《Srna介导的调节高尔M RNAE.?大肠杆菌RNase E与Rho依赖的转录终止有关-医学论文发表》期刊简介
Srna介导的调节高尔M RNAE. 大肠杆菌RNase E与Rho依赖的转录终止有关-医学论文发表
· 香金贞,
· 李永和,
· Monford Paul Abishek N,
· 王迅
· 德鲁巴·K·查菲拉伊，
· 洪·林(Heon M.Lim
数字
摘要
在细菌中，小的非编码RNA(SRNAs)与目标mRNAs结合并调节其翻译和/或稳定性。在多顺反子中GalETKM操纵.大肠杆菌，SPOT 42 Srna与运算子记录的结合将导致加莱MRNA这一规定的机制仍不清楚。我们发现Srna-mrna基对在加尔克基因导致转录终止和转录加尔克，并生成加莱有两个不同的3‘-OH末端的mRNA。转录终止需要Rho，转录产物的切割需要内切酶RNase E.Srna-mRNA碱基配对片段是生成这两个片段所必需的。加莱物种是不同的，表示对这两个事件的不同的顺序要求。在mRNA中使用两个目标，每一个都会导致不同的结果，这似乎是Srna的一种新的行动模式。考虑到潜在的SrNA靶点在信号管连接处的普遍存在，根据本文报道的机制产生新的mRNA可能是一种广泛的细菌基因调控模式。
作者摘要
SRNAs是所有生命形式中基因表达的调节因子。在细菌中，如E. 大肠杆菌，sRNAs碱基对与mRNA结合，可导致rho提前转录终止，内源性核糖核酸酶E降解mRNA。在此，我们发现这两个过程可以发生在相同的Srna-mRNA对上，并产生较短但稳定的mRNA，这可能具有重要的功能意义。因此，在mRNA的Srna调控中，转录产物的切割可能是已知的转录终止产生新的mRNA物种的另一种机制。在这两种机制之间的选择取决于在mRNA上与Srna配对的基对发生在哪里。
引用：Jeon HJ，Lee Y，N Mpa，Wang X，Chantiaj DK，Lim HM(2021)Srna介导的调控高尔M RNAE. 大肠杆菌RNase E与Rho依赖的转录终止有关.PLOS Genet 17(10)：e1009878。Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009878
编者：Jue D.Wang，威斯康星大学-麦迪逊，美国
收到：2021年5月11日；接受：(二0二二一年十月十四日)出版：2021年10月28日
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数据可得性：所有相关资料都在手稿中辅助信息档案。
供资：这项研究由韩国国家研究基金会的基础科学研究项目资助：2017R1D1A3B03027965,2018R1D1A3B07044032，20R1A2C200633611至H.M.L.，以及2017R1A5A2015385至H.J.J.。这项研究也得到了美国国立卫生研究院NCI的癌症研究中心内部研究项目的资助。资助方没有参与研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿的编写。
相互竞争的利益：提交人宣布，不存在任何相互竞争的利益。-医学论文发表
导言
半乳糖(高尔)操作大肠杆菌已经成为许多关于细菌转录调控的开创性研究的主题。1]。四个结构基因构成了这个操纵子：盖尔, 高塔, 加尔克，和加尔姆 (图1A)。除了全长高尔MRNAGalETKM(前称MM1)，还发现了另外四种mRNA产品：盖尔, GalE 1, 加莱和GalETK [2]。这些mRNAs在转录起始点有相同的5‘端，但在转录起始点后有不同的3’端。盖尔, 高塔，或加尔克基因(产量)盖尔, 加莱，或GalETKMRNA。的3‘端GalE 1MRNA位于高塔基因。
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图1.SPOT 42促进加莱MRNA形式GalETKM歌剧。
(A)GalETKM的转录起始点的每个基因的终止密码子的最后核苷酸的位置。P1启动子(+1)(上线)。点42(红色)结合位点大约跨越75个核苷酸，位于高尔交界处[20]。.区域盖尔用于探测北方斑点的标记为电子探针。接下来的两条线显示了3‘端的核苷酸序列。加雷特-肖特和加列特MRNA用粗体表示的字母为Shine-Dalgarno序列(ggag，红色字母)。加尔克的停止密码子(UAA，蓝色字母)高塔的起始密码子(8月，绿色字母)加尔克。整个SPOT 42 rna的序列以红色表示，其区域与高尔用黑点标记mRNA，标记为I、II和III.B区。高尔MG 1655(WT，REAN 1)和MG 1655Δ的mRNA防晒系数(Δ)防晒系数，2)细胞。注意，加莱在通道2中缺失mrna带。MG 1655Δ中两条微弱带的同源性防晒系数单元格加莱波段驻留尚未确定。底部显示16S rRNA，用作加载控制。(C)3‘端的3’种族分析加莱MG 1655(RAN 1)和MG 1655Δ的mRNA防晒系数(巷2)细胞。作为长度标记的DNA测序梯位于标记T和C的车道上，其中的数据代表了三个独立的实验。
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全长的3‘端GalETKMMRNA位于高尔操作子核苷酸坐标4,313，其中1是转录起始点。GalP 1启动子(图1A) [2,3]。3‘端是由rho依赖性转录终止(Rdt)产生的，然后再经过4,313个外核反应，这是目前公认的成熟的3’端。GalETKMMRNA4]。另一种类型的转录终止，称为内禀或与rho无关的转录终止，在4,315处生成3‘端，由rnase II立即处理到4,313[4]。Rho还会在高尔导致启动子-近端转录本水平增加[5]。在每个基因的末端发生的rho依赖的终止被认为是导致自然极性的关键分子事件。高尔基因表达1,2].
细菌通过调节基因表达来应对迅速变化的环境。其中一种自适应反应是由一组编码的小RNAs(SRNAs)介导的。反式与其碱基对的目标mRNAs[6]。大多数sRNAs结合在靶mRNA的5‘端附近，并介导阴性对照[7]。在靶mRNA翻译起始点附近的Srna结合阻断了翻译起始。这也可能使rnase E被招募，该酶在rna结合所产生的rna无核糖体区被切割；这增加了由于目标mrna的降解而产生的负性控制。7–12].
靶mRNA 5‘端Srna结合的另一个结果是Rho依赖性终止(RDT).没有伴随翻译的转录使不含核糖体的转录本可用于rho结合和随后的转录终止[1,13–16]。例如，Srna Chix与目标mRNA的5‘端结合ChiPQ，这导致翻译与转录脱钩，导致RDT下游的去耦点[17–19]。在细胞间区高塔和加尔克的停止密码子高塔(蓝色UAA)和引发子加尔克(绿色8月)由3个核苷酸(图1A)。可能的核糖体结合位点加尔克(红色GGAG)存在于高塔停止密码子。众所周知，srna，SPOT 42，参与了这方面的监管工作。高尔区域[20]。SPOT 42是在E. 大肠杆菌及约196种其他种类的γ蛋白细菌[21]。点42在加尔克起始密码子和抑制翻译加尔克 (图1A) [20,22]。此绑定还导致加尔克转录[23]。在之前的一项研究中，我们报告说SPOT 42会减少。盖克-通过加速降解高尔歌剧GalKMMRNA(前称Mk2)[24]。然而，我们也发现SPOT 42结合导致转录终止。高塔产生了一个新的mRNA物种，加莱(前称MT1)。因此，通过生成启动子-近端加莱MRNA和降解启动子-远端GalKMMRNA，SPOT 42增强天然极性高尔歌剧[24].
在本研究中，我们将进一步探讨SPOT 42在高尔交界处加莱MRNA种类我们发现加莱MRNA有两个交替的3‘端，分别位于下游的30和60个核苷酸处。高塔停止密码子(图1A) [24]。我们表明，这两个不同的3‘端是由于SPOT 42的两个不同区域与mRNA的相应互补区域的碱基配对和两种不同机制的参与而产生的：rdt(正如我们已经知道的那样)[24]和以前未见报道的RNase E介导的转录产物切割。经RNaseⅢ处理后，RNase E只产生较长的产物，Rho主要产生较短的产物。加莱物种由两种不同的3‘端生成机制组成。Srna-控制主要位于消息的5‘端。高尔Operon是第一个将Srna规则视为消息内部的示例。最后，我们讨论了产生多顺反子信息的不同截断稳定版本的可能的生理相关性。
结果
SPOT 42促进加工高尔操纵子mRNA加莱MRNA
我们用0.5%半乳糖的LB培养基培养的WT(MG 1655)细胞的RNA进行了Northern杂交。600在0.6点中，42点产量仍保持最大的增长阶段[23]。我们用一个与操纵子第一个基因的前半部分杂交的电子探针分析了这个印迹，盖尔 (图1A)。结果表明：高尔特定的mRNAs存在于WT细胞中：盖尔, GalE 1, 加莱, GalETK，以及完整的长度GalETKM (图1B，1号线)。在我们之前的研究中，我们确定了高尔跨整个操作子的mRNAs，并发现其中提到的3‘端图1B是从歌剧中产生的主要的3‘端[2].
在这项研究中，我们测量了3‘端的位置。加莱用3‘RACE法更精确地表达mRNA。3‘端加莱聚集在高尔核苷酸坐标2,125-29和2,161-63之间的操纵子(图1c，1号线)。这两个3‘端簇位于大约30和60个核苷酸下游的停止密码子。高塔 (图1A)。自从加莱居住在转录起始点[2]，这些结果表明，在Northernblot中观察到的单个mRNA条带实际上是由两组mRNA组成，它们的3‘端存在差异。-医学论文发表
我们发现加莱MG 1655的mRNA特异性降低到30%(±3)%。Δspf删除SPOT 42 Srna基因的细胞(图1B，2号线)。MG 1655中的所有其他mRNA条带Δspf显示相同数量的WT(图1B)。在这些单元中，加莱MRNA缺失(图1c，2号线)(图S1)。这些结果表明，SPOT 42是生成这两个簇的必要条件。在这项研究中，我们提到了加莱的下游有大约60个核苷酸的3‘端的mRNA。高塔停止密码子加莱-长的下游有大约30个核苷酸的3‘端。高塔停止密码子加莱-短的 (图1c).
SPOT 42和高尔MRNA是生成加莱3‘端
i)SPOT 42第一区突变使加列特但不是加雷特-肖特。SRNAs通常通过碱基配对与目标mRNAs起作用。核苷酸序列分析表明，Beisel和Storz确定的SPOT 42的第一、第二和第三区[23，每一个都能与三个不同的区域形成8到10个完美的碱基配对。高尔MRNA(图1A)。我们研究了点42的每个碱基配对区在产生3‘端的作用。加莱.
区域I位于SPOT 42的5‘端，其鸟嘌呤与胞嘧啶的坐标为2 158。高尔MRNA(图2A)。可能有8个连续的核苷酸序列的第一区碱基高尔MRNA，从3‘端上游的几个核苷酸加莱-长。我们从区域1的5‘端删除了一个或三个核苷酸。利用3’种族，我们测定了MG 1655中的3‘端。Δspf含有pBR 322衍生表达质粒pSpot42的细胞，其中SPOT 42基因有不同的突变(防晒系数)介绍[23]。3‘种族结果显示，SPOT 42(如Spot42DMI-1)存在单核苷酸缺失。图2A)导致生产的3‘端加列特大约两个核苷酸比WT短加莱-长 (图2B，2号线)。三个核苷酸(如Spot42DMI-2)的缺失图2A)导致大幅度降低……的水平。加列特 (图2B，3号线)。水平加莱-短的在这两个突变体中，与SPOT 42为WT时基本相同(图2B，1号线)。这些结果表明，SPOT 42区I区的5‘端在其形成过程中起着重要的作用。加列特特别是。
图2.SPOT 42和高尔MRNA是生成加莱3‘端。
(A)前两行显示42个区域的序列，其中42个区域(i-iii)是互补的。高尔MRNA图1A。的3‘端序列加雷特-肖特2,125-9和加列特在2,161-3是表示倒置括号和下划线。2,107处的鸟嘌呤和2,158处的胞嘧啶可帮助定位以下谱线中所显示的突变核苷酸。基本更改以粗体表示。上线表示SPOT 42中的变化，而较低的行显示高尔MRNA(B)3‘端的3’种族分析加莱MG 1655Δ防晒系数携带质粒携带的WT SPOT 42基因或其I区突变衍生物的细胞。在底部显示5‘种族分析，以表明点42 WT和突变RNA在不同通道的相对数量。(C)与(B)相同(除第42点在第II.d区发生突变外)与(B)相同，但该点42在第III.E区3‘端的3’种族分析中变异。加莱MG 1655Δ高尔携带不同质粒高尔突变的操纵子。F)3‘端的3’种族分析加莱MG 1655Δ高尔Δ防晒系数携带两个不同质粒的细胞，一个带有突变高尔操纵子和突变点42基因的另一个。选择质粒对，使其突变碱基互补。这些数据代表了三个独立的实验。
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接下来，我们在SPOT 42的I区引入了替换突变。将I区(5‘GUA)5’端的三个核苷酸转化为互补核苷酸，生成Spot42MMI-1，并将接下来的3个核苷酸(5‘GGG)转化为互补序列，生成Spot42MMI-2(图2A)。3‘种族的结果显示加莱-长当SPOT 42有任何一种替换突变(图2B，第4和第5车道)。同样，这些区域i的变化对加雷特-肖特 (图2B，1-5车道)。因此，Spot42的I区缺失和替换突变的结果表明，I区与其互补序列的配对高尔MRNA在基因的生成中起着至关重要的作用。加列特特别是。
(二)SPOT 42区II区突变使Galet短但不发生加里特-长。SPOT 42区II与10个连续核苷酸序列有很好的互补性。高尔MRNA(图2A)。SPOT 42区域II的3‘端与引发子密码子后面的第二个核苷酸互补。加尔克(鸟嘌呤为2,107，图2A)。我们在第二区进行了一系列的替换突变，并分析了这些突变对第二区的形成的影响。加莱3‘端。第2区3‘端的1个、2个或3个核苷酸被转化为互补序列，分别产生42个突变体MMII-1、-2和-3。图2A)。3‘种族的结果表明，在Spot42MMII-1的SPOT 42中替换一个单核苷酸会导致加莱-短的 (图2C，2号线)。当进行二核苷酸和三核苷酸替换时，结果是相同的。图2C，第3和第4车道)。生代加列特不受这些II区突变体存在的影响(图2C，表示生成配对事件的加列特不受SPOT 42区Ⅱ区三个核苷酸配对的影响。
(三)SPOT 42的第三区突变对这两种基因的产生都没有影响。加列特或加雷特-肖特。SPOT 42的第三区与9个连续核苷酸完全互补，部分覆盖了Shine-dalgarno序列。加尔克MRNA(GGAG，图2A)。与第一区和第二区的突变不同，SPOT 42区第三区的替换突变没有影响3‘端的任何一个世代。加莱MRNA显著(图2D、1-7车道)。我们注意到，当点42个突变体引起大幅度的变化时，加莱MRNAs，并不是由于SPOT 42突变体RNA水平的急剧变化(图2B-2D、下排)。
进一步研究SPOT 42和高尔MRNA，我们采用了互补的方法：我们没有改变SPOT 42，而是在一些高尔与SPOT 42有牵连的碱基配对序列，并分析了碱基对的形成。加莱3‘端。在pbac衍生的低拷贝数质粒pgal中产生突变，pgal携带整个pgal。高尔歌剧[25]。对.的影响高尔检测MG 1655Δ的突变高尔菌株[25].
我们取代了pGal的3个核苷酸，生成GalMMI-1这会改变高尔从5‘UGC到5’ACG的mRNA，从而打破了在SPOT 42的5‘端与Aug的互补性。图2A，较低的一组序列线)。3‘种族的结果表明加列特形成严重受损(图2e，2号线)。当我们替换接下来的3个核苷酸时，结果是一样的。高尔，从CCC到GGG，生成GalMMI-2 (图2A，也见图2e，3号线)。相反，这两个高尔突变体在产生加雷特-肖特。这些结果与SPOT 42区域i突变体spot42mmi-1和-2的结果(它们在与高尔突变体GalMMI-1和-2)，导致我们得出这样的结论：SPOT 42的第一区与第42号区域之间的特定碱基配对。高尔MRNA是形成3‘端的关键加列特.
我们采用了类似的方法来测试生成加雷特-肖特。鸟嘌呤在2,107高尔与SPOT 42区II区3‘端配对的mRNA被转变为胞嘧啶，产生高尔突变体GalMMII-1 (图2A，最后一个序列行)。3‘比赛结果显示：加雷特-肖特降低到40(±3)%的水平观察到在没有突变(图2e，4号线)。当下一个基被另外更改时，生成GalMMII-2的3‘端的级别。加雷特-肖特减少到在没有突变的情况下观察到的水平的20%(±4)%图2e，5号线)。生代加列特不受这些突变的影响(图2e，第1、4和5号车道)。结合Spot42MMII-1和-2突变体Spot42MMII-1和-2的结果(这些突变体在相同的碱基配对区域与高尔突变体GalMMII-1和-2)，这些结果使我们得出结论：SPOT 42的第二区与第42号区域之间的碱基配对。高尔MRNA是形成3‘端的关键加雷特-肖特.
接下来，我们测试了这些高尔突变体加莱在Spot 42突变体存在的情况下，产量达到WT水平，并具有互补变化(图2f)。MG 1655Δ高尔Δ防晒系数对pGal和pSpot 42突变质粒的细胞进行了检测，结果表明pGal和pSpot 42突变质粒均有3‘端。加莱在所有病例中，3‘端的mRNA水平均恢复到WT水平(图2f)。这些结果证实了需要基对来生成两个加列特和加雷特-肖特，与其世代有关的碱基配对区域是不同的。
RNase E参与了加列特3‘端
在我们之前的研究中，我们认为rdt是生成3‘端的分子事件。加莱MRNA24]。因为我们发现有两个不同的3‘端加莱MRNA，我们验证了内源性核糖核酸酶介导的转录产物切割可能是产生3‘端之一的另一机制。我们分析了加莱内含子核酸酶RNase G缺失株的mRNA(英文)RNG-)，RNase P(RNP特氏)和RNase E(雷恩特氏)。在……里面RNG- [26]，都是加莱-长和加莱-短的的产量与WT的产量相当，表明RNase G没有参与这两种物质的产生加莱种(图3A，第一和第二车道)。
图3.RNase E参与了加列特3‘端。
3‘种族分析加莱RNA 3‘端位于三种不同的内切酶突变株中。所用菌株为GW 10(RNG+RNE+RNase G和RNase E，通道1、7和8)、GW 11(RNG::猫; [RNG-[RNase G下降突变体，RAN 2)，NHY 312(RnpA+; [RNP+]RNase P，RNase 3和4的WT)，NHY 322(RnpA 49; [RNP特氏]RNase P温度敏感突变体，通道5和6)，GW 20(AMS 1特氏; [雷恩特氏]RNase E温敏突变体，通道9和10)。这些数据代表了三个独立的实验。-医学论文发表
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为了测试其他两种内含子核酸酶的需求，RNP特氏和雷恩特氏菌株[26,27成长为OD600在允许温度(30°C)下为0.3，与其各自的WT菌株一起。然后在不允许的温度(44°C)下培养25分钟，然后收获细胞进行分析。到这个时候，文化OD600大多数情况下达到0.6左右。在……里面RNP特氏，在允许生长温度和非允许生长温度下收获的细胞中两种3‘端的水平没有差异，表明rnase P不参与这两种生长过程中的任何一种。加莱种(图3A、3至6车道)。相反，在雷恩特氏在不允许的温度下，3‘端的水平加莱-长降至低于WT细胞观察到的10%的水平(图3A、8号和10号车道)。的3‘端水平的差异。加莱-短的是可以忽略不计的。这些结果表明，RNase E在RNase E的产生中起着重要的作用。加莱-长特别是。
依赖于rho的转录终止生成加雷特-肖特3‘端
测试Rho是否参与了加雷特-肖特，我们通过在无细胞系统中加入pgal来检测转录。E. 大肠杆菌菌株BL 21(λDE3)[28]。无细胞系统包含所有必要的转录和翻译因子，但不包含模板DNA.加入模板DNA pGal后，在30℃下反应30 min。添加pGal后3‘跑的结果没有明显的3’端(图4A，3号线)。然而，在半乳糖存在下(最终浓度为0.5%)产生了明显但微弱的3‘端。图4A，表示这些条带来自于高尔歌剧。有趣的是，当质粒pRho存在时，2,184的条带增加了5倍，其中Rho受T7启动子控制(图4A，5号线)。这些结果表明，2,184-带是RDT的乘积.
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图4.Rho依赖性转录终止离体在无细胞系统中检测。
(A)3‘种族试验加莱MG 1655 mRNA 3‘端体内(1)不含DNA模板的无细胞系统(REAN 2)、DNA模板pGal(RAIN 3)、pGal和0.5%半乳糖(REAN 4)、pGal、pRho和0.5%半乳糖(RAIN 5)。T，C：DNA测序阶梯。(B)3‘种族试验加莱除pRho质粒缺失和SPOT 42 RNA存在外，mRNA 3‘端均为(A)。第一巷与(甲)第一巷相同；第二巷与(甲)第四号道相同；第三至五线：反应与第二线相同，但反应为1.5海里(第三线)、十五海里(第四线)及一百五十海里42 RNA点(第五线)。T，C：DNA测序阶梯。(C)Rho利用位点的核苷酸序列车辙，被称为“C-富区域”，位于高塔基因和跨度高尔坐标2 075至2 175(以橙色表示)。中的结合位点高尔SPOT 42的I-Ⅲ区的mRNA被装箱。RNA聚合酶停顿位点的一致性序列+1、-1和-10以粗体表示。以下分别显示绿线和蓝线区域的胞嘧啶和鸟嘌呤含量。富C区域(用虚线括起来)显示在横坐标上。高尔坐标。用70 nt的滑动窗口绘制GC含量。这些数据代表了三个独立的实验。
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为了证实在2,184处的条带是否为rdt的结果，我们在pGal、0.5%半乳糖和pRho存在下，在无细胞反应中增加了Rho抑制剂Biccyclomycin(BCM)的浓度。当bcm浓度从0.5g/ml增加到10μ/ml时，2,184的条带逐渐减少。图S2、2号至6号车道)。浓度为10μg/ml的bcm可抑制2,184条带的形成，其抑制率约为未用药水平的90%(图S2，1号线)。这些结果表明，2184波段是RDT的结果。
此外，2,184的胞嘧啶是Rho-利用位点下游的9个核苷酸(车辙)，被称为“C-富区域”，存在于高塔跨越坐标2,075至2,175的基因(图4c) [24]。我们为RNA聚合酶暂停位点找到了一个完美的一致序列[29,30]，其中2,184位的胞嘧啶位于共识序列的-1位。这些结果表明rho终止。高尔转录停顿在2,184(图4A).
接下来，我们测试了SPOT 42 RNA在RDT中的作用。我们用离体转录反应材料和方法)。与pGal和0.5%半乳糖一起，我们在无细胞反应中加入了越来越多的SPOT 42 RNA。结果表明，随着SPOT 42 RNA浓度的增加，2,184条带增加；当SPOT 42分别为1.5、15和150 nm时，条带分别增加5倍、9倍和12倍(图4B)。这些结果表明，SPOT 42直接控制高尔.
在2,125~2,129处，我们观察到一个3‘端的团簇，它也随着点42浓度的增加而增加。有趣的是，这3‘端正是在加雷特-肖特被发现(图4B)。这些结果表明，rdt生成加雷特-肖特3‘端。这3‘端在没有添加点42的情况下不会形成(图4A，5号线)。似乎加雷特-肖特3‘末端由SPOT 42介导的RDT产物在2,184处由无细胞系统中未知的外核酶处理而产生。
RNase III-介导的转录产物切割导致加雷特-肖特3‘端
以确定处理3‘端的外显子核酸酶加列特还有-短的在他们观察到的位置，我们用MG 1655Δ制备的rna进行了3‘种族竞赛。RnB(RNase II已删除)，MG 1655ΔRnR(RNase R已删除)和W 3110ΔPNP(PNPase删除)。结果表明，外显子酶缺陷菌株的3‘端代均未被破坏。图5A)。这促使我们测试内含子核酸酶，特别是RNA双链特异性内切酶rnaseⅢ.
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图5.生代加雷特-肖特3‘端由RNaseⅢ介导的转录产物切割。
(A)3‘种族鉴定加莱3‘E. 大肠杆菌缺乏外显子核酸酶的突变体。所用菌株为MG 1655Δ。RnB(其中RNaseⅡ的基因从染色体上被删除)(RAN 2)，MG 1655ΔRnR(其中RNase R基因从染色体上被删除)(RAN 3)，W3110ΔPNP(将PNPase基因从染色体上删除)(RAN 5)。Δ菌株的WT检测结果RnB和ΔRnR显示在第1车道上，并显示在Δ中。PNP菌株出现在4.b)3‘种族试验中。加莱在pRNIII质粒存在的无细胞系统中，rnaseⅢ基因处于T7启动子的控制之下。这些数据代表了三个独立的实验。
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在质粒pRNIII存在的情况下，我们用无细胞系统分析了rnaseⅢ基因(RNC)处于T7启动子控制之下。在RNase III存在的情况下，加雷特-肖特2,125~2,129增加2倍，2,184条带减少50(±5)%。图5B，4号线)。这些结果进一步支持了生成加雷特-肖特在2,125-2,129需要点42，并从RDT产品处理在2,184，并意外地，揭示了一个内生酶参与了这一过程。
SPOT 42调节半乳糖代谢和分解代谢相互竞争的酶的产生，以优化生长。
众所周知，SPOT 42被认为是下调的。加尔克转录[23[翻译]和翻译[20]。SPOT 42也被认为加速了其中一种物质的降解。高尔MRNA种类，GalKM，它包含了操纵子的最后两个基因[24]。在这里，我们还发现并证实了SPOT 42绑定导致了加莱两个启动子-近端基因的mRNA。这些结果的预期是，在SPOT 42存在的情况下，启动子-远端基因产生Gal蛋白，加尔克和加尔姆，当启动子-近端基因产生的时候，盖尔和高塔，会增加。-医学论文发表
为了检验这一预测，我们测定了MG 1655和MG 1655Δ中的Gal蛋白。防晒系数用西方的墨迹。细胞在添加0.5%半乳糖(M9-半乳糖)的M9培养基中培养。结果表明，在OD处600在0.6中，MG 1655的产量分别为83(±16)%和68(±25)%。更多谷蛋白和谷丙转氨酶蛋白分别为17(±5)%和12(±5)%较少分别为Galk和Galm，分别比MG 1655Δ生产的要好。防晒系数 (图6a)。结果表明，SPOT 42增加了甘氨酸和谷丙转氨酶的产量，降低了Galk和Galm的产量，但下降幅度相对较小。Gale是一种参与产生LPS和其他多糖所需的UDP-葡萄糖/半乳糖生物合成的表观酶，而Galk是一种参与半乳糖分解代谢的激酶。31,32]。这些结果表明SPOT 42可以调节高尔促进该通路合成作用的表达。
图6.SPOT 42调节高尔蛋白质水平向合成途径。
(A)蛋白质产物的westernblot分析高尔来自WT和Galm的歌剧(Gale，Galt，Galk和Galm)Δspf细胞。(B)SPOT 42缺失的生理效应。这是通过比较MG 1655和MG 1655Δ的生长速度来衡量的。防晒系数细胞在不同培养基中分别添加0.5%半乳糖(淡蓝色和绿色)，M9添加0.2%葡萄糖(灰色和黄色)，M9添加0.5%半乳糖(蓝色和红色)。MG 1655Δ的生长SPF细胞在LB-半乳糖和M9-葡萄糖培养基中与MG 1655相同。在M9-半乳糖培养基中，MG 1655Δ防晒系数细胞(红色)比MG 1655细胞(蓝色)生长慢。误差条表示三个独立实验(n=3)的三个副本的平均折叠变化±标准差。
Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009878.g006
基于以上结果，我们推断出MG 1655Δ。防晒系数在类似M9-半乳糖的培养基中，细胞的生长速度比MG 1655细胞慢，在这种培养基中，半乳糖的合成和分解都是必需的。为了检验这一点，我们测量了MG 1655和MG 1655Δ的生长情况。防晒系数各种介质中的细胞。在不需要半乳糖或不相关的LB-半乳糖或M9-葡萄糖培养基中，两种细菌之间没有生长差异。图6B)。然而，在M9-半乳糖中，MG 1655Δspf生长速度比MG 1655慢。指数生长阶段600在0.05到0.4之间，MG 1655的倍增时间Δspf比MG 1655长23%(S3A图和表1).
·
表1.倍倍时间高尔和防晒系数M9-半乳糖培养基中的突变体。
Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009878.t001
出于同样的原因，我们认为高尔突变体加莱在M9-半乳糖培养基中，mRNA生长较慢。为了测试这一点，我们测量了MG 1655Δ的生长情况。高尔细胞编码GalMMI-1(产生缺陷)加列特)，或GalMMII-1(产生缺陷)加雷特-肖特)在M9-半乳糖培养基中。在指数生长阶段，细胞编码的加倍时间。GalMMI-1或GalMMII-1 (S3B图)比wt编码长22%和26%。高尔顺序，分别(表1)。生长缺陷在高尔突变体得到了点42突变体的补充，这将恢复SPOT 42的碱基配对。高尔MRNA(图2f) (S3C图)。加倍时间GalMMI-1和GalMMII-1在SPOT 42突变体的存在下，具有互补变化的突变体比WT时分别缩短了21%和22%。表1)。这些结果揭示了细胞差异表达的生理相关性。高尔操纵子基因点42，即通过引导来优化生长。高尔向合成途径表达。
讨论
转录产物的切割和转录终止都参与了加莱MRNA
在本研究中，我们探讨了非编码Srna，SPOT 42，通过调节高尔操纵.E. 大肠杆菌在转录后-启动水平。我们的结果表明，在SPOT 42存在的情况下，加莱物种产生。这些mRNAs具有与全长相同的5‘端。GalETKMMRNA33，但是有两个不同的3‘端，在这里称为加雷特-肖特和加列特。这些RNA是由SPOT 42的两个不同区域(区域I和II)的碱基配对而产生的，它们的互补序列位于加尔克ORF。第二区碱基配对导致加雷特-肖特并且需要转录终止因子rho，区域i碱基配对导致加列特并要求内切酶RNase E.Rho参与加莱这是已知的世代，也是由RNase E产生的。下面，我们讨论一个区域的碱基配对如何导致转录终止，而在另一个区域，转录本切割。
转录与翻译E. 大肠杆菌 [34–36]。当与RNA聚合酶结合在一起时，RNA聚合酶就与主要的核糖体连接在一起，从而翻译出新生的转录本。37–39]。这种耦合是一个随机事件，因此rna聚合酶常常在没有连接核糖体的情况下转录ORF，从而生成不含核糖体的mrna区域[40,41].
根据Moller等人的实验结果[20，这表明SPOT 42结合抑制了加尔克，我们建议，当转录与翻译随机分离时，SPOT 42就会启动碱基配对。高尔MRNA，特别是第二区的碱基对，紧邻下游加尔克启动密码子阻止启动加尔克翻译(图7a) [42]。产生的不含核糖体的rna，包括一个rho利用点(车辙)，被称为“C-富地区”[24]，允许Rho绑定到车辙在2,184处暂停的转录位点和随后的终止(图7B) [1,15,17,43,44]。Rnase III单独或与未知的外显子酶一起参与Rho终止转录本的处理，其3‘端为2,184至2,184。加雷特-肖特3‘端为2,125-2,129的产品(图7c).
图7.SPOT 42 Srna介导的加莱Rho和RNase E.
(A)产生加雷特-肖特由Rho：模型显示(领先)核糖体在停止密码子。高塔在一条新生的链条上高尔MRNA高尔与转录的RNA聚合酶不耦联的细胞间区。在这种情况下，与SPOT 42区II配对的mRNA序列没有被核糖体覆盖。(B)假定II区结合维持下游mRNA不含核糖体。这为rho的加载和生成提供了平台。加雷特-肖特由Rho在2184转录终止。3‘端加雷特-肖特下划线。(C)Rnase III切割的Rho终止转录本的后续处理显示在rnaseⅢ的3‘端。加雷特-肖特(向下的绿色箭头)。(D)生产加列特RNase E：这一过程需要与SPOT 42区杂交。我们假设翻译终止于高塔并不总是导致翻译开始加尔克(由于随机解耦)加尔克译自高塔(翻译)，这将使加尔克RNA核糖体不含核糖体并促进与区域I(E，F)的杂交。该杂交旨在确保下游RNA在新生转录本(E)或非新生转录本(F)中保持不含核糖体，从而允许RNase E断裂。杂交区I也可以阻断3‘→5’外核酶在RNase E酶切后的3‘端处理。请注意，SPOT 42区域iii不能与相应的碱基对对。高尔由于核糖体的存在高塔停止密码子，这可能解释了为什么该区域的突变对加莱MRNA产生“RNase(？)”表示当前可能参与加莱成绩单。
Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009878.g007
与依赖于从翻译中解偶联转录的Rho加载不同，RNase E的切割不必受到如此的限制。新生转录本和非新生转录本都可能作为SPOT 42介导的底物。加列特生产。因此，RNase E切割的概率将取决于在新生转录本情况下，翻译与转录的解偶联的概率，以及加尔克译自高塔非初生成绩单的翻译(图7D-7F)。与转录本结合的SPOT 42有望增加下游RNA不含核糖体的可能性，从而促进RNase E的作用。图7e)。SPOT 42还可以通过允许RNase E与SPOT 42的5‘单磷酸化末端结合来招募RNase E[45但是，我们的数据(S4图)。RNase E通过直接进入途径进入核糖体不含核糖体的mRNA。45].
总之，我们的结果表明，与转录终止一样，RNase E的转录产物切割是另一种生成机制加莱MRNA种类我们认为这是第一个使用至少两种不同机制产生细菌Srna的例子。然而，RNase裂解和RDT同时调节核糖体[46–48].
我们的数据还表明，产生加莱独立发生，即一个事件发生的频率不影响另一个事件发生的频率(图2B和图2C)。虽然这些事件可能通过消耗衬底而相互影响，但我们注意到有相当一部分的衬底(GalETKM和GalETK)保持原样(图1B)，暗示基板可用性可能不是一个限制因素。我们认为这两个事件都是概率性的，并且发生在不同的成绩单上，效率相当。如果SPOT 42以不平衡的两种形式存在，那么这些结果也是可以理解的。在这种情况下，失去一个不会影响另一个的结果。
转录终止或转录切割产生的3‘-OH末端的处理
SPOT 42区域I突变体Spot42DMI-1(在5‘端有一个单核苷酸缺失)生成加列特在3‘端有两个短核苷酸的mRNA(图2B，2号线)。这些结果的一个可能的解释是，第一区和第一区之间的碱基配对双链RNA高尔Mrna阻断3‘→5’外显子酶的消化，因为众所周知，在3‘端有发夹(茎环)结构。E. 大肠杆菌MRNA可以保护游离的3‘-OH端免受这种消化[49–52].
已知rdt生成的转录本的3‘端立即接受3’→5‘外显子酶消化[4,50]。然而，在这项研究中，我们首次报告说，rnaseⅢ是一种双链RNA特异性内切酶，它可以处理rdt释放的转录本的3‘端，而rnaseⅢ是一种双链RNA特异性内切酶(rnaseⅢ)。图5)。然而，目前尚不清楚RNaseⅢ的切割位点是否位于SPOT 42和SPOT 42之间形成的双链RNA区域。高尔RNA或分子内形成的RNA高尔RNA序列
Srna在室间区和5‘UTR处的结合可能有不同的结果
Srna与5‘非翻译区(5’UTR)的结合通常导致翻译起始受到抑制。这导致从Srna结合区下游产生不含核糖体的区域，这可能使rho[17,24,53,54[RNase E]或RNase E[7–12]。通常情况下，这两个事件产生的一个新的→3‘端会立即被3’5‘外显子酶消化，从而导致靶mRNA的降解。
然而，如果Srna与多个顺反子mRNA的内顺反子区结合，则该SrNA可抑制下游基因翻译的启动，从而使Rho或RNase E的合成成为可能。在这些情况下，3‘→5’外显子酶的消化(从新生成的3‘端开始)很可能在SrNA-mRNA杂交时停止，不可能到达目标mRNA的5’端，并将信息降解至完成。因此，多顺反子mRNA中的SrNA结合在细胞间质区，可以保护上游的顺反子，导致相对稳定的新的mRNA种的积累。我们在我们的研究中观察到了这样的一个例子：点42结合在高尔导致了一种新的mRNA物种的产生，加莱。考虑到潜在Srna靶点在cistron连接处的普遍性[55]，通过上述机制产生新的mRNA可能是SrNA在多顺反子基因调控中的一种普遍功能。-医学论文发表
大气中cAMP、SPOT 42与极性的关系高尔操纵子
极性高尔在Wt细胞(cAMP水平较低)或cAMP突变细胞的葡萄糖培养基中，操纵子明显[2,56–58]。这两个观察表明cAMP是极性的抑制剂。SPOT 42的合成受到cAMP的抑制，并在葡萄糖培养基或cAMP突变细胞中诱导。换句话说，极性在高尔在没有夏令营的情况下所见的操纵子可归因于42点的诱导。
材料和方法
细菌菌株和引物
E. 大肠杆菌使用的火车是GW 10(RNG+, 雷恩+；WT表示RNase G和RNase E)，GW 11(RNG::猫RNase G down突变体)，GW 20(AMS 1特氏；RNase E温度敏感突变体)，NHY 312(RnpA+RNase P)和NHY 322(RnpA 49RNase P温度敏感突变体)。染色体缺失株E. 大肠杆菌MG 1655是利用噬菌体Lambda Red介导的重组[59]。Biccyclomycin(BCM)是美国哥伦比亚大学M.Gottesman的慷慨礼物。本研究中使用的引物列于S1表。本研究所用菌株列于S2表.
细菌生长条件
所有细胞在37°C条件下培养，分别加入0.5%(w/v)半乳糖和氯霉素(15μ/ml)或氨苄青霉素(100μg/ml)，在溶原肉汤(10克胰蛋白胨、5克酵母膏和10克氯化钠每升水)中培养。600RNA提取前的0.6。为了确定指数生长过程中的世代时间，在m9-半乳糖培养基上培养至OD。6001.0稀释至新鲜培养基至OD6000.0 1，用OD监测生长600周期性地达到0.4。
RNA制备
用直接唑RNA迷你准备试剂盒(Zymo Research，USA)从澄清的细胞裂解物中纯化总RNA.产生细胞裂解物，2×108细胞悬液50μl(15 mm Tris-HCl[pH8.0]、0.45M蔗糖和8mMEDTA)。加入5μ1的溶菌酶(50 mg/ml)，在25℃下孵育5 min，加入含酚洗涤剂(1 ml三种试剂；美国分子研究中心)10秒钟，在25°C下孵育5 min。用纳米荧光分光光度计测量260 nm处的吸光度，测定RNA浓度(美国费舍尔科学公司，ThermoFisher)。
Northern杂交分析
用1 2%(w/v)甲醛琼脂糖凝胶电泳(8V/cm，2 h)分离总RNA(10μg/ml溴化乙锭)，在紫外光下检测μ的完整性，用下传系统(美国惠特曼Turboblotter)将其转至带正电荷的尼龙膜(美国热费舍尔科学)。用80℃焙烧1h将RNA固定在尼龙膜上，制备了Northern印迹探针。首先，一个500 bp的dna片段盖尔用PCR方法制备区域(从+27到+527)，然后用32将模板DNA(0.15pmol)与随机(4μl，1mm)(TAKARA，日本)混合，总体积为28μ1，然后在95°C下加热3 min。反应在冰上快速冷却5 min，加入5μl 10×Klenow缓冲液，5μl脱氧核苷三磷酸(DNTP)混合液(0.2mm dATP，dgtp，dttp)，10μlα。32加入P-dCTP和2个μl Klenow片段(2U/μl)(日本Takara)。反应在37℃下孵育1h，然后在65℃下灭活Klenow片段5 min。产品经G-50柱通过传送带纯化。在65°C下，在7ml超敏杂交缓冲液(Invitrogen，USA)中预杂交30 min。DNA探针在95℃下变性5 min，在杂交缓冲液中加入5μ1。在42°C下进行杂交，然后在低浓度洗涤缓冲液(2×SSC，0.1%SDS)中，室温下各清洗5 min，然后在42°C的高浓度洗涤缓冲液(0.2×SSC，0.1%SDS)中各2次清洗15 min，最后观察X射线胶片照射后的放射性带。用ImageJ软件(美国NIH)对薄膜进行扫描，并对RNA谱带进行定量分析。
CDNA末端的快速扩增(RACE)
用TurboDNase I(ThermoFisher Science，USA)去除RNA制备过程中的DNA污染。为了扩增3‘RNA端(3’RACE)或5‘RNA端(5’RACE)，我们在25μ1反应体积中进行了一次RNA连接反应，反应体积为10 0nm合成RNA寡糖的1μ1(3‘RACE为27μ)。S1表)和E. 大肠杆菌5S rRNA分别用于5‘RACE，2.5μg或5μg总RNA分别用于3’种族或5‘RACE，2.5μl 10 x反应缓冲液(Thermo Fisher Science-USA)，10 U T4核酸连接酶(Thermo Fisher Science-USA)和10 U rRNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega，美国)。结扎反应在37℃下孵育3h，用G-50柱(美国GE Healthcare)纯化RNA。4微克的连接RNA在37°C下反向转录2h，在20μ1反应混合物中加入4U的Omniscript逆转录酶(齐根，德国)，0.5mm的dNTP，10μM随机检测者和10U的rRNasin。对于3‘种族，具体的3RP引物(S1表)，与已连接的RNA杂交。分别以2.5或10μ1为模板，用靶RNA特异性引物集和HotStarTaqDNA聚合酶(齐根，德国)，在50μ1反应量内，分别对3‘种族和5’RACE进行了目标RNA的PCR扩增。扩增的cdna被纯化并用作引物延伸反应的模板，该反应以20μ1的体积进行。32P标记特异性引物和Taq聚合酶的一个单位(齐根，德国)2]。反应产物在8%(w/v)聚丙烯酰胺-尿素测序凝胶上分解，用X射线胶片观察放射性带。
逆转录定量PCR
根据制造商的推荐，使用TurboDNase I从反应混合物中去除基因组或质粒DNA后进行逆转录(Thermo Fisher Science，USA)。1微克总RNA在37℃下孵育2h，反应体积为20μ1，包括4U的Omniscript逆转录酶、0.5mm的dNTP、8个μM随机引物和10U的rRNasin。用CFX 96型聚合酶链反应仪(美国Bio-Rad)，在10μ1反应体积中进行RT-qPCR，反应体积为5μl的IQ SYBR绿混和剂(Bio-RAD，美国)，3μ1的RNase无酶水，0.5μl的10μ正向引物和反向引物，1μ1。采用95°C初始变性3 min，95℃变性10 s，60°C杂交20s，72°C延伸10s，共40次，每个样品的结果用rrsB进行归一化，rrsB编码16S rRNA。
SPOT 42的诱变和定量
在pSpot42质粒中产生了42个突变点[23]使用超级引物法[60]。所有突变均经DNA测序证实。用5‘RACE法对42个点的产量进行了量化。
离体Spot42RNA的合成与纯化
离体用T7 RNA聚合酶(美国新英格兰生物实验室)按照制造商的指示进行了Spot42RNA的合成。利用pSpot42质粒，利用T7-SPOT 42-for和T7-SPOT 42-rev引物，通过PCR方法构建了含T7启动子的DNA模板。20]作为模板。在反应缓冲液(40 mm Tris-HCl，pH 7.9；6mm MgCl 2；2mm亚精胺；1mm二硫苏糖醇(DTT))中，将DNA模板(1μg)在反应缓冲液(40 mm Tris-HCl，pH 7.9；6mm MgCl 2；2mm亚精胺；1 mm二硫苏糖醇(DTT))中孵育1h。37°C孵育1h后，加入TurboDNaseⅠ，37°C孵育15 min，去除DNA污染。加入5μ1的DNase I灭活剂(美国费舍尔科学公司)，可使反应停止。在2,650 g离心5 min后，水相(30μl)通过G-50柱。纯化后的RNA在-70℃下定量保存。
用无细胞表达系统检测Rho依赖的转录终止离体转录翻译反应
我们用pgal质粒作为dna模板离体转录-翻译反应。反应用E. 大肠杆菌萃取物(S30)E. 大肠杆菌RNA聚合酶全酶/T7 RNA聚合酶(韩国Bioneer)用于转录和翻译的所有必需成分[28按照制造商的指示。总之，DNA模板(10 NM)和pRho质粒(其中Rho处于T7启动子/终止子和rbs[核糖体结合位点]控制下)在30℃下孵育30分钟，其中E. 大肠杆菌反应缓冲液(韩国Bioneer)(包括氨基酸、rNTPs、tRNAs、ATP生成系统、IPTG和适当的盐)中含有0.5%(w/v)的半乳糖在60μl反应中的萃取物。在30°C保温30 min后，加入等量苯酚：氯仿：异戊醇25：24：1(美国默克)。在2,650 g离心10 min后，水相(30μl)通过G-50柱。用纯化的核酸进行3‘RACE反应。
Westernblot分析。
为了进行gal蛋白的westernblot分析，我们在框架中插入了一组氨酸残基(一串组氨酸残基)。高尔基因高尔质粒pGal中的操纵子DNA，产生质粒；pGalE-组蛋白，pGalT-组分，pGalK-组分，和pGalM-组分。MG 1655或MG 1655Δ防晒系数每种质粒在M9-半乳糖中生长至0.6的OD 600。用SDS-丙烯酰胺平板凝胶电泳分离各培养物(5μg)的粗细胞裂解液中的蛋白质，并用蛋白质印迹仪在硝化棉膜上进行印迹(Bio-Rad，美国)。根据制造商的指示，用德国默克公司(Merck)的His标记抗体对这些印迹进行了检测.
辅助信息
强度对应加莱北方杂交和3‘种族分析结果之间的条带。-医学论文发表
显影1/6: Pgen.1009878.s001.TIF
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图S1.强度对应加莱北方杂交和3‘种族分析结果之间的条带。
在没有42号点的情况下，特别是加莱乐队(A)从北方污迹中消失(标记为Δ的车道)防晒系数)，就像在图1B。类似地，在Δ中防晒系数细胞，产生的3‘端加雷特-肖特还有-长明显抑制(~95%)。当SPOT 42过量生产时(防晒系数*)，加莱产量增加150%吨(A)，以及3‘端的生产。加雷特-肖特还有-长也相应增加(B).
Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009878.s001
(TIF)
图S2.Rho依赖性转录终止离体在无细胞系统中检测。
3‘种族分析加莱3‘端由pGal、pRho和0.5%半乳糖组成，不含BCM(RACE 1)或增加浓度(0.1、0.5、1、5和10μg/ml)(第2-6条)。
Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009878.s002
(TIF)
图S3.不同细胞在M9-半乳糖培养基中的指数期生长速率。
(A)MG 1655(蓝色)和MG 1655Δspf(红色)。(B)MG 1655ΔGAL/pGal(蓝色)，MG 1655ΔGAL/pGalMMI-1(绿色)及MG 1655ΔGAL/p半MMII-1(红色)。(C)MG 1655Δ高尔Δ防晒系数/pGal/pSpot42(蓝色)，MG 1655Δ高尔 Δ防晒系数/pGalMMI-1/PSpot42(棕色)，MG 1655Δ高尔Δ防晒系数/pGalMMI-1/PSpot42MMI-1(灰色)，MG 1655Δ高尔Δ防晒系数/pGalMMII-1/PSpot42(绿色)和MG 1655Δ高尔Δ防晒系数/pGalMMII-1/PSpot42MMII-1(红色)
Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009878.s003
(TIF)
图4。3‘种族分析加莱MG 1655Δ中的3‘端RppH，一种缺乏RNA焦磷酸水解酶的菌株。
RNase E与Srna的单磷酸化5‘端结合.这种能力使RNase E能够被招募到靶mRNA(1)上的切割位点。看看RNase E的切割是否会产生加列特根据点42的单磷酸化5‘端，我们测定了加莱在MG 1655Δ中RppH从染色体上删除RNA焦磷酸水解酶基因的菌株。没有RNA焦磷酸水解酶，大部分5‘端RNA仍处于二磷酸化状态。33]。结果表明：3‘端世代无明显差异。加列特还有-短的在WT(Lay 1)和MG 1655Δ之间RppH(2)菌株。这些结果表明，SPOT 42的单磷酸化5‘端并不是产生加列特.
Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009878.s004
(TIF)
S1表本研究使用的引物。
Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009878.s005
(Docx)
S2表用于本研究的细菌菌株。
Https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009878.s006
(Docx)
致谢
作者感谢Gerhart Wagner教授(瑞典Uppsala U.)和Nadim Majdalani博士(美国NIH)的周到评论。作者感谢Jeongok Park的细胞生长测量。
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