《传染性卡波西肉瘤相关疱疹病毒后代的组装需要形成一个pORF 19五聚体-杂志期刊论文发表》期刊简介
传染性卡波西肉瘤相关疱疹病毒后代的组装需要形成一个pORF 19五聚体-杂志期刊论文发表
· 彼得·纳尼马,
· 纳伊莫(Eleonora Naimo),
· 桑德拉·科赫
· 尤特·柯思，
· Khaled R.alkharsah，
· Luisa J.Str h，
· 安妮·宾兹
· 简·马克·贝内克
· 本杰明·沃尔默
· 海克·博宁
· 伊娃·玛丽亚·博斯特
· 普拉尚特·德赛
· 延斯·博妮
· [ ... ],
· 托马斯·克里
· [全视]
· 发表日期：2021年11月4日
摘要
疱疹病毒会引起严重的疾病，特别是免疫功能低下的患者。无论是基因组包装还是从衣壳中释放出来，都需要一个独特的门户通道，占据12个衣壳顶点中的一个。在此，我们报告了γ-疱疹病毒Kaposi肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的五聚体pORF 19的2.6的晶体结构，类似于封闭该通道的门静脉帽。我们还介绍了它的β-疱疹病毒正射体的结构，揭示了其与α-和γ-疱疹病毒的结构相似之处，尽管衣壳有明显的差异。我们展示了pORF 19五聚体在溶液中的形成，并提供了关于五胺化是如何在感染细胞中触发的见解。其侧界面突变阻断了pORF 19五胺化，严重影响了KSHV衣壳的组装和感染性后代的生产。我们的结果为更好地理解pORF 19在衣壳组装中的作用以及寻找治疗疱疹病毒所致疾病的新药物靶点铺平了道路。
引用：Naniima P，Naimo E，Koch S，Curth U，alkharsah KR，Str h LJ，等。(2021年)传染性卡波西肉瘤相关疱疹病毒后代的组装需要形成一个pORF 19五聚体。PLOS Biol 19(11)：e3001423。Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423
学术编辑：Bill Sugden，威斯康星大学-麦迪逊，美国
收到：2021年1月19日；接受：(二0二二一年九月二十二日)出版：(2021年11月4日)
版权：2021年Naniima等人这是一篇以CreativeCommonsAttribution许可证，允许在任何介质中不受限制地使用、分发和复制，只要原始作者和源被记入帐户。
数据可得性：三种结构的原子坐标和结构因子在蛋白质数据库(PDB)中分别存放在7 NXP(HCMV PUL77CTD)、7 NXQ(KSHV PORF19KCTD)和7 NXR(MuHV-68 pORF19MCTD)。所有其他相关数据均在本文件及其辅助信息档案。
供资：这项工作得到了德国感染研究中心(DZIF)对传统知识的资助。Www.dzif.de/en)，由德国研究基金会(DFG，德国研究基金会，Www.dfg.de)根据德国的卓越战略--例如2155-Projektnummer 390874280，由德国Forschungsgemeinschaft(DFG)-Projektnummer 158989968-SFB 900，项目B10，并通过向EMB和TK提供资金，由Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG)-Projektnummer 441233738。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
相互竞争的利益：提交人宣布，不存在任何相互竞争的利益。
缩略语：ATCC，美国型培养集物；AUC，分析性超离心；CATC，衣壳相关被膜复合物；冷-EM，冷电镜；CTD，羧基末端结构域；CVSC，衣壳顶点特异性组分；DAPI，4‘，6-二氨基-2-苯环吲哚；ECL，增强化学发光；FACS，荧光激活细胞分选；FBS，胎牛血清；HAT，组蛋白乙酰转移酶；HCe，人巨细胞病毒；HDAC，组蛋白脱乙酰酶；HRP，辣根过氧化物酶；HSV，单纯疱疹病毒；SHV，Kaposi肉瘤相关疱疹；R，病毒末端病毒；CMV，Mcapine；Muhv-68，小鼠γ疱疹病毒68；pfa，多聚甲醛；prv，伪狂犬病病毒；pvat，门静脉顶点相关被膜；rfp，红色荧光蛋白；rt，室温；sb，丁酸钠；scp，小衣壳蛋白；sec，尺寸排除色谱；wt，野生型。-杂志期刊论文发表
导言
疱疹病毒是一大群双链DNA病毒，在脊椎动物和非脊椎动物中都存在潜在的终身感染。它们分为3个亚家族(α-，β-和γ-)。疱疹病毒科)根据它们的遗传关系和生物学特性[1]。其中九宗感染人类，并引致多种疾病，包括轻微疾病及致命的临床表现。2]。疱疹病毒有一个共同的三维组织，它的双链dna基因组被包装成一个伪二十面体衣壳(三角数T=16)，嵌入蛋白质被膜层和病毒包膜[3]。衣壳由形成衣壳面的150人、位于11个衣壳顶点的11人和位于第12顶点的1个DNA门户组成。正己人由6个主要衣壳蛋白(mcp；pORF 25在卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kshv))组成；关于选定的疱疹病毒衣壳蛋白的比较命名，见S1表)和小衣壳蛋白(SCP；pORF 65在KSHV中)，而五子含有5个MCP拷贝，在一些疱疹病毒中也含有SCP。异三聚体蛋白复合物，三叉神经丛，交叉连接在它们的碱基上的捕获者。门户由一个由门蛋白组成的十二聚环组成。4–8](KSHV中的pORF 43)，在组装过程中促进病毒基因组的调节包装，并将它们从传入的衣壳释放到核质中[8,9].
尽管整个疱疹病毒家族的衣壳结构都是保守的，但α-，β-和γ-疱疹病毒的衣壳结构也显示出一些独特的结构特征。冷冻-电子显微镜(cryo-emm)分析发现，α-疱疹病毒单纯疱疹病毒(Hsv)的门盖蛋白pUL 25和γ-疱疹病毒kshv的正方体pORF 19的两个拷贝，分别位于γ-疱疹病毒kshv周围，作为称为“衣壳顶点特异性组分”的蛋白质复合物的一部分；[10–12]或“衣壳相关的柚皮复合体”(CATC；[4,13–15]；在[16])。有关pUL25及其同系物的结构信息到目前为止以pUL 25(PDB2F5U)的羧基端球状结构域的晶体结构形式提供；[17])它围绕着α-和γ-疱疹病毒pUL 25的N端部分的原子分辨率cryo-EM重构，它们通过cvc螺旋束连接各自的羧基端结构域(Ctd)和cvc的第二主要成分(hsv的pUL 17及其位置同系物pUL93(Hcmv)和pORF 32(Kshv))与三重链蛋白(Kshv)之间的连接。图S1).
α-和γ-疱疹病毒的cvc组分有不同的占用率[4]，解释了CVSC密度的变化，但两者都以类似的方式与五边形顶点相关联。与α-和γ-疱疹病毒衣壳不同，人类和小鼠巨细胞病毒(hcmv和mcmv)最近的冷电镜重建属于β-疱疹病毒科，没有揭示任何密度周围的五旬节顶点，可能对应于一个β-疱疹病毒cvc。相反，β-疱疹病毒特异性磷蛋白pp 150形成紧密的衣壳结合层，位于戊子和己子周围[18,19]。同样地，在人类疱疹病毒6B三系上五角点附近的所有潜在的cvc结合位点都被β疱疹病毒特异性pU 11蛋白的一个四聚体所占据。20]，表明在疱疹病毒亚家族中，五子周围的CVSC的空间组织并不保守。
尽管衣壳结合存在明显差异，但α-疱疹病毒cvc组分(pUL 17和pUL 25)及其β-疱疹病毒同源物(pUL93和pUL77)具有类似的功能。在α-疱疹病毒和β-疱疹病毒中，它们形成一个复合体，它们对于病毒基因组的包装是必不可少的；此外，α-疱疹病毒cvsc蛋白在基因组包装后稳定衣壳，并促进dna填充的衣壳的核出口。16])。α-疱疹病毒cvsc与内被膜蛋白pUL 36的羧基端部分稳定地相互作用，并将端部连接到衣壳三叉神经[15,21]。裂解级联病毒DNA不需要pUL 25[10，而是为了使衣壳相对于包装后高电荷DNA基因组的内部压力而稳定[22–25](在[16])。值得注意的是，在包装终止和直接与dna的相互作用过程中，pUL 25参与了DNA的断裂[26]，最近的一项冷冻-EM研究表明，dna基因组的终止与可能由pUL 25组成的门户帽的电子密度非常接近[5]。在HCMV中，pUL77与DNA包装蛋白pUL56和pUL89相互作用[27，也被称为终止酶复合体，尽管另一项研究没有找到这种直接相互作用的证据。28]。此外，还描述了pUL77与DNA结合并与门户蛋白pML 104相互作用[29]，表明pUL77和其HSV-1正方体pUL 25一样，参与了DNA的包装。然而，与hsv-1正方体pUL 25不同，hcmv pUL77也是dna裂解所必需的。28]。缺乏第二个cvc组分pll 17的hsv-1突变体不能切割级联dna，因此也不能包装单位长度的基因组[30]。最近的一份报告指出，pUL 17是连接终止酶复合物的关键病毒因素之一。31]。同样，HCMV pUL 93也对病毒DNA的断裂起着至关重要的作用。28,32]。Cvsc也参与成熟衣壳的核出口，因为hsv-1 pUL25直接结合到核出口复合体[33]，以及假狂犬病病毒(PRV)突变体的衣壳，缺乏功能的pIL 25在内核膜上积聚。34].
最近应用聚焦分类或对称放松图像处理策略重建疱疹病毒衣壳的冷电镜技术进展，促进了对门户点结构的新见解[4–6]。传送门是个道具[8,9并以星状的五聚体密度为上限，与先前在门户点识别的尾端结构相一致[35]。这种密度是由HSV-1和KSHV中pUL 25或pORF 19的CTD的五聚层组成。4–6]，与其在防止衣壳包被病毒基因组泄漏方面的作用一致(关于五旬节和门户点的示意图比较，见图S1)。不幸的是，在报告的cryo-EM地图的门户帽区域的低分辨率不允许建立原子模型，留下了重要的机械问题，门盖组装以及蛋白质-蛋白质和蛋白质-dna之间的相互作用在dna包封过程中没有答案。
在此，我们报告了β-和γ-疱疹病毒(HCMV、KSHV和Muridγ-疱疹病毒68(MuHV-68))3个成员的pUL 25同源体CTD的晶体结构，强调了它们在疱疹病毒亚家族中的结构保守性。此外，我们还确定了KSHV pORF 19 CTD完整的五聚体的晶体结构，它与所报道的门户帽密度有惊人的相似之处。4]。这种CTD的五聚化可以在溶液中被触发，为研究衣壳组装过程中的齐聚动力学提供了新的见解。以结构为基础的侧位五聚体pORF 19界面突变严重影响了衣壳组装和病毒释放，表明五聚体门帽的形成是疱疹病毒复制周期的关键步骤。因此，我们确定了一个新的有前途的目标，为基于结构的抗疱疹病毒抑制剂的设计提供了条件。
结果
PORF 19及其同系物的晶体结构呈现保守的三维折叠。
对疱疹病毒衣壳的冷冻-EM分析表明，HSV-1小衣壳蛋白pUL 25及其KSHV的正方体pORF 19作为CVSC的一部分排列在五旬节周围。图S1) [4,5,11–13,15]。HCMV pUL77被认为是pUL 25的正方根[28，但尽管有生化证据表明它与衣壳有关[28]，β-疱疹病毒特异性磷蛋白pp 150的密集层占据了五边形顶点周围的类似位置。19,36]。补充有关pUL25的现有结构信息([17PDB2F5U)，我们开始结晶β-和γ-疱疹病毒的pUL 25同源体的CTD。我们将hcmv、kshv和muhv-68同源物的氨基酸序列与hsv-1 pUL25序列进行了比对，并表达了ctds(PUL77)。CTD(HCMV)，pORF 19KCTD(KSHV)和pORF 19MCTD(MuHV-68)对应于结晶的pUL 25羧基端球状结构域[17]。大小排斥色谱(SEC)显示，相应的蛋白质在溶液中是单聚的，根据它们的洗脱体积(图S2)，得到了它们的衍射质量晶体。材料和方法描述了结晶和结构测定的细节，并列出了晶体的统计数据。S2表.
实验电子密度图允许对463个氨基酸中的423个、427个中的394个和413个氨基酸中385个进行跟踪。CTD、pORF 19KCTD，以及pORF 19MCTD分别(见材料和方法; 图1A-1d)，在几个内部无序循环中出现内部中断(S3表)。HSV-1、HCMV、KSHV和MuHV-68的整体结构是保守的。图1A-1d)通过使用DALI服务器进行结构比较(S4表) [37]尽管在“暮光区”中氨基酸同一性很低[38(HSV-1 pUL 25和MuHV-68 pORF 19的结晶碎片之间约占20%；如S3图)。α-和γ-疱疹病毒同源体的这种结构相似性是基于它们在各自的衣壳上相似的cvc组织和形状[4,5,11–13,15]，但β-疱疹病毒HCMV pUL 77的预测值为未知数，到目前为止还没有关于该病毒的结构信息。PIL 77与其α-和γ-疱疹病毒同源体结构相似，表明其具有保守的功能，这与其在基因组封闭和衣壳成熟过程中所描述的关键作用相一致。23,28].
图1.小分子KSHV衣壳蛋白pORF 19及其同源物的晶体结构
(a-D)由HSV-1pUL25(PDB2F5U；18)、HCMV-pUL77、KSHVpORF 19和MuHV-68 pORF 19根据二级结构着色的CTD的卡通表示，α-螺旋为红色，β-链为绿色，环区为黄色。无序区表现为虚线管，N端和羧基端.(E)对MuHV-68 pORF 19 CTD(PORF 19)的看法MCTD)在表面表示法中显示，在所有四个用黄色着色的同义词中，残基都是保守的。一个较大的保守斑块，由4个在初级序列中遥远的残基(橙色颜色)组成，与连接Y的环非常接近。365和S384(黑色箭头)，这是无序的晶体结构的所有同源，表明保守的补丁很可能被埋藏在天然的蛋白质。CTD，羧基末端结构域；HCMV，人巨细胞病毒；HSV，单纯疱疹病毒；KSHV，Kaposi肉瘤相关疱疹病毒；MuHV-68，小鼠γ疱疹病毒68。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.g001
在整个病毒进化过程中保持相同的功能，如与病毒或宿主蛋白的相互作用，可能需要保存不相邻的残基，以在所有疱疹病毒同源物上形成连续的表面斑块。为了检验这一假设，我们对所有4个ctd进行了结构调整，并确定了一些保守的残基(黄色图1E和黑色的红色字体S3图)。这些残基分布在整个蛋白质中，其中大部分位于内部，这与它们对蛋白质核心结构完整性的重要性相一致。唯一暴露在分子表面的较大的保守斑块覆盖面积为590.312(橙色)图1E)，并位于不同正字词中大小可变的表面环附近(pUL25的残馀值为417至425)。CTD，pUL77的残馀物472至492CTD，pORF 19的残基400至407KCTD，而pORF 19的残基为366至383。MCTD)。这个循环在所有结构(N-末端和羧基-末端残基)中都是无序的。图1E和S3表)，因此很可能会在天然蛋白质中掩蔽保守的斑块，至少部分如此。综上所述，4种同源生物之间的蛋白质表面差异并不表明蛋白质-蛋白质相互作用界面的保守性。-杂志期刊论文发表
Hsv-1 pUL25 ctd的晶体结构显示出明显的电荷分布，在分子的一侧有许多带正电荷的残基(蓝色的S4A图)和一簇负电荷残基在对面([17]；红色的S4B图)。虽然已经讨论了这些带正电荷的斑块在DNA相互作用中可能起的作用[17]，这种费用分配的含义仍然难以理解。在pUL77中观察到静电势有相似但更明显的极化。CTD，而γ-疱疹病毒同系物的相应表面并没有显示出带电残余物的积累(S4图).
KSHV pORF 19的晶体结构显示了一个稳定的五聚体
类似于hsv-1 pUL25CTD [17]，pUL77CTD和pORF 19MCTD作为单体结晶的。相反，pORF 19KCTD以三种独立晶体形式组装成五聚体，每不对称单位有一个五聚体或两个五胺体(图2, S5图)。对5个有效的五聚环进行了结构比较，发现其与<1.6Au的Cα原子间的根均方偏差有显著的相似之处。该五聚体的外径约为142个，中心腔约为14个，略小于双链dna螺旋直径(约20个)，以及埋有约1,049个小时的横向相互作用。2(±44.5)2)一个原生质体和大约1,147个2(±53.1)2)在相邻的原生质体(图2D)。由疏水相互作用、氢键和盐桥组成的广泛的相互作用网络稳定了这一界面，计算出的总结合能约为19.2kcal/mol(±0.9kcal/mol)。横向相互作用和相互作用界面所掩埋的溶剂可达比表面积类似于抗体-抗原复合物[39]。再加上不同晶体形式下观察到的不相关的晶体堆积，这些特征表明这种五聚体反映了pORF 19的真正寡聚状态。KCTD.
图2.PORF 19的五聚体排列KCTD.
(A)PORF 19的卡通表现KCTD在侧面视图(左面板)和顶部视图(右面板)中观察到的P2 12121空间组中的衰变形式。单个原始人的颜色不同。(B)近距离观察到的2种醋酸离子为球体的横向界面区和乙酸盐的极性相互作用623用Q的侧链458稳定显示为虚线的五边形界面。该嵌体突出了来自相邻质子链的2β链之间的质子间主链氢键，这很可能给五聚体带来额外的稳定性。(C)在两个原生质体上，用亮灰色和深灰色分别突出显示与B相同的视图的表面表示。(D)近距离观察界面区域，突出2乙酸离子的位置(如B所示)。
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原生质体还通过由表面环(残基454至467)形成的分子间β片相互作用，该环包括一个短的β链(残基462至464)，该链与相邻原生质体的N端2链β片平行运行(图2B)。这些原生质间的主链β相互作用很可能给五聚体带来额外的稳定性.值得注意的是，由这条短β链组成的表面环被建议插入到pORF 25和pORF 65之间的五旬节顶点之间的沟槽中，从而构成羧基端kshvpORF 19结构域的端子缔合的主界面[4]。我们的晶体结构还表明，每一个原生质体通过4个原核内氢键(乙酸盐)结合2乙酸根离子。622)和3座盐桥(醋酸盐)623)分别。这些乙酸离子中的一种(醋酸盐)623)通过极性相互作用将两个相邻的原生动物与Gln的侧链连接起来。458从而进一步稳定了五聚体相互作用(图2B).
晶化的五聚体的空间排列使人想起门通道上的五聚体密度，称为门脉顶点相关的测试(PVAT；图3A，EMDB 20431；[4)，它与KSHV衣壳上与五旬节相关的CVSC有很大的不同(图3B，EMDB 6038；[13])。继最近对HSV-1和KSHV衣壳进行冷冻-EM分析之后，该门户帽被提议由pUL 25或pORF 19 CTDs的五聚体组成[4–6]。我们的pORF 19原子坐标的拟合KCTD五聚体进入KSHV门盖的密度[4]具有较高的拟合质量(相关系数为0.78；图3A)，支持pORF 19的五聚体排列的概念。KCTD可能反映了pORF 19在传染性病毒门帽内的空间排列。五聚体pORF 19的3种独立晶体堆积环境KCTD (S5图)建议一个五角体作为建筑块，在HSV-1中，它随后可以采用“堆叠环”的结构。5,6]为门户帽形成双层。
图3.PORF 19的安排KCTD在衣壳上。
(A)五角体pORF 19的卡通表现KCTD不对称(C1)KSHV门静脉顶点重建的门静脉帽电子密度(EMDB 20431；[4])和(B)PORF 19KCTD在对称的KSHV五边形顶点重建(EMD 6038)的CVSC密度中安装的原生质体(颜色为深灰色)；[13])。衣壳蛋白被着色，如图S1。近距离观察图(A，底部面板)强调了拟合的高质量(奇米拉计算的互相关系数为0.78)[40]). (C)五聚体pORF 19分子表面的静电势KCTD环，从红色(阴性)到蓝色(正)再到白色(中性)，用?5~+5KT/e的比例计算，显示在五聚体中心漏斗内或周围积累了正电荷，表明它与病毒基因组末端的磷酸骨架存在静电相互作用。CVSC，衣壳顶点特异性成分；KSHV，卡波西肉瘤相关疱疹病毒；PVAT，门静脉顶点相关被盖。
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由于门盖密度的分辨率有限，我们无法通过拟合PVAT密度来明确地确定我们的五聚体pORF 19原子模型的取向，尽管互相关系数表明漏斗的形状倾向于向入口方向。如上所述，单个pORF 19的分子表面KCTD原生质体不表现出任何明显的正负电荷聚集成斑块-不像hsv-1 pUL 25表面大量带正电荷的残留物。CTD [17]。相反，pORF19KCTD潘特默尔显示了一个显著的富集带正电的补丁，衬里漏斗内部(图3C)。这种显著的电荷分布符合入口帽与病毒dna基因组中带负电荷的磷酸盐骨架之间的直接静电相互作用，并得到hsv-1衣壳的cryo-EM分析的支持，该分析显示，末端dna通过门静脉顶点[5]。只有位于漏斗内部的带正电荷的残基在疱疹病毒中是保守的，这意味着这个区域的其他残基取代了pORF 19同源物中的功能。用五角形漏斗朝向入口，pORF 19的N端KCTD原生质体指向衣壳并连接到由22个残基组成的连接区，这些残基既不能用我们的晶体结构来解释，也不能用最近对KSHV入口顶点的不对称(C5)重建来解释。4]。在重建过程中，在较低的阈值处可以看到这个链接区，并可能参与将帽锚定在门静脉顶点上的蛋白质-蛋白质相互作用，因为从门户的剪辑区向门户帽发出的“触角螺旋”并不延伸到五边形帽密度[18].
侧面pORF19KCTD界面的结构突变
为了更好地理解五聚体的形成，我们分析了pORF 19的齐聚状态。KCTD正在解决。在低盐缓冲液(SEC缓冲液，10 mm Tris pH7.5，50 mm NaCl)中的SEC分析没有提供证据证明溶液中存在五聚体。S2B图)。在3种结晶条件下，均含有约1.7M的乙酸锂，研究了pORF 19的结晶行为。KCTD通过分析超离心(AUC)在低离子强度缓冲液和高离子强度缓冲液(分别含50 mm NaCl(SEC缓冲液)和0.5M醋酸锂)中的沉降速度实验。沉积系数20，w经c(S)分析，沉降系数为3.4S，沉淀边界扩散加宽，分子量为46 kDa。材料和方法)。这些数据与为pORF 19计算的47.3kDa的理论分子质量相吻合。KCTD并支持pORF 19的概念KCTD是在这些条件下的单体(图4A左面板)。当蛋白质浓度为63μM时，在0.5M醋酸锂存在下，c(S)分布出现s值较高的第二个峰，其分数和s值呈浓度依赖性增加。图4A在最高蛋白质浓度(254μM)下，s值为6.9S。这清楚地表明了pORF 19。KCTD在这些条件下的齐聚。S值随蛋白质浓度的增加而增加，如pORF 19所述KCTD是典型的齐聚反应，在沉淀的时间尺度上是快速的，因为低聚物分数增长，而单体和低聚物在离心过程中容易相互转换[41]。只要存在单体组分，所观察到的s值将介于纯高阶齐聚物和单体之间，无法确定准确的齐聚状态。考虑到pORF 19中稳定的五聚体KCTD晶体结构，在AUC中观察到的齐聚反应很可能反映了蛋白质浓度太低，无法完全填充五聚体的情况。这些结果表明，单体和五聚体pORF 19之间的平衡。KCTD被高浓度的醋酸锂转移到五聚体。利用沉降速度实验分析了在一系列缓冲器和离子强度条件下的pORF 19齐聚反应，结果表明，在没有乙酸锂的情况下，也可以引发齐聚反应，尽管其程度要小得多。S5表)，表明平衡可以被各种外部触发因素改变。-杂志期刊论文发表
图4.结构突变灭活剂pORF 19KCTD溶液中的戊胺化。
(A)PORF 19的齐聚KCTD在SEC缓冲液(左面板；10 mm Tris pH7.5，50 mm NaCl)和Liac缓冲液(右面板；100 mm HEPES pH值7.5和0.5M醋酸锂)。在SEC缓冲区中，pORF 19KCTDS值为3.4S的沉积物，不受所用浓度的影响。相反，在Liac缓冲液中，pORF 19的沉淀系数KCTD以浓度依赖的方式增加，表明蛋白质齐聚。(b-i)基于侧向五边形界面的三维结构(B)设计了4个突变体来调控五聚氰胺化过程。(C)为了稳定五聚体，根据二硫键设计服务器，通过引入2个半胱氨酸残基来构建二硫键。42]. (D)PORF 19的齐聚KCTD含有50 mm HEPES的Liac缓冲液中的突变体。在蛋白质质量分数显著但不完全齐聚的条件下(127个μM；面板A，右)，氧化的pORF 19KCTD在较低浓度(11μM)时，CC(黑色曲线)呈稳定的五聚体沉积，即使在较低的11 M下，c(S)分布也被归一化为同一区域，以更好地比较不同的蛋白质浓度。A和D面板的底层数据可在S1数据. (E)氧化型pORF 19的阴性染色EMKCTDCC具有明显的5倍对称性，表明其在SEC缓冲液中为五聚体.(F)选择的2D类表示氧化的pORF 19的顶部和侧面视图KCTDCC，表明后者在溶液中形成双层“叠层环”组件的倾向较高。(G-I)根据(I)消除促成相互作用的突出侧链(G，pORF 19)，产生了三个具有不稳定的横向五聚体界面的突变体(G，pORF 19)。KCTDDQ；(Ii)用柔性链接器替换整个交互回路(H，pORF 19)KCTD(3)通过插入笨重的侧链(I，pORF 19)产生立体冲突KCTDVL)。界面突变体在动画和/或表面表示中显示，观察到的晶体结构透明和着色，如在B和一个计算生成的模型引入的突变的灰色。值得注意的是，在127个μM浓度下，所有3个界面突变体几乎都是单聚体，其s值为3.4S(见面板D)，表明所有突变都能消除重组蛋白的寡聚。AUC，分析超离心；EM，电子显微镜；SEC，尺寸排除色谱；wt，野生型。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.g004
为了在低盐条件下形成稳定的寡聚体，我们通过将2脯氨酸残基突变成半胱氨酸，引入了一种原基间二硫键(P137C和P461C；pORF 19KCTDCC，图4B和4c)。半胱氨酸硫醇在重组质粒pORF 19中的氧化反应KCTDCC在0.5M醋酸锂溶液中，氧化蛋白在溶液中形成稳定的低聚物(如SEC所示)；图S2)。对Liac缓冲液沉降速度数据的c(S)分析显示，有一种沉积，沉积速率为8.9S。图4d)，分子质量为210 kDa(介于四聚体和五聚体之间)和pORF 19阴性染色EM图像的2D分类。KCTDCC明确地证明了氧化蛋白的5倍对称性(图4e和4f, S6图).
为了更好地理解pORF 19戊胺化，我们对五聚体横向界面进行了基于结构的突变。我们根据三种方法设计了期望减少原生质体间结合的变体：(1)去除两条主要的侧链，这是导致横向相互作用的因素(D)。173A/Q177A；pORF 19KCTDDQ；(Ii)替换一个相互作用的循环(156MNQNQ160)通过柔性链接器(PORF 19)KCTD(3)通过插入笨重的侧链产生立体碰撞(V)463W/L465Y；pORF 19KCTDVL图4g-4i)。Τ和后一突变被设计成一个表面环，它不仅与五聚体pORF 19环中相邻的原生质体相互作用，而且还被提议构成pORF 19与戊on pORF 25结合的主要界面[4]。表达了相应的突变蛋白，沉淀速率实验表明pORF 19KCTDDQ，pORF 19KCTD循环和pORF 19KCTD在野生型(Wt)蛋白表现出明显的齐聚的条件下，VL几乎完全以单体的形式存在。图4A和4D)，表示一个有效的五元化块。
PORF 19对感染KSHV后代的组装至关重要。
接下来，我们利用缺乏球状结构域的敲除突变体和上述五聚体化不合格变异体，研究了pORF 19在感染KSHV病毒子组装中的作用。在KSHV衣壳上，pORF 19可以以两种不同的方式与顶点相互作用：(1)以异二聚体的形式与pORF 32结合，与五环周围的三链体结合，并通过其球状结构域与pORF 25直接相互作用；我们首先分析突变的pORF 19蛋白是否能与五边形顶点相互作用。为此，我们采用了以前报道的一种基于昆虫细胞产生KSHV衣壳的衣壳组装试验。43]。本实验中，除pORF 43外，所有必需的KSHV衣壳蛋白(MCP pORF 25、pORF 62和pORF 26、蛋白酶pORF 17和支架蛋白pORF 17.5和SCP pORF 65)均由单个杆状病毒产生，并参与了二十面体KORF衣壳蛋白在昆虫细胞中的组装。当pORF 19和pORF 32(第二个KSHV CVSC组件)共同表达后，这些缺乏入口顶点的组装衣壳将合并两个CVSC组分[44]，表示pORF 19与五边形顶点的关联。在此基础上，我们分别与pORF 32、wt或突变型pORF 19蛋白共同表达了必需的KSHV衣壳蛋白。在所有情况下，细胞裂解物的密度梯度离心显示在预期位置有一个清晰的衣壳带(见材料和方法)。对经梯度纯化的衣壳的免疫印迹分析表明，突变体pORF 19蛋白与衣壳有相似的联系。图5)，表明在本实验条件下，戊胺化阻断突变并不影响CVSC与戊子的关联。
(A)用梯度离心法从细胞裂解液中分离纯化了含有pORF 43的杆状病毒产生的KSHV衣壳，其中含有wt或突变体pORF 19。44]进行Westernblot分析。以携带V5标签(153.4 kD)的MCP pORF 25和三链蛋白pORF 26(30 KD)为标准。免疫印迹分析表明，GFP标记的pORF 19具有代表性的实验(88.2kD).(B)在3个独立的生物复制体中进行衣壳生产，对pORF 19条带的强度进行量化，以pORF 19的百分比表示，用误差条表示SD的平均值。底层数据可在S2数据。KSHV，Kaposi肉瘤相关疱疹病毒；MCP，主要衣壳蛋白；SD，标准差；wt，野生型。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.g005
为了确定pORF 19在病毒感染中的生物学相关性，我们在细菌人工染色体克隆16(KSHV-Bac16)中克隆的KSHV基因组中引入了一个终止密码子[45]，导致羧基端pORF 19被敲除；我们还将上述五聚氰胺化突变引入单独的KSHV基因组中。对KSHV-Bac16DQ、KSHV-Bac16DQ、KSHV-Bac16VL、KSHV-Bac16KO等4个突变体KSHV-Bac16KO的亲本和突变体KSHV-Bac16KO进行了序列分析。我们用亲本KSHV-Bac16和4种突变体单独转染iSLK细胞。这些细胞来源于SLK内皮细胞，经强力霉素诱导后，可有效地使病毒重新激活并产生大量的感染性KSHV，导致裂解开关蛋白RTA的表达。46]。用kshv-Bac16提供的潮霉素抗性基因和单个细胞克隆筛选出稳定的细胞克隆，其中KSHV在诱导后重新激活，用抗早期裂解蛋白K-bZIP的抗体免疫印迹法鉴定KSHV。图6a)。为了分析感染后代的产生情况，我们收集了复活后的上清液。这些上清液在HEK 293细胞上的滴定显示为1.4×10。5亲本kshv-Bac16构建的感染单位为每毫升，而转染kshv-Bac16 ko的iSLK细胞(表达缺乏球状结构域的pORF 19蛋白)并不产生任何以未转染iSLK细胞为对照的上清液所定义的高于背景水平的感染性后代(图6B)。这类似于先前报道的HSV-1中的一个pUL 25基因敲除突变体，该突变体是通过在UL25阅读框中插入一个停止密码子而产生的，该密码子位于它的球状结构域上游的类似位置上。22].
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图6.PORF 19五胺化对感染性后代的生产具有重要意义。
(A)采用早期裂解蛋白K-bZIP(37 KD)的免疫印迹分析方法，对转染wt或突变型KSHV-Bac16基因的iSLK细胞克隆进行KSHV再激活实验。(b、C)分别用编码pORF 19和rfp(wt+pORF 19)、TRIM 5α和rfp(wt+rfp)的逆转录病毒粒子转染iSLK细胞克隆(wt+rfp)作为对照，分析pORF 19的功能互补作用。用流式细胞仪(FACS)对转导的细胞进行分类，获得蛋白表达均一的细胞群体，并使KSHV在所得到的群体中重新激活。(B)对相应上清液中的感染性粒子的滴定显示，在所有3个突变体的功能互补作用下，感染后代的产量增加了8~30×。测定3种生物复制物的三份滴定值，计算平均±SD值。底层数据可在S2数据。采用单因素方差分析与Bonferroni校正进行统计学比较。****P < 0.0001. n.s., not significant. (C)用糖蛋白Gh(病毒包膜；130 kD)、pORF 45(病毒被膜；78 KD)和pORF 26(病毒衣壳；30 kD)的抗体对单个细胞克隆上清及其补充的KSHV颗粒进行免疫印迹分析，证实转染KSHV-Bac16VL或KSHV-Bac16DQ的iSLK细胞在病毒颗粒释放方面存在明显的缺陷。星号表示在iSLK细胞中经常观察到的非特异性条带。流式细胞术，荧光活化细胞分类；KSHV，Kaposi肉瘤相关疱疹病毒；rfp，红色荧光蛋白；wt，野生型。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.g006
突变体KSHV-Bac16VL(表达的pORF 19在侧界面有空间冲突)和KSHV-Bac16环(表达缺乏相互作用环的pORF 19)不产生任何感染后代--如敲除突变体--而转染突变体KSHV-Bac16DQ的细胞上清液中含有感染性后代，尽管比亲本KSHV-Bac16构建物少140×10。推测与KSHV-Bac16DQ相比，KSHV-Bac16环和KSHV-Bac16VL的抑制作用可能是二次效应所致。例如，pORF 19的突变KCTDVL不仅可以阻止五元化，还可以阻止与先前提出的端子pORF 25的相互作用[4]。进一步的功能和结构分析将需要更详细地分析抑制机制。
为了证实我们的kshv-Bac16突变体中所观察到的五甲基化阻断突变并不是由于无意中的突变所致，我们转-用wt pORF 19辅助稳定的KSHV-Bac16突变体转染细胞克隆。为此，我们用编码pORF 19 wt和红色荧光蛋白(RFP)的逆转录病毒粒子，在最小CMV启动子的控制下，将单个细胞克隆转化为[47,48]用荧光活化细胞分选法(FACS)对其进行均一的RFP表达。由此产生的细胞群为每一个kshv-Bac16突变体产生了大约8至30×10×10×10×10×10×10×10反式-对wt pORF 19的补充(图6B)。相比之下，反式-仅与RFP互补并不能增加传染性KSHV后代的产量。值得注意的是，补充的细胞群体没有达到类似于转染wt KSHV-Bac16的iSLK细胞的效价。如此不完整反式如果突变体pORF 19也在这些细胞中表达，那么pORF 19在pORF 19五胺化过程中起主导-阴性竞争作用，那么pORF 19将起到互补作用。-杂志期刊论文发表
转染突变型KSHV-Bac16的iSLK细胞上清液中缺乏传染性颗粒，其原因可能是病毒颗粒形成受损(即衣壳组装块)，也可能是由于缺乏传染性(即细胞进入细胞的阻滞和传入衣壳的核靶向)。为了区分这些可能性，我们用密度梯度离心从单个iSLK细胞克隆的上清液中纯化了KSHV颗粒。转染wt KSHV-Bac16和KSHV-Bac16DQ细胞释放的颗粒中含有病毒包膜(Gh)、病毒被膜(PORF 45)和免疫印迹显示的病毒衣壳(PORF 26)。相比之下，转染KSHV-Bac16VL、KSHV-Bac16loop和KSHV-Bac16KO作为对照的细胞的相应梯度组分不含Gh、pORF 45或pORF 26，这与其感染后代的生产受到更严重的损害相一致。值得注意的是，当这些细胞克隆与wt pORF 19互补后，标记蛋白Gh、pORF 45和pORF 26很容易在相应的梯度分数中检测到(图6c)。这些结果表明，含有KSHV-Bac16VL-、KSHV-Bac16loop-或KSHV-Bac16KO的细胞不支持病毒的产生，而功能性pORF 19对KSHV颗粒的释放是必不可少的。
PORF 19突变体对kshv感染细胞的衣壳组装或DNA包装/保留的影响
其次，用免疫荧光显微镜检测了衣壳蛋白pORF 26在KSHV-Bac16细胞中的亚细胞定位。图7a)。转染wt KSHV-Bac16(图7a，在KSHV-Bac16DQ(图7a(第二线)，衣壳三链蛋白pORF 26主要定位于核质中与核衣壳组装位点相似的狭窄区域，如上文所述。49,50]。此外，这些细胞在细胞质中含有大量的单个pORF 26点，这可能反映了核外溢后的KSHV衣壳。相反，转染KSHV-Bac16VL、KSHV-Bac16环或KSHV-Bac16KO的细胞中未见pORF 26信号。图7a)。然而，反式-与wt pORF 19互补，使pORF 26在含有KSHV-Bac16VL、KSHV-Bac16环或KSHV-Bac16KO(图7B)，而这些细胞中几乎没有pORF 26点状体。图7B)。这些结果表明，功能性pORF 19对核点和细胞质点的形成是必不可少的，这些核点和细胞质点最有可能是含有pORF 26的衣壳，其成熟构象为已使用的抗体所识别的。从形式上说，pORF 26信号的缺失也可能是由于pORF 19蛋白的突变阻碍了pORF 26的表达，导致pORF 26的降解，或影响了二十面体衣壳的形成。然而，尽管没有pORF 19，角型KSHV衣壳是在用杆状病毒衣壳蛋白过度表达的衣壳装配试验中组装的。43].
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图7.功能性pORF 19是衣壳装配所必需的。
转染和不转染kshv-Bac16基因的iSLK细胞克隆(A)与wt pORF 19互补后(B)用三链蛋白pORF 26(橙色)和DAPI(蓝色)标记核，用免疫荧光显微镜观察KSHV活化后的细胞核。每个面板的左2列描述概览图片，每个面板的右2列描述聚焦于单个单元格的更高放大图片。(A)在wt KSHV-Bac16和较小程度的KSHV-Bac16DQ转染细胞中，观察到典型的三重链蛋白pORF 26的核内分布，与核质类似核衣壳组装位点的局限区的衣壳积累相对应。胞浆中pORF 26点状体的存在表明衣壳的核出口。相反，转染其他突变体或KSHV-Bac16pORF19KO构建物的细胞中未检测到pORF 26信号。(B)利用逆转录病毒途径与wt pORF 19互补，使pORF 26的核内染色恢复，从而证明pORF 26在KSHV核衣壳组装位点中的积累依赖于pORF 19的存在。核出口也观察到在这些细胞互补，虽然程度低于wt KSHV-Bac16转染细胞。所显示的图像是堆叠的图像，单个面板是用ImageJ生成的。鳞片对应20μm.kshv，Kaposi肉瘤相关疱疹病毒；wt，野生型.
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.g007
因此，我们用电子显微镜研究了KSHV的形态发生和衣壳组装。转染wt KSHV-Bac16细胞(图8ai核内有许多空的甲壳(图8Aii)含有蛋白核的衣壳(B衣壳；图8Aiii)，以及含有病毒基因组的C型衣壳(图8Aiv以C型为主的衣壳在内核膜处接受初级包膜(白色箭头图8a)。转染KSHV-Bac16DQ的细胞胞核含有A-和B-衣壳，但未见成熟C衣壳或经原代包膜的衣壳，但转染该突变体的细胞在一定程度上产生了感染性颗粒。图6B)。相反，我们没有在转染KSHV-Bac16VL(未显示)的细胞中检测到任何衣壳。图8c和8d)，或KSHV-Bac16KO(未显示)，与各被重新激活的细胞克隆分泌的感染性颗粒缺乏一致(图6B).
图8.在重新激活的细胞中形成衣壳需要有功能的pORF 19。
(a-D)重组KSHV后转染或转染突变型KSHV-Bac16的iSLK细胞克隆的电镜分析。转染wt kshv-Bac16的细胞(A)病毒衣壳多见于细胞核(AI、Aii、AIII)，胞浆(AIV)较少。在细胞核中，核衣壳组装的各个阶段都被识别，包括A衣壳(A标记)、B衣壳(B标记B)和C衣壳(C标记)，以及核包膜初级包膜过程中的衣壳(AI，白箭头)。转染KSHV-Bac16DQ细胞(B)只有A型核衣壳(Bii标记A)和B型核衣壳(BIII和Biv标记B)，但未见C型衣壳。未发现衣壳在原发包膜或细胞质中。在转染KSHV-Bac16VL(C)或KSHV-Bac16loop(D)的细胞中，细胞核和细胞质中均未发现病毒结构，与模拟转染细胞相似。标度为200 nm。KSHV，Kaposi肉瘤相关疱疹病毒；wt，野生型。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.g008
在昆虫细胞中，杆状病毒感染导致大量靶蛋白过度表达，占细胞总蛋白的50%。51]，如果疱疹病毒衣壳蛋白导致衣壳蛋白组装，也是在没有门户蛋白pORF 43的情况下[52]。在受感染的细胞中，表达水平可能达不到同等水平，因为许多病毒蛋白和大量参与基本细胞过程的细胞蛋白同时表达。这些考虑表明，昆虫细胞中杆状病毒感染的衣壳装配试验只能在一定程度上反映感染细胞中衣壳的聚集情况。上述结果表明，在生理条件下，完整的pORF 19是衣壳装配的关键。图8)及制造具传染性的KSHV病毒(图6B)。作为KSHV-Bac16DQ突变体，干扰pORF 19五胺化。图4)，仍然允许组装空的A和B衣壳，但不允许含有dna的C衣壳(图1)。6–8)，正确的DNA包装可能需要在门静脉帽处对pORF 19进行五聚氰胺化。这些观点引起了人们对侧位五聚体pORF 19界面的关注，认为它是开发新型抗病毒抑制剂的一个很有前途的靶点。
讨论
最近，α-和γ-疱疹病毒病毒的对称松弛冷冻-EM重建策略提供了独特的门户点的第一张快照，这是dna封闭和释放所必需的[4–6]。这些研究首次揭示了门户顶部的一个五聚体帽，该帽可能在包装后封闭衣壳以防止dna泄漏，并已被提议由HSV-1中的pIL 25及其在kshv中的正方体pORF 19组成。4–6]。然而，门盖的结构至今仍难以确定，因为该区域低温电子密度图的分辨率较低，无法建立原子模型。我们的KSHV pORF 19的五边形球状畴的晶体结构(分辨率为2.6)现在可以缩小这一差距，因为将该五聚体的刚体拟合到KSHV门户点的cryo-EM图上[4]强烈暗示我们的五聚体pORF 19具有生理相关性。KCTD结构(图3)。Hsv-1和kshv的cryo-EM重建表明pUL 25/pORF 19帽通过门静脉夹发出的所谓“触须螺旋”锚定在衣壳上，这与报道的pUL 25与HSV-1中的门户蛋白pUL6直接相互作用一致[53]。PORF 19五聚体单面上明显的不对称电荷分布解释了最近在HSV-1的冷电镜重建中发现的基因组最后5个末端碱基对与门脉帽之间的明显相互作用。5]。正带正电荷的pORF 19漏斗与带负电荷的DNA骨架之间的强静电相互作用在包装后紧密地封闭了门通道，因此，这些相互作用对于稳定的基因组封闭是必不可少的。值得注意的是，在漏斗中产生这些正电荷的赖氨酸残基在疱疹病毒中是保守的，这意味着其他带正电的残基会产生类似的带电表面。因此，研究类似的静电相互作用是否能在五聚体pORF 19的同系物中观察到将是很有趣的。-杂志期刊论文发表
值得注意的是，pORF 19的存在对于衣壳的形成是必不可少的，pORF 19基因敲除突变体转染的iSLK细胞中没有组装的衣壳(见上文)。这与HSV-1的结果形成鲜明对比，之前报道的pUL 25基因敲除突变体允许A-和B-衣壳组装[22]，因此说明KSHV pORF 19和HSV-1pUL25之间的功能差异。我们的结果表明，pORF 19是二十面体衣壳形成所必需的；然而，到目前为止，pORF 19是否直接参与了二十面体衣壳的形成，是否在CVSC稳定前直接参与了二十面体衣壳的形成，是否参与了其他衣壳蛋白的聚集，其他衣壳蛋白的稳定，或者pORF 19是否通过一种意想不到的间接作用而发挥作用。需要对pORF 19进行仔细的功能研究，以解释pORF 19在KSHV组装过程中的精确作用。这些研究很可能更好地说明γ-疱疹病毒pORF 19和这里描述的α-疱疹病毒pUL 25之间的功能差异。
PORF 19、pUL 25和它们的β-疱疹病毒同源体pUL77之间惊人的结构保守性很可能表明了依赖于这种保守结构的进化保守功能。PUL77与位于细胞核内的HCMV衣壳有联系，也存在于细胞外病毒[28]，但与α-和γ-疱疹病毒不同的是，β-疱疹病毒的对称冷电镜重建并没有显示任何可能对应于pUL77球状结构域的密度。18,19]。这3个疱疹病毒亚家族的比较表明，与五环端相关的异二聚体CVSC相比，封闭门户的五聚体组装提供了稳定地将病毒DNA基因组封装到衣壳中的关键保守功能。因此，我们的结果还表明，HCMV门户上存在一种五聚体pUL77组装，这与报道的pUL77齐聚的趋势一致。54].
一个有趣的问题仍然存在：是什么引发了核KSHV pORF 19、HSV-1 pUL25的寡聚，以及可能是HCMV pUL77来密封DNA填充的C衣壳，以及如何在核孔处摘除五聚体帽，以便将传入的基因组释放到核内，以防止下一次感染？Cvsc蛋白和终止酶组分被认为在DNA包封开始之前组装到衣壳上。16])。最近关于HSV--1衣壳的研究表明，这是一个协调的多步过程，包括终止酶复合物与pIL 17的有序相互作用，它与pIL 25共同构成CVSC，并形成pUL6门户，导致嵌合基因组的断裂和每个衣壳中一个基因组的包装。随后，终止酶的释放伴随着门户的向外移位-3031]便利由五聚体pUL25密封门户。因此，一种假设可能是，pORF 19可以自发地(1)激活；或(2)在其ctd启动的过程中，由终末dna围绕着门脉顶点触发，这一过程与pORF 19的五聚体化是一致的。KCTD。值得注意的是，这样的五聚体化在五旬节周围的空间上要困难得多，因为后者离衣壳底部比入口更远，因此，通过CTD进行五聚体化将需要在CVSC螺旋束和/或三链结合中进行重大构象重排。
已在α-和γ-疱疹病毒中证实了五聚体门帽[4,6,18；然而，HSV-1 pUL25都没有。CTD [17]NOR MuHV-68 pORF 19MCTD在溶液或晶体中是五聚体，这表明五聚体化需要额外的触发器或稳定力。导致体内五聚体稳定性的一个可能因素可能是N-末端片段，在所有同源物的结晶CTD中都没有N-末端片段。然而，在衣壳上，这些部分是cvsc螺旋束的一部分，这些螺旋束对称地分布在门脉顶点附近，因此不太可能直接接触到使五边形稳定下来的。4–6,11,12,15,20,55]。另一方面，由5个对称cvsc副本确定的pORF 19 ctd的高局部浓度与pORF 19的浓度依赖的五聚体化相一致，与更广泛的突出的端子顶点相比，可能有助于五聚体的稳定。KCTD在体外。此外，我们的pORF 19KCTD五聚体结构显示，在横向界面上存在2乙酸根离子，使其稳定在晶体和溶液中。在细胞核中，在组蛋白乙酰转移酶(HATS)和组蛋白脱乙酰酶(HDACs)的活性之间，乙酸根离子被持续地从组蛋白中摄取或释放，成为基因表达的关键调控机制。56]。因此，我们不能正式排除乙酸离子也需要在体内形成KSHV门静脉帽。然而，在溶液中五聚氰胺化所需的高醋酸根离子浓度，加上缺乏乙酸离子的缓冲液也会引起pORF 19。KCTD齐聚和MgAc2而NAAC缓冲器诱导的齐聚程度要低得多。S5表)提示不同的触发器至少在体外可以改变单体-低聚物的平衡。决定体内五溴化的触发器的身份至今仍难以确定。
门静脉帽使衣壳能够承受被包围的病毒DNA基因组的排斥力所引起的高衣壳压力[25,57]。这表明：(1)门户和门静脉帽之间需要紧密相互作用，以防止过早的dna泄漏；(2)这种相互作用的中断，即门帽的拆卸或移除，是一个高度协调的过程，导致病毒基因组通过核孔复合体释放到核质[58,59].
最后，我们的结果表明，pORF 19的横向界面构成了疱疹病毒抑制剂未来发展的一个有吸引力的靶点。目前，大多数针对疱疹病毒引起疾病的治疗方案都针对病毒聚合酶，而且往往与严重的副作用有关。2])。入口顶点的独特特性和通过锁定KSHV pORF 19五元的横向界面来阻止其封口的可能性(图6)为利用基于结构的药物设计产生有效的新型抗病毒药物开辟了一个令人兴奋的前景。虽然pORF 19五胺化抑制剂在治疗KSHV引起的疾病方面的益处仍有待确定，但门静脉帽在α-疱疹病毒中是保守的，在β-疱疹病毒中也很可能是保守的，在那里开发更多的治疗方案是一种迫切的医疗需求。
材料和方法
结构设计与克隆
PUL77的表达结构CTD、pORF 19KCTD，以及pORF 19MCTD它们分别由180至642(HCMV PUL77)、123至549(KSHV PORF 19)和104至516(MuHV-68 pORF 19)组成，类似于已公布的HSV 1 pUL 25羧基末端片段的晶体结构。17]基于使用PROMALS 3D服务器的氨基酸比对[60]。这些基因片段被克隆到一个基于pET 28的载体上NCOI和诺蒂限制地点(适用于pUL77)CTD和pORF 19MCTD)或不受限制的克隆(适用于pORF 19)KCTD) [61]。PORF 19KCTD突变体由Quik突变位点定向诱变而成。本研究中使用的所有引物均列于S6表.
蛋白表达与纯化
PUL77CTD、pORF 19KCTD、pORF 19MCTD，以及pORF 19KCTD突变体在转化后的细胞质中表达。大肠杆菌IPTG(0.2mm)诱导Rosetta(DE3)细胞在16°C下培养20h6000.6。表达一种pORF 19的硒甲基酮衍生物KCTD，一种由个体转化而来的一夜之间的前文化。E. 大肠杆菌罗塞塔(DE3)菌落颗粒化，用M9最小培养基洗涤两次，再悬浮于1-L新鲜M9培养基中，37℃接种至OD 600为0.5。随后加入氨基酸混合物(100 mg苯丙氨酸、100 mg苏氨酸、50 mg异亮氨酸、50毫克亮氨酸、50毫克缬草碱和100毫克赖氨酸)，在30℃下培养30分钟后，用0.2mmIPTG诱导培养，并加入60毫克硒蛋氨酸。在16°C条件下，对硒甲基硫醚衍生物进行了24小时的表达。
为了纯化蛋白质，将颗粒化细菌重新悬浮在萃取缓冲液(50 mM Tris pH7.5、300 mM NaCl、40 mm咪唑、10%甘油)中，再用恒系统细胞干扰器在约21.8 KPSI下进行裂解。将澄清后的溶出液装到1ml HisTrap粗柱(德国索林根，GE Healthcare)上，在各自的提取缓冲液中进行预平衡。纯化的pUL77CTD、pORF 19KCTD，以及pORF 19MCTD用500 mm咪唑洗脱，然后用Superdex 200增加10/300 GL色谱柱(GE Healthcare)在含有高盐(1 M NaCl；pUL77)的SEC缓冲液(10 mm Tris pH 7.5)中洗脱。CTD)或低盐(50毫米NaCl；pORF 19)KCTD和pORF 19MCTD)。用分子量(MW)标准对柱进行了标定，并从相应的洗脱体积中生成了一条校正曲线，以使重组蛋白的寡聚态近似。
初始SEC后纯化蛋白浓缩至1mg/ml，用羧肽酶(Sigma，Taufkirchen，德国)消化，根据制造商的推荐去除羧基末端组氨酸标记。经0.45μM注射器过滤，再经2步纯化，从未消化蛋白质中分离出消化蛋白。首先，将该蛋白负载到HisTrap粗柱1-ml上，SEC用Superdex 200增加10/300 GL柱(GE Healthcare)在含有高盐(1M NaCl；pUL77CTD)或低盐(50 mm NaCl；pORF19KCTD和pORF19MCTD)的SEC缓冲液(10 mm Tris pH7.5)上进一步纯化。-杂志期刊论文发表
结晶与结构测定
所有蛋白质的晶体都是在18°C下生长的。CTD用静坐滴气相扩散法在含pUL 77的0.25μl的滴中生长了晶体。CTD(6 mg/ml)含0.08M Na-CaCO_2溶液pH 6.5、16%PEG 8000和20%甘油的油藏均为四方型油藏，含0.25mg/ml的μ1。P4122空间群，衍射到1.9。用相量分子置换法确定了其结构。62]和从pUL25(PDB2F5U，[17]).
原生pORF 19KCTD用悬滴气相扩散法在含有1μl的pORF 19的液滴中生长了晶体。KCTD含0.1M HEPES、pH7.5和1.69M醋酸锂的油藏溶液(6mg/ml)和1μ1.PORF 19KCTD结晶在P212121空间群和晶体衍射到2.6。与pUL77的晶体形成对比CTD和pORF 19MCTD，其中包含不对称单元pORF 19中的一个分子。KCTD晶体中每个不对称单元含有约10个分子，使得用分子置换法确定晶体结构变得困难。因此，我们种植了硒甲基硫氨酸pORF 19。KCTD含硒甲基硫蛋白pORF 19的0.5μ1滴中静坐滴气相扩散法制备的衍生物晶体KCTD含0.1M、MES、pH7.4和2M醋酸锂的油藏溶液(6mg/ml)和0.5μ1。我们在两个不同的空间群中得到了导数晶体(P21和P6322)分别衍射到3.3和3.2，用自SHARP[多波长反常衍射法]测定了晶体结构。63]。初步的电子密度图显示了1和2的五聚体pORF 19。KCTD每个非对称单元分别组装。用相位剂取代分子[62]和搜索模型这样的五聚体集合，可以根据2.6奥尔的本地数据集对结构进行改进。
PORF 19晶体MCTD在含有1μl pORF 19的液滴中用静坐滴气相扩散法生长。MCTD(6 mg/ml)和1μ1%聚乙二醇6 0 0 0和0.1 M HEPES pH7.5的油藏溶液，属于六角形P61太空群。最佳晶体衍射至1.9，结构由分子置换法确定。62]和从pORF 19导出的搜索模型KCTD结构。
所有晶体的数据采集都是在同步太阳电池(Proxima 1和Proxima 2)进行的。用XDS处理、缩放和减少数据[64无意义[65，以及来自ccp 4套件的程序[66]。使用Coot[67，并使用AutoBuster[68]使用MolProbity进行反复验证[69].
五聚体pORF 19的产生KCTDCC
设计共价连接的五聚体pORF 19KCTD，我们按照DulfideyDesign服务器的建议将2个脯氨酸残基突变为半胱氨酸[42]。相应的重组蛋白(PORF 19)KCTD得到了上述pORF 19的表达和纯化。KCTD。氧化型pORF 19KCTDCC是通过重组pORF 19生成的。KCTD在氧化缓冲液(0.1M HEPES pH7.5，0.5M醋酸锂)中，CC的最终浓度为3mg/ml。,2mm氧化谷胱甘肽(GSSG)，37℃孵育16h。用Superose 6增加10/300 GL柱，SEC进一步纯化氧化蛋白。
分析超离心
在分析超离心蛋白质实验室XL-I(德国科菲尔德贝克曼库尔特)上，使用AN-50 Ti转子，转速为40,000 rpm和20°C，用数据采集软件ProteomeLab XL-I Version 6.0(固件5.7)在280 nm或290 nm处测量了浓度分布。标准的3毫米或12毫米双扇形中心件分别填充100-或400-μl样品.在醋酸锂的存在下，钛的中心件(德国波茨坦的纳米仪器)被使用，否则被木炭填充的EPON中心件(贝克曼库尔特)。实验在10 mm Tris pH7.5和50 mm NaCl、100 mm HEPES pH 7.5和0.5 M醋酸锂、50 mm HEPES pH 7.5和0.5 M醋酸锂中进行，或在含有不同盐类型和浓度的缓冲液中进行。S5表.
对于数据分析，在SEDFIT程序中实现了扩散-反容微分沉降系数分布(连续c(S)分布)模型[70]使用。利用SEDNTERP程序计算了部分比体积、280 nm处的消光系数、缓冲密度和缓冲液粘度。71]并用于将实验s-值校正为s-值。20，w。密度(ρ=1.023?10)3公斤/米3)和粘度(η=1.262 MPa，?s)，用面积计(路德维希施耐德)和肖特KPG Ubbelohde毛细管粘度计(自动取样器)测量了含50 mm HEPES、pH7.5和0.5M醋酸锂缓冲液在20°C下的粘度[72]。对于含有100 mm HEPES pH7.5和0.5M醋酸锂的缓冲液，ANS20，w通过对32μm pORF 19下单体实验s值的比较，确定了1.449的校正因子。KCTD和S20，w单体在相同的缓冲液中，但与50毫米的HEPES。蛋白质浓度测定分光光度法，并给出了整个文本的单体。数字是用古西程序编制的。73].
结构分析
五聚体pORF 19内界面的掩埋溶剂可达表面积KCTD使用jsPISA[74]。利用事先知情同意[75]。用UCSF Chimera的“SegFit”工具对疱疹病毒衣壳-EM图谱进行可视化，并将晶体结构进行刚体拟合。40]。在拟合过程中，采用了从7.6奥尔的晶体结构生成模拟地图的选项。计算了模拟MAP与实验MAP之间的互相关系数，作为拟合质量的定量估计。数字是用Pymol(Http://www.pymol.org)和UCSF Chimera[40].
衣壳组装试验
PORF 19KCTD利用含有ORF 19-gfp的pFB 1(PFB1)杆状病毒转移载体产生突变体。44]；重组质粒按标准程序制备，并利用Effectene(德国希尔登，齐根)和一种用于转染Sf9细胞的方法将其转染到Sf9细胞中。果蝇S2细胞[76]，对Sf9细胞进行了2轮病毒扩增。免疫印迹法或SDS-PAGE法检测感染后72h内单个蛋白的表达，然后用Coomassie染色。在衣壳组装实验中，将Sf9细胞与编码pORF 25、pORF 17、pORF 17.5、pORF 26、pORF 62、pORF 65和pORF 32的7种不同杆状病毒(编码pORF 25、pORF 17、pORF 17.5、pORF 26、pORF 62、pORF 65和pORF 32)混合感染。细胞在衣壳提取缓冲液中溶解(ACC：500 mm氯化钠，1mm EDTA，20 mm Tris-HCL pH7.5，1%TritonX-100，蛋白酶抑制剂(罗氏，曼海姆，德国)，每50毫升1片)，在预冷保镖中进一步破裂，用声纳3200设定为60%10次，5秒在湿冰上停顿30秒。溶解液以75,000 g离心90 min，球粒再悬浮于5 ml行政首长协调会中，轻轻分层于20%~50%蔗糖连续梯度(15 ml 20%蔗糖+15 ml 50%蔗糖)，50,000 g离心90 min。离心后，从与衣壳相对应的蔗糖梯度底部分离出约15毫升的光散射带，如上文所述[44]?作进一步分析。-杂志期刊论文发表
抗体
下面列出了用于westernblot分析的初级和次级抗体。小鼠抗KSHVK-bZIP(sc-69797)是从圣克鲁斯生物技术(德国海德堡)购买的。抗β-actin原鼠抗体(A 2228)是从西格玛-奥尔德里奇(Taufkirchen，德国)购买的.为了检测KSHV LANA，我们使用了以前报道的一种大鼠单克隆抗LANA抗体。77]。HRP结合兔抗大鼠IgG抗体(3050-05)是从美国伯明翰的南方生物技术公司购买的，HRP结合的兔抗鼠IgG抗体(P 0447)和山羊抗兔IgG抗体(P 0448)是从美国达科(美国圣克拉拉市)购买的。抗ORF 26单克隆抗体(克隆2F6B8)来源于美国西雅图LSBio和英国剑桥郡Ely公司的Cy-3偶联二次抗体(Cy3亲和纯驴抗鼠IgG)。
KSHV-BAC 16突变体的产生
中生成不同的突变。PORF 19在携带KSHV基因组的BAC 16基因中，进行了基因突变。78]。从pOri6KI-SCEI载体中扩增出一盒卡那霉素抗性盒，该载体具有整合的Ⅰ-SCEI切割位点，其中包括携带突变的同源侧翼序列，直接在25μl反应中加入前引物的0.2μM，然后在17次PCR循环后加入相同数量的反向引物。以类似的方式，用卡那霉素抗性盒取代pORF 19球状结构域(残基123~549)，产生pORF 19基因敲除突变体。随后，重组熟练E. 大肠杆菌将携带KSHVBAC的GS 1783与PCR扩增产物进行电穿孔转化。筛选出对卡那霉素和氯霉素耐药的电穿孔菌，并进行酶切鉴定。
第二步，卡那霉素抗性克隆只与氯霉素在32℃下孵育3h，在32℃下加入1%L-阿拉伯糖1小时，诱导I-SCEI表达，在42°C培养25 min诱导重组酶。热休克后，将培养物恢复至32°C，共培养3h。对kanR标记缺失的筛选显示，最终克隆具有卡那霉素敏感性。
通过对整个KSHV BAC的限制性内切酶分析和下一代测序，证实了突变体中引入突变的存在。为此，用超声剪切纯化的BAC DNA。为了避免过度扩增造成的偏倚，使用KAPA实时库准备试剂盒(KAPA生物系统，美国马萨诸塞州威尔明顿)进行了文库准备，但PCR周期有限。用试剂试剂盒v3对MiSeq(德国柏林，Illumina)的质量控制库进行测序，生成2×300个碱基配对读。READS定位于KSHV BAC 16亲本株，并利用CLC基因组学工作台v9中的低频变异检测功能对突变体进行鉴定。
细胞培养
Hek-293(CRL-1573，美式培养物，ATCC)和多西环素诱导的iSLK细胞[46](由Erlangen大学Frank Neipel提供)在添加10%胎牛血清(FBS，Sigma)的DMEM(吉布科，Thermo Fisher Science，Waltham，Waltham)中培养。ISLK细胞加入250μg/mlG 418(Sigma，A 1720)。转染iSLK细胞(2×10)可获得稳定的iSLK细胞株。52μg bac dna(macherey-nagel(德国杜伦)，原子核邦德bac 100)与Fugene 6转染试剂(roche，11 814 443 001)按3：1的比例使用。第二天，细胞从6孔板转移到10厘米盘子中，24小时后用1.2毫克/毫升潮霉素B(PAN生物技术(德国艾登巴赫)，p 06-08020)进行筛选[45]在G 418面前。14d后，在150μg/ml潮霉素B和G 418存在下，保留所选的KSHV阳性细胞株。
感染性后代的溶质再活化和滴定
用2mM丁酸钠(SB)和2μg/ml强力霉素处理KSHV细胞72h，诱导KSHV裂解蛋白RTA的表达。为定量检测感染性病毒颗粒的产生，将诱导的iSLK细胞培养上清在4°C下664×G离心5 min，加入3×10。4Hek-293细胞在96孔板中，于前一天播种。在感染后32°C、450×G和72h离心30 min，用PFA固定细胞，用生物Tek的5细胞成像多模阅读器计数GFP阳性细胞，计算病毒滴度。-杂志期刊论文发表
细胞裂解和westernblot
在PBS中洗涤后，用SDS裂解缓冲液(62.5mm Tris-HCl pH6.8，2%(w/v)SDS，10%(v/v)甘油，50 mm DTT，溴酚蓝)溶解细胞。样品在17.949×G和4°C下离心10 min，制成颗粒细胞碎片。如有必要，在离心前对溶出物进行几秒钟的超声处理。用NanoDrop1000测量蛋白质浓度(Peqlab，VWR，Darmstadt，德国)。在95℃下煮沸5 min，用8%~12%SDS聚丙烯酰胺凝胶负载。采用精细加蛋白全蓝预染蛋白标准(1610373，Bio-Rad，Feldkirchen，德国)作为蛋白质标记.SDS PAGE后，蛋白在硝化纤维素膜上转移，在PBS-T缓冲液中孵育5%牛奶，阻断非特异性结合，并在4°C或室温1小时的滚筒孵育器上进行一次抗体孵育。在PBS-T中洗涤3个步骤后，用次级辣根过氧化物酶(HRP)结合抗体在RT下孵育1h。为了可视化地检测特定的蛋白质，在LAS-3000成像仪(Fujifilm，Duesseldorf，德国)上，使用SuperSignal West Femto Maximun敏感性底物(34096，Thermo Fisher Science，Waltham，USA)或自制的增强化学发光(Ecl)，研制了这种膜。
KSHV颗粒的纯化
检测转染wt或突变体pORF 19 BAC的iSLK细胞、互补细胞和未感染的iSLK细胞产生病毒的情况。此外，4×106细胞被镀在一个T 150瓶(每细胞10瓶)中，最终体积为每瓶20毫升。24小时后，用2mm Sb(默克)和2μg/ml强力霉素(Sigma，Taufkirchen，德国)处理KSHV。诱导后48小时，收集上清液，1,878×G离心10 min，4°C离心10 min，27,632×G，4°C离心4h，病毒颗粒在5 ml DMEM，10%FBS加冰2 ml 15%蔗糖(w/v)，离心1h，72,000，xG，4°C离心1小时后，再悬浮于30μl的MNT缓冲液(20 mm MES；100 mm NaCl；30 mm Tris)中；PH 7.4经KOH调节后，用DNase(罗氏)消化，并按制造商的推荐进行消化。在液氮中冷冻，保存在?80°C，待进一步分析(westernblot或qPCR)。
ISLK BAC 16-pORF 19突变体的互补
将pORF 19 wt克隆到逆转录病毒载体pSRS.SF.pORF19.mCMV.RFP670Pre中，该载体能表达由强鼠白血病病毒衍生启动子(SF)驱动的转基因基因，并在最小CMV启动子的控制下进行流式细胞分析，并克隆到3‘端重复序列(LTR)的修饰U3区[47,48]。控制载体编码人TRIM 5α和rfp基因。VSVg假型病毒载体粒子如前面所述[47]除了按照制造商的协议使用CAPHOS转染试剂盒(Sigma)对产生的293 T细胞进行转染。转染48h后取上清液，保存于?80°C。
将转染载体pORF 19 BAC的iSLKs转染上清液，加入4μg/ml硫酸鱼精蛋白，37°C、800×G离心1h，37°C孵育6h后转化为DMEM10%FBS。感染后72小时，1×107利用FACSAria融合技术，根据APC通道中的荧光强度对细胞进行分类，以检测RFP 670的表达(Becton Dickinson，Heidelberg，德国)。
转染wt或突变体pORF 19 BAC重组iSLK细胞的免疫荧光
转染wt或突变体pORF 19 bac的iSLK细胞，其辅助细胞和未感染的iSLK细胞被镀在玻璃表面(4×10)上。5每井6孔板的细胞)。24h后，用2mMSB(默克)和2μg/ml强力霉素(Sigma)诱导KSHV裂解周期。细胞活化后48小时，用PBS冲洗一次，用4%多聚甲醛(PFA；Roth，Karlsruhe，德国)固定20分钟。固定后，用PBS冲洗3次，用0.2%TritonX-100在PBS中渗透10 min。用10%FBS在37°C孵育1h，阻断非特异性结合，37°C下加入pORF 26(LSBio，10%FBS稀释1：200)1小时，pBS洗涤3次，Cy-3偶联抗体(CyTM 3-共轭亲和素-鼠抗IgG，稀释1：200，10%FBS中稀释1：200)与4μg/μl 4‘，6-二氨基吲哚-2(DAPI)混合；在37°C下加入热费舍尔科学溶液1小时，用10%FBS洗两次，用PBS洗两次，用ddH2O冲洗10×10，再用5μ1的ProLongTM玻璃防渗剂(Invitrogen，ThermoFisher Science，Waltham，USA)冲洗。幻灯片在RT夜间在黑暗中干燥，并在ZEISS 980航空扫描显微镜下拍摄。
转染wt或突变体pORF 19 BAC重组iSLK细胞的电镜观察
转染wt或突变体pORF 19 bac结构的iSLK细胞、互补的iSLK细胞和未感染的iSLK细胞被镀在玻璃细胞上(4×10)。5每井6孔板的细胞)。24h后，用2mMSB(默克)和2μg/ml强力霉素(Sigma)诱导KSHV裂解周期。感染后48小时，用2%戊二醛和2.5%甲醛固定在超声缓冲液(130 Mm)中。3)2麻生太郎2H，pH 7.4，2毫米CaCl2，10毫米MgCl2)1小时，并与1%(w/v)OsO 4在超声缓冲液(165 mm(CH))中进行对比。3)2麻生太郎2H，pH 7.4，1.5%(w/v)K3[Fe(CN)]6在50%(v/v)乙醇中隔夜加入0.5%(w/v)醋酸铀酰。细胞植入塑料(29.19g EPON 812，12.66 g DDSA，16.58 g MNA，0.75 ml DMP 30，Serva，Heidelberg，德国)和50 nm超薄切片平行于基质。图像用Morgani透射电子显微镜(FEI，Eindhoven，荷兰)在80 kV。
五聚体pORF19KCTDCC的阴性染色EM
5-μ1氧化的pORF 19KCTD在浓度为0.03mg/ml的SEC缓冲液中，将CC作用于辉光放电碳栅(铜支撑栅上的超薄碳膜，400目，美国哈特菲尔德电子显微镜科学)。孵育2分钟后，用水冲洗两次，然后用2%(w/v)醋酸铀酰溶液染色30秒。在Tecnai G上拍摄到了带有负电荷的EM网格220显微镜(FEI，Thermo Fisher Science，Waltham，美国)在200 kV下工作。照片是用一个轴上底部安装的鹰4k相机拍摄的(FEI，ThermoFisher Science，Waltham，美国)。在2D分类中，大约有12.000个粒子是用Warp[79]。关于救济3.0.8[80]用于提取大约12.000个粒子，使用260个盒子大小，并生成2D类平均数。
统计分析
在GraphPad Prism v9中对生物复制生成的数据进行了统计测试，并对多次比较进行了适当的校正：*P < 0.0001, ***P < 0.001, **P < 0.01, and *P < 0.05.
辅助信息
KSHV衣壳顶点模型。
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图S1.KSHV衣壳顶点模型。
五边形顶点的示意图(a，B)和入口顶点(c、D)，从上面(顶部)和侧面(底部)观察，说明主要的差异。为清晰起见，CVSC和PVAT的组分分别用橙色染色，颜色不同，分别描绘了pORF 19和pORF 32，而SCP pORF 65在六边形和戊子上分别呈浅灰色和深灰色三角形。CVSC，衣壳顶点特异性成分；KSHV，卡波西肉瘤相关疱疹病毒；PVAT，门静脉顶点相关被盖；SCP，小衣壳蛋白。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s001
(TIF)
图S2.重组蛋白的SEC分析。
(a-D)从HCMV pUL77中纯化单个CTDs后，Superdex 200的洗脱谱增加了10/300 GL大小的排阻柱(A)、KSHV pORF 19(B)，以及MuHV-68 pORF 19(C)。在所有的情况下，大部分的蛋白质以一个体积的速度溜走，大概与单体相对应。(D))氧化型pORF 19的排放剖面KCTDCC通过SEC分析与非氧化wt pORF 19的轮廓相一致KCTD。垂直红色虚线标记氧化的pORF 19的洗脱体积。KCTDCC与非氧化wt pORF 19KCTD (B)。氧化后的蛋白质以较早的体积排出，强调了寡聚状态的差异。所有色谱图的底层数据可在S3数据。CTD，羧基末端结构域；HCMV，人巨细胞病毒；KSHV，卡波西肉瘤相关疱疹病毒；MuHV-68，Muridγ疱疹病毒68；SEC，尺寸排除色谱；wt，野生型。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s002
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HSV-1pUL25(PDB2F5U)、HCMV pUL77、KSHV pORF 19和MuHV-68 pORF 19球状结构域的结构排列，通过与DALI服务器的配对比较得到[37]。洋红色或黄色背景颜色表示由ENDScript服务器确定的单个蛋白质的SSE[81HSV-1pUL25的编号和SSE显示在对齐上。黑色框框中红色的残基在所有4种疱疹病毒同源品中都是保守的。小写字母表示相对于HSV-1pUL25的插入。本研究中突变的五聚体残基被染成青色，带正电荷的残基在五聚体pORF 19的漏斗区域。KCTD蓝色的。HCMV，人巨细胞病毒；HSV，单纯疱疹病毒；KSHV，Kaposi肉瘤相关疱疹病毒；MuHV-68，Muridγ疱疹病毒68；SSE，二级结构元件。-杂志期刊论文发表
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s003
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图4。PUL 25的静电表面电位CTD以及它的同源词。
(A+B)在前面描述的pUL 25表面上，包含大量代表正电荷(左面板，PDB 2F5U)和相对面(右面板)的基本斑块，与相同方向的pUL25正字词表面的电荷分布相比较。静电势的表示和计算图3。CTD，羧基末端结构域。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s004
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S5图5.五聚体pORF 19的晶体填充KCTD戒指。
五聚体pORF 19的晶体排列KCTD环P212121空间组(顶部面板；每AU 2个环)，P6322空间组(中间面板；每AU 1圈)和P21空间组(底部面板，每AU 2个环)在侧面视图(左)和顶部视图(右)。每个AU中的第一个五边形环是绿色的，第二个是空间群(空间群)。P212121和P21)用红色来说明各自的晶体包装环境。在所有情况下，环横向相互作用，形成密集的层叠层；然而，不同的晶体晶格之间横向相互作用的类型不同，表明五元体是功能组装单元。Au，不对称单元；CTD，羧基末端结构域。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s005
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图6.PORF 19的2D分类KCTDCC.
用阴性染色EM图像进行单粒子分析，得到二维类平均值。CTD，羧基端结构域；EM，电子显微镜。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s006
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S1表对疱疹病毒衣壳组装重要的蛋白质的命名。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s007
(Docx)
S2表衍射数据的收集和细化统计。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s008
(Docx)
中3桌。正射结构中缺少的环。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s009
(Docx)
中4桌同构词之间的结构相似性。
使用DALI伺服器对列出的pUL25正字词进行配对分析的统计[37]。作为参考，Z分数低于2是没有意义的，而当比较来自两种不同晶体形式的同一蛋白质的结构时，则得到大约50的值(可作为大小大致相同的蛋白质的参考)。RMSD是Cα原子之间的均方根偏差。每个框中的第三行是“N/NT”，其中对齐残数(N)与对齐(NT)中的总剩余数(NT)进行比较。“%id”表示对齐后的%氨基酸同一性。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s010
(Docx)
中5桌。PORF 19的效率KCTD体外戊胺化。
所有病例的蛋白浓度均为127μM。“单体”和“齐聚物”的百分比是通过单体和低聚物峰的积分来计算的，如从沉降剖面得到的c(S)分布所示。图4A，右面板。由于单体和低聚物共沉淀在移动较快的边界上，因此低聚物的浓度被高估，不应视为绝对值，而应视为不同条件下促进pORF 19的能力的一种措施。KCTD寡头化。CTD，羧基末端结构域。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s011
(Docx)
中六桌本研究中使用的寡核苷酸列表。
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s012
(Docx)
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s013
(Xlsx)
S2数据Excel电子表格，包含图中的基本数值5B和6B.
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s014
(Xlsx)
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s015
(Xlsx)
“X”表示在主文本图中未显示的示例。在原始印迹中显示的三项图5A分析的目的是图5B.
Https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001423.s016
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致谢
我们感谢Stephane Roche(I2BC，Gif-Sur-Yvette)、Kay Grünewald(CSSB，汉堡)和Krey实验室成员的有益讨论；Simon Krooss帮助统计；同步波束线Proxima-1和-2的工作人员在太阳城帮助收集数据；Lidia Litz提供出色的技术援助；Norbert Mücke博士(DKFZ，Heidelberg)测试缓冲密度和粘度；Marija Backovic和Janna Bigalke对手稿进行批判性阅读。
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