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《FOXR 1调节应激反应通路，是大脑正常发育所必需的。-医学论文发表》

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《FOXR 1调节应激反应通路，是大脑正常发育所必需的。-医学论文发表》期刊在线投稿系统

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《FOXR 1调节应激反应通路，是大脑正常发育所必需的。-医学论文发表》期刊简介

FOXR 1调节应激反应通路，是大脑正常发育所必需的。-医学论文发表

· 安德烈莎·莫塔

· 汉娜·K·瓦克斯曼

· 瑞康，

· 加文·拉加尼

· 盛勇牛，

· Féodora L.Bertherat，

· 林恩·沃尔夫

· 克里斯汀·梅·马利钦

· 托马斯·C·马凯洛

· 大卫·R·亚当斯

· 威廉·A·加尔

· 程丽娜，

· 乌韦·贝弗特,

· 何安琪拉

· 发表日期：2021年11月1日

摘要

叉头盒(forkhead box，Fox)转录因子家族高度保守，在广泛的细胞和发育过程中起着重要的作用。我们报告一个人有严重的神经症状，包括产后小头畸形，进行性脑萎缩和全球发育迟缓。德雷沃错义变体(M280 L)FOXR 1基因。在蛋白水平上，M280L影响FOXR 1的表达，并因蛋白质的错折叠和蛋白水解而诱导核聚集表型。RNAseq和路径分析表明，FOXR 1在热休克反应、伴侣辅因子依赖的蛋白质复性和细胞对应激途径的反应中起着重要的转录激活和抑制作用。事实上，FOXR 1的表达是随着细胞压力的增加而增加的，这是一个直接控制细胞压力的过程。HSPA 6, HSPA1A和DHRS 2成绩单。M280L突变体使FOXR 1的应激反应能力受损，部分原因是参与应激反应通路的下游靶基因的调控受损。小鼠胚胎组织定量PCRFoxr 1在胚胎大脑中的表达。通过CRISPR/Cas9基因编辑，我们发现小鼠的缺失Foxr 1当新生儿存活时，会导致严重的生存缺陷。Foxr 1击倒老鼠可以减轻体重。新生儿进一步检查Foxr 1基因敲除的大脑显示，与小白鼠相比，大脑皮层厚度减少，脑室增大，这表明Foxr 1导致不典型的大脑发育。这些结果表明FOXR 1在细胞应激反应通路中起着重要作用，是正常大脑发育所必需的。

作者摘要

有严重神经症状的个体，包括产后小头畸形、进行性脑萎缩和全球发育迟缓，其外显子序列显示德雷沃中的错义变体FOXR 1基因是潜在的致病基因。FOXR 1是功能未知的叉头盒(Fox)转录因子家族的成员。FOXR 1在培养细胞中的过表达表现为弥漫性核定位，而FOXR 1突变体由于蛋白质错折叠而导致核聚集聚集。作为一种转录因子，FOXR 1可调控大量基因，包括参与蛋白质折叠途径的基因，而突变体则表现为应激应答基因的调控受损。虽然FOXR 1在大多数组织中低表达，但我们检测到Foxr 1在小鼠胚胎脑组织中的表达。使用CRISPR基因编辑，删除Foxr 1小鼠的基因导致出生时存活率下降。脑病理学Foxr 1敲除小鼠皮层厚度减少，脑室增大。我们的数据显示，FOXR 1调节的基因涉及到适当的蛋白质折叠和缺乏。Foxr 1在小鼠中，存活和大脑病理的下降与人类大脑中的观察相一致。

引用：莫塔A，香港华克斯曼，洪R，拉加尼GD，牛S-Y，Bertherat FL，等.(2021)FOXR 1调节应激反应通路，是正常大脑发育所必需的。PLOS Genet 17(11)：e1009854。Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854

编者：韦恩·N·弗兰克尔，哥伦比亚大学医学中心，美国

收到：2021年7月2日；接受：(二0二二一年十月一日)出版：2021年11月1日

这是一个开放存取的文章，没有所有版权，可以自由复制、分发、传输、修改、基于任何合法目的或以其他方式用于任何合法目的。该作品可在创作共用CC0公共领域奉献。

数据可得性：所有相关资料都在手稿中辅助信息档案。

供资：这项工作得到了国家人类基因组研究所(HG 000215至W.A.G.)内部研究项目的部分支持。并由美国国立卫生研究院(R21GM114629)提供给U.B.和A.H.。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

相互竞争的利益：提交人宣布，不存在任何相互竞争的利益。

导言

神经发育障碍是由于大脑发育异常和无法达到认知、情感和运动发育的里程碑。基因组学的进展促进了人类神经发育障碍的预后，并为了解疾病的分子机制提供了理论依据。1–3]。虽然一些因果基因是高度渗透的，但也有许多罕见的单核苷酸变化，对未知功能的基因产生有害影响。通过外显子测序，NIH未诊断疾病计划(NIH UDP)--NIH未诊断疾病网络(UDN)的一个临床站点--在单个等位基因中识别了一个变异体(M280L)。FOXR 1基因(叉头盒R1；NM_181721.2)在有严重神经症状的个体中，包括产后小头畸形、进行性脑萎缩和全球发育迟缓。

FOXR 1是进化上保守的叉头盒(Fox)转录因子家族的成员，其名称来源于在突变体中观察到的异位头部结构。果蝇基因叉头 (福克) [4–6]。突变果蝇在胚胎发生过程中，基因会引起头部皱褶退化的缺陷，从而导致成虫头部出现明显的尖头现象。自从发现福克，数百狐狸从酵母菌到人类的生物体中都发现了基因，这使它成为最大但探索最少的高等真核转录因子家族之一。7–8])。所有成员狐狸转录因子基因家族是由三个连接的α螺旋组成的核心fkh dna结合区的单聚螺旋螺旋蛋白。通孔一对类似蝴蝶翅膀或“翼螺旋”的圆环的小β片[9–11]。尽管FOX蛋白在DNA结合域具有高度的保守性，但它们结合不同的靶序列具有很大的特异性。FOX蛋白影响大量基因的转录调控，调控细胞增殖和细胞命运等主要发育过程。9,12–14]。人类遗传分析显示狐狸基因具有与大脑发育相关的重要生物学功能，包括FOXG 1(前脑大小的潜在决定因素；]15–17])和Foxp 2(声乐学习；[18–20])。此外，突变FOXG 1, FOXC 2, FOXL2, Foxp 1和Foxp 2对人脑发育有深远影响，包括小头畸形、智力障碍和语言障碍。21–25].

FOXR 1，又称FOXN 5(叉头盒N5)或DLNB 13，是一种含有fkh dna结合区的292个氨基酸蛋白质。26]。人类FOXR 1老鼠Foxr 1基因由6个外显子组成，外显子-内含子结构保守，表明FOXR 1在人和大鼠基因组之间具有良好的保守性。27]。基于基因组的组织表达联盟表明，FOXR 1在人脑和生殖器官中表达28]。人脑转录体显示FOXR 1在胚胎发育和出生后发育过程中在所有脑区表达，其在大脑中的表达水平在整个生命周期中保持不变(Https://hbatlas.org)。此外，原地杂交显示Foxr 1所有脑区均有表达，胞核内表达增强，与基于Allen脑地图集的人体组织表达谱一致[29]。然而，人们对FOXR 1的功能知之甚少。几项研究表明老鼠Foxr 1参与精子发生[30]。此外，人类的几个点突变FOXR 1已被证明与多种癌症有关，尽管这些癌的功能特征FOXR 1突变体尚未执行[31–33]。最近，Foxr 1被发现是斑马鱼必需的母性效应基因，是细胞分裂和存活所必需的。34].

在这里，我们报告了一种人类神经发育障碍，与一种罕见的变异FOXR 1。我们证明德雷沃错义的M280L变异体降低了HEK293T细胞FOXR 1蛋白的表达，并出现核点状聚集体，提示FOXR 1功能受损可能是致病性的。此外，我们还发现FOXR1M280L突变体对胁迫的反应能力受损，部分原因是参与应激反应通路的下游靶基因的调控受损。此外，我们的分析显示Foxr 1基因敲除小鼠表现出严重的生存缺陷。存活新生儿Foxr 1敲除小鼠的大脑皮层变薄，脑室增大，表明哺乳动物大脑的结构依赖于Foxr 1.

结果

**外显子测序发现一个发育迟缓的个体携带德雷沃错义变体*FOXR 1***

NIH UDP鉴定了一个先证者有严重的神经症状，包括出生后小头畸形、进行性脑萎缩和早期严重的肌张力低下。脑MRI表现为大脑皮层、脑桥、小脑进行性发育不全，与年龄匹配的正常脑扫描相比，1岁至5岁时脑室增大(P<0.01)。图1A和1B)。先证者还表现为生长迟缓、体重下降、身材矮小、脊柱侧凸、髋关节发育不良、踝阵挛和钟状胸部(S1表)。眼科异常包括视神经萎缩、皮层视觉损害和视网膜色素变性。神经肌肉异常包括深肌腱反射亢进、关节高活动、严重肌张力低下和头部控制不良。此外，先证者还具有肌原相、耳前凹、前耳廓和低耳。-医学论文发表

图1. 新的FOXR 1先证者有小头畸形和脑萎缩。

(A)MRI扫描中矢状面(上)和水平(下)视图的正常年龄匹配和先证者在1岁。(B)MRI扫描中矢状面(上)和水平(下)视图的正常年龄匹配和先证者在5岁。矢状面中的箭头显示先证者脑桥发育不全.此外，水平视图上的箭头显示先证者心室扩张，与年龄匹配的正常人相比。(C)红色字母P(黑方)表示先证者的家族的谱系。(D)Sanger序列分析证实新的FOXR 1变体。序列色谱图显示先证者II-4(红色箭头所示)和双亲及兄弟姐妹(绿色箭头)中都存在杂合变异体。顶部的字母表示氨基酸残基(Q=谷氨酰胺，C=半胱氨酸，M=蛋氨酸，L=亮氨酸，S=丝氨酸，P=脯氨酸)。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.g001

对未受影响的先证者、兄弟姐妹和父母进行外显子测序。3个可能的致病候选基因，雷帕霉素和FKBP 12靶基因。RAFT 1)，ATP酶Na+/K+转运亚基α3(ATP 1A3)，以及FOXR 1都被确认了。RAFT 1作为一种激酶，调节细胞的生长、增殖、运动和存活[35–36]。先证者有纯合子RAFT 1歧义变体，但EXAC数据库识别了一个未受影响的个体。RAFT 1变体。第二个候选人，ATP 1A3维持质膜钠钾梯度[37]。研究发现，一个具有相同变异的个体表现出轻微的学习障碍和眩晕症状。ATP 1A3中的变异被认为是导致最终表型的因素，并作为部分诊断(OMIM紊乱182350和/或128235)返回到家族。最后一个候选人是德雷沃错义变体FOXR 1，一个功能未知的基因，在兄弟姐妹或父母中没有被发现。图1c)。杂合子德雷沃非同义变异导致在280位(M280 L)出现蛋氨酸到亮氨酸的替代，并经Sanger测序证实(图1d)。M 280位于DNA结合区下游的FOXR 1蛋白的C末端。M 280在进化上高度保守，从哺乳动物、鸟类、爬行动物到青蛙和斑马鱼(图S1)。此外，M280L变异体的危害和致病性是基于注释相关耗竭的分数(分数为29.9，其中30分表示该变异体在人类基因组中处于前0.1%的有害变异中)、PolyPhen-2(评分：0.994/1.0)和突变体验(评分：0.99/1.0)而预测的。虽然初步诊断表明ATP 1A3对于这个病人已经做了变异，一个额外的变异，包括FOXR1M280L变异，不能排除的协同作用。

FOXR 1 M280 L突变体导致FOXR 1蛋白表达下降

检测FOXR1M280L突变体是否得到正确表达离体在HEK293T或COS 7细胞中瞬时转染FOXR 1野生型(WT)或M280L突变体，免疫印迹检测FOXR 1或GFP标记的FOXR 1蛋白。M280L突变体FOXR 1水平显著降低(图2A，2B和2C)。自FOXR 1作为一种转录因子，我们接下来测试M280L突变体是否影响转染无标记或GFP标记的FOXR 1 WT或M280 L的HEK293T细胞的FOXR 1核定位。Westernblot分析表明，FOXR 1 WT和M280 L蛋白均定位于细胞质和核组分中，核组分中表达量较高(图2D)。然而，与FOXR 1相比，M280L突变体在细胞质和核组分中的蛋白水平均有所降低。

(A)转染pCMV-Sport6人FOXR1WT或M280L突变体的HEK293T细胞FOXR 1的代表性免疫印迹及定量分析。GAPDH作为装载控制。图表示归一化为WT的GAPDH上的FOXR 1。未配对t-试验(n=4项独立实验，**p=0.0025)。(B)转染GFP、GFP标记人FOXR 1 WT或M280 L突变株HEK293T细胞FOXR 1的代表性免疫印迹及定量分析。GAPDH作为装载控制。图表示归一化为WT的GAPDH上的FOXR 1。未配对t-试验(n=5项独立实验，*p<0.0001)。(C)转染GFP、GFP标记的人FOXR 1或M280L突变株COS 7细胞FOXR 1的代表性免疫印迹及定量分析。GAPDH作为装载控制。图表示归一化为WT的GAPDH上的FOXR 1。未配对t-试验(n=4项独立实验，**p=0.0013)。(D)转染pCMV-Sport6或GFP标记人FOXR 1或M280 L的HEK293T细胞FOXR 1胞浆(C)和核(N)组分的代表性免疫印迹和定量分析。GAPDH和组蛋白H3分别作为细胞质和核负荷标记。图表示归一化为WT的GAPDH上的FOXR 1。未配对t-试验(n=5项独立实验，*p<0.0001)。测定细胞总FOXR 1在细胞质组分和核组分中的百分比。(E)定量PCR(QPCR)FOXR 1转染GFP、GFP标记人FOXR 1 WT或M280 L突变体的HEK293T细胞mRNA水平。图表示相对的FOXR 1MRNA表达趋于GFP。单因素方差分析图基多重比较检验(n=3项独立实验)。(F)转染GFP标记的人FOXR 1或M280L突变株HEK293T细胞FOXR 1的代表性免疫印迹及定量分析。用蛋白酶体抑制剂MG 132阻断后，定量免疫印迹法检测蛋白质稳定性。图表示归一化为未处理WT的GAPDH上的FOXR 1。单因素方差分析图基多重比较检验(n=3项独立实验，*p=0.0245，**p=0.0003)。(G)转染GFP标记的人FOXR 1、M280L突变体或缺乏最后12个氨基酸的FOXR 1 C端截短突变株HEK293T细胞FOXR 1的代表性免疫印迹和定量分析(Δ280-292)。用MG 132阻断蛋白酶体降解，检测FOXR 1、Δ2 80-292突变体的蛋白质稳定性。GAPDH作为装载控制。图表示归一化为未处理WT的GAPDH上的FOXR 1。单因素方差分析图基多重比较检验(n=3项独立实验，*p<0.0001)。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.g002

接下来我们研究了M280L突变体中FOXR 1水平的降低是否是由于转录或蛋白质稳定性的变化所致。在HEK293T转染细胞中，我们检测到等量的FOXR 1FOXR 1 WT和M280 L mRNA水平降低，提示M280 L蛋白水平下降不是转录减少所致。图2e)。为了检测蛋白质的稳定性，我们用细胞通透性蛋白酶体抑制剂MG 132处理转染的HEK293T细胞来阻断蛋白酶体通路。蛋白酶体抑制后，FOXR 1、WT和M280 L蛋白水平基本相同。这表明，M280L变异体使FOXR 1蛋白失稳，这可能是由于蛋白质折叠不当，使其易于通过蛋白酶体途径分解和降解。图2f).

最后，我们研究了含有M 280的短C端尾是否是稳定蛋白质所必需的.我们从M 280(Δ280-292)中产生了一个缺乏最后12个氨基酸的FOXR 1 C末端截短突变体。事实上，转染gfp标记的Δ280-292的HEK 293 T细胞已经降低了FOXR 1蛋白的水平，而在MG 132处理后，FOXR 1蛋白水平升高，说明FOXR 1 C端尾对FOXR 1蛋白的稳定性至关重要。图2G).

FOXR 1 M280 L诱导核聚集表型

为了研究M280L突变体是否改变了FOXR 1的细胞定位，我们用GFP、GFP标记的FOXR 1 WT、M280 L或Δ280-292突变体转染HEK293T细胞。GFP的免疫染色显示FOXR 1 WT主要在细胞核内呈弥漫性分布，与DAPI共定位，DAPI是一种核标记物(图3A)。相比之下，约13%的细胞转染M280 L突变体形成离散核点(图3b和图3C)。我们在转染M280L变异体的COS 7细胞中观察到了类似的表型。图S2)。在15点以上的细胞核中，单个点的平均大小<2μm。2，而含<5点的核团则有>4μm的聚集体。2 (图3)。这些结果表明，大点状可能是由小核聚结而形成的。此外，转染FOXR 1Δ2 80-292突变体的细胞具有相似的核点状模式，提示FOXR 1的C末端尾是蛋白质正确折叠所必需的。

图3.M280 L变异体诱导核点状体表型。

(A)转染GFP或GFP标记人FOXR 1 WT、M280 L或Δ280-292突变体的HEK293T细胞荧光图像。DAPI(蓝色)作为核标记物。标尺=20μm。(B)转染GFP标记的M280L突变体的HEK293T细胞荧光图像显示出一系列核点状表型。标尺=5μm。(C)FOXR 1点状表型细胞百分率的定量分析。单因素方差分析图基多重比较检验(n=3项独立实验，**p=0.0048，*p=0.0002)。(D)聚合体平均大小与每个核点数的相关分析。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.g003

新的FOXR 1依赖转录子的RNA序列分析鉴定

为了鉴定FOXR 1调控的靶基因，研究FOXR1M280L对HEK293T细胞进行RNA测序(RNAseq)的作用，我们对转染GFP、GFP标记的FOXR 1 WT或M280 L的HEK293T细胞进行了RNA测序(RNAseq)。主成分分析表明，除实验协变量和批处理效应外，三组聚类均为单独聚类。S3A图)。我们绘制了所有差异表达基因(Degs)的log(-2)折叠变化的热图，并勾画出五个相干簇(图4A)。GFP和FOXR 1 WT转染细胞的差异基因表达分析鉴定出2644个DEGS，其中1315个(49.7%)被上调，1329(50.3%)被下调(无花果)。4A和S3B)。为了确定FOXR 1 M280 L的作用，我们比较了WT和M280 L，鉴定出735个DEGS，其中561个(76.3%)上调，174(23.7%)下调。S3B图)。我们特别注意那些转录本，其水平显示FOXR 1 WT增加2倍，M280 L下降，如E组所示(图4B).

图4.FOXR 1野生型和M280 L突变体的RNAseq分析。

(A)分层聚类的热图表明，GFP、GFP标记的FOXR 1和M280 L之间存在差异表达基因(ROW)(折叠变化>2，p<0.05)。红色代表上调基因，蓝色代表下调基因。(B)基因簇‘E’的热图表明，与WT相比，FOXR 1基因在FOXR 1中上调，M280 L基因表达下调。(C)基因本体论(GO)术语在FOXR 1 WT和M280 L中的表达。(D)基因簇‘E’的热图显示几种伴侣蛋白在FOXR 1 WT中差异表达，在M280 L中下调。(E)火山图显示FOXR 1 WT与GFP对照、M280 L与GFP、FOXR 1 WT与M280 L之间的差异表达基因。值得注意的是，上调基因是红色的，而下调基因是蓝色的。没有意义的基因是灰色的。(F)定量实时PCR验证RNAseq分析显示FOXR 1驱动HSPA 6, HSPA1A和DHRS 2在M280 L突变体中被错误调控。图表示相对表达式。单因素方差分析图基多重比较检验(n=3项独立实验，*p<0.005，**p<0.005，P<0.0001)。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.g004

对E簇内生物过程的基因本体论(GO)分析表明，基因参与了热休克反应。这个簇包含功能相关的基因，这些基因与包涵体组装负调控、伴侣辅因子依赖的蛋白质折叠有关，德雷沃蛋白质折叠，细胞对应激的反应，以及hsf 1介导的热休克反应的调节，这些反应在FOXR 1中富集，在M280 L中被下调。4C和S4)。在总结表达褶皱变化和统计意义的火山图的基础上，在m280L中，对FOXR 1 WT和下调的上调基因包括：HSPA1A和HSPA 6(均为热休克蛋白hsp 70家族的成员)，以及DHRS 2(脱氢酶/还原酶SDR家族成员2，线粒体还原酶)(图4d和4e)。这些蛋白质在抗氧化应激中起保护作用。此外，当我们检查M280 L与GFP之间的火山图时，我们发现了M280 L与GFP之间以及WT与GFP之间的重叠转录本。图4e)。事实上，皮尔逊的高度相关性证实了这一点。r=0.96)检查日志2(折叠变化)在WT与GFP之间和M280 L与GFP之间，提示M280 L突变是由于FOXR 1蛋白水平降低而导致的功能亚纯性缺失。S3C图).

定量实时PCR(qrt-pcr)支持RNAseq数据HSPA 6, HSAPA1A和DHRS 2 (图4f)，证实基因在FOXR 1 WT中的表达上调，而在M280 L突变体中不上调。其他hsp，如囊囊, DNAJC 21和DNAJC6FOXR 1 WT组和M280 L组均增加。并非hsp 70家族的所有成员在m280 L突变体中都被错误地调控；例如，HSPA12A在FOXR 1 WT和M280 L突变体中，转录本均被上调。这些结果表明，FOXR 1驱动特异性HSP和一种重要的NADPH依赖的还原酶的表达，该酶可能与减轻氧化应激的细胞保护途径有关。以确定DEG是否包含FOXR 1响应元素的一致序列[14]，我们对每个簇的DEGS启动子区域进行了检测，但只有少数几个基因组成的C簇除外。每个簇包含一个包含FOXR 1共识元素的DEG子集，它可能是FOXR 1的直接目标，支持FOXR 1作为转录激活器和抑制器发挥作用(S3D图).

FOXR 1控制热休克伴侣和抗氧化剂NADPH依赖还原酶基因的表达

决定是否HSPA 6, HSPA1A和DHRS 2直接由FOXR 1调节，我们手动执行德雷沃目标启动子的基序分析，以确定ATG起始位点上游的一致dna结合位点(图6)。5A和S5)。我们找到了FOXR 1响应元素的强一致序列[14]在至少三个顶级FOXR 1调控基因的启动子区域内，HSPA 6, HSPA1A和DHRS 2 (图5B)。为了确定FOXR 1是否通过与它们的启动子序列相互作用来调节这三个基因的表达，我们使用了人类近端上游区域控制的双荧光素酶系统。HSPA 6(-1119至-113 BP)HSPA1A(-1053至-210 BP)或DHRS 2(-3329~-2313 bp)共转染HEK293T细胞GFP对照、FOXR 1 WT或M280 L突变体。我们发现HSPA 6, HSPA1A，和DHRS 2由FOXR 1 WT而不是由M280 L激活，表明这些启动子区域包含FOXR 1响应序列，并且是FOXR 1 WT的目标(图5c).-医学论文发表

图5.人类DNA结合-由FOXR 1结合的位点基序。

(A)FOXR 1反应元件显示一致的主序列和次级序列，受FOXR 1约束(改编自[14]). (B)推测的FOXR 1反应元件在三个高度调控的FOXR 1靶向基因的启动子中表示：HSPA 6, HSPA1A和DHRS 2. (C)双荧光素酶报告法检测gfp对照、FOXR 1 WT或m280 L共转染HEK293T细胞及相应细胞。HSPA 6, HSPA1A和DHRS 2荧光素酶记者。数据绘制为荧光素酶活性归一化为GFP对照。单因素方差分析-图基多重比较检验(n=3项独立实验，P<0.0002.0 5，*p<0.0002.0 1)。(D)由HSF 1约束的一致初级序列。假定的hsf 1反应元件在hsf 1的启动子中表示。FOXR 1。Gfp对照或gfp-hsf 1共转染HEK293T细胞的双荧光素酶报告试验FOXR 1荧光素酶报告员。FOXR 1突变体(Mut)由FOXR 1中的HSF 1反应元件组成，其中FOXR 1 WT中的两个TT残基突变为GG(下划线)。数据绘制为荧光素酶活性归一化为GFP对照。单因素方差分析图基多重比较检验(n=3项独立实验，**p=0.0062)。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.g005

已知许多hsp的表达受转录因子热休克因子1(Hsf 1)的调节，hsf 1对hsp有很高的亲和力。顺式-作用dna序列元件，包括hsf应答基因(如hsp 70蛋白)启动子中的热休克元件(Hse)。38]。HSF 1靶基因的延伸也优先于分子伴侣。例如，在C. 羊毛衫减少胰岛素信号的保护作用需要HSF 1和FOXO转录因子，非洲发展新议程-16，以防止蛋白质误折叠所造成的损害，并促进寿命[39–41]。根据对生物学过程的GO分析，在FOXR 1转染细胞中上调的转录本是与hsf 1介导的热休克反应(Hsf 1)相关的基因。S4图)。因此，我们测试了HSF 1是否可以调节FOXR 1，因为我们在FOXR 1(图5d)。利用人类FOXR 1上游区(-633~+1 bp)控制下的双荧光素酶系统，发现FOXR 1被GFP-HSF 1激活。图5d)。然而，当fxr 1中的hsf响应元件发生突变时，未观察到hsf 1介导的foxr 1激活。TTCTAGAAGGCTAGAA(Mut)离体表明人FOXR 1是HSF 1的靶点，HSF 1可能受细胞应激的调控。

FOXR 1表达在细胞应激反应中增加。

因为FOXR 1调节HSPA 6和HSPA1A转录本和它们也是HSF 1的直接靶点，我们推测FOXR 1的表达可能受应激诱导范式的直接调控。我们用两种不同的模式诱导细胞压力：血清剥夺(代谢应激24小时)和CO。2-剥夺(氧化应激24小时)。转染FOXR 1 WT的细胞在血清和CO的作用下，FOXR 1蛋白水平分别增加了2.5倍和3.3倍。2-与无压力的情况相比，分别被剥夺(图6a)。FOXR 1蛋白水平的增加与核FOXR 1的增加(图6B)。相比之下，FOXR 1 m280 L蛋白水平在CO下也增加了3.3倍。2-剥夺而非血清剥夺，表明M280L突变体可能对不同类型的环境应激敏感。事实上，M280L突变体转染细胞中的核聚集体数量是对CO的响应。2-剥夺增加，但不是对血清的反应-剥夺(S1视频).

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图6.FOXR 1的表达在细胞应激反应中增加。

(A)转染gfp、gfp标记FOXR1WT或M280L突变体的HEK293T细胞FOXR 1对血清和CO的代表性免疫印迹及定量分析2剥夺。GAPDH作为装载控制。图表示归一化为未处理WT的GAPDH上的FOXR 1。单因素方差分析、图基多重比较检验(n=4项独立实验，**p<0.0051)。(B)GFP标记人FOXR 1 WT或M280 L转染HEK293T细胞对血清和CO的反应2剥夺。标尺=20μm。(C)转染GFP标记人FOXR1WT或M280L的HEK293T细胞荧光图像显示，PMA是一种NADPH氧化酶激活剂，具有增强活性氧活性(ROS)的作用。细胞在24小时后固定，用一种光稳定的ROS传感器CellROX评估ROS的生成。标度BAR=20μm.表达FOXR 1点状表型细胞百分率的定量分析。未配对t-试验(n=4项独立实验，*p<0.0001)。(D)PMA处理HEK293T细胞条件培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的水平。阳性对照是用裂解缓冲液处理的一组细胞。数据表示根据吸收读数在490 nm归一化为阳性对照。单因素方差分析图基多重比较检验(n=3项独立实验，*p<0.0001)。(E)PMA处理后HEK293T细胞的代表性免疫印迹和定量分析显示FOXR 1表达增加。图表示归一化为未处理WT的GAPDH上的FOXR 1。单因素方差分析图基的多重比较(n=5项独立实验，*p<0.0001)。(F)转染GFP、GFP标记人FOXWT或M280L的HEK293T细胞HSPA 6、HSPA1A和DHRS 2蛋白水平的定量分析。图表示GAPDH上符合GFP的感兴趣的蛋白质。单因素方差分析图基的多重比较(n=3-5个独立实验，*p<0.05，**p<0.005，*p<0.0005)。(G)转染GFP、GFP标记人FOXWT或M280L并经PMA处理的HEK293T细胞HSPA 6、HSPA1A和DHRS 2蛋白水平的定量分析。图表示GAPDH上符合GFP的感兴趣的蛋白质。单因素方差分析图基的多重比较(n=2-3个独立实验，*p<0.05)。

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为了进一步探讨FOXR 1与氧化应激的关系，我们将FOXR 1基因转染的HEK293T细胞用佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)处理，PMA是已知的一种药物NADPH氧化酶激活剂，通过蛋白激酶C介导的途径增强活性氧(ROS)。42]。我们使用一种光稳定的ROS传感器--CellROX，通过荧光成像来评估ROS的生成。与其他应激模式一致，PMA增强了转染FOXR 1 WT和M280 L的HEK293T细胞的ROS生成。图6c)。PMA能增强转染FOXR 1 WT的HEK293T细胞的扩散FOXR 1荧光。转染m280L突变体的细胞的核聚集数较非pma处理增加3.9倍(P<0.05)。图6c和S2视频)，提示ROS诱导突变FOXR 1蛋白在应激反应中聚集。为了确定ROS诱导FOXR 1蛋白的聚集是否具有细胞毒性，我们测定了释放到培养液中的乳酸脱氢酶(LDH)的数量。在PMA诱导ROS毒性的同时，我们发现单独转染GFP的细胞与GFP标记的FOXR 1 WT之间或FOXR 1与M280 L之间的细胞LDH无变化，表明细胞核聚集物不具有细胞毒性。图6d).

我们发现，转染FOXR 1 WT和M280 L突变体的细胞经PMA处理后，FOXR 1蛋白水平分别提高了2.3倍和1.8倍。图6e)。同时，我们发现转染FOXR 1的细胞HSPA 6和DHRS 2蛋白水平都有升高。图6F和6G)。经PMA处理后，M280L突变体HSPA 6水平升高。相反，我们没有观察到在转染M280 L的细胞中DHRS 2蛋白表达水平的任何变化，无论PMA处理。此外，虽然我们观察到HSPA1A转染FOXR 1 WT细胞的mRNA水平图4)转染FOXR 1 WT或M280 L的细胞HSPA1A蛋白水平无明显变化。然而，与FOXR 1 WT相比，我们发现转染M280 L的细胞HSPA1A蛋白水平下降，但这种差异在PMA处理后消失。-医学论文发表

M280L突变体中的FOXR 1核点不溶性

为确定转染M280L突变体的HEK293T细胞中形成的核点状体是否为侵袭体，可作为错误折叠或聚集蛋白的储存箱[43转染的HEK293T细胞经PMA处理后，用恒蛋白染色染色。染料检测细胞中错误折叠和聚集的蛋白质。我们发现在表达m280L突变体的细胞中，与核点状体共存的蛋白体阳性聚集体有明亮的点状染色，而在FOXR 1 WT中则没有。图7a)。这些结果与用细胞渗透蛋白酶体抑制剂MG 132处理的表达m280 L的转染细胞相似，进一步支持m280L变异体不稳定FOXR 1蛋白并形成核聚集体。图7B).

图7.M280 L核团是不溶性错折叠蛋白。

(A)GFP标记人FOXR 1 WT或M280 L转染HEK293T细胞并经PMA处理的荧光图像。24小时后固定细胞，免疫标记蛋白标记。中间面板中的白色方框表示在较高放大率下显示在底部面板中的图像。顶部和中部面板，标尺=20μm。底部面板，标尺=10μm。(B)转染GFP标记的M280L和MG 132处理的HEK293T细胞荧光图像。24小时后固定细胞，免疫标记蛋白标记。标尺=10μm。(C)GFP标记M280L转染HEK293T细胞的延时成像研究。顶部的面板显示了核聚集体正在进行广泛运动和融合的图像。下面的面板显示了融合事件的示意图。标尺=5μm。(D)用Tris-HCl、Triton X-100、Sarkosyl和SDS依次提取FOXR 1。定量结果表明，沙克糖组分中FOXR 1的含量不显著(N.S.)在WT和M280 L之间。而M280L突变体中SDS的含量明显高于Tris-HCl的总含量。单因素方差分析图基的多重比较(n=2个独立实验，*p=0.0003)。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.g007

错误折叠的蛋白质经常暴露其疏水结构域，导致聚集[44–45]。此外，大多数聚集的蛋白质倾向于聚结并形成大量沉积，如侵入体或包涵体[46–47]。以前的研究表明，多q蛋白(如共济失调素-1)的核和细胞质聚集体是动态的，它们的组成相互交换，而共济素-3则是不动的。48–49]。事实上，转染gfp标记的m280L的HEK293T细胞的时移活细胞成像表明，这些核团具有很强的动态性，并经历了广泛的运动和融合，小的聚集体相互移动，并融合形成更大的聚集体(图7c和S3视频).

入侵体内沉积的错折叠蛋白的另一个标准是它们很大程度上是不溶于洗涤剂的。46,50–53]。因此，我们检测了M280 L聚集体与FOXR 1 WT的生化特性，检测了转染GFP、GFP标记的FOXR 1 WT或M280 L的HEK293T细胞的蛋白质裂解物在不同洗涤剂中的溶解度。用Tris-HCl缓冲液、含1%Triton-X 100、1%Sarkosyl的Tris-HCl缓冲液、2%SDS依次提取蛋白质提取物。用免疫印迹法检测各组分中提取的FOXR 1含量。在Tris-HCl可溶性、Sarkosyl可溶性和SDS可溶组分中检测到GFP-FOXR 1 WT，但在Triton X-100组分中不存在，说明FOXR 1蛋白大部分是可溶性的，与膜结合蛋白无关(图7d)。而大多数M280 L在SDS组分中检出，而在Sarkosyl组分中未检出，表明大部分蛋白不溶性和聚集性，这与Proteostat免疫标记法显示的聚集增强相一致。

***Foxr 1*敲除小鼠皮层变薄和心室增大**

人FOXR 1与小鼠同源性为66%。S6A图)。使用针对小鼠的特异性引物Foxr 1，我们用qPCR证明Foxr 1在胚胎第17天，在心脏、肝脏、肺和脑组织中都检测到了mRNA的表达。S6B图)。为了更好地理解FOXR 1在哺乳动物脑发育中的作用，我们研究了Foxr 1通过分析缺乏Foxr 1使用CRISPR/Cas9基因编辑系统的基因。单导RNA(GRNAs)被设计成针对内含子1和外显子4的大部分，从而破坏了外显子4剪接受体(图8a)。这导致外显子2，3和大部分外显子4的缺失，导致976 bp的缺失，从Chr 9：44435486到44436461。纯合子Foxr 1基因敲除小鼠是由交配杂合子产生的。Foxr 1突变的老鼠。提取基因组尾DNA，用PCR进行基因分型，并在第一个内含子中扩增引物对进行Sanger测序验证。Foxr 1野生型等位基因和引物对从第一个内含子扩增到第5个外显子，以注释跨越整个基因的核苷酸位置。Foxr 1缺失区8A和8B和S6C)。分析Foxr 1逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)证实Foxr 1在大脑中的表达Foxr 1基因敲除小鼠与野生型和杂合子对照比较(图8c).

图8. Foxr 1敲除小鼠表现为皮质变薄，脑室增大。

(A)代表对用于生成的CRISPR/Cas9目标定位战略的示意图Foxr 1击倒老鼠。这个Foxr 1位点由5个外显子(彩色盒)和内含子(黑线)组成。两个gRNAs(红线)，一个位于内含子1的上游和一个位于第4外显子内的下游被用来针对Foxr 1基因和删除976个核苷酸，包括外显子2，3和部分外显子4(蓝盒)。引物以黑色半箭头表示，以指示前向(引物1)和反向基因型引物(引物2和引物3)的相对位置。(B)具有代表性的引物组1和2(A组)的PCR基因分型结果用于检测Foxr 1野生型等位基因(354 Bp)。下面是对引物集1和3进行检测的具有代表性的PCR基因分型结果。Foxr 1野生型(1381 Bp)、杂合子(野生型1381 bp、敲除403 bp)和基因敲除等位基因(403 Bp)。(C)RT-PCRFoxr 1(175 Bp)和18S核糖体转录本(129 Bp)Foxr 1击倒老鼠。(D)子代数的基因型分析Foxr 1出生后第21天(P21)杂合子杂交。(E)中华人民共和国初生子代数量的基因型分析Foxr 1出生后0天杂合子杂交(P0)。(F)野生型和Foxr 1击倒新生儿，显示其体积缩小Foxr 1敲除突变体。(G)体重测量(克)Foxr 1野生型(n=53)、杂合型(n=120)和基因敲除小鼠(n=12)在出生后0天出现下降。Foxr 1击倒老鼠。单因素方差分析图基的多重比较(*p<0.001)。(H)尼氏染色脑切片Foxr 1野生型(+/+)、杂合子(+/-)和敲除(-/-)小鼠。顶部面板显示bregma前面的冠状面。虚线代表皮层测量0°，45°和90°(相对于中线)到皮亚面。白色方框表示底部面板的放大倍数。标尺=500μm。底部面板代表皮质的更高放大率，垂直线表示皮质厚度的测量。侧筋划分不同的皮层层。标尺=125μm。(I)脑组织切片免疫染色Foxr 1野生型和敲除型老鼠。顶部面板显示bregma前面的冠状面。白色方框表示底部面板的放大倍数。标尺=500μm。底部面板代表皮质的更高放大率，垂直线表示皮质厚度的测量。标尺=125μm。(J-L)4例野生型、4例杂合子和4例混合脑切片皮质厚度的定量研究Foxr 10°、45°和90°(相对于中线)敲除小鼠的皮亚面。图表示相对厚度归一化为野生型(WT)。单因素方差分析图基多重比较(0°，*p=0.0165；45°，**p=0.0033，*p=0.0003；90°，**p=0.0019，*p<0.0001)(M)4例野生型和4例合并脑切片心室面积的定量研究Foxr 1击倒老鼠。图表示相对厚度归一化为野生型(WT)。单因素方差分析图基多重比较*p=0.04野生型和敲除型；p=0.02杂合子和敲除。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.g008

交配Foxr 1杂合子小鼠偏离正常孟德尔期望1：2：1的比例Foxr 1+/+: Foxr 1+/-: Foxr 1-/-出生后21天(χ2=18.576，df=2，p<0.001)。在85只老鼠中，32只是Foxr 1+/+，48人Foxr 1+/-只有5人Foxr 1-/-，从而显示严重的生存缺陷，仅占23.5%Foxr 1基因敲除小鼠存活至出生后第21天(图8d)。以决定是否删除Foxr 1在胚胎发育或出生后的第一个星期内，我们分析了Foxr 1杂合子在出生后第0天立即穿越(P0)。在223只P0小鼠中，61只是Foxr 1+/+，143人Foxr 1+/-19人Foxr 1-/-(χ2=33.619，df=2，p<0.001)。我们观察到~34%Foxr 1击倒存活在P0的小鼠，表明大多数的Foxr 1基因敲除小鼠在胚胎发育过程中死亡(图8e)。此外，幸存的新生儿Foxr 1击倒老鼠看起来比它们的小白蚁小24.5%。图8F和8G).

我们接下来研究的是Foxr 1新生儿脑组织的缺失分析Foxr 1小鼠进行连续切片染色，免疫标记尼氏(Nissl)和麻黄2(Map2)。图8H和8i)。我们分析了Foxr 1野生型，杂合子和敲除大脑在不同的解剖位置(bregma的前面，bregma，和bregma的后部)在三个不同的角度(从中线0°，45°和90°)测量到软脑膜表面(S7图)。连续脑切片显示皮质板厚度~11.3%Foxr 1基因敲除小鼠与野生型小白蚁比较(图8j，8K和8L)。此外，我们还发现脑室增大了34.6%Foxr 1与野生型小白蚁相比，敲除小鼠(无花果)8m和S7). Foxr 1杂合子小鼠没有出现任何组织学异常，包括皮质变薄或心室增大。

讨论

UDN已经确定了一个有严重神经症状的个体，并将一个错误的变体联系在了FOXR 1基因是罕见神经发育障碍(图1)。当然，在第二个基因中有可能引起疾病的变异体，ATP 1A3使FOXR 1表型贡献的确定复杂化。然而，临床过程的整体严重程度并不具有以下特点：ATP 1A3-迄今报告的相关疾病。因此，我们假设FOXR 1，基于我们描述的工作，是最终表型的额外贡献者。单曲德雷沃错义变体FOXR 1将氨基酸280处高度保守的蛋氨酸残基转化为亮氨酸，并根据几个基于web的应用程序预测其具有破坏性和致病性。事实上，我们发现FOXR 1中的M280L变异会导致FOXR 1蛋白水平的大幅下降，这是由于蛋白质的不稳定性。图2)。蛋白酶体抑制后，FOXR 1 WT和M280 L蛋白水平基本相同，提示M280 L突变体破坏了FOXR 1蛋白的稳定性，这可能是由于蛋白质折叠不当，使其易受蛋白酶体途径的蛋白质水解和降解所致。为了支持这一发现，我们发现M280L变异体形成了离散的核点，与蛋白质染色共定位，与FOXR 1 WT中的扩散核模式定位相比，它识别错折叠和聚集的蛋白质(图1)。3和7)。M280 L核点状具有大多数聚集蛋白的特征，其中较小的聚焦点聚集形成较大的不溶于洗涤剂的聚集体，从而损害FOXR 1的功能。我们发现FOXR 1的C端序列对确定蛋白质稳定性有重要意义。一个缺失M 280(Δ280-292)最后12个氨基酸的FOXR 1 C末端截短突变体模仿M280 L表型，表明M280L变异极有可能影响蛋白质结构或蛋白质与蛋白质的相互作用对蛋白质稳定性至关重要。

在此，我们利用RNAseq技术在HEK293T细胞中通过一个无偏倚的转录筛选，确定了FOXR 1调控的靶基因。图4)。在启动子中包含FOXR 1一致序列的DEGS表明FOXR 1作为转录激活因子和抑制因子。对FOXR 1 WT反应最强烈的基因，在M280 L中表达下调，其中包括Hsp 70家族的两名成员(HSPA1A, HSPA 6)和一种线粒体还原酶，DHRS 2。这些蛋白质中的每一种都在介导减轻氧化应激的保护性细胞反应中发挥作用。此外，顶级的FOXR 1调控基因HSPA 6, HSPA1A和DHRS 2在启动子区域中包含FOXR 1响应元素。荧光素酶分析表明HSPA 6, HSPA1A和DHRS 2是FOXR 1的靶点，而M280 L则取消了它激活这些目标基因表达的能力。然而，需要额外的染色质免疫共沉淀数据来显示与这些目标基因启动子的直接结合。同时，我们发现DEGS的表达增加，HSPA 6, HSPA1A和DHRS 2在RNAseq实验中，与荧光素酶的检测结果相比要高得多。这可能是因为我们只克隆了一个靠近荧光素酶转录起始点的启动子序列的子集。因此，在上游可能还有其他重要的调控元件，它们是这些基因完全激活所必需的，包括需要与其他共调控基因组序列结合的蛋白质。

细胞通过激活特定的生理途径，增加伴侣蛋白的丰度或活性，从而防止蛋白质误折叠，保护蛋白质组，维持蛋白质平衡，从而对环境应激产生反应。54–57]。其中一个重要的机制是诱导HSP的表达，例如在急性细胞应激期间通过分子伴侣作用帮助维持蛋白质平衡的HSP 70大家族。58–60]。众所周知，HSF在HSF与HSP启动子区域内的热休克元件结合时，调节了几种热休克蛋白的表达。61]。然而，现在有越来越多的证据表明，Fox家族的转录因子也影响HSP的表达。例如，FOXO亚家族的转录因子在保护生物体免受压力方面发挥着重要作用。62–64]。双管齐下FOXO基因果蝇 (DFOXO)和C. 羊毛衫 (DAF 16)是转录激活因子HSP 70又小热休克在氧化应激下维持蛋白质平衡的基因。DAF 16维持C. 羊毛衫通过转录增加一个小的子集热休克重要基因在非洲发展新议程-16依赖寿命延长[39,65]. 果蝇DFOXO还能诱导HSP基因在氧化应激下的转录，从而产生对ROS的抗性[66]。哺乳动物FOXO 3和FOXM 1通过上调过氧化氢酶和锰超氧化物歧化酶(MnSOD)调控氧化应激抗性的基因表达程序，这些酶参与活性氧的解毒[63,64,67,68]。在此，我们发现FOXR 1蛋白水平在代谢和氧化应激下增加，这也增加了HSPA 6和DHRS 2蛋白水平。我们证明HSF 1与FOXR 1启动子结合并诱导其转录，提示FOXR 1是HSF 1的靶基因。HSF可能是一种对应激产生反应的转录因子，与FOXR 1的交叉作用是对特定应激刺激的目标基因进行微调转录。

人类基因分析表明，几种福克斯转录因子在大脑发育和突变过程中具有重要的生物学功能。狐狸基因对大脑的发育和功能有着深远的影响。FOXG 1原称脑因子-1(BF-1)，是最早表达于神经细胞类型和组织中的转录因子之一。FOXG 1主要在端脑和端脑中表达。FOXG 1基因敲除小鼠出现严重的小头畸形，大脑半球缩小。69]。机械地说，FOXG 1与Groucho/Transfering样增强子家族(TLE)的全球转录抑制子相互作用，提示FOXG 1作为转录抑制因子，协调神经祖细胞增殖的调控和分化的时机[70]。扰乱FOXG 1在人类中，会导致大脑异常，包括小头畸形和胼胝体发育不全。17,24,71]。此外，Foxp 1和FOXP 2中的人类突变也会导致严重的语言和认知障碍[18,19,25,72–74而且，这两种基因也与自闭症谱系障碍有关。74–77]。的作用FOXR 1在大脑发育中，我们检查了小鼠的零突变Foxr 1利用CRISPR/Cas9基因编辑。我们发现大部分纯合子空Foxr 1突变体会在围生期死亡。此外,Foxr 1与未发现的野生型和杂合子对照相比，敲除小鼠的皮质变薄，心室增大，提示：Foxr 1是生存和正常大脑发育所必需的(图8)。由于先证者是m280 L突变的杂合子，所以先证者可能与杂合子相似。Foxr 1老鼠在某些方面。我们没有发现任何组织学异常Foxr 1杂合子小鼠根据qPCR数据，Foxr 1杂合子小鼠的表达与野生型小鼠相似。这表明M280L突变的不稳定性可能导致功能蛋白水平低于杂合子个体。此外，我们不能排除M280L突变可能是一个显性阴性表型，其中一些部分的蛋白质在核聚集体中是功能的。-医学论文发表

FOXR 1在HEK293T或COS 7细胞中不表达。因此，本研究的一个局限性在于它是基于异位过表达模型来研究FOXR 1功能的。然而，转染FOXR 1 WT的HEK293T细胞的RNAseq分析为以后的研究提供了理论依据。例如，一些上调的基因参与核糖体的生物发生，如核糖体生物发生调节因子1(RRS 1)和神经系统发育(MTURN, PDZD 8, PTPRZ 1, Noch 2)。由于HEK293T细胞起源于神经嵴细胞，这可能解释了几个神经元特异性基因的表达。核糖体生物发生是神经发育的关键驱动因素，核糖体发生失调导致神经发育综合征，表现为小头畸形、孤独症、智力缺陷和/或进行性神经变性[78]。此外，核糖体组装是一个需要能量的过程，核糖体生物发生过程中任何步骤的改变都会使细胞极易受到蛋白质毒性应激的影响，从而迅速激活特定的应激通路，协调地上调热休克靶基因。79]。FOXR 1可能在核糖体组装过程中对蛋白质毒性应激起保护作用，而核糖体组装在脑发育过程中起着至关重要的作用。我们推测FOXR 1是一种转录因子，调节大脑发育过程中所需的关键基因，参与平衡生长和蛋白质稳态。因此，了解FOXR 1如何调控基因的转录，以及如何影响大脑发育，是未来实验需要解决的重要问题。

材料和方法

道德声明

这项研究的研究伦理批准是由国家人类基因组研究所(NHGRI)，机构审查委员会(#76-HG-0238)提供的。所有被描述的研究参与者都签署了NHGRI，机构审查委员会批准的协议#76-HG-0238。未满18岁的参加者须获得参加者父母的同意。

先证者登记及同意

先证者在美国国立卫生研究院未诊断疾病计划(NIHUDP)中进行了评估，并被国家人类基因组研究所(NationalHumanGenomeResearchInstitutionInstitutionReviewBoard)批准加入该方案。先证者的父母为进行医学和遗传学研究提供了书面知情同意，以便进行医疗诊断。先证者和年龄匹配的正常人的MRI图像来自其他UDP病例。

外显子测序

外显子测序使用从研究参与者和家庭成员的外周血样本中提取的基因组DNA进行，在知情同意后进入机构审查委员会批准的协议(76-HG-0238)。利用TruSeq Exome富集试剂盒(Illumina，San Diego，CA)使用制造商协议进行外显子捕获，并在HiSeq 2000测序系统(Illumina)上进行测序。对人类基因组参考序列(UCSC组装hg 19，NCBI Build 37)进行比对，采用高效的核苷酸数据局部比对算法(伊兰，Illumina，Inc.)如前所述[80]。简单地说，配对末端(Pe)读取是独立地对齐的，唯一对齐的读取被分组成大约100 kb的基因组序列间隔，而没有对齐的读被与PE伙伴绑定。伊兰使用PE信息。映射在多个位置的读取被丢弃。为了使双读与它们各自的100 kb基因组序列对齐，交叉匹配，使用了基于smith-Waterman的局部对齐算法，该算法基于以下参数-minScore 21和-masklevel 0(Http://www.phrap.org)。基因型是用贝叶斯基因型(最可能的基因型)来鉴定的。81]。选编德雷沃Sanger测序法检测外显子序列所检测的变异体。Sanger测序证实已鉴定的变异体在FOXR 1引物5‘-AAAGCACTTCCTTTTTCC-3’(正向)和5‘AGTTTTTCCCATGGATTC-3’(反向)。

表达载体的构建

全长人pCMV-Sport6FOXR 1质粒来源于GEDharmacon(克隆ID 5164198；登录号：BC 038969)。人M280 L变异株FOXR 1利用QuikChangeⅡ位点定向突变试剂盒(Agilent Technologies)，在pSport 6人FOXR 1质粒中引入碱基280(蛋氨酸转亮氨酸)点突变，得到以下5‘-CCAACAGCTTGAGGCAGCCAG-3’和5‘-ATACTTTCTAGCCGGGGGAAG-3’(反向)引物。这个FOXR 1利用5‘-AAAGCACTCGAGATGGGAGAGCTCTTTCTG-3’和5‘-TTTGCCCGGTATAGATCAGAGGAAGGG-3’(反向)引物对野生型和M280 L突变体进行PCR扩增，并亚克隆入pEGFP-C3(Clontech)的XhoI和SacII限制性位点。若要生成FOXR 1C端截短变异体，Δ280-292，我们使用全长度的人gfp标记。FOXR 1以野生型为模板，设计PCR 5‘-AAAGCTCGAGATGGGGAACGAGC-3’(正向)和5‘-TTTGCCCGGGTCTAGCCG-3’(反向)引物，扩增编码氨基酸1-279的区域，并亚克隆到pEGFP-C3的XhoI和SacII限制性位点中。

细胞培养

HEK293T(ATCC CRL-3216)和COS-7(ATCC CRL-1651)细胞在添加10%胎牛血清(FBS；HyClone)和1%青霉素/链霉菌素(5%CO)的Dulbecco改良Eagle‘s培养基(DMEM)中保存。237°C孵化器，60%融合率的细胞，按厂商的指示，用FuGENE 6试剂转染GFP、GFP-FOXR 1或GFP-M280 L质粒。亚细胞分馏：用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞，用蛋白酶抑制剂组成的缓冲液A(50 mm Tris-HCl pH7.5，0.5%Triton-X 100,137.5 mm NaCl，10%甘油，5 mm EDTA pH8.0)中溶解。溶解液被离心了850倍g在4°C下培养15 min，将上清液“胞浆”部分移至新管，其余的“核”颗粒用缓冲液A在4°C下洗涤两次，在850 x下离心。g2分钟。然后在缓冲液B(50 mm Tris-HCL pH7.5，0.5%Triton-X 100,137.5 mm NaCl，10%甘油，5 mM EDTA pH8.0，0.5%SDS)中用蛋白酶抑制剂溶解，超声作用5~10s。在含核组分和细胞质组分的管中加入相同量的2x样品缓冲液(0.1mtris-HCL，pH6.8，4%十二烷基硫酸钠，20%甘油，10%β-巯基乙醇，0.01%溴酚蓝)，在100°C下煮沸10 min，进行SDS-PAGE。MG 132转染细胞用50μMG 132(Sigma-Aldrich)处理24h后，用PBS洗涤，在2x样品缓冲液中溶解。细胞应激模式：血清饥饿，37℃无胎牛血清在DMEM中孵育24 h；2剥夺细胞5%CO237°C下用佛波酯1μM处理细胞24 h，37°C下用佛波酯12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA，Sigma)作用24h。

WESTERNBLOTTING

在2倍的样品缓冲液中提取细胞的全细胞裂解液，用10%SDS-PAGE凝胶分离，转移到硝化纤维素膜(GE Healthcare)。在PBS(独角兽)中用Odesey阻断缓冲液阻断膜，然后用人FOXR 1(Biorbyt，兔1：200)、GFP(突触系统，小鼠1：1000)、GAPDH(EMD Milli孔隙，小鼠1：5000)、HSPA1A和HSPA 6(Enzo生命科学，小鼠1：1000)、DHRS 2(ABCAM，兔1：500)、组蛋白H3(细胞信号传导，兔1：1000)在4°C过夜，用IRDye68080-或IRDyeCW二级抗体(Li-cor，1：20,000)检测抗体识别的蛋白质。

免疫细胞化学与图像分析

转染细胞用PBS冲洗10 min，室温下用4%多聚甲醛固定10 min，经10%山羊血清、0.1%皂甙渗透阻断。为检测PMA处理后的氧化应激，将转染细胞与5μM细胞氧化应激试剂(热费舍尔科学)在37℃下孵育30 min，然后与多聚甲醛固定。为了检测转染细胞的侵袭性，我们使用PROTEOSTAT Aggresome检测试剂盒(Enzo Life Science)。染料插入第四纪蛋白质结构的交叉β脊柱，发现错折叠和聚集的蛋白质。用DAPI(Fisher Science)安装延长金防褪色座，用卡尔蔡司LSM 700共焦显微镜成像。以相同的共焦设置采集所有样本的图像，Z叠加图像采用最大投影模式，利用Zeiss共焦软件进行投影。

RNA序列分析

用FuGENE 6转染HEK293T，转染GFP、GFP-FOXR 1或GFP-M280L突变体。转染48小时后，用QIAshredder和RNeaseMini试剂盒(QIAGEN)纯化总RNA，用Trizol(Invitrogen)对样品进行处理。三个生物复制体被独立处理。RNA样品悬浮在DEPC处理的水中，用纳米滴ND-1000(热科学)测定浓度，所有样品的A 260/A 280比值均高于2.0。在生物分析仪(Agilent 2100)中也检测了RNA的完整性。图书馆的准备工作和测序工作由马萨诸塞州剑桥布罗德研究所使用IlluminaHiSeq 2000技术进行。

Rna序列读取与grch 38进行了比对。智人使用HISAT 2的基因组[82]具有默认参数。Bam文件按读取的名称排序，而不是由samtools对染色体坐标进行排序。83]。每个样本的基因计数矩阵是由htseq生成的，htseq是一个用于处理高通量测序数据的Python框架[84]。下游分析是用DEseq 2进行的[85]没有在任何细胞中表达的基因被从下游分析中删除。用“plotPCA”函数生成样本PCA图，以检测和去除每一种情况下的异常样本。使用默认参数的“DESeq”函数进行条件间的差异表达式分析。对差异表达式分析结果进行对数折变收缩。将调整值<0.05的DEGS和对数倍变化>0.25的DEGS进行下游分析。用热图显示DEGS的热图，并在热图上对表达模式相似的基因进行聚类。用GSEA进行基因集富集分析。86]。使用注释、可视化和集成发现数据库(DavidV6.8)软件对包含DEGS的基因本体和丰富分析进行了分析，该软件将阈值设置为修正的Fisher确切值P-数值(轻松评分)≤0.05。

包裹荷马[87]用于在DEGS启动子区域寻找FOXR 1结合基序。方法findMotifs.pl与-find选项一起使用。分析的输入内容包括：DEG各聚类中的基因符号，除第4组外，其余均含有少量DEGS和含有FOXR 1主、次结合基元正向和反向序列的基序矩阵文件。利用内部R脚本对启动子区域FOXR 1结合基序的DEGS百分比进行了总结。

定量实时PCR分析

用QIAshredder和RNeaseMini试剂盒纯化总RNA。用iScript cDNA合成试剂盒(Biorad)或Accuris qMax cDNA合成试剂盒(Midland Science)合成cDNA。在ABI棱镜7900 HT快速实时PCR系统(应用生物系统)上，采用动力SYBR绿色PCR主混合物(Thermo Science)，采用两步循环工艺，退火/延伸温度为60°C，进行定量实时PCR。以GAPDH或18S为参考基因，对各靶点的相对量进行归一化，用ΔΔCT法计算基因表达的折叠变化，并以转染GFP的细胞为对照。引物如下，人DHRS 2：5‘-TCAGCTGCAGGAGGGG-3’(前进)和5‘-AATGTTCTCCGTTGACGTA-3’(反向)；人DNAJC6：5‘-AGCAACTTGAAAGACACACCCT-3’(前进)和5‘-AAATCTCTTTGTGTAGCTGG-3’(反向)；人DNAJC 21：5‘-CCTGAAATGGCACCCGGATAA-3’(前进)和5‘-TTTCCGGGTCACTCAACA-3’(反向)；人GAPDH：5‘-GGATGGTCGTATTGGG-3’(前)和5‘-GGAAGATGTGATGGG总协定-3’(反向)；人HSPA1A：5‘-GCCTTTCCAAGATTGCTGGTT-3’(向前)和5‘-TCAACATTGCAAACACAGGA-3’(反向)；人HSPA 6：5‘-CAAGGTGCGTATGCTAC-3’(前进)和5‘-GCTTTGATGATCCGCAACAC-3’(反向)；人HSPA12A：5‘-GCTCCCATCTGCATATTCAT-3’(前进)和5‘-TTCTGAGTTGGGAGTCAGT-3’(反向)；人囊囊：5‘-AcacagCGGTTCACC-3’(向前)和5‘-GCCGATTCATGGGGGCCAA-3’(反向)。鼠Foxr 1：5‘-GATGTCCACACATTAAGCCC-3’(前)和5‘-GCTGCTGTACCTCCGAAGC-3’(反向)。鼠18S：5‘-CGAACGTCTGCCCTATCAACT-3’(前向)和5‘-CTGTTTTTTGGATGGGGT-3’(反向)。数据分析采用ABI棱镜7900 HTSDS软件。-医学论文发表

双荧光素酶法

通过分析人类3000 kb的上游调控序列，确定了fxr 1的DNA结合基序。HSPA 6, HSPA1A, DHRS 2。从HEK293T细胞(基因组DNA纯化试剂盒，ThermoFisher科学)中提取基因组DNA，用以下引物对这些区域进行扩增。HSPA 6：5‘-TTCTGGTACCCACCGGCCTCTGGAGACG-3‘(前进)和5’-TTCTGCTAGCCGGATGCTCAGCTCCGC-3‘(反向)；人HSPA1A：5‘-TTCTGGTACCGGCTGCTCCGACCAATCAATC-3‘(前进)和5’-GCTCCTCAGGCTAGCCGTTATC-3‘(反向)，亚克隆入pNL3.1[Nluc/MINP]报告质粒(Promega)的KpnI-NheI位点。为了人类DHRS 2：5’-TGCAGGTGCCAGAACATTTCTCTTAATGCCAAATCATTTCCCAAAGTGATTGTACTTACC(前进)和5’-TGGTGGCTTTACCAACAGTACCGGATTGCCAGAGTTGTTCATTCCTCTCGGTGCATTC-3’(反向)和吉布森克隆到pNL3.1[Nluc/MINP]。用FuGENE 6转染试剂(Promega)转染HEK293T细胞，转染质粒pGL4.54[Luc2/TK](Promega)、报告质粒(pNL3.1-Nluc/MINP-HSPA1A、pNL3.1-Nluc/MINP-HSPA 6或pNL3.1-Nluc/MINP-DHRS 2)和GFP、GFP标记的FOXR 1或M280 L表达质粒。在PBS中收集转染细胞，用Nano-Glo双荧光素酶报告系统(Promega)检测荧光素酶活性。用Victor-3平板阅读器(Perkin Elmer)对双荧光素酶信号进行定量。为控制转染效率，将Nluc报告质粒信号归一化为组成荧光素酶信号(即pGL4.54[Luc2/TK]质粒Nluc/Luc2的信号)。在GFP-FOXR 1或GFP-M280 L质粒存在下，计算各上游基因调控序列的折叠诱导值与报告质粒的背景活性。报告试验为3个生物复制，每个生物复制3个技术复制。

在HSF 1报告实验中，采用PCR方法从HEK293T细胞(基因组DNA纯化试剂盒，Thermo Fisher Science)中扩增出含有HSF 1结合基序(TTCTAGAA)的人FOXR 1上游转录调控区(TTCTAGAA)。FOXR 1：5‘-TTCTGGTACCGTCCCAGGCTGAG-3‘(前进)和5’-GCCAGGCTCTCTCTCTTATAATCCGCAGCGATCGTCTT-3‘(反向)亚克隆到pNL3.1[Nluc/MINP]报告质粒(Promega)的KpnI-NheI位点。第二个pNL3.1-nluc/minp-FOXR 1报告质粒是通过破坏hsf 1结合基序(突变为GGCTAGAA命名为Mut)，有以下针对人类的引物FOXR 1*5‘-CTTTCATAACGGCTAGAAAGTAACTACTAATAC-3‘(正向)和5’-GTTTGTTTATCCACG-3‘(反向)采用Q5位点定向突变试剂盒(新英格兰生物突变试剂盒)，并经核苷酸测序验证。用FuGENE 6转染试剂(Promega)转染HEK293T细胞，转染质粒pGL4.54-LuPrc 2/TK，分别转染报告质粒pNL3.1-Nluc/MINP-FOXR1-WT或pNL3.1-Nluc/MINP-FOXR1-Mut和gfp对照或gfp标记的HSF 1表达质粒(32538，Addgene)。收集并分析转染细胞。

乳酸脱氢酶法

用FuGENE 6转染试剂转染HEK 293 T细胞，转染GFP、GFP-FOXR 1或GFP-M280 L质粒。用1μM-甲基丙烯酸甲酯(Sigma)处理细胞24小时，并根据制造商的指示从培养基中进行乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验(ThermoFisher Science)。作为阳性对照，用试剂盒提供的阳性对照裂解缓冲液处理一组细胞。用比色板阅读器(BioRad)测量了490 nm的读出值。

洗涤剂提取试验

转染HEK293T细胞在pH7.5的50 mm Tris-HCl缓冲液中，用蛋白酶抑制剂进行短暂超声作用，在350,000 x下离心。g15分钟后，将上清液收集成Tris-HCl可溶组分[改编自88]。在含有1%TritonX-100的Tris-HCl缓冲液中依次提取得到的颗粒，然后用1%的Sarkosyl萃取，最后用2%的SDS提取。每一步洗涤剂提取步骤在4℃下孵育1h，350,000 x超滤。g15 min后，分别得到TritonX-100可溶性组分、Sarkosyl可溶性组分和SDS可溶性组分.将含有20μg总蛋白的Tris-HCl组分，以及等量的TritonX-100、Sarkosyl和SDS组分加载到SDS-PAGE上。

**用CRISPR/Cas9进行基因编辑Foxr 1小鼠敲除**

这个Foxr 1 (C57BL/6N-Foxr 1)小鼠系是加拿大酚基因组中心KOMP2-Phase2项目的一部分，从加拿大小鼠突变库获得。这个Foxr 1通过注射含有GGCCAAGCCCGGTAGTATG和TCCACTTTACCCCATGATC(5‘侧)和CCGCAAGCCAGCCCAGA和TGAGTGCCAAGGCAATCAGA 3’侧间隔序列的Cas 9核蛋白复合物和单导RNA(GRNAs)，获得敲除小鼠系。这导致外显子2，3和外显子4的大部分缺失，从而破坏了外显子4剪接受体，导致从chr 9：44435486到44436461的976 bp缺失，导致移码突变。Foxr 1全长蛋白编码转录本。

PCR基因分型

从燕尾中提取基因组dna，以确定野生型，并将其删除。Foxr 1等位基因。引物集1检测野生型和杂合子的354 bp产物。Foxr 15‘-CCAGCTCTCATATAGACG-3’(前)和5‘-GAGAAGAGTCAGAAGAAGAAGGC-3’(反向)。引物组2检测403 bp和1381 bp产物。Foxr 15‘-CCAGCTCTCTGCATATAGACG-3’(向前)和5‘-GGTAGGGTGTTATTTTCTTGAG-3’(反向)。较大的1381 bp带代表Foxr 1野生型，403 bp和1381 bp均为杂合子，纯合子中仅存在403 bp带。

脑组织学与图像分析

杂合子繁殖成对的新生小鼠幼仔Foxr 1用无菌锐利剪刀摘除突变小鼠的头部。即刻取脑，4°C静置4%多聚甲醛和5%蔗糖。在4°C条件下，脑转移至10%蔗糖24 h，20%蔗糖24 h，4°C 30%蔗糖24 h，OCT复合稀释液2：1，30%蔗糖：OCT 2：1，室温下摇动25 min，1：1，25 min，1：2 30%蔗糖：OCT，2：2 30%蔗糖：OCT孵育25 min。大脑被放置在含有OCT复合物的组织模子中，并允许在冷冻前再休息20分钟，然后用干冰冷冻2-甲基丁烷，然后储存在-80°C，直到准备使用为止。在20μm时，用LeicaCM 1850冷冻器(LeicaBiossystems)对大脑进行切片，并安装在超低温显微镜(Fisher科学)上，并保持在-20°C。

在Nissl染色前，从-20°C取出切片，允许室温下干燥6 h。用1%甲酚紫溶液(Sigma C-1791)染色2.5 min。然后在以下系列解决方案中孵化幻灯片，每个解决方案为5s：2O，DDH2O，50%Etoh，70%Etoh，95%Etoh，100%Etoh，在二甲苯中清除(Fisher X4-4)。在成像前，将幻灯片安装在PerMountMedia(Fisher SP15-100)上，并在一夜之间干燥。免疫染色：脑切片加热至室温，再用PBS冲洗20 min。将组织VT 1(Nacalai USA)抗原回收液预热到70°C，用抗原回收液代替PBS，在70℃水浴中孵育20 min，然后在台架上冷却15 min。切片在PBS中洗涤，室温下与阻断液(5%山羊血清，0.3%TritonX-100)孵育1h。脑切片与原代多克隆兔抗MAP 2抗体(5%山羊血清1：500稀释，PBS；CAT#AB 5622微孔)在4℃下孵育一夜。第二天，用pBS冲洗脑切片，并在二抗AlexaFluor 488山羊抗兔IgG中(5%山羊血清稀释1：500稀释；CAT#AB_2576217热费雪)在室温下孵育1h。最后冲洗后，用DAPI延长金(CAT#P-36931 Fisher)安装滑片.图像是用蔡司LSM 700共焦显微镜拍摄的，使用25x物镜，像素大小为0.5μm，校正环设置为油浸。在Brightfield捕获Nissl染色切片。MAP 2染色为488 nm激发，DAPI为405 nm激发。图像被捕获在一个单一的焦平面使用边界网格瓷砖扫描和图像拼接在一起后采集。然后将图像输入斐济(ImageJ)，用直线工具测量皮质厚度，测量皮质厚度(0°、45°和90°)，测量范围分别为0°、45°和90°(相对于中线)。用徒手选择工具追踪心室的边界，计算心室横截面积。

统计分析

为了确定统计意义，我们使用了一个学生的t-两组比较试验，或单因素方差分析(ANOVA)与TUKEY试验进行多重比较。所有条形图和误差条均为平均±S.E.M，显着性为p<0.05。使用GraphPad Prism 7软件(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)对数据进行分析。本研究报告的所有数据列于S1数据

辅助信息

先证者临床特征总结德雷沃变式FOXR 1.

显影1/12: Pgen.1009854.s001.docx

跳到无花果分享通航

神经

萎缩

无花果分享

**S1表先证者临床特征总结德雷沃变式*FOXR 1***.

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.s001

(Docx)

图S1.FOXR 1在物种间的残基比对。

C-末端氨基酸序列显示FOXR 1高度保守区域内的蛋氨酸残基(用红色表示)。数字表示氨基酸残基。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.s002

(TIF)

图S2.M280 L变异体诱导COS 7细胞核点状表型。

转染GFP或GFP标记的人FOXR 1、WT或M280 L质粒的COS 7细胞荧光图像。DAPI(蓝色)作为核标记物。标尺=20μm。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.s003

(TIF)

图S3.RNAseq分析

(A)在多维尺度分析中，这三组聚类的PCA图分别聚类。利用主成分分析(PCA)图对样本组进行聚类，将不同条件下的聚类进行聚类。(B)饼图显示了2644个差异表达基因在GFP与FOXR 1 WT之间的分布，以及在FOXR 1 WT与M280 L之间的735个差异表达基因的分布。(C)Pearson相关图检查FOXR 1 WT与GFP和M280 L与GFP之间的对数2(折叠变化)。(D)簇A、B、D和E中具有FOXR 1一致序列的差异表达基因(DEGS)百分比表。-医学论文发表

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.s004

(TIF)

图4。基因本体(GO)富集分析FOXR 1 WT与M280 L与GFP对照及FOXR 1 WT。

归一化富集分数表示生物过程在按超几何学分数排列的基因列表中的分布情况。较高的富集分数表明属于特定GO类别的基因向排名列表的两端转移，代表上下调节(分别为正值或负值)。(A)GO在WT和M280 L之间的富集分析，M280 L下调。(B)GO在WT和M280 L之间的富集分析在M280 L中被上调。(C)GFP与WT之间的GO富集分析在WT中被下调。(D)GFP与WT之间的GO富集分析在WT中被上调。(E)GFP与M280 L之间Go富集分析，M280 L下调。(F)GFP与M280 L之间Go富集分析，M280 L上调。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.s005

(TIF)

**S5图5.启动子序列FOXR 1响应元素位于两个HSE的上游。HSPA 6和HSPA1A推动者。**

此外，我们还确定了hsf 1在启动子区域与hsf 1结合的一致序列。FOXR 1.

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.s006

(Docx)

图6.鼠***Foxr 1*CRISPR/Cas9基因编辑的表达及基因敲除策略**

(A)氨基酸序列显示人FOXR 1与小鼠同源性为66%。数字表示氨基酸残基。(B)用特异性引物靶向小鼠的qPCRFoxr 1秀场Foxr 1在胚胎第17天，在心脏、肝脏、肺和大脑中的高表达。(C)Sanger测序分析说明了用于生成的两个gRNAs(用红色表示)。Foxr 1敲除小鼠(顶)，确认979 bp缺失(下)。虚线Foxr 1野生型等位基因代表两个gRNAs之间的原始空间。红色框框的虚线Foxr 1基因敲除等位基因显示979 bp的缺失。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.s007

(TIF)

**图7.大鼠皮层厚度和脑室大小的定量研究Foxr 1野生型和敲除型老鼠。**

(a-D)4例野生型和4例Bregma前脑区的代表性图像及定量研究Foxr 10°、45°和90°(相对于中线)敲除小鼠的皮亚面。图表示相对厚度归一化为野生型(WT)。未配对t-试验(0°，p=0.0021；45°，p=0.0054；90°，p=0.2369)。(E)脑前部脑室面积图。未配对t-测试p=0.0405。(F-I)4种野生型和4种野生型bregma的代表性图像及脑切片的定量研究Foxr 10°、45°和90°(相对于中线)敲除小鼠的皮亚面。图表示相对厚度归一化为野生型(WT)。未配对t-试验(0°，p=0.3208；45°，p=0.0447；90°，p=0.0368)。(J)Bregma脑切片心室面积图。未配对t-测试p=0.2049。(K-N)4例野生型和4例bregma后脑区的代表性图像及定量研究Foxr 10°、45°和90°(相对于中线)敲除小鼠的皮亚面。图表示相对厚度归一化为野生型(WT)。未配对t-试验(0°，p=0.0745；45°，p=0.0811；90°，p=0.0253)。(O)脑后部脑室面积图。未配对t-测试p=0.040。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.s008

(TIF)

S1视频。M280L突变体对CO的反应表现为核点状表型。2压力。

M280 L响应CO的延时视频2转染HEK293T细胞的应激。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.s009

(MP4)

S2视频。M280 L突变体在PMA处理后表现出核点状表型。

PMA治疗后M280 L的延时录像。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.s010

(WMV)

S3视频。M280L突变体在PMA处理后表现出核聚集。

时间推移视频M280 L响应PMA治疗的高放大率。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.s011

(AVI)

S1数据所有报告的数据为这项研究。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009854.s012

(Xlsx)

致谢

我们感谢实验室的同事们对这项工作提供了建设性的反馈意见。

参考文献

00001. 1.作者声明：McCarroll SA，Hyman SE。多基因脑疾病遗传学研究进展：神经生物学面临的重大新挑战。神经元。2013年；80(3)：578-87。EPub 2013/11/05。PMID：24183011；PubMed Central PMCID：PMC 4066986。

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FOXR 1调节应激反应通路，是大脑正常发育所必需的。-医学论文发表

摘要

作者摘要

导言

结果

外显子测序发现一个发育迟缓的个体携带德雷沃错义变体FOXR 1

FOXR 1 M280 L突变体导致FOXR 1蛋白表达下降

FOXR 1 M280 L诱导核聚集表型

新的FOXR 1依赖转录子的RNA序列分析鉴定

FOXR 1控制热休克伴侣和抗氧化剂NADPH依赖还原酶基因的表达

FOXR 1表达在细胞应激反应中增加。

M280L突变体中的FOXR 1核点不溶性

Foxr 1敲除小鼠皮层变薄和心室增大

讨论

材料和方法

道德声明

先证者登记及同意

外显子测序

表达载体的构建

细胞培养

WESTERNBLOTTING

免疫细胞化学与图像分析

RNA序列分析

定量实时PCR分析

双荧光素酶法

乳酸脱氢酶法

洗涤剂提取试验

用CRISPR/Cas9进行基因编辑Foxr 1小鼠敲除

PCR基因分型

脑组织学与图像分析

统计分析

辅助信息

S1表先证者临床特征总结德雷沃变式FOXR 1.

图S1.FOXR 1在物种间的残基比对。

图S2.M280 L变异体诱导COS 7细胞核点状表型。

图S3.RNAseq分析

图4。基因本体(GO)富集分析FOXR 1 WT与M280 L与GFP对照及FOXR 1 WT。

S5图5.启动子序列FOXR 1响应元素位于两个HSE的上游。HSPA 6和HSPA1A推动者。

图6.鼠Foxr 1CRISPR/Cas9基因编辑的表达及基因敲除策略

图7.大鼠皮层厚度和脑室大小的定量研究Foxr 1野生型和敲除型老鼠。

S1视频。M280L突变体对CO的反应表现为核点状表型。2压力。

S2视频。M280 L突变体在PMA处理后表现出核点状表型。

S3视频。M280L突变体在PMA处理后表现出核聚集。

S1数据所有报告的数据为这项研究。

致谢

参考文献

4.Weigel D，Jurgen G，Kuttner F，Seifert E，Jackle H.同源异形基因叉头编码一个核蛋白，并在果蝇胚胎的末端区域表达。细胞。1989年；第57(4)条：645-58。EPub 1989/05/19.PMID：2566386。-医学论文发表

42.Bhat SA、Sood A、Shukla R、Hanif K.AT2R激活以NOX依赖的方式抑制小胶质细胞亲炎症激活：PP2A抑制PKC活化和P47(Phox)磷酸化。摩尔神经生物醇。2019年；56(4)：3005-23。EPub 2018/08/05。PMID：30076526。-医学论文发表

谷歌学者-医学论文发表

**外显子测序发现一个发育迟缓的个体携带德雷沃错义变体*FOXR 1***

***Foxr 1*敲除小鼠皮层变薄和心室增大**

**用CRISPR/Cas9进行基因编辑Foxr 1小鼠敲除**

**S1表先证者临床特征总结德雷沃变式*FOXR 1***.

**S5图5.启动子序列FOXR 1响应元素位于两个HSE的上游。HSPA 6和HSPA1A推动者。**

图6.鼠***Foxr 1*CRISPR/Cas9基因编辑的表达及基因敲除策略**

**图7.大鼠皮层厚度和脑室大小的定量研究Foxr 1野生型和敲除型老鼠。**