究将揭示细胞竞争的体内作用。
材料和方法
苍蝇品系和克隆的产生
除非另有说明，否则将果蝇黑色素ogaster菌株在含有标准玉米粉 - 蔗糖 - 酵母食品的小瓶中培养，保持在25°C。在大多数假想椎间盘研究中解剖的幼虫的性别没有区别。使用以下菌株在幼虫假想盘中产生荧光标记的有丝分裂克隆（MARCM克隆）;使用以下菌株在幼虫假想盘中产生：tub-Gal80，FRT40A;eyFLP6， Act>y+>Gal4， UAS–GFP （40A tester）， eyFLP1， UAS-Dicer2;Tub-Gal80， FRT40A;Act>y+>Gal4， UAS-GFP （40A Dicer2 tester） 和 Tub-Gal80， FRT40A;UAS-His2AmRFP， eyFLP6， Act>y+>Gal4 （40A RFP tester）.使用以下测试菌株生成RpL14/+细胞的克隆：hs-FLP，UAS-GFP：：CD8;米RpL14， salE>gRpL14>Gal4/TM6B （L. Johnston）.允许苍蝇产卵6小时。取出亲蝇，48小时后在37°C下对幼虫后代进行热休克，并在72小时后使用荧光双目或共聚焦显微镜进行分析以进行克隆测量。使用的其他菌株如下： PERK - RNAi （ # GL00030 ）， UAS - wol （ FlyORF # F003019 ）， UAS - dcr2 （ Bloomington # 24650 ）， UAS - Xbp1 - GFP （ Bloomington # 60731 ）， Xrp1 - RNAi （ Bloomington # 34521 ）， Xrp1 - lacZ （ Bloomington # 11569 ）， UAS - Xrp1 （ FlyORF # F000655 ）， UAS - Xrp1短 [46]， Gcn2-RNAi （BDSC #35355）， UAS-CD8-PARP-Vinus （Bloomington #65609）， wol1 [24]和UAS-GFP（BDSC）。
CCP突变体的基因筛查
对于ccp突变体的遗传筛查，携带同源FRT40A染色体的雄性苍蝇（w / Y;FRT40A）被喂给25mM EMS，然后配给w;Kr/CyO 雌性。基因型FRT40A*/CyO的单个F1雄性分别杂交到4-5名基因型eyFLP1的雌性;Ubi-GFP， FRT40A/CyO （40A Ubi-GFP tester）.分析了白色突变细胞的克隆区域与F2眼中红色色素野生型细胞（非CyO成蝇）的克隆区域作为主要筛选。在二级筛选中，使用GMR-hid，FRT40A，l（2）Cl-L' / CyO去除突变细胞周围的野生型细胞;ey-Gal4 UAS-FLP（40A CL测试仪）应变。-厦门杂志期刊论文发表
全基因组测序
根据标准苯酚-氯仿方法或核旋组织XS（MACHEREY-NAGEL）从25-40只反式杂合成蝇中提取基因组DNA。在Illumina Hi-Seq 4000或Next Seq 500上进行30×覆盖率的150-bp配对端测序。使用BWA-MEM算法（Burrows-Wheeler Aligner）将序列读数映射到dm6参考基因组（UCSC版本dm6），并根据基因组分析工具包（GATK）最佳实践（Broad Institute，http://www.broad.mit.edu）进行校准。遗传变异信息由GATK中的HaplotypeCaller获得。EMS诱导的突变通过亲本菌株（"突变体"）背景和果蝇遗传学参考小组（DGRP）数据库序列进行区分。然后由SnpEff根据BDGP6.85参考基因组对突变进行注释和分类。
抗体染色
将游荡的三龄幼虫解剖并在室温下用4%多聚甲醛固定20 min，并用5%驴血清和0.1%Triton X-100溶液封闭20 min。对于免疫染色，将样品与一抗在4°C下孵育过夜，然后在室温下与Alexa Fluor 405-，488-，546-或647偶联二抗（1：200，赛默飞世尔科技）一起孵育2小时。使用以下一抗：兔抗裂果蝇DCP1（细胞信号传导技术，1：100），兔抗磷酸化-eIF2α（细胞信号传导技术，1：100），兔抗GFP（Nacalai Tesque，1：250），鸡抗β-gal（Abcam，1：1000），抗裂PARP抗体（细胞信号传导技术，1：200）。
蛋白质合成分析
使用Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 647蛋白质合成检测试剂盒（赛默飞世尔科技）分析新生蛋白质合成。在施耐德含有5%FBS（赛默飞世尔科技）的培养基中解剖游荡的L3幼虫，并在20μM OPP中孵育10分钟。在OPP掺入后，幼虫在室温下固定在4%多聚甲醛中20分钟，随后按照制造商的手册检测OPP。
图像分析
用SP8徕卡共聚焦显微镜拍摄共聚焦图像。使用 ImageJ 软件 （NIH） 计算每个光盘的总克隆面积/光盘 （%）。
统计分析
R（版本4.1.1）用于数据绘图和统计分析。原始数据显示为点阵图。显著性水平设置为 p < 0.05。通过韦尔奇的t检验通过单次比较对数据进行分析。通过Steel-Dwass检验或Dunnett检验对数据进行多重比较。统计评估的细节和样本数量在图例中标明。条形图中的所有数据均表示为均值±SD。没有使用统计方法来预先确定样本量。所有n个数字都代表生物重复。每个实验至少独立进行三次。所有实验均未随机化或盲法。在图5E–5H中，测量了GFP阳性细胞与GFP阴性细胞中Xrp1-lacZ或p-eIF2α信号的相对强度。
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ER stress underlies several different genetic contexts of cell competition.
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S1 图ER应激是细胞竞争的几种不同遗传背景的基础。
（A）引起ER应激的分离ccp突变体列表，以及Elp3，Calr和Wol的一般结构域结构的示意图，以及全基因组测序检测到的突变。（B） 眼盘中含有eyFLP诱导的mCD8-PARP-Vinus-exprssing wol的MARCM克隆ccp-28-/-用抗裂PARP染色的细胞（检测半胱天冬酶激活的死亡细胞）。（C）携带eyFLP诱导的Elp3[ccp-2]克隆（左图）或Elp3[ccp-2]克隆的成年眼睛嵌合物，其周围的野生型组织被GMR隐藏和细胞致死突变（中间图）去除。带有eyFLP诱导的Elp3[ccp-2]的MARCM克隆（RFP）的眼盘+ 用抗GFP染色的UAS-Xbp1-GFP细胞（右图）。（D）携带eyFLP诱导的Calr[ccp-21]克隆（左图）或Calr[ccp-21]克隆的成年眼睛嵌合物，其周围的野生型组织被GMR隐藏和细胞致死突变去除（中间图）。带有eyFLP诱导的CALR的MARCM克隆（RFP）的眼盘[ccp-21] + 用抗GFP染色的UAS-Xbp1-GFP细胞（右图）。比例尺，50μm。（E） 野生型（左）或狼-/--/--/--/--/--/-ccp-28-/-（右）眼盘承载UAS-Xbp1-GFP。在两种组织中，野生型或狼ccp-28-/-在眼盘中诱导克隆，然后通过GMR隐藏和细胞致死突变去除周围的野生型组织。比例尺，50μm。（F） 野生型（左）或狼ccp-28-/-（中间）眼盘沾有抗裂Dcp-1。在两种组织中，野生型或狼ccp-28-/-在眼盘中诱导克隆，然后通过GMR隐藏和细胞致死突变去除周围的野生型组织。比例尺，50μm。（右）定量野生型或沃尔型中垂死细胞的数量ccp-28-/-眼盘。误差线， 标清;p<0.001 由韦尔奇的 t 检验。详见S1文本，了解详细的基因型。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009958.s001
（TIF）
S2 图GCN2既不是eIF2α磷酸化所必需的，也不是细胞竞争所必需的。
（A） 眼盘携带eyFLP诱导的马尔克克隆体ccp-28-/-+ 用抗磷酸化eIF2α染色的Gcn2-RNAi细胞。定量GFP标记克隆的相对大小或抗磷酸化eIF2α染色的相对强度，如A所示。p<0.001 由韦尔奇的 t 检验。比例尺，50μm。详见S1文本，了解详细的基因型。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009958.s002
（TIF）
S3 图Xrp1敲低不会抑制由wol突变引起的ER应激。
（A） 眼盘携带eyFLP诱导的马尔克克隆体ccp-28-/-+ Xrp1-RNAi + UAS-Xbp1-GFP细胞染色抗GFP。详见S1文本，了解详细的基因型。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009958.s003
（TIF）
S4 图Xrp1 引起 PERK 介导的 eIF2α 磷酸化。
（A）带有eyFLP诱导的UAS-GFP细胞的MARCM克隆的眼盘，用抗磷酸化的eIF2α染色。（B）带有eyFLP诱导的用抗磷酸化eIF2α染色的PERK RNAi细胞的MARCM克隆的眼盘。（C） 翼盘过表达 GFP， Xrp1短在机翼袋中，由nub-Gal4驱动器染色，用抗磷酸化eIF2α染色。（D） 翼盘过表达 GFP，Xrp1飞行器（FlyORF：F000655）在机翼袋中由nub-Gal4驱动器染色，上面涂有抗磷酸化eIF2α。比例尺，50μm。详见S1文本，了解详细的基因型。-厦门杂志期刊论文发表
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009958.s004
（TIF）
S5 图Xrp1表达在PERK的上游诱导。
（A）Xrp1-lacZ/+背景翼盘，带有hsFLP诱导的RpL14 / +的GFP标记克隆，salE>GFP + PERK-RNAi细胞用抗β-gal染色。（B）Xrp1-lacZ/+背景眼盘，带有eyFLP诱导的Hel25E + PERK RNAi细胞的MARCM克隆，用抗β-gal染色。比例尺，50μm。详见S1文本，了解详细的基因型。-/-
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009958.s005
（TIF）
S6 图PERK 诱导 Xrp1 表达。
（A） Xrp1-lacZ/+ 背景翼盘在机翼袋中过度表达 GFP，由沾有抗β-gal 的nub-Gal4驱动器制成。（B） Xrp1-lacZ/+ 背景翼盘过度表达 GFP，PERK 在机翼袋中由nub-Gal4驱动器沾染有抗β-gal。比例尺，50μm。详见S1文本，了解详细的基因型。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009958.s006
（TIF）
S1 文本。每个图中使用的详细基因型。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009958.s007
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确认
我们感谢 Y . Noguchi ， K . Baba ， M . Tanaka ， M . Koijima ， M . Matsuoka 和 K . Gomi 的技术支持， N . Baker ， P . Leopold ， M . Mannervik ， HD . Ryoo ， T . Uemura ， Bloomington Drosophila Stock Center ， National Institute of Genetics Stock Center （ - FLY ）， Drosophila Genomics and Genetic Resources （ DGGR ，京都库存中心）和维也纳果蝇 苍蝇种群和试剂资源中心（VDRC），T. Kondo，Y Sando和京都大学生物研究研究生院的NGS核心设施，用于全基因组测序。我们还感谢Y. Sanaki，H. Kanda和Igaki实验室成员的讨论。
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