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《使用基于PCR的方法在热休克蛋白70（I型）基因的3′未翻译区域上分子鉴定两种新发现-沈阳医学论文发表》

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《使用基于PCR的方法在热休克蛋白70（I型）基因的3′未翻译区域上分子鉴定两种新发现-沈阳医学论文发表》期刊简介

使用基于PCR的方法在热休克蛋白70（I型）基因的3′未翻译区域上分子鉴定两种新发现的引起利什曼病的人类病原体

· 纳里萨拉·贾里亚潘，

· 米歇尔?贝茨，

· 保罗·贝茨

· 出版日期： 2021年11月30日

抽象

基于PCR的扩增热休克蛋白70（I型）基因（HSP70-I）的3′未翻译区域（3′-UTR）的方法以前曾用于利什曼原虫的分型，但不适用于利什曼原虫（Mundinia）马提尼克病和L。（蒙迪尼亚）东方，新发现的人类病原体。这里，L的HSP70-I的 3′-UTR 。马提尼克岛， L.东方人和其他10个物种被测序和分析。针对HSP70-I的3′-UTR进行PCR限制性片段长度多态性（RFLP）分析。此外，将HSP70-I-3′-UTR PCR方法的检测限与另外两个常用靶标进行比较：18S小亚基核糖体RNA（SSU-rRNA）基因和rRNA（ITS1-rRNA）基因的内部转录间隔1区。结果表明，HSP70-I-3′-UTR PCR方法可用于鉴定和鉴别L。马提尼克病（480–2 bp）和L。 orientalis（674 bp），并将它们与Viannia亚属和利什曼原虫亚属的寄生虫区分开来。用BsuRI限制性内切酶消化的HSP70-I片段的3′-UTR的PCR-RFLP图谱成功分化L。马提尼克岛， L.东方， L.巴西人， L.圭亚那 = L.帕纳曼西斯， L.墨西哥 = L.埃塞俄比亚 = L.热带， L.亚马逊， L.主要和L。多诺瓦尼= L.婴儿。对于检测限，HSP70-I-3′-UTR PCR方法可以检测L的DNA。马提尼克和L。东方人具有相同浓度，1 pg / μL，与SSU-rRNA PCR水平相似。扩增ITS1-rRNA的PCR比HSP70-I -3′-UTR PCR更敏感（0.01pg/ μL）。然而，SSU-rRNA和ITS1-rRNA PCR扩增子的大小无法区分L。马提尼克和L。东方 .这是第一份使用基于HSP70-I-3′-UTR PCR的方法鉴定泰国利什曼病寄生虫的报告。此外，BsuRI-PCR-RFLP方法可用于区分其他亚属中的某些物种。

作者简介

L.马提尼克岛和L.新发现的人类病原体东方利什曼病分别引起HIV阴性患者的内脏利什曼病和皮肤利什曼病。然而，这两种寄生虫都会引起HIV阳性患者中伴有内脏利什曼病的播散性皮肤利什曼病。利什曼病中的物种分型在诊断、流行病学和临床研究中非常重要。我们在这里表明，HSP70-I区域的3′-UTR是基于PCR鉴定和L之间鉴别的合适靶标。马提尼克和L。东方 .该技术易于执行，可以在所有可用PCR的环境中实施。在具有相似PCR产物大小的物种中，HSP70-I片段的3′-UTR的BsuRI-PCR-RFLP模式可用于区分其他亚属中的某些物种。然而，如果物种鉴定至关重要，或者有泰国境外的旅行史，建议对HSP70-I-3′-UTR产物或类似的鉴别靶序列进行测序。本研究中使用的基于PCR的方法也适用于鉴定从载体和储层获得的利什曼原虫物种。

引文：Jariyapan N，Bates MD，Bates PA（2021）使用基于PCR的方法在热休克蛋白70（I型）基因的3′未翻译区域上对两种新发现的引起利什曼病的人类病原体进行分子鉴定。PLoS Negl Trop Dis 15（11）：e0009982。https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009982

编辑器：Syamal Roy，CSIR-印度化学生物学研究所，印度

收到：七月 15， 2021;接受：十一月5，2021;发表：十一月 30， 2021

数据可用性：所有相关数据均在稿件及其支持信息文件中。

资金：新泽西州得到了人力资源与机构发展，研究与创新项目管理部门 - 朱拉隆功大学[拨款编号B16F630071]和泰国科学研究与创新（TSRI）基金[拨款编号CU_FRB640001_01_30_1]的财政支持，https://www.chula.ac.th/en/和https://www.tsri.or.th/。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

相互竞争的利益：作者宣布不存在相互竞争的利益。

介绍

利什曼病是泰国一种新出现的疾病。迄今为止，泰国已经报道了两种利什曼原虫：L.（Mundinia）马提尼克病[1]和L。（蒙迪尼亚）东方 [ 2]。有一篇关于L的报告。婴儿，但这可能是一个输入性病例[3]。L的临床体征。马提尼克病感染包括HIV感染和免疫功能正常的患者的皮肤利什曼病和内脏利什曼病[1，4]。一例L.在一名免疫功能正常患者中，东方利什曼病表现为单纯性皮肤利什曼病，在HIV感染患者中，另外两种表现为播散性皮肤/内脏利什曼病[2]。

确定利什曼原虫感染的物种对于临床管理、治疗和流行病学非常重要。虽然症状可能有很大的重叠，但每个物种都会引起自己的疾病表现谱，需要自己的支持措施，并且预后不同。例如，L.主要和L.热带病在大多数患者中均可引起皮肤利什曼病，在北非和中东的许多地区可同时发生，但流行病学不同[5]。L. major起源于人畜共患，皮肤病变感染通常会消退，而L。热带病往往发生在由人类传播驱动的流行病中，病变更持久或更容易激活（利什曼病复发）。另一个例子是中美洲和南美洲的皮肤利什曼病，其中L引起的感染。亚马逊和L.巴西人可以发生在相同的地区，但感染的后果可能非常不同。亚马逊利什曼病主要引起单纯的皮肤利什曼病，但也可能进展为伴有多个病变的播散性皮肤利什曼病，而L。巴西人有时会进展为破坏性皮肤黏膜疾病[6，7]。

尽管多年来培养寄生虫的多位点酶电泳（MLEE）是利什曼原虫物种鉴定的最佳方法[8]，但这是一个耗时的过程，需要大规模寄生虫培养。然而，更关键的是，现在已经很明显，具有明显相同酶表型的菌株可以具有不同的氨基酸序列，并且假定的杂合表型也难以解释[9]。因此，MLEE已被PCR和DNA测序等分子方法所取代，这些方法具有更灵敏，更快速和更容易执行的潜力。结果可在数天内获得，而不是数周或数月，并且在测序的情况下，为所有研究人员提供永久记录。到目前为止，已有几种靶基因用于PCR和测序方法中用于利什曼原虫物种鉴定，例如SSU-rRNA基因[10]，RNA聚合酶II基因[11]，DNA聚合酶α基因[12]，gp63基因[13]，细胞色素氧化酶II基因[14，15]，剪接领导者迷你外显子基因[16]，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）基因[17] ]、热休克蛋白70（HSP70）基因[18]、18S核糖体RNA[19]、半胱氨酸蛋白酶b（cpb）基因[20]、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶基因[21]、SSU-rRNA基因[22、23]的内部转录间隔物1（ITS1）区、细胞色素b（细胞b）基因[24]、7SLRNA基因[25]和磷酸三糖异构酶（tim）基因[26]。

对于在泰国发现的物种，到目前为止，只有一种基于PCR的方法，使用一对用于微圆运动质体DNA的引物[27]，用于区分L。马提尼克从'L.siamensis' （MHOM/TH/2010/TR）（syn. L.），但PCR产物的大小无法将这些寄生虫与其他亚属区分开来[28]。2012年，Requena及其同事分析了PCR扩增后代表11种利什曼原虫物种的24个菌株的利什曼原虫HSP70型I型（HSP70-I）基因的3'未翻译区域（3'UTR）[29]。观察到引物靶标中有足够的序列保护，能够扩增利什曼原虫亚属和维亚尼亚亚属物种的DNA。HSP70-I基因的这个特定区域似乎有可能通过直接可视化不同大小的PCR扩增产物来区分利什曼原虫亚属[29]。本研究的主要目的是利用HSP70-I基因的3′UTR区来鉴定和诊断L。马提尼克和L。东方人，从而将物种范围扩大到Mundinia亚属[30]，并包括在泰国发现的物种。除直接PCR外，还进行了HSP70-I-3′-UTR限制性片段长度多态性（HSP70-I-3′-UTR PCR-RFLP）以研究该方法鉴定利什曼原虫物种的潜力。此外，将HSP70-I-3′-UTR PCR的检测限与另外两个广泛使用的靶标SSU-rRNA基因和rRNA基因的ITS1的检测限进行了比较。

材料和方法

道德声明

该研究得到了朱拉隆功大学医学院伦理委员会的批准（IRB编号：051/64）。本研究未提供患者信息。

寄生虫分离物和培养

如前所述[1]，以下物种分离物在体外作为前鞭毛虫生长：L. aethiopica （LV546）;亚马逊L.巴西栉水母（U1096）;L.多诺瓦尼（LV9）;L.圭亚那（M4147）; L.婴儿（JPC）;L.大调（FV1）;L. martiniquensis （LSCM1， LSCM2， LSCM3， LSCM5， LEM2494）;L. mexicana （M379）;L. orientalis （LSCM4）;L. panamensis （LS94）;L.热带（LV357）.

脱氧核糖核酸的分离

根据制造商的说明，使用QIAamp DNA Mini Kit（德国希尔登Qiagen）提取利什曼原虫物种和人类血液DNA。使用Nano Drop分光光度计（ND-1000模型，Fisher Scientific，Loughborough，UK）测量DNA浓度。

聚合酶链反应和测序

使用引物70-IR-D（5'-CCAAGGTCGAGGAGGTCGACTA -3'）和70-IR-M（5'-ACGGGTAGGGGGGAAAGA-3'）[29]使用引物进行HSP70-I-3′-UTR扩增，使用校对DNA聚合酶（Qiagen HotStar HiFidelity Polymerase，Qiagen，USA）进行。在50μL的最终体积中进行PCR，其中每个引物含有50 pmol，10μL5X Qiagen PCR缓冲液，1μL DNA聚合酶和1μL（40pg）每个DNA模板，使用以下扩增循环：95°C2分钟，然后在95°C下循环30次，持续30秒， 62.5°C持续30秒，72°C持续1分钟20秒，最后在72°C下延伸5分钟[29]。蒸馏水作为阴性对照。在1.5%琼脂糖凝胶上分离预期的PCR产物扩增子，用GelRed染色（赛默飞世尔科技，英国拉夫堡），并使用GelDoc成像系统（英国剑桥紫外产品有限公司）进行可视化。使用PCR纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific，英国拉夫堡）纯化PCR产品，并使用商业服务（英国剑桥的Source Bioscience Sequencing）直接测序，并使用Chromas Lite 2.1.1（http://technelysium.com.au/）检查质量。使用ClustalOmega（http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/）进行序列比对。

计算机限制分析

在对HSP70-I基因的3′-UTR序列的预测BsuRI限制性片段进行计算机分析时，使用限制性映射器版本3（www.restrictionmapper.org/）进行，并且手动确定理论片段大小。手动分析HSP70-I基因3′-UTR中的微卫星分布。

聚合酶链反应-射频低密度脂蛋白分析

如上所述，针对HSP70-I基因的3′-UTR序列进行PCR扩增。PCR产品根据制造商的说明用限制性内切酶BsuRI（赛默飞世尔科技波罗的海UAB，立陶宛维尔纽斯）消化。布苏RI是HaeIII的异裂子，以前曾用于通过PCR-RFLP[16，18]分析利什曼原虫，两者都切割靶序列GGCC。通过3%琼脂糖凝胶电泳分析消化产物的模式。GeneRuler 100 bp DNA 分子量标准品（Thermo Fisher Scientific Baltics UAB，立陶宛维尔纽斯）被用作 DNA 大小标记。用GelRed染色凝胶（赛默飞世尔科技，英国拉夫堡），并使用GelDoc成像系统（英国剑桥Ultra-Violet Products Ltd.）进行可视化。

PCR 方法的检测限

制备提取的利什曼原虫DNA的十倍连续稀释液，以产生100，000的标准浓度;10,000;1,000;100;10;1;0.1;0.01;0.001;和 0.0001 pg/μL。为了模拟检测从血液或组织样本中提取的寄生虫DNA的真实情况，从血液中提取的浓度为18 ng / μL的人类DNA被用作利什曼原虫DNA的10倍稀释系列的背景DNA和稀释剂。将每种浓度的1微升用作最终体积为25μL的PCR扩增的DNA模板。每次PCR反应含有100，000至0.0001 pg的利什曼原虫DNA和19.8ng的人DNA。如上所述，对HSP70-I基因的3′-UTR序列进行PCR，并将这些结果与其他两个常用的鉴定靶标进行比较，如下所示。利什曼原虫特异性引物R221（5'-GGTTCCTTTCCTTTTAGC-3'）和R332（5'-GGCCGGTAAAGGCCGAATAG-3'）用于扩增18S rRNA基因的一个区域，产生603 bp的产物[31，32]。底漆（5′-CCAAGTCATCCATCGCGACACG-3′)和 LeF （5′-TCCGCCCGAAAGTTCACCGATA-3′）用于扩增rRNA基因的内部转录间隔物1区（ITS1），产生379 bp的产物[22]。为了确认存在标准浓度的背景人类DNA通用引物UNFOR403（5'-TGAGGACAAATAATTCTGAGG-3'）和UNREV1025（5'-GGTTGTCCTCCAATTCATGTTA-3'）来扩增人类DNA[33]。PCR产品在1.5%琼脂糖凝胶上运行，用GelRed染色（赛默飞世尔科技，英国拉夫堡），并使用GelDoc成像系统（紫外线产品有限公司，英国剑桥）进行可视化。

评估临床样品中DNA的测定

为了对直接从临床样品中提取的DNA进行PCR测定，从唾液，血液和L的皮肤中提取的六个DNA样品。马提尼克病病例[34，35]被使用。

结果

***利什曼原虫HSP70-I*基因3′-UTR区域的PCR扩增和测序**

70-IR-D和70-IR-M引物用于扩增来自泰国北部五种先前表征的利什曼原虫分离株的HSP70-I-3′-UTR DNA。其中四个是L。马提尼克病（LSCM1，LSCM2，LSCM3，LSCM5）和所有这些在琼脂糖凝胶电泳上产生约480 bp的条带，类似于参考分离物LEM2494（S1图）。另一个分离物是L。orientalis （LSCM4; Reference Isolate）.它产生了约670 bp的带子。对5种泰国分离株的PCR产物进行测序。L的四个分离株的序列。马提尼克吻合并显示出高度相似性，并且参考分离物LEM2494（99.5-100%同一性）（S2图）。

除此之外，HSP70-I-3′-UTR PCR产物来自其他10种利什曼原虫：L. 亚马逊， L.巴西人， L.多诺瓦尼， L.圭亚那人， L.婴儿， L.大调， L.墨西哥， L.帕纳门西斯和L。热带.这些PCR产物的大小各不相同，但都可以与L的小~480 bp乘积明显区分开来。使用凝胶电泳的马提尼克病（图1）。L的 ~670 bp 乘积。东方人的大小也与其他物种不同，但仅通过电泳很难区分。尧亚属的寄生虫（L.巴西人， L.圭亚那和L.帕纳曼西斯）生产的产品约为550-630 bp，而利什曼原虫亚属的其余物种都生产了约750-780 bp的较大产品（图1）。为了证实这些结果，这些HSP70-I-3′-UTR PCR产物全部测序，这些序列的确切大小与它们的GenBank加入号一起显示在表1中。

下载：

图 1.琼脂糖凝胶电泳12种利什曼原虫HSP70-I-3′-UTRPCR产物。

M = 分子标记，N = 阴性对照。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009982.g001

表 1.在计算机预测中HSP70-I-3′-UTR-Bsu RI限制片段和PCR-RFLP片段大小。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009982.t001

***HSP70-I*-3′-UTR PCR检测法对从临床样品中提取的DNA进行检测**

将HSP70-I-3′-UTRPCR应用于从临床标本中提取的6个DNA样本：3个来自唾液;两个来自血液;和一个来自L的皮肤。马提尼克病病例 [34，35]。PCR产物在每种情况下都成功生成，并且正如预期的那样，来自唾液，血液和皮肤标本的这些产品的大小与L的大小完全匹配。马提尼克病PCR产物（图2）。

图 2.琼脂糖凝胶电泳HSP70-I-3′-UTR PCR产物的DNA从临床样品中提取。

A. HSP70-I-3′-UTR PCR产物 B. 使用UNFOR403和UNEV1025引物扩增的聚合酶链反应产物。M = 分子标记，N = 阴性对照。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009982.g002

***HSP70-I*基因的3′-UTRs含有多种微卫星**

未翻译区域大小变化的一个来源是微卫星的出现。由于L中HSP70-I基因的3′-UTRs。马提尼克岛， L.东方和L。mexicana尚未被分析为微卫星，沿着三个物种的序列碎片进行了结构基序的搜索。结果表明，HSP70-I片段的3′-UTR包含许多微卫星。最常见的微卫星是CA重复（作为互补链上的TG或GT）。然而，在L中没有发现TGC微卫星。东方（图3）。

图 3.L的HSP70-I基因3'-UTR中的微卫星分布。马提尼克岛， L.东方和L。墨西哥。

重复的图案对应于在感觉链中发现的图案。请注意，绘制比例对于不同的利什曼原虫物种不成比例。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009982.g003

***HSP70-I基因3′-UTR序列BsuRI限制片段的计算机预测及*PCR-RFLP分析**

为了探索PCR-RFLP增强物种间鉴别的潜力，在L的HSP70-I基因3′-UTR序列的BsuRI限制片段的计算机分析中。马提尼克岛， L.东方和其他10个物种被执行。这揭示了各种不同的预测模式和片段大小（表1）。我们还分析了L。墨西哥人首次出现，在计算机分析中显示出与大多数其他物种不同的碎片大小，但在这方面与L相似。aethiopica和L.热带.

为了验证计算机预测，对12种利什曼原虫进行了PCR-RFLP分析，通过用BsuRI限制性内切酶消化后靶向HSP70-I的3′-UTR。对于L，获得了HSP70-I扩增子与BsuRI消化的3′-UTR的不同PCR-RFLP模式。马提尼克岛， L.东方， L.巴西人， L.圭亚那 = L.帕纳曼西斯， L.墨西哥 = L.埃塞俄比亚 = L.热带， L.亚马逊， L.多诺瓦尼= L.婴儿和L。主要（图4和表1）。L的PCR-RFLP图谱图。圭亚那（M4147）和L。 panamensis（LS94）相似，并且从计算机预测模式中差异地观察到一个额外的条带（>500 bp）。结果还证实L.墨西哥， L.aethiopica和L.热带具有相似的PCR-RFLP模式（图4和表1）。同样，L.多诺瓦尼和L.婴儿具有相似的条带模式。一些大小相似的片段低于分辨率限制，无法通过凝胶电泳区分，表现为合并条带。这些如表 1所示。

图 4.PCR-RFLP分析12种利什曼原虫的HSP70-I-3′-UTR片段。

使用HSP70-I -3′-UTR特异性引物进行PCR扩增，并用BsuRI消化PCR产物。M = 分子标记，N = 阴性对照。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009982.g004

在这些结果中，也许最令人惊讶的是L的条带模式的相似性。墨西哥到L.埃塞俄比亚/L.对应性和L的差异。亚马逊.为了确认这是一个真实的结果，而不是由于培养物的混合，对三个L进行了进一步的序列分析。亚马逊和两个L。墨西哥分离株（S3图）。该分析证实了所有这五种分离株之间的紧密序列相似性以及观察到的条带模式的原因。两个L.墨西哥分离序列彼此相同，并且三个L。亚马逊分离株显示出95-99%的身份。所有五个分离株都有一个保守的BsuRI位点，但由于单核苷酸多态性和插入，在所有三个L中都发现了一个额外的位点。亚马逊分离株在L中均不存在。mexicana分离出来，相反，在L中都有一个额外的位点。墨西哥分离株在所有三个L中均不存在。亚马逊分离物。这些解释了L之间条带图案的差异。亚马逊和L.墨西哥。分析表明，在L中观察到的相似大小的条带。墨西哥和L.埃塞俄比亚/L.热带是共发性的结果，而不是总体序列相似性的结果。

**三种PCR方法的检测限以鉴别*L。马提尼克和L。东方***

最后，对于L.马提尼克和L。我们研究了HSP70-I -3′-UTRPCR方法的检测限，并将该靶标与另外两个广泛使用的序列SSU-rRNA和ITS1-rRNA进行了比较。HSP70-I-3′-UTR方法可以检测L。马提尼克和L。东方人在相同的DNA浓度下为1 pg / μL（图5A）。与此相比，PCR扩增的SSU-rRNA区域在两种利什曼原虫物种中显示出相似的检测限（图5B）。ITS1-rRNA PCR方法可以在0.01 pg / μL的较低浓度下检测两种利什曼原虫物种的DNA（图5C）。但是，请注意，SSU-rRNA和ITS1-rRNA PCR扩增子的大小无法区分L。马提尼克和L。东方 .

图 5.琼脂糖凝胶电泳L的PCR产物。马提尼克和L。东方 .

A. HSP70-I-3′-UTR PCR产物 B. SSU-rRNA PCR产物 C. ITS1-rRNA PCR产物。以每次反应19.8ng的人血DNA作为背景对照。N = 负对照，泳道 1–10 表示量为 100，000;10,000;1,000;100;10;1;0.1;0.01;0.001;和0.0001 pg的利什曼原虫DNA分别在每次反应中。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009982.g005

讨论

利什曼病中的物种鉴定在诊断、流行病学和临床研究中非常重要。为此，DNA测序是用于鉴定利什曼原虫物种的有效方法。然而，在泰国的一些偏远地区以及东南亚和东亚或其他地方的其他低收入或发展中国家，它不是一种具有成本效益的方法，对于常规诊断是不可行的，并且将样本送到其他地方进行测序还有其他问题，特别是在运输方面。简单的PCR方法对于诊断和鉴定致病寄生虫以及医疗随访是首选。目前的研究表明，HSP70-I-3′-UTR区域的PCR能够产生能够容易区分L的产物。马提尼克病（480–2 bp）和L。orientalis （674 bp）是泰国利什曼病的两种主要致病因子，仅根据其大小，前提是准确测量。为了证实HSP70-I-3′-UTRPCR方法在临床样品中的应用，使用了从唾液，血液和皮肤中提取的DNA。阳性结果表明，PCR方法可以应用于从临床样品中提取的DNA。虽然我们没有用L临床样本中的DNA提取物进行测试。由于没有可用的材料，敏感性测试表明PCR能够鉴定低至1 pg / uL的DNA，这在实践中对诊断肯定是有用的。这些信息在临床上是有用的，如迄今为止已知的病例L。马提尼克病似乎能够引起比L更严重的疾病。东方 .然而，关于L的可能的种内多样性的信息。orientalis HSP70-I-3′-UTR 被限制为只有一个L。东方分离株[2]被培养并可用于本研究。如果更多L.未来获得东方分离株，可考察该区域的种内多样性。因此，仅 PCR 可用于确认泰国的利什曼病疑似本土病例，并可暂时识别该物种。

对本研究和先前研究中产生的HSP70-I序列的分析表明，利什曼原虫亚属利什曼原虫物种的3′-UTR区域显然是最长的。对于Mundinia亚属，除L外所有物种的UTR区域。马提尼克岛比Viannia亚属的物种长。L的 UTR 区域。马提尼克是最短的。这种大小变异的生物学意义（如果有的话）尚不清楚，但它可能会影响寄生虫在不同环境/宿主中的适应性，因为3′-UTR包含参与HSP70表达转录后的各种调节区域序列。HSP70蛋白帮助利什曼原虫寄生虫在宿主巨噬细胞内存活，并在其生命周期内适应感染后对不同应激的耐受性的新环境[36]。应进一步研究HSP70-I在Mundinia亚属新物种中的表达的调控，特别是L。马提尼克病，因为它可能是世界几个地区各种宿主的病原体[1，37–39]。

微卫星是大约一到六个非编码核苷酸的重复基序，普遍分布在所有真核生物基因组中[40]。L的HSP70-I-3′-UTR片段的微卫星。马提尼克岛， L.东方和L。墨西哥人是第一次在这里报道。最常见的微卫星，CA重复，在所有研究物种的3′-UTR中被观察到。这与L中的报告一致。婴儿， L.主要和L.巴西人基因组 [29，41].。然而，利什曼原虫基因组中另一个丰富的重复，TGC-微卫星[41]，在L中不存在。东方人，在维亚尼亚亚属的物种中也有报道[29]。在研究的所有利什曼原虫物种样本中，还注意到许多其他微卫星，如C，GC，GTG，GGC和GCG，可能被归类为利什曼原虫[29]不常见。在这项研究中，3′-UTR片段的大小变异部分是由于微卫星序列重复次数的变化，更长的UTR具有更多的微卫星。虽然在本研究中检查的分离序列中未见，但这种变异也可能导致PCR产物大小的亚特异性变异。

关于在泰国境外发现的物种，HSP70-I-3′-UTR PCR生成了L的产物。马提尼克和L。东方人的大小与其他热带利什曼原虫不同，经测序证实。然而，仅通过凝胶电泳即可可靠地鉴定这些PCR产物的大小，特别是L。东方 .因此，进行了PCR-RFLP分析，以试图提高歧视水平。据报道，与单独使用PCR相比，PCR-RFLP方法有时有助于改善利什曼原虫物种鉴别，例如，使用利什曼原虫小圆动力学细胞DNA保守区域的HaeIII限制性片段来区分L。巴西人来自L.亚马逊物种[42]。同样，ITS1基因的PCR-RFLP测定用于直接鉴定L。主要和L.热带[43]。在目前的研究中，PCR-RFLP分析的结果通常与在计算机分析中对HSP70-I -3′-UTR扩增区的BsuRI限制性片段的预测相对应。PCR-RFLP模式可以清楚地区分L。马提尼克岛， L.东方， L.巴西人， L.亚马逊和L.主要物种。虽然与其他物种不同，但PCR-RFLP仍然无法区分两对密切相关的物种：L. 帕纳曼西斯;和L。多诺瓦尼和L.婴儿。然而，先前的研究表明，用BccI限制性内切酶消化的HSP70基因片段的PCR-RFLP模式可以区分L。圭亚那和L.如果需要的话[44，45]。在这项研究中，两个L的意外波段>500 bp。圭亚那和L.帕纳门西斯注意到PCR-RFLP模式。该条带的起源尚不清楚，但可能是由于这些物种的HSP70-I-3′-UTR的序列变异引起的。对于L.墨西哥，它的模式类似于L。aethiopica和L.热带，但不同于维尼亚亚属和利什曼原虫亚属中的其他物种，包括L。亚马逊，否则通常被认为与L密切相关。墨西哥。但是，在这种情况下，结果是由于共发生而不是L之间的任何潜在关系。墨西哥和L.aethiopica或L.热带.总体而言，PCR和PCR-RFLP分析的结合能够清楚地鉴定出在泰国引起利什曼病的两个物种，并将其与世界其他地方发现的物种区分开来。

在泰国，Sriworarat等人（2015）已经展示了一种比色环介导的等温扩增（LAMP）技术，用于直接检测利什曼原虫DNA。LAMP测定还可以检测除L以外的多种利什曼原虫物种的DNA。siamensis （MHOM/TH/2010/TR）' 和L.马提尼克，包括L。埃塞俄比亚， L.巴西人， L.多诺瓦尼和L.热带[46]。然而，LAMP容易受到污染，因为它可以产生大量的DNA，并且它能够扩增微量的DNA[46]。一种基于PCR的方法，使用一对引物的微圆动力学DNA基因[27]可用于区分L。马提尼克从'L.siamensis' （MHOM/TH/2010/TR），但PCR产物的大小无法区分其他亚属中的寄生虫[28]。对于ITS1-PCR方法，它不适合对'L进行判别。siamensis' （syn L.东方）和L。马提尼克病感染，因为它产生相同大小的产物[1，28，47]。

本研究的检测限结果表明，ITS1-rRNA PCR是检测LDNA最灵敏的方法。马提尼克和L。与HSP70-I -3′-UTRPCR和SSU-rRNA PCR方法相比，东方人浓度为0.01 pg / μL，可以在相同的DNA浓度（1 pg / μL）下检测两种物种的DNA。这可以解释为，到目前为止研究的利什曼原虫物种中的HSP70基因都排列在一个基因组簇中，该基因组簇包含五个或六个HSP70-I拷贝，然后是一个HSP70-II拷贝[48]，而在利什曼原虫物种中，每个细胞在20-40个拷贝之间观察到SSU rRNA基因和rRNA基因的ITS1区域的副本[31，49].

本研究中使用的基于PCR的方法现在可以应用于鉴定从泰国的病媒和宿主获得的利什曼原虫物种，以调查其流行病学意义。该技术易于执行，可以在所有可用的PCR-RFLP环境中实施。对于确定的本土病例，仅 PCR 产物可能足以进行鉴定。但是，如果怀疑或无法消除输入性病例，则 L.东方PCR产物的大小与L非常相似。panamensis和L.圭亚那，在这种情况下，BsuRI-PCR-RFLP方法可用于区分这些物种和其他亚属中的其他物种。然而，如果物种鉴定至关重要或感染可能是在泰国境外获得的，则建议对HSP70-I-3′-UTR产物或类似的鉴别靶序列进行测序。综上所述，HSP70-I区域的3′-UTR是基于PCR鉴定和鉴别L的合适靶标。马丁昆西斯和L.东方 .

支持信息

琼脂糖凝胶电泳L的HSP70-I-3′-UTRPCR产物.马提尼克分离出来自泰国和参比菌株LEM2494。

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S1 图琼脂糖凝胶电泳L的***HSP70-I-3′-UTRPCR产物.马提尼克分离*出来自泰国和参比菌株LEM2494。**

M = 分子标记，N = 阴性对照。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009982.s001

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S2 图L的***HSP70-I-3′-UTR序列的多序列比对。马提尼克分离*出来自泰国和参比菌株LEM2494。**

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009982.s002

（TIF）

S3 图L的***HSP70-I-3′-UTR序列的多序列比对。亚马逊（M2269，PH8和C1S1）和L。墨西哥*（M379和U1103）分离物。**

突出显示了BsuRI（HaeIII）限制站点（GGCC）的位置。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009982.s003

（TIF）

确认

我们感谢Padet Siriyasatien教授和Atchara Phumee博士的临床样本，以及Sriwatraporn Sor-suwan博士和Benjarat Phatanawiboon博士的技术帮助。

引用

00001. 1.Pothirat T， Tantiworawit A， Chaiwarith R， Jariyapan N， Wannasan A， Siriyasatien P， et al.首次从泰国北部分离出利什曼原虫：病例报告，确定为马提尼克利什曼原虫病和利什曼原虫复合体内的系统发育位置。PLoS Negl Trop Dis. 2014;8（12）：e3339.pmid：25474647;PMCID： PMC4256172.

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您的位置：首页 > 医学 > 使用基于PCR的方法在热休克蛋白70（I型）基因的3′未翻译区域上分子鉴定两种新发现-沈阳医学论文发表

使用基于PCR的方法在热休克蛋白70（I型）基因的3′未翻译区域上分子鉴定两种新发现的引起利什曼病的人类病原体

抽象

作者简介

介绍

材料和方法

道德声明

寄生虫分离物和培养

脱氧核糖核酸的分离

聚合酶链反应和测序

计算机限制分析

聚合酶链反应-射频低密度脂蛋白分析

PCR 方法的检测限

评估临床样品中DNA的测定

结果

利什曼原虫HSP70-I基因3′-UTR区域的PCR扩增和测序

HSP70-I-3′-UTR PCR检测法对从临床样品中提取的DNA进行检测

HSP70-I基因的3′-UTRs含有多种微卫星

HSP70-I基因3′-UTR序列BsuRI限制片段的计算机预测及PCR-RFLP分析

三种PCR方法的检测限以鉴别L。马提尼克和L。东方

讨论

支持信息

S1 图琼脂糖凝胶电泳L的HSP70-I-3′-UTRPCR产物.马提尼克分离出来自泰国和参比菌株LEM2494。

S2 图L的HSP70-I-3′-UTR序列的多序列比对。马提尼克分离出来自泰国和参比菌株LEM2494。

S3 图L的HSP70-I-3′-UTR序列的多序列比对。亚马逊（M2269，PH8和C1S1）和L。墨西哥（M379和U1103）分离物。

确认

引用

***利什曼原虫HSP70-I*基因3′-UTR区域的PCR扩增和测序**

***HSP70-I*-3′-UTR PCR检测法对从临床样品中提取的DNA进行检测**

***HSP70-I*基因的3′-UTRs含有多种微卫星**

***HSP70-I基因3′-UTR序列BsuRI限制片段的计算机预测及*PCR-RFLP分析**

**三种PCR方法的检测限以鉴别*L。马提尼克和L。东方***

S1 图琼脂糖凝胶电泳L的***HSP70-I-3′-UTRPCR产物.马提尼克分离*出来自泰国和参比菌株LEM2494。**

S2 图L的***HSP70-I-3′-UTR序列的多序列比对。马提尼克分离*出来自泰国和参比菌株LEM2494。**

S3 图L的***HSP70-I-3′-UTR序列的多序列比对。亚马逊（M2269，PH8和C1S1）和L。墨西哥*（M379和U1103）分离物。**