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《谷胱甘肽1介导的杀虫剂抗药性调控小菜蛾由miRNA和incRNA-医学论文发表》

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《谷胱甘肽1介导的杀虫剂抗药性调控小菜蛾由miRNA和incRNA-医学论文发表》期刊在线投稿系统

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《谷胱甘肽1介导的杀虫剂抗药性调控小菜蛾由miRNA和incRNA-医学论文发表》期刊简介

**谷胱甘肽1介导的杀虫剂抗药性调控小菜蛾由miRNA和incRNA-医学论文发表**

· 朱斌，

· 李林红，

· 瑞伟，

· 裴亮,

· 西武高日期：2021年10月28日

摘要

众所周知，杀虫剂抗药性的演变与解毒酶的过度表达密切相关。虽然谷胱甘肽的作用S-转移酶(GST)基因在杀虫剂抗药性中得到了广泛的报道，其潜在的调控机制尚不清楚。在这里，一个GST基因(GSTu1)及其反义转录子(INC-GSTu1-as)被鉴定和克隆，并在几种抗氯转胺丙酸酯中被上调。小菜蛾人口。GSTu1被证实通过直接降解这种杀虫剂而参与了氯霉素的抗药性。此外，我们还证明了INC-GSTu1-与GSTu1通过形成一个rna双工结构，使miR-8525-5p的结合位点在GSTu1-3‘UTR总之，我们发现英科-GSTu1-维持mRNA的稳定性GSTu1通过防止miR-8525-5p引起的降解，从而提高了P. 小菜蛾给氯米利普乐。我们的发现揭示了一种新的非编码RNA介导的途径，它调节抗药性昆虫解毒酶的表达，为进一步了解杀虫剂和抗药性的机制提供了机会。

作者摘要

害虫抗药性的发展是世界范围内普遍关注的问题，也是农业面临的一个重大问题。了解杀虫剂抗药性的遗传学是有效保护作物的关键。冥王星. 小菜蛾(L.)是十字花科作物的主要害虫，对几乎所有种类的杀虫剂都有抗性，并已成为世界上最具抗药性的害虫之一。解毒酶的过度表达与杀虫剂的抗药性密切相关，但对其调控机制的研究还很有限。这里,GSTu1被鉴定为在几种抗氯转胺丙酸酯中被上调。P. 小菜蛾通过这种杀虫剂的直接降解，种群被证实参与了氯氨酰脯氨酸的抗药性。另外，印度-GSTu1-从相反的DNA链转录到GSTu1的mrna稳定性。GSTu1通过阻断miRNA的活性，从而增加了对.P. 小菜蛾给氯米利普乐。这一结果进一步揭示了代谢抗药性的机制。

引用：朱B、李L、魏R、梁P、高X(2021)对GSTu1介导的杀虫剂抗药性的调控小菜蛾由miRNA和incRNA。PLOS Genet 17(10)：e1009888。Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888

编者：Subba Reddy Palli，美国肯塔基州大学

收到：(二0二二一年六月十七日)接受：(二0二二一年十月十八日)出版：2021年10月28日

版权：2021年朱等人这是一篇以CreativeCommonsAttribution许可证，允许在任何介质中不受限制地使用、分发和复制，只要原始作者和源被记入帐户。

数据可得性：所有相关资料都在手稿中辅助信息档案。

供资：该项工作由国家自然科学基金(编号31572023)资助。该项工作由国家自然科学基金(编号31901915)和中国博士后科学基金(2018M641546)资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

相互竞争的利益：提交人宣布，不存在任何相互竞争的利益。

导言

害虫直接和间接对农作物造成严重危害，每年损失数十亿美元1]。虽然人们日益认识到虫害综合管理(IPM)的重要性，但使用化学杀虫剂仍然是防治害虫的主要战略[2, 3]。然而，杀虫剂抗药性的演变对防治效果造成了威胁，对农业生产、环境安全乃至人类健康造成了持续的影响。4, 5]。小菜蛾，冥王星. 小菜蛾(L.)是十字花科作物的主要害虫，是全球最具抗性的昆虫之一。6, 7]。敌百虫是一种蒽醌类杀虫剂，对几种害虫，特别是鳞翅目害虫表现出显著的防治效果，但对非目标生物的毒性较低。8, 9]。但是近几年来，P. 小菜蛾在许多国家已经对氯氨酰丙酸产生了高水平的抗药性。10–12].

Ryanodine受体(二胺杀虫剂的靶标)中的氨基酸突变(G4946E和I4790M/K)被认为是导致氯氨酰丙酸耐药的主要原因之一。13–18]。解毒酶或异生物转运体的上调也在二胺抗药性中发挥重要作用。到目前为止，几个解毒酶基因，包括两个细胞色素P 450基因(CYP6BG1和CYP321E1) [19, 20]，一个尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT)基因(UGT33AA4) [21]和一个Flavin依赖的单氧酶(FMO)基因[22]，已被发现在抗氯转流菌中起一定作用。P. 小菜蛾.

代谢解毒在杀虫剂抗药性中起着非常重要的作用。23, 24]。除了P 450，FMO和UGT，谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)也可能参与氯曲霉耐药。例如，染毒24 h后，GSTs活性显著升高。家蚕 [25]。此外，rna-seq分析显示，3个gst基因的差异表达随着对氯转流丙酸的抗性的增加而增加。P. 小菜蛾 [26]。在我们之前的研究中，rna-seq分析表明，一个gst基因(命名为GSTu1(在本研究中)在抗氯氨酰丙酸酯中被上调。P. 小菜蛾人口。有趣的是，另一份转录本(预计为反义长非编码RNA，incRNA)与基因外显子重叠。GSTu1另一条链也被抬高[27]。因此，我们推测这两种转录本可能在P. 小菜蛾.

非编码RNA(NcRNAs)是一种功能性的RNA分子，不被翻译成蛋白质，通常分为两大类：小的和长的ncRNAs[28, 29]。本研究的重点是microRNAs(MiRNAs)和incRNAs。MiRNAs短(～22 nt)，内源性非编码RNA，主要通过与靶RNA转录体3‘-非翻译区(3’-UTR)结合而调节基因表达，并最终导致切割、翻译抑制或mrna衰变[30–32]。已证实许多miRNAs通过靶向解毒酶或杀虫剂靶点参与抗药性[33, 34]。IncRNAs是长于200个核苷酸的非编码RNA，其结构与信使RNA(MRNAs)相似，但缺乏显著的开放阅读框架[35, 36]。通常，根据它们在蛋白质编码基因中的位置和转录方向，将其分为正义、反义、内含子和基因间等几类。已有的研究表明，incRNAs可以通过多种机制调控基因的表达，包括转录调控、转录后调控和表观遗传修饰。37]。在转录水平上，incRNA可以跨越下游蛋白编码基因的启动子区域，通过“诱饵”作用来阻止转录调节因子的结合，或者通过直接的活性位点阻断或变构效应来抑制其活性，从而抑制靶基因的表达；相反，incRNA还可以促进转录活性，作为增强子RNAs，或者通过与蛋白质结合增强子活性来促进转录活性[38]。在转录后调控中，incRNAs参与了mRNAs的稳定性和翻译、mRNA前剪接、蛋白质活性，并作为miRNAs和siRNAs的前体[39, 40]。在表观遗传学水平上，INcRNAs通过DNA甲基化或去甲基化、RNA干扰(RNAi)、组蛋白修饰和染色体重塑等调控基因表达。38, 39, 41]。在过去的几十年里，在哺乳动物中已经进行了大量的关于incRNAs的研究。然而，对其在杀虫剂抗药性中的作用，甚至在农业昆虫中的作用的研究还很有限。最近报道了一种内含子20的incRNA调控粉红色棉铃虫钙粘素1的转录。棉铃虫，这也是它易受Cry1Ac[42]。此外，据报道，一种基因间的INcRNA，lincRNA_Tc13743.2，参与了对.GSTM 02通过竞争miR-133-5p结合从而介导朱砂叶螨[43].

本研究旨在探讨GSTu1在氯曲霉烯丙酸酯耐药中的作用及其调控机制GSTu1它的反义INcRNA(INC-)GSTu1-AS)。我们的结果揭示了一种新的ncRNA介导的调控途径，它参与控制杀虫剂抗药性中的解毒酶，为进一步研究杀虫剂抗药性甚至抗药性的潜在机制提供了机会。

结果

**的克隆及表达模式GSTu1和印度-GSTu1-易感与耐氯丙酸盐之间P. *小菜蛾***人口

我们以前的转录组数据显示GSTu1它的反义转录体INc-GSTu1-在耐氯转利脯氨酸中均被上调。P. 小菜蛾人口[27]。核苷酸序列GSTu1和印度-GSTu1-最初是从先前的转录组序列中获得的[27经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)鉴定。四GSTu1获得不同3‘UTR长度的转录本(GenBank登录号：MZ 889082-MZ 889085)。图1A).

图1.的结构和位置GSTu1和印度-GSTu1-AS及其在感病群体和三个耐氯转流丙酸盐抗性群体中的相对表达。

答：全长的结构和位置。GSTu1和印度-GSTu1-作为。用qRT-PCR(B)和Westernblotting(D，E)方法检测GSTu1在感病群体(SS)和3个耐氯转苯胺丙酸脯氨酸耐药群体(0、BL和HK)中的相对表达。C：INC的相对表达-GSTu1-用qRT-PCR方法检测敏感群体(SS)和3个耐氯曲霉丙酸脯氨酸的种群(0、BL和HK)。不同的小写字母代表着显著的差异(单向方差分析，然后是图基的多重比较测试，P < 0.05).

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.g001

双场抗氯转胺P. 小菜蛾2016年，首次在广东省博罗市(BL)和海南省海口市(香港)的菜田采集种群。从BL和实验室感病群体SS中获得了近等基因抗性群体。0、BL和HK对氯曲利脯的抗性分别是SS的465倍、5057倍和6722倍。S1表)。定量实时聚合酶链反应(qrt-PCR)结果显示GSTu1在0，BL和香港幼虫分别比SS幼虫高3.7倍、5.5倍和8.0倍。图1B)。此外，最短转录本的转录水平GSTu1远高于其他三份较长的成绩单(图1B)。根据他们的长度，最短的成绩单被命名为“短”，三个较长的成绩单一起被命名为“长”。图1A)。Westernblot结果表明，GSTu1在0、BL和HK幼虫中的表达也高于SS幼虫。图1d和1E).

INC的核苷酸序列-GSTu1-RT-PCR和RACE鉴定(GenBank登录号：MZ 889086)。LNC-GSTu1-是从另一条链转录过来的GSTu1的整个3‘UTR重叠GSTu1 (图1A)qRT-PCR结果表明INc-的转录水平-GSTu1-0、BL和香港幼虫的AS分别是SS幼虫的6.3倍、14.4倍和35.5倍(图1c).

两者的表达水平GSTu1和印度-GSTu1-AS随着零、BL和香港种群抗氯转胺脯氨酸的增加而逐渐升高。可以推断GSTu1在氯霉素中，抗性是保守的，两者之间可能存在类似的调节关系。GSTu1和印度-GSTu1-在这三个抗药性群体中。考虑到零遗传背景与SS有非常相似的遗传背景，所有这些都是后续的。体内用0进行验证实验。

GSTu1序列分析

GSTS通常有两个催化活性位点：主要的GSH底物结合位点(G位)和二级疏水底物结合位点(H位)。GST中的G位点是由蛋白质N端结构域的一组高度保守的氨基酸残基构成的。H位通常是由C端区域中较少的保守残基构成的[44]。用ncbi cd-搜索程序对gstu 1氨基酸序列中的G位和H位进行了分析，结果如下：S1a图。利用邻接法，根据鳞翅目、双翅目、膜翅目、直翅目和鞘翅目22种昆虫的GSTu1氨基酸序列构建了系统发育树。结果表明，鳞翅目中的GSTu1，包括P. 小菜蛾，是比较保守的，并聚集成一个特定的子类(S1B图).

**的发育和组织表达模式GSTu1在……里面P. *小菜蛾***

相对表达GSTu1在不同发育阶段和不同组织中，采用qRT-PCR方法进行检测.结果表明：GSTu1在成虫、蛹和三龄幼虫中转录量很高，中肠和马尔卑斯小管中也有大量转录。图2A和2B)。Westernblot也得到了类似的结果。图2C和2D).

图2.GSTu1在不同发育阶段和不同组织中的表达。

E：卵；L1-L4：一至四龄幼虫；PP：预蛹；P：蛹；A：成虫.Mg：中肠；MT：Malpighian小管；FB：脂肪体；HL：血淋巴；IN：整数。不同的小写字母代表着显著的差异(单向方差分析，然后是图基的多重比较测试，P < 0.05).

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.g002

GSTu1在氯霉素耐药中的作用分析

.的作用GSTu1用RNAi技术研究了氯曲洛普的耐药情况。QRT-PCR结果表明：GSTu1注射DS后48h，0和BL种群分别下降70%和62%。GSTu1与对照组比较(注射DS)EGFP) (图3A和3B)。此外，dsRNA注射(DS)EGFP和DSGSTu1)0和BL的幼虫都暴露在LC中。50氯曲利丙酸酯。DS的死亡率GSTu1注射组在注射后72h和96h分别增加17%和22%，BL分别增加21%和36%(P<0.05)。图3A和3B)。这些结果表明，RNAi介导的基因敲除GSTu1增加易感性P. 小菜蛾幼虫对氯曲柳。

RNAi介导的基因敲除GSTu1降低了.的阻力P. 小菜蛾在0(A)和BL(B)中对氯曲尼洛尔。C：谷胱甘肽1的表达和纯化E. 大肠杆菌系统(M：蛋白质标记；RAIN 1：阴性对照；RAN 2：可溶性总蛋白；RAN 3：纯化蛋白)。D：GSTu1与一系列上升的氯曲尼洛尔(0-1000μM)和固定GSH的酶动力学。E：重组GSTu1对氯曲尼洛尔的耗竭率。F：纯化的GSTu1对CDNB的特异性活性。星号表示治疗与相应的对照(学生的)有显着性差异。t-测试，*0.01<P < 0.05, **P < 0.01).

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.g003

此外，重组的gstu 1作为可溶性蛋白在大肠杆菌。重组GSTu1蛋白的分子量约为30 kD，纯化后得到的重组蛋白超过1mg。图3C)。在pH6.5和37°C条件下，以CDNB为底物的GSTu1的比活力为0.464μ/min/mg。图3f)。竞争试验表明，氯曲尼洛尔(1-1000μM)可使重组GSTu1的催化能力降低26%~82%。图3)。结果表明，杀虫剂浓度对抑制效果有一定的影响。采用高效液相色谱法(HPLC)研究重组GSTu1对氯曲尼洛尔代谢的影响。结果表明，与对照组(热灭活GSTu1)相比，重组GSTu1代谢率约为47.4%。图3e).

**INC的发育和组织表达模式GSTu1-如P. *小菜蛾***

INC的发育和组织特异性表达模式GSTu1-也已确定。QRT-PCR显示GSTu1-在第一至三龄幼虫期高度表达，在中肠和马尔皮氏小管中大量表达。图4A和4B)。这些结果表明：GSTu1和印度-GSTu1-在不同发育阶段和组织中有非常相似的表达模式P. 小菜蛾.

图4.LNC-GSTu1-AS参与调节氯氨酰脯氨酸的抗性。

INC的相对表达GSTu1-在不同发育阶段(A)，不同组织(B)，核RNA和细胞质RNA(C)，以及控制和INc-GSTu1-被击倒的群体(D)P. 小菜蛾。GSTu1在对照组和INc中的相对表达GSTu1-qRT-PCR(E)和Westernblot(F，I)。G：儿童死亡率P. 小菜蛾用LC处理50氯曲利丙酸酯。H：分析INC-GSTu1-作为和GSTu1-核糖核酸酶保护试验(RPA)检测3‘UTR。J：INC的共同本地化-GSTu1-作为和GSTu1在中肠P. 小菜蛾通过荧光原地杂交(FISH)试验星号表示治疗与相应的对照(学生的)有显着性差异。t-测试，*0.01<P < 0.05, **P < 0.01). Different lowercase letters represent significant differences (one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparison tests, P < 0.05).

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.g004

**INC-功能分析GSTu1-抗氯转利脯氨酸P. *小菜蛾***

细胞核和细胞质的RNA分馏表明GSTu1-细胞质主要丰富(图4c)，表明其在转录后调控中的潜在作用。INC的功能-GSTu1-然后用RNAi技术对氯转流液的耐药进行了研究。QRT-PCR结果表明，INc的相对表达。-GSTu1-Asc后24h、48h、72h和96h，AS抑制率分别为31%、64%、44%和40%。-GSTu1-分别与si-nc-注入控件中的注入量进行了比较。图4d)。作为回应，转录水平GSTu1(短+长)下降29%和20%，转录水平降低谷胱甘肽1-长期下降53%和60%，在72小时和96小时后-GSTu1-分别作为注射(图4e)。Westernblot检测结果表明，沉默后GSTu1的含量也显著下降。-GSTu1-特别是96小时后-GSTu1-注射(图4F和4i)。注射siRNA的幼虫暴露在LC中。50氯曲利丙酸酯。西印度的死亡率-GSTu1-注射组在72h和96h分别增加28%和38%(图4G)。这些结果表明RNAi介导的INc基因敲除。-GSTu1-随着易感性的增加P. 小菜蛾幼虫通过降低GSTu1的表达而转化为氯转流。

INC的反向互补序列-GSTu1-作为和GSTu1表明他们可能有一种有约束力的关系。因此，INC的潜在结合-GSTu1-的3‘UTRGSTu1被调查过。检测由INC形成的RNA双链-GSTu1-作为和GSTu1进行RNase保护试验(RPA)。结果表明，重叠区的多个序列片段(P3/P4，P5/P6)不受降解，而Inc-的非重叠区则受到保护。GSTu1-作为和GSTu1(P1/P2)几乎完全被RNase A降解。图4H)。此外，INC的共定位信号-GSTu1-作为和GSTu1在四龄鸡的中肠也检测到。P. 小菜蛾通过荧光原地杂交(FISH)分析，表明这两个转录本形成一个短暂的双工(图4j)。以往的研究表明，反义INcRNAs通过瞬时双工合成和抑制miRNA或RNA结合蛋白(Rbp)诱导的正义mRNA衰变来促进正义转录本的稳定性。45]。所以，我们假设英科-GSTu1-在GSTu1规则中可能具有类似的作用。

**靶向miRNAs的鉴定GSTu1在……里面P. *小菜蛾***

Rna下拉试验表明rbp与rbp之间没有相互作用。GSTu1 (图S2)。两种miRNA靶预测软件米兰达和rna杂交的结果表明，13种miRNAs可能作用于3‘UTR。GSTu1，这些miRNAs的所有结合位点都位于正义反义转录本的重叠区域(S3图).

验证13个预测的miRNAs与GSTu1全长3‘UTR序列最长GSTu1包含所有预测的miRNA结合位点的转录本最初被克隆并插入到pmirGLO载体(pmirGLO&GSTu1-长-3‘UTR)结果表明，只有miR-8525-5p-或miR-8530-5p未转染的细胞对报告活性有显著影响。图5A)。其次，对miR-8525-5p或miR-8530-5p的“种子”序列互补的结合位点进行了突变(pmirGLO&)。GSTu1-长-3‘UTR-mut)当miR-8525-5p基因与pmirGLO&共转染时，GSTu1-短-3‘UTR或pmirGLO&GSTu1-长-3‘UTR进入HEK293T细胞，荧光素酶活性较突变对照组分别下降46%和51.3%。图5B)。当miR-8530-5pagomir与pmirGLO&共转染时，GSTu1-长-3‘UTR进入HEK293T细胞，荧光素酶活性较突变对照组下降45.3%。图5c)。此外，还进行了RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)测定，以确定是否GSTu1与miR-8525-5p或miR-8530-5p相关RNA诱导的沉默复合物(RISCs)结合。结果表明：GSTu1与阴性对照相比，miR-8525-5p和miR-8530-5p分别显著提高了6.75倍和2.35倍。图5d)。这些数据表明GSTu1可能与miR-8525-5p和miR-8530-5p直接相互作用。MiR-8525-5p的结合位点位于四种基因重叠的3‘UTR序列上。GSTu1转录本，而miR-8530-5p的结合位点位于三个较长的重叠的3‘UTR序列上。GSTu1成绩单。

图5.靶向miRNAs的鉴定GSTu1.

A：验证13个预测的miRNAs与GSTu1用双荧光素酶报告法。双荧光素酶报告用含有野生型或突变(Mut)结合位点的重组pmirGLO载体共转染miR-8525-5p agomir(B)或miR-8530-5p agomir(C)。D：miR-8525-5p或miR-8530-5p之间的相互作用GSTu1Rna结合蛋白免疫沉淀法测定体内。E：用RT-qPCR方法检测miR-8525-5p(E)和miR-8530-5p(F)在SS、NL、BL和HK中的相对表达.星号表示治疗与相应的对照(学生的)有显着性差异。t-测试，*0.01<P < 0.05, **P < 0.01). Different lowercase letters represent significant differences (one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparison tests, P < 0.05).

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.g005

MiR-8525-5p和miR-8530-5p在SS、nil、bl和hk中的表达水平

用qRT-PCR法检测SS、NL、BL和HK组织中miR-8525-5p和miR-8530-5p的表达水平。结果表明，0、BL和香港幼虫的miR-8525-5p水平分别是SS幼虫的4.2倍、4.6倍和2.4倍。图5e0、BL和香港幼虫的miR-8530-5p水平分别是SS幼虫的2.7倍、4.8倍和5.8倍。图5f).

单用miR-8525-5p或miR-8530-5p上调和下调miR-8525-5p不影响GSTu1的表达。

当将miR-8525-5p或miR-8530-5p单独注射到0~3龄时，与对照相比，miR-8525-5p或miR-8530-5p具有明显的抑制作用。图6a和6e)。然而，无论是转录水平还是翻译水平，均未检测到明显的变化。GSTu1 (图6B，6C，6F和6G抗肿瘤药物组的死亡率与对照组相比，差异无显着性(P>0.05)。图6d和图6H)。当注射miR-8525-5p或miR-8530-5p时，也得到了类似的结果。图6I-6P)。这些结果表明，单用miR-8525-5p或miR-8530-5p的上调和下调对GSTu1的表达没有影响。

图6.单用miR-8525-5p或miR-8530-5p上调和下调对GSTu1表达的影响。

用qRT-PCR和Westernblotting检测miR-8525-5p/agomir对miR-8525-5p(A，I)和GSTu1(B，C，J，K)表达的影响，以及对氯曲利脯氨酸(D，L)敏感性的影响。QRT-PCR和Westernblotting检测miR-8530-5p/agomir对miR-8530-5p(E，M)和GSTu1(F，G，N，O)表达的影响，以及对氯曲利脯氨酸(H，P)敏感性的影响。星号表示治疗与相应的对照(学生的)有显着性差异。t-检验，ns表示无显着性差异，*0.01<P < 0.05, **P < 0.01).

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.g006

**LNC-GSTu1-加强了.的稳定性GSTu1通过防止miR-8525-5p对氯转胺丙酯的降解作用P. *小菜蛾***

为了进一步调查INC的影响-GSTu1-关于…的稳定性GSTu1与miRNAs相关，我们首先通过注射antagomir抑制miR-8525-5p或miR-8530-5p(以antagomir-nc为对照)，然后(12 h后)下调了inc-的表达。GSTu1-注射西林-GSTu1-AS(si-NC为对照)，以3龄幼虫为对照。注射miR-8525-5p/si-inc-后48 h、72 h和96 h，miR-8525-5p相对表达水平分别下降了58.8%、60.6%和42%。GSTu1-AS(图7a)。INC的相对表达-GSTu1-在miR-8525-5p-antagomir/si-inc-GSTu1-AS(注射后48h、72h和96h分别为50.5%、62.1%和46.1%)和抗肿瘤药-NC/si-INc-GSTu1-注射组(注射后48h、72h和96h分别为47.8.5%、53.3%和50.1%)。图7B).

图7.LNC-GSTu1-AS维持GSTu1通过掩蔽miR-8525-5p在抗氯丙酸酯中的结合位点来防止其降解。P. 小菜蛾.

MiR-8525-5p(A)和INc-的相对表达GSTu1-As(B)在抑制miR-8525-5p和击倒INc后-GSTu1-qRT-PCR法。抑制miR-8525-5p并结合INc-基因敲除后GSTu1的相对表达GSTu1-qRT-PCR(C)和westernblot法(D，F)。E：儿童死亡率P. 小菜蛾用LC处理50氯曲利丙酸酯。星号表示治疗与相应的对照(学生的)有显着性差异。t-检验，ns表示无显着性差异，*0.01<P< 0.05, **P < 0.01).

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.g007

作为一种影响，转录水平GSTu1(短+长)注射抗黑药-nc/si-inc-GSTu1-AS下降54.0%和49.8%，转录水平下降GSTu1-siRNA注射后72h和96h，Long分别下降54.0%和49.8%，与对照组(antagomir-NC/si-NC注射组)相比，差异有显着性(P<0.05)。图7c)。Westernblot在GSTu1翻译水平上也得到了类似的结果。图7D和7F)。接触LC的幼虫死亡率50氯曲尼洛尔组为78.7%，明显高于抗黑药-NC/si-NC组(50.9%)(P<0.01)。图7e).

转录水平GSTu1(短+长)注射miR-8525-5p-antagomir/si-inc-GSTu1-AS下降35.1%，转录水平下降GSTu1-长期下跌30.3%(图7c而注射siRNA后96h，与对照组(抗黑素-NC/si-NC-注射组)比较，差异无显着性(P>0.05)。Westernblot在GSTu1翻译水平上也得到了类似的结果。图7D和7F)。此外，接触LC的幼虫的死亡率50氯曲尼洛尔的含量为54.6%，明显低于抗肿瘤药nc/si-inc-的含量。GSTu1注射组(78.7%)(图7e).

总之，这些结果表明对INC的击倒-GSTu1-只会增加幼虫对氯曲尼洛普的敏感性，同时抑制这两个方面-GSTu1-AS和miR-8525-5P没有。这意味着印度-GSTu1-维持稳定GSTu1通过防止miR-8525-5p引起的降解，从而介导了对氯转胺脯氨酸的抗性。P. 小菜蛾.

**Mir-8530-5p不参与INc-介导的GSTu1的调控。GSTu1-AS**

在注射miR-8530-5p-antagomir/si-inc-后48 h、72 h和96 h，miR-8530-5p的丰度分别显著下降43%、48.6%和58.8%。GSTu1-AS(图8a)，而INC的表达-GSTu1-注射miR-8530-5p-antagomir/si-inc的两组患者的AS明显下调-GSTu1-AS(注射后48h、72h和96h分别为35.6%、58.6%和47.4%)和抗肿瘤药-NC/si-INc-GSTu1-AS(注射后48h、72h和96h分别减少46.1%、41.9%和49.2%)(图8B).

图8.Mir-8530-5p不参与对GSTu1由印度-GSTu1-作为。

MiR-8530-5p(A)和INc-的相对表达GSTu1-As(B)在抑制miR-8530-5p和击倒INc后-GSTu1-作为。C：抑制miR-8530-5p和INc-基因敲除后GSTu1的相对表达GSTu1-qRT-PCR(C)和westernblot法(D，F)。E：儿童死亡率P. 小菜蛾用LC处理50氯曲利丙酸酯。星号表示治疗与相应的对照(学生的)有显着性差异。t-检验，ns表示无显着性差异，*0.01<P < 0.05, **P< 0.01).

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.g008

作为回应，转录水平GSTu1(短+长)下降47.8%和47.9%。GSTu1注射组和miR-8530-5p-antagomir/si-inc注射组分别为43.8%和58.4%。GSTu1注射组(图8c)分别于siRNA注射后72h和96h与对照组(抗胃泌素-NC/si-NC-注射组)比较，差异有显着性(P<0.05)。同时，转录水平GSTu1-Long展示了类似的变化(图8c)。Westernblot法测定GSTu1的翻译水平也得到了相似的结果。图8d和8f)。此外，暴露在LC中的幼虫的96-h死亡率50氯曲尼洛尔在抗黑药nc/si-inc-中占76.6%。GSTu1注射组和miR-8530-5p-antagomir/si-inc中的83.7%GSTu1-注射组均显著高于抗肿瘤组(52.7%)(P<0.05)(P<0.01)。图8e).

总之，这些结果表明，无论是对INC的击倒-GSTu1-单独或压制两个印度-GSTu1-As和miR-8530-5p可增加幼虫对氯曲利脯的敏感性。因此，miR-8530-5p不参与INc-介导的GSTu1的调控。GSTu1-AS，可能因为miR-8530-5p只能对三个较长的转录本起作用(GSTu1)，它的丰度在所有四个国家中都要低得多GSTu1转录本，可能与抗氯转流菌无关。

讨论

GST是一种重要的解毒酶，它能催化谷胱甘肽(GSH)与化学物质结合，增加它们的溶解度，促进它们从动物细胞中排出。44]。以前的研究表明，GSTs不仅通过直接代谢或隔离化学物质，而且通过间接地提供保护，防止因接触杀虫剂而引起的氧化应激，从而增加了对杀虫剂的抗药性[44]。在本研究中，GSTu1在P. 小菜蛾通过RNAi和离体新陈代谢实验。RNAi介导的基因敲除GSTu1在两个耐氯曲霉的种群中，降低了对.的抗性。P. 小菜蛾给氯米利普乐。此外，重组GSTu1蛋白的活性也受到氯曲霉素的抑制，提示该酶可能与抗药性有关。P. 小菜蛾 [46]。用高效液相色谱法进一步研究了GSTu1与氯氨酰脯氨酸的相互作用。重组GSTu1对氯氨酰脯氨酸有明显的分解作用。尽管有报道称GSTs参与了有机氯的代谢[47, 48有机磷[49和拟除虫菊酯[50]昆虫中的杀虫剂和蜘蛛螨中的半氟甲酚代谢[51]，这是关于GSTs参与二胺杀虫剂直接代谢的第一份报告。

反义INcRNAs从与之相反的DNA链转录到其配对的蛋白质编码基因，并通过阻断miRNA活性来增强mRNA的稳定性。例如，incrna bace 1-as对bce 1(一个编码β位点淀粉样前体蛋白切割酶1的基因)部分反义，已被证实在阿尔茨海默病患者的大脑中被显著上调，并促进了它的感觉伴侣(Bace 1)的稳定性[45]。进一步的实验表明，INcRNA BACE 1-AS通过阻止miRNA诱导的mRNA衰减和翻译抑制而调节BACE 1的表达。52]。同样，多嘧啶束结合蛋白1(PTB 1)反义RNA(PTB-AS)也可以通过屏蔽miRNA结合位点来调节其mRNA的稳定性。具体来说，PTB 1-AS与PTBP 1的3‘UTR结合，防止miR-9(一种已知的针对PTBP 1 3’UTR的神经特异性miRNA)结合降解[53].

在这里，我们鉴定了一个反义的incRNA，inc-GSTu1-AS，部分反义GSTu1在……里面P. 小菜蛾。QRT-PCR结果表明GSTu1-作为和GSTu1在耐氯菌群中均有上调。此外，我们发现英科-GSTu1-与GSTu1MRNA，这表明INC-GSTu1-可能是顺式-管制因素GSTu1。目前的研究集中在杀虫剂抗药性相关基因的调控机制上。54]。一系列反式-和顺式-已确定调节基因在抗药性昆虫中的表达，特别是转录因子[54, 55]和miRNAs[33, 34]。最近证实，mRNA甲基化是调控细胞色素P 450基因(CYP4C64)，这反过来又导致了全球粉虱对杀虫剂的抗药性。烟粉虱 [56]。然而，很少有研究强烈地揭示了INcRNAs在抗性相关基因调控中的作用。基于RNAi的INC基因敲除GSTu1-由于减少了.的表达GSTu1，尤其是在蛋白质水平上。MiRNA的一个重要作用是抑制靶基因的翻译。因此，我们推断出GSTu1-在维持安全理事会的稳定方面可能发挥关键作用GSTu1通过阻止miRNA诱导的翻译抑制。两种miRNAs miR-8525-5p和mir-8530-5p被鉴定为针对GSTu1采用双荧光素酶报告法和RIP法。然而，注射mir-8525-5p或mir-8530-5 p agomir/antagomir并不影响GSTu1或敏感的.P. 小菜蛾给氯米利普乐。我们推测反义incRNA可能阻止miRNAs与GSTu1。此外，GSTu1和印度-GSTu1在长期接触氯氨酰脯氨酸后，可能会保持动态平衡，因此，单是miRNA丰度的变化并不能影响GSTu1.

抑制miR-8525-5p，同时抑制INc-GSTu1-AS，有效地防止GSTu1表达的下降，从而维持对P. 小菜蛾给氯米利普乐。详细的说，印度-GSTu1-绑定到3‘UTR的GSTu1从而防止了miR-8525-5p结合引起的降解。图9)。虽然miR-8530-5p也可以绑定到GSTu1，它只对三份较长的文字记录采取行动。GSTu1。3种较长的转录本的丰度过低，对耐氯性没有显著影响。虽然很难验证INC的功能-GSTu1-通过体内过表达和生物检测，考虑到单独注射它们各自的agomir或antagomir会引起miR-8525-5p或miR-8530-5p的上调或下调，而对gstu 1的表达没有影响，以及miR-8525-5p和miR-8530-5p在抗绿药人群中的高表达，我们推断出inc-的丰富程度。GSTu1-本来可以提供足够的保护GSTu1在抗性种群中，从而保持了对氯曲利脯的抗性。

下载：

图9.建议的模型的示意图描述了INC的作用-GSTu1-在管理方面GSTu1MRNA稳定性

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.g009

总之，我们的结果显示GSTu1-稳定表达GSTu1通过掩蔽miR-8525-5p在3‘UTR处的结合位点。GSTu1从而提高GSTu1对氯曲尼洛尔代谢的影响。图9)。据我们所知，这是一种调节GST介导的代谢抗性的新机制，也是利用其反义INcRNA促进昆虫互补mRNA稳定性的首次报道。这一结果为进一步深入研究杀虫剂抗药性的机制提供了新的思路，也为进一步深入研究杀虫剂抗药性的机制提供了新的思路。

材料和方法

昆虫

易感种群P. 小菜蛾最初于2014年从中国科学院动物研究所生物农药试点基地购买，并在中国农业大学实验室维持了七年，没有接触任何杀虫剂。田间抗性P. 小菜蛾2016年在广东博罗菜田采集了BL种群，然后用氯霉素间歇筛选以保持抗性。零是一个近等基因抗性种群，它是从SS和BL中获得的，和以前一样[57]。2016年，从海南省海口市菜田采集了香港地区的抗性种群，并在实验室中不断地用氯曲霉素进行筛选。0、BL和HK对氯曲利脯的抗性分别是SS的465倍、5057倍和6722倍。S1表)。各阶段P. 小菜蛾维持在27±1°C，光照16h，萝卜幼苗8h黑暗。拉帕努斯(Raphanus Ativus)(L.)向成虫提供10%(w/v)蜂蜜溶液，并允许在萝卜幼苗上产卵。

生物测定

浸叶法58]测定氯曲尼洛尔的毒性。将卷心菜叶片浸泡在所需浓度的氯曲霉脯溶液中15s，然后阴凉干燥20 min。以0.1%(v/v)TritonX-100水溶液为对照.在每片叶片上移栽约20~3个龄期，每种浓度用3个重复。治疗后96h观察死亡率。LC50数值是用Polo-Plus 2.0软件(Leora Software Inc.，Berkeley，CA)计算的.

总RNA的提取与cDNA的合成

用TRIzol试剂提取总RNA(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。从每个P. 小菜蛾人口(SS，NIL，BL，HK)。从卵子、一至四龄成虫、前蛹、蛹和第一天成虫(雌、雄)采集发育特异性样本。取4龄大鼠头部、中肠、珠被、脂肪体和马尔卑斯小管等组织标本。利用PrimeScript RT试剂试剂盒和gDNA橡皮擦(Takara，中国大连)根据制造商的建议，从总RNA中提取第一链cDNA。

**克隆及序列分析GSTu1和印度-GSTu1-如P. *小菜蛾***

核苷酸序列GSTu1它的反义转录子(名为INcRNA)-GSTu1-AS最初是从我们以前的转录组数据中获得的[27]。用RT-PCR方法对这两种转录本的序列进行了验证。程序为：94°C 3 min，94°C 35次，30 s，60°C 30 s，72°C 1 min，72°C 10 min。利用RACE cDNA扩增试剂盒(克隆技术，山景城，CA，美国)克隆了GSTu1和印度-GSTu1-作为。根据这两种转录本的已知片段，设计了5‘-种族和3’-种族的基因特异性引物。用试剂盒中提供的基因特异性引物和通用引物组合(UPM)进行第一轮PCRS，程序为：94°C 3 min，94°C 5次，30 s，72°C 3 min，94°C 25次，30 s，68°C 30 s，72°C 3 min，72℃下延长10 min。对于第二轮PCR，第一轮PCR产物稀释50-100倍，然后作为模板.第二轮PCR：94°C×3 min，94°C 20次，30 s，68°C 30 s，72°C 3 min，72°C延伸10 min。

推测的GSTu1氨基酸序列P. 小菜蛾利用集群X2.0对其它相关昆虫进行比对，利用MEGA 6软件利用邻接法构建系统发生树，并对其进行了1000个拷贝的自举分析。

基因表达的qRT-PCR验证

用qrt-PCR方法对该基因的相对表达进行了实验验证。GSTu1和印度-GSTu1-成绩单。β-肌动蛋白和EF1a作为内部控制。QRT-PCR是在ABI 7500实时PCR系统(应用生物系统，福斯特市，美国)上进行的.采用SYBR预混ExTaq试剂盒(TAKARA)，采用标准PCR方法，PCR程序为：95°C 30 s，95°C 40次，5 s，60°C 34 s，将样品加热至95°C 15s，再冷却至60°C 15s，得到熔融曲线，每周期1°C/15s，直至95°C。每个转录本的相对表达量用以下方法计算。-ΔΔCT方法[59].

RNA干扰与miRNA注射

双链RNAGSTu1准备好离体使用MEGAscript RNAi试剂盒(美国加利福尼亚州福斯特市Ambion)。在E-RNAi网站上设计了含有T7聚合酶启动子序列的基因特异性引物(用于设计和评价各种物种的RNAi试剂的工具)，Http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/)。以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的dsRNA为对照。所有合成的dsRNA都溶解在无核酸酶的水中，然后用NanoDrop 2000进行定量(Thermo Science，Wilmington，DE，USA)。一种针对INC的siRNA-GSTu1-作为(西-英)-GSTu1-AS)是在GSTu1和印度-GSTu1-上海基因臂有限公司(中国上海)合成的AS。以阴性对照siRNA(NC-siRNA)作为对照.GSTu1dsRNA和si-inc-GSTu1-用微注射器(纳升2000注射器；WPI公司，佛罗里达州萨拉索塔，美国)向早期第三龄婴儿(400纳克/人)注射。上海基因臂有限公司(上海)合成了miRNA模拟物(Agomir)、抑制剂(Antagomir)及其阴性对照物(NC agomir、NC antagomir)。S2表)。每3龄幼虫分别注射1 3 8nL 50μM miRNA或抗黑素，对照组注射相同剂量的Ncagomir或antagomir。对注射后的昆虫标本进行基因表达的检测，并对其余昆虫进行平行生物检测，以确定注射后的幼虫对氯曲尼洛普的敏感性。采用上述浸叶法对注射的幼虫进行LC处理。50氯曲利丙酸酯。治疗后96h记录死亡情况。实验用三个重复进行。图中显示了所有注入实验的原理图。S4图.

谷胱甘肽1的表达及纯化

序列验证GSTu1用BamHI和EcoRI酶切，插入表达载体pet-28a(+)，转化为E. 大肠杆菌BL 21(DE3)细胞表达。重组GSTu1蛋白在含0.2mm异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)的500 mL L-Bertani(LB)液体培养基中诱导表达，在30°C下摇动12h，在12 000 g和4°C离心获得诱导菌，在10 mL 10 mm-Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中再悬浮。超声作用5 min后，在12 000 g和4°C条件下离心10 min，用SDS-PAGE法鉴定重组GSTu1的可溶性成分。重组蛋白经Ni-NTAHIS结合树脂(ABiotech，济南)结合，用一系列咪唑(20、50、150和250 mm)进行洗脱。纯化后的蛋白用10 mM Tris-HCl缓冲液与150 mM NaCl和50%甘油进行透析。采用BCA(比星-软骨酸)蛋白检测试剂盒(CwBiotech，北京，中国)测定重组GSTu1的浓度。

离体酶动力学及代谢测定

用Zhang等人描述的方法检测重组GSTu1的特异性活性。[60]。总反应量为4μL重组谷胱甘肽1蛋白4μL，含1mM CDNB的50 mm磷酸盐缓冲液196μL，10 mm谷胱甘肽10 mM，在37°C的吸光度微板阅读器(SPECTRAMAX，分子器件，Sunnyvale，美国)上测定了氯曲霉对重组GSTu1的抑制作用。总反应量为2 0 0μL，其中重组GSTu1蛋白4μL，含1 mM CDNB，10 mM GSH的5 0mPBS(pH6.5)μL，1，10，10 0，1 0 0 0μM。酶活性按上述方法测定。以相同体积的50 mm PBS(pH6.5)和热灭活的GSTu1为阴性对照，每项试验重复三次。

为了测定GSTu1代谢氯氨酰脯的能力，离体试验是从巴达维[61]。将含0.1mPBS(pH7.2)、2.5mMGSH、0.45mm氯氨酰脯氨酸和20μg重组GSTu1蛋白的反应体系，在30℃下孵育4h，200 rpm摇动。随后，加入500μL的甲醇(高效液相色谱法，hplc分级)来阻止反应.然后在13,600 g和4°C下离心10 min。将所得上清液的200微升转入高效液相色谱小瓶，20μL上清液注入LC-18(4.6×150 mm，5μm)反相分析柱(AgilentTechnologies，CA，美国)。以70%乙腈+30%水为流动相，流速为1.0 mL/min，30°C为流动相，用峰积分法定量测定260 nm处吸光度的变化，并按标准曲线测定。S5图)。对3个重复样品进行了分析。以100°C热灭活酶10 min为对照.

细胞质和核RNA的分离

核和细胞质RNA分离是按照制造商的协议使用细胞质和核RNA纯化工具包(加拿大安大略省Norgen Biotek公司)进行的。然后用实时定量PCR法检测RNA水平.总之，用相应体积的细胞核和细胞质RNA进行RT-PCR，生成cDNA模板。计算细胞核和细胞质富集率，以显示最终结果53]. β-肌动蛋白以mRNA作为细胞质对照，以U6为核对照。

MiRNA靶预测和双荧光素酶报告试验

两个miRNA目标预测软件程序，米兰达(Http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do) [62]和RNA杂交(Http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/welcome.html) [63]，与默认参数一起使用，以预测潜在目标为3‘未翻译区域(UTR)的miRNAs。GSTu1成绩单。通过插入野生型或突变的靶序列构建荧光素酶报告质粒。GSTu1萤火虫荧光素酶ORF(开放阅读框)和SV40poly(A)之间进入pmirGLO载体(Promega，Leiden，荷兰)。根据制造商的指示，利用定点突变试剂盒(Beyotime，中国南京)合成了突变目标序列。在荧光素酶检测中，HEK293T细胞在96孔板中培养，用磷酸钙细胞转染试剂盒(Beyotime)转染报告质粒和miRNA agomir或NC agomir。每口质粒均含有0.2μg质粒和90 NMmiRNA。转染后24h，用双Glo荧光素酶分析系统(Promega)进行荧光素酶检测。将归一化萤火虫荧光素酶活性(萤火虫荧光素酶活性/雷诺荧光素酶活性)与对照组进行比较。每转染一次，从6个重复的结果中获得荧光素酶的平均活性。

拉皮

采用Magna RIP试剂盒(德国米利波)进行了YEY等人的RIP试验。[64]。在RIP裂解缓冲液中，收集约10~3龄幼体，在冰上进行匀浆。溶菌物在13,600 g，4℃离心10 min，上清液(10 0μ1)与5μg的RIPAb+AGO-1抗体(微孔)或正常小鼠IgG(4°C)微球孵育12h，用RIP洗涤缓冲液洗涤几次。最后，用TRIzol试剂(Invitrogen)纯化RNA，用于cDNA合成。用qRT-PCR法测定RNA的转录本富集率.进行了3个生物复制和3个技术复制。

FISH和RPA

一种用于检测的反义核酸检测探针(5’-AATCTCTTTCTGCGGATTCATCTGAGCATATCCCTCGGTGAGGTG-3’)GSTu1被标记为Cy3。探测INC的探测器-GSTu1-(5’-TATCAAGTTACGCATCCAAGATAACAGAGTTAGATAGGTAAGTAC-3’)标记为FAM(中国，GefanBio)。随机洗牌探针(5‘-UUCUCCGAGUUCACGU-3’)和探针(5‘-UGUACUACACAAAAGUACUG-3’)分别作为INcRNA和mRNA阴性对照。用于荧光原地用4%多聚甲醛固定中肠2 h，用0.2M盐酸和蛋白酶K处理组织切片，在65°C下用mRNA或miRNA探针在黑暗中孵育48h。样品在室温下用PBS洗涤5次(每次1 min)。对荧光信号进行分析，用Nikon Eclipseci显微镜(日本东京)记录图像。

从中肠提取总RNAP. 小菜蛾采用TRIzol试剂，用DNaseⅠ消化，去除DNA污染。用RNase A(Takara)处理纯化的RNA，在消化缓冲液中消化单链RNA。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，进行琼脂糖凝胶分析，鉴定其结合能力和保护作用。GSTu1-与GSTu1一样。

WESTERNBLOTTING

抗GSTu1抗体由北京蛋白创新有限公司(北京，中国)合成。以一种抗β-actin的抗体(转基因生物技术，北京，中国)作为内部对照.每个样本的总蛋白都是按照制造商的协议使用组织蛋白提取试剂盒(中国Cwbio)提取的。然后用BCA蛋白分析试剂盒(Cwbio，中国北京)测定蛋白质浓度。提取的总蛋白经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，转移到0.45μm厚的聚偏氟乙烯膜上。用5%脱脂乳(中国生物膜)阻断膜2 h，4°C与特异性抗体共同孵育1 h，用吐温-20(PBST)磷酸盐缓冲液冲洗膜，用山羊抗兔免疫球蛋白G(稀释率为1：20,000)(CwBio，中国)孵育1h，最后用改良的ECL westernblot试剂盒(CwBio，中国)分析特异蛋白条带。用ImageJ程序对westernblot结果进行定量分析。

统计分析

数据用学生的t-试验，以评估agomir或antagomir/dsRNA治疗组与对照组之间的显着性差异。采用单因素方差分析(ANOVA)结合Tukey的多重比较方法，比较各转染组的相对荧光素酶活性及相对表达量。GSTu1和印度-GSTu1-处于不同发育阶段或在不同组织中。所有的统计分析都是用spss软件20进行的。P-数值<0.05被认为是有统计学意义的。本研究中使用的所有引物均列于S3表.

辅助信息

GSTu1的序列分析。

显影1/8: Pgen.1009888.s001.tif

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图S1.GSTu1的序列分析。

A：GSTu1的G位和H位残基P. 小菜蛾。B：GSTu1的系统发育分析P. 小菜蛾和其他相关昆虫。保守的G位残基用红色三角形标记，基片结合区(H位)用蓝色三角形表示。推测的GSTu1氨基酸序列埃及伊蚊(XP_021706303)，致倦库蚊(XP_001851103.2)，黑腹果蝇(XP_014766382)，家蝇(XP_005183645)，[医]库普拉(XP_023295552)，[医]家蚕(XP_012169538)，[医]唇形科(XP_017796904)，[医]四角藻(KOX 72227)Neodiprion lecontei(XP_015515049)，[医]蓖麻蚕(XP_975048)，光肩星(XP_018564199)，[医]无尾孢(APX 61055)飞蝗(AHC 08059)棉铃虫(XP_021191578)，斜纹夜蛾(XP_022825963)，P. 小菜蛾, [医]斜纹夜蛾(Amyeloistransitella)(XP_013196444)，二化螟(RVE 50143)家蚕(Np 001108462)，帕皮里奥马卡翁(XP_014361114)，番木瓜(NP_001299563)和帕皮里奥多角体(NP_001298693)从GenBank下载用于系统发育分析。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.s001

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图S2.利用RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)寻找RNA结合蛋白。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.s002

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**图S3.靶向miRNAsGSTu1由米兰达和RNA杂交预测。**

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.s003

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图4。所有注入实验的示意图。

向上箭头和向下箭头分别表示表达式向上调整和向下调整；平端箭头表示表达式没有变化。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.s004

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S5图5.测定氯曲尼洛尔的标准曲线。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.s005

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**S1表氯曲霉对不同种群的毒性*小菜蛾***.

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.s006

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S2表MiR-8525-5p和miR-8530-5pagomir和antagomir序列。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.s007

(Xlsx)

中3桌。所有引物均用于本研究。

Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009888.s008

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参考文献

00001. 1.Savary S，Ficke A，Aubertot JN，Hollier C.因疾病造成的作物损失及其对全球粮食生产损失和粮食安全的影响。粮食安全。2012年；4：519-537。

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谷胱甘肽1介导的杀虫剂抗药性调控小菜蛾由miRNA和incRNA-医学论文发表

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导言

结果

的克隆及表达模式GSTu1和印度-GSTu1-易感与耐氯丙酸盐之间P. 小菜蛾人口

GSTu1序列分析

的发育和组织表达模式GSTu1在……里面P. 小菜蛾

GSTu1在氯霉素耐药中的作用分析

INC的发育和组织表达模式GSTu1-如P. 小菜蛾

INC-功能分析GSTu1-抗氯转利脯氨酸P. 小菜蛾

靶向miRNAs的鉴定GSTu1在……里面P. 小菜蛾

MiR-8525-5p和miR-8530-5p在SS、nil、bl和hk中的表达水平

单用miR-8525-5p或miR-8530-5p上调和下调miR-8525-5p不影响GSTu1的表达。

LNC-GSTu1-加强了.的稳定性GSTu1通过防止miR-8525-5p对氯转胺丙酯的降解作用P. 小菜蛾

Mir-8530-5p不参与INc-介导的GSTu1的调控。GSTu1-AS

讨论

材料和方法

昆虫

生物测定

总RNA的提取与cDNA的合成

克隆及序列分析GSTu1和印度-GSTu1-如P. 小菜蛾

基因表达的qRT-PCR验证

RNA干扰与miRNA注射

谷胱甘肽1的表达及纯化

离体酶动力学及代谢测定

细胞质和核RNA的分离

MiRNA靶预测和双荧光素酶报告试验

拉皮

FISH和RPA

WESTERNBLOTTING

统计分析

辅助信息

图S1.GSTu1的序列分析。

图S2.利用RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)寻找RNA结合蛋白。

图S3.靶向miRNAsGSTu1由米兰达和RNA杂交预测。

图4。所有注入实验的示意图。

S5图5.测定氯曲尼洛尔的标准曲线。

S1表氯曲霉对不同种群的毒性小菜蛾.

S2表MiR-8525-5p和miR-8530-5pagomir和antagomir序列。

中3桌。所有引物均用于本研究。

参考文献

**谷胱甘肽1介导的杀虫剂抗药性调控小菜蛾由miRNA和incRNA-医学论文发表**

**的克隆及表达模式GSTu1和印度-GSTu1-易感与耐氯丙酸盐之间P. *小菜蛾***人口

**的发育和组织表达模式GSTu1在……里面P. *小菜蛾***

**INC的发育和组织表达模式GSTu1-如P. *小菜蛾***

**INC-功能分析GSTu1-抗氯转利脯氨酸P. *小菜蛾***

**靶向miRNAs的鉴定GSTu1在……里面P. *小菜蛾***

**LNC-GSTu1-加强了.的稳定性GSTu1通过防止miR-8525-5p对氯转胺丙酯的降解作用P. *小菜蛾***

**Mir-8530-5p不参与INc-介导的GSTu1的调控。GSTu1-AS**

**克隆及序列分析GSTu1和印度-GSTu1-如P. *小菜蛾***

**图S3.靶向miRNAsGSTu1由米兰达和RNA杂交预测。**

**S1表氯曲霉对不同种群的毒性*小菜蛾***.