《层状肌动蛋白网络的离散力学模型实现了分子离合器机制，并产生弧和微钉。--医学论文发表投稿》期刊简介
层状肌动蛋白网络的离散力学模型实现了分子离合器机制，并产生弧和微钉。--医学论文发表投稿
· David M.Rutkowski，
· 瓦维隆尼(Dimitrios Vavylonis发表日期：2021年10月18日
摘要
机械力，肌动蛋白丝的周转，和与细胞外环境的粘附，调节层脂肪突出。在连续介质水平上的计算和数学模型被用来研究分子离合器的机制，通过薄片和周围的焦点粘着物计算应力剖面。然而，肌动蛋白网和肌动蛋白束之间的相互作用不容易用这种方法来考虑。我们利用三维布朗动力学建立了一个在逆行过程中的层状脂化肌动蛋白网络的长丝级模型。在模拟中，通过从前缘推力(由于肌动蛋白聚合)、拉力(由于分子马达)以及在细胞质和焦点粘连中的粘性阻力，来促进逆行流动。模拟网络的密度与先前电子显微图中的测量值相似。单个肌动蛋白片段之间的连接是由永久的和动态的交联剂维持的。网络的重构是通过在前缘附近添加单丝肌动蛋白丝和切断丝键来实现的。研究了几个参数对应力分布、网络变形和逆流速度的影响。该模型捕捉到了随着粘着强度的增加，逆行流的减少。应力分布变化从压缩到延伸的前缘，与区域的灯丝弯曲周围的焦点粘连。该模型复制细胞松弛素D暴露后所观察到的逆行血流速度下降，从而阻止肌动蛋白聚合。交联剂浓度和动力学的变化，以及新添加的丝的取向模式的变化表明，该模型能够产生垂直的(肌动蛋白弧)或平行的(微刺)突起方向的纤维束。
作者摘要
附着在扁平表面上的细胞可以通过将肌动蛋白细丝聚合的片状网络延伸到细胞的前部，进行定向运动。片状物质通过称为焦点粘连的区域连接到细胞外的环境，这有助于将聚合力转化为推动细胞膜向前推进的突出力。虽然肌动蛋白纤维上的作用力促进了纤维的断裂，可能会影响层合物的结构，但在细丝水平上，板层内的力平衡仍有很大的探索余地。在三维布朗动力学模拟的焦粘着作用下，我们确定了层状肌动蛋白网络稳态模型中的作用力。我们重述了离合器模型的主要思想，该模型指出，由于局部粘连而增加的阻力会减少逆行流，增强突起力。我们的仿真结果表明，靠近前缘的层板网络受到压缩，而在更远的地方，网络处于扩展状态，这可能反映了网络拓扑结构的变化。最后，我们发现，通过改变前缘纤维束附近的纤维导入角，可以形成与实验相似的纤维束。
引用：Rutkowski DM，Vavylonis D(2021)层状肌动蛋白网络的离散力学模型实现了分子离合器机制，产生弧和微尖。PLOS Comput Biol 17(10)：e1009506。Https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009506
编者：美国加州大学欧文分校
收到：2021年5月5日；接受：2021年9月30日；出版：2021年10月18日
版权：2021年，Rutkowski，Vavylonis。这是一篇以CreativeCommonsAttribution许可证，允许在任何介质中不受限制地使用、分发和复制，只要原始作者和源被记入帐户。
数据可得性：所有相关资料都在手稿中辅助信息档案。模拟的C++代码可在Https://github.com/davidmrutkowski/LamellipodiumBrownian.
供资：这项工作得到了美国国立卫生研究院R01GM114201和R35GM136372对DV的资助。使用极限科学和工程发现环境(XSEDE)的高性能计算能力，这是由国家科学基金会，项目编号。TG-MCB 180021也表示感谢。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
相互竞争的利益：提交人宣布，不存在任何相互竞争的利益。
导言
附着在2D表面上的细胞可以经历爬行运动，方法是在细胞的前缘(称为板层)附近延伸一个薄片状的聚合肌动蛋白网络[1–4]。板层内的肌动蛋白网络是一种高度分枝的细丝网络，当每一丝聚合时，它会在前缘推动质膜，以促进细胞的生长。由于Arp 2/3复合物在网络中形成分支，该复合物在靠近前缘活化后，结合到一个现有的肌动蛋白丝的一侧，并在～70°的角度上，使一个新的肌动蛋白丝的生长与尖对刺的末端轴成核。在片状脂肪层的背面，肌动蛋白网络会转化为单聚肌动蛋白，这是由于辅酶蛋白介导的细丝断裂和解聚的结合。因此，片状体以恒定的翻转状态存在，其驱动因素是ATP水解能与肌动蛋白(Actin)亚基结合，而肌动蛋白亚基则随着ATP与ADP+P的结合而老化。i和释放Pi [2–5].
爬行细胞通过调节肌动蛋白聚合的比例来控制运动，而肌动蛋白聚合在前缘转化为膜突起，而肌动蛋白网络向细胞内部收缩(称为逆行流)。前突和逆行流之间的平衡被一种离合器机制所控制：逆行流被局灶性粘连的存在所阻碍，它通过整合素和粘着蛋白等粘着蛋白(如距骨素和文脉蛋白等整合素和粘着蛋白等整合素和粘着蛋白，将层脂肪层和板层(层后的肌动蛋白细胞骨架区域)与细胞内部的肌动蛋白(肌动蛋白)连接在一起。6–8]。当离合器“接合”时(即当板盘网络强烈附着在焦斑粘着上时)，肌动蛋白网络上的摩擦力增加，导致逆行流速度降低，板盘网络在前缘的力增加，有助于提高细胞推进速度。
除了前缘的肌动蛋白聚合力和焦点粘附力外，分子马达的作用力也有助于逆行流动。在神经元生长锥的片状体中，肌球蛋白II型马达在生长锥的中央区域产生收缩力[9]。然而，在许多其他细胞类型中，力是由不同于肌球蛋白II的逆流马达产生的，尽管这些马达的确切特性尚不清楚。10].
板层内的肌动蛋白网络不均匀，但在形态上存在时空变化，其调控作用与多个肌动蛋白结合蛋白一起发生在丝的水平。靠近前缘时，Arp 2/3复合纤维的密度很高，从而产生能够支撑力的短枝，这一过程很可能是通过分支偏置在弯曲的细丝上发生的[。11]。在离片层中间较远的地方，角化细胞的电镜观察显示，细胞的网状结构向较长的细丝转变，分支密度较低。12]。这种形态上的变化可能部分是由于纤维的去分支所致，这些纤维可因水解而发生，并通过在树枝上施加力而增强。13]。交联剂，包括α-放线菌素和丝素[14]，存在于整个层脂肪层，并与肌动蛋白纤维结合和连接。α14–17]。另一种交联剂，Fascin，可以将平行的肌动蛋白紧密地捆绑在板层内的高密度微钉/丝状足上。这些捆绑的结构可以推到前缘，形成手指状突起。18, 19]。纤维在板层中的弯曲可能发生在阻碍逆行流动的附近，例如靠近粘着区[10]。切断这些弯曲的长丝，可增强板层网络的破坏。这些弯曲的长丝以较高的频率发生在部分由肌动蛋白结合蛋白辅料修饰的长丝上。20].
上面描述的长丝级过程需要定量模型来解释生物化学和长丝力学之间的反馈。这样的模型也可以用来解释机械实验的结果，如牵引力显微镜和细胞骨架流的测量，这些实验到目前为止都是基于连续体近似来分析的。21–26]。虽然先前的模型已经研究了薄片内部的结构和力，但许多模型都简化了假设，不包括整个层板网络上的离散细丝力分析。一些模型和模拟研究了分支、捆绑和交联网络的力学[27–30]然而，这些模型没有应用于动态板层，主要考虑静态网络而不添加长丝。一些具有网络增长的动态层压板模型对丝状网络采用连续近似[9, 31–35，或视为连在连续凝胶上的细丝[36, 37]。有个别细丝的模型提供了最详细的细节，但其中一些先前的研究并不构成完整的板层模型，因为没有逆行流与粘连的相互作用，也没有马达引起的拉力。38–40]。Schreiber等人[41]用既包括前缘又包括焦点粘附区的模型在灯丝一级模拟片状金属基；然而，该模型中的片状金属基网络缺乏交联剂，由短的单个分支组成，没有形成连续的网络，因此不研究力在网络中的传播。聚焦于局灶性粘连的模型在几项研究中也得到了考虑，这些研究侧重于了解粘连与板脂肌动蛋白网络之间的相互作用，但这些模型中的丝状网络没有得到明确的处理。25, 42–44].
在这里，我们模拟了一个2μm在细丝水平的板层肌动蛋白网络的宽条，结合了来自前缘的推动力和由于运动蛋白而产生的拉力，在粘着斑的情况下。我们没有像以前的一些工作中所研究的那样，专注于长丝加成/交联/破坏和与单个粘附分子结合的具体子过程的细节，而是在长丝水平上创造了整个片状物质的稳定状态，以后可以通过改进局部机制加以改进。作为参考实验系统，我们采用Yamashiro等人研究的XTC细胞。[10]世卫组织测量了静止板的肌动蛋白血流模式，无论是成熟的还是新生的局灶性粘连。我们使用这个细胞系统是因为它们的板层比较宽(扩展了～5)。μm(进入细胞)并且有一个几乎恒定的逆流速度值，约为50。NM/s这是准确的单分子成像，没有复杂的褶皱或收缩不稳定经常观察到在其他细胞类型或不同的条件。(XTC细胞也能在恒定的逆行时表现出前缘的突起和收缩周期[45]，但是，这里我们考虑了前沿处于平稳状态的条件。)在此模型中，我们研究了焦点粘附强度对逆流速度和内力的影响，通过调整推拉力的平衡，使之与XTC细胞的逆行流速近似匹配。我们发现，在焦粘着区附近存在一个高于平均弯曲的区域。由于我们将交联剂加入到我们的模拟中，我们能够探索层状细胞束形成的机制，包括微刺/丝状足和应力纤维弧。
结果
我们模拟了一个肌动蛋白(Actin)丝网络，它代表了一个静止的细胞的板层，细胞的宽片状细胞正在经历稳定的逆行流。我们使用来自Yamashiro等人实验的XTC细胞。[10]作为调整模型参数的参考案例。该模型采用三维布朗动力学模拟，在聚合力、马达拉力和与焦斑粘连的相互作用下进化肌动蛋白丝。图1A，和建模方法详细情况)。我们假设前缘固定在y=0，层合物高度为0.2μm，并每2次沿板层应用周期边界条件。μm。细丝表示为由弹簧和弯曲力连接的珠子(图1B)并通过排除的卷间交互(图1d).
· 下
图1.逆流层脂肌动蛋白网络长丝级模型的布朗动力学模拟。
(A)通过添加1生成层脂肌动蛋白网络μm长的肌动蛋白细丝(模拟为一条线性链的离散珠通过弹簧连接)接近前缘。聚合对前缘的影响被模拟为向下推到靠近前缘的细丝上的力。分子马达的作用被模拟为一种将肌动蛋白珠向下拉的力。分子的作用力要么作用于所有的肌动蛋白珠(均匀拉力)，要么只作用于带有肌动蛋白珠。y大于3.25的位置μm(后拉)红色区域表示新生粘着斑的位置，其中灯丝珠的粘度较高。随着年龄的增长，细丝段会被网络底部附近的键切断而去除。放大图像显示更详细的肌动蛋白网络，永久交联剂(代表Arp 2/3复合物)用蓝色和动态交联剂(代表α另一个放大的图像显示肌动蛋白片段的颜色，根据他们的瞬时键张力。(B)弹簧力作用于每个肌动蛋白丝中相邻的一对珠子之间，使肌动蛋白片段长度保持在0.1。μm。一个弯曲力作用于相邻珠子的三重奏，对应的持久力长度为17。μm。(C)动态和永久性交联表示为丝珠之间的弹簧连接。(D)每个肌动蛋白丝段都排除了每年春天周围虚线所指示的与邻近片段的体积相互作用。根据两个相邻纤维段之间的最小距离，计算出肌动蛋白丝段之间的排除体积相互作用，dαβ，在一个截止距离以下，d排除在外。将被排除的体积力分布到长丝段末端的两个珠子上。(E)焦斑粘着区内的珠子通过离散时间Gillespy算法与焦斑粘着结合和解除束缚，并定义了开和关率。当与粘着灶区结合时，微球比周围流体的粘度更高。(F)模型层压板网络的侧视图，显示前缘附近的三维方向。
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我们的目标是生成一个粗的长丝级表示法，其中包括对板层的大小的主力贡献，而不是在模拟中按最小元素的顺序来描述尺度(～100)。NM)，今后的工作还需要进一步改进。特别是，我们并没有考虑到薄片的结构变化，从靠近前缘的短丝树枝状笔迹，到后部较长的细丝。2, 12]而不考虑单分子显微镜所揭示的肌动蛋白单体在整个层合物中的分布周转[10, 46]。最近的研究表明，短的肌动蛋白寿命可能与肌动蛋白的网络结构变化有关，通过切断和退火在有刺的末端[47]。这样的过程发生在丝端附近，如这里所假设的那样，可以维持板层中肌动蛋白网络的主要弹性反应。因此，我们的模型不同于[25].
我们在前缘进行聚合，将单独的长丝添加为1。μm-长段(典型的片状花丝长度[12, 15, 48)，它们的尖头在.y = 0.5 μm以及沿XY在-70°至70°之间的平面，这一分布大致相当于成纤维细胞中的实验分布，但在-35°和35°时没有峰值[15, 49]。这样，我们就省去了靠近前沿聚合所产生的大部分力的复杂性：质膜对网络的影响只是作为一种推动力而包括在内，而不考虑将肌动蛋白或Prolin-actin传递到纤维带刺末端的膜复合物的力-伸长特性，而这取决于纤维的长度和取向。36, 50–52]。聚合所产生的力是用1.5的恒推力来解释的。PN每条长丝适用于接近前缘的所有长丝。由于与此力相关的简化假设，在y=0，边界效应最大可达0.5μm进入牢房(图1A).
永久的交联，如arp 2/3复合物产生的交联，被添加到新插入的长丝中，而短寿命的动态交联被添加到相邻的丝珠之间，这意味着代表肌动蛋白交联剂的效果。α-放线菌素、丝素或纤溶蛋白(图1A)。由此形成的网络具有接近实验测得的树枝状肌动蛋白网络的有效弹性性质。建模方法和图S1)。肌动蛋白丝段的拆卸被模拟为老化长丝的丝键断裂(寿命大于125)。s).
分子马达对产生逆行流的作用也包括在内。而在有神经元生长锥的细胞中，流动很大程度上是由于肌球蛋白Ⅱ在生长锥的中央区域积聚。9]，用肌球蛋白II抑制剂博比司他汀治疗XTC细胞，并不改变逆行血流的速度，表明有其他流动马达的存在。10]。由于这些分子马达在许多细胞类型(包括我们的参考的XTC细胞)中的确切身份和位置是未知的，我们认为这种运动力作用于两种模式之一：均匀的或向后的，这意味着代表逆行电机的不同的空间分布。在均匀的情况下，拉力作用于每个肌动蛋白珠，而对于后拉，力只作用于3.25以上的珠子上。μm从最前沿。拉力是在模拟的外部产生的，并假定产生于片状区域(后拉)或马达(如肌球蛋白I)附着在膜上(均匀拉力)。53, 54]。对这些力的大小进行了调整，以提供与实验测量一致的逆行流速[10]。我们的目标是，前缘力对逆行流的贡献略高于马达拉力，正如细胞松弛素D阻止肌动蛋白聚合的实验所表明的那样。55, 56]并在下文“对抑制聚合的反应”一节中加以讨论。
在连续介质水平上，新生的粘着斑被模拟为一个高有效粘度的囊状区域，位于z=模拟箱的0面(图1E)。我们假设肌动蛋白网络和焦斑粘连之间有一个简单的摩擦相互作用，类似于25]。粘附分子与肌动蛋白的结合和不结合可导致双相和粘滑力-速度关系，这在以前的一些建模工作中得到了考虑，如42, 57]。我们离开了，然而，这种现象的调查在离散的长丝水平，供今后的工作。在我们的0.2中有一个焦点粘连μm宽周期模拟盒与新生灶粘连的典型密度相匹配，如[图7A]中的图7A所示。10]。在这里，我们主要考虑由新生粘连所主导的细胞区域，如图7A所示。10]，不要试图在成熟的焦斑粘连周围模拟应力纤维。位于粘着灶区域内的肌动蛋白珠以速率常数结合和解除与它的结合。kFA,绑定和kFA,解束缚，而那些被束缚的人则经历了更高的粘性阻力。为了提供焦斑粘着强度的标度，我们定义了κFA焦斑粘着粘度与周围流体粘度的无量纲比。我们各不相同κFA并观察其对椎板内逆行血流速度和力产生的影响。
粘着斑的存在对肌动蛋白结构和动力学的影响
为了研究新生粘着力对肌动蛋白网络结构和动力学的影响，我们进化成稳定的网络(由平板长度、力和浓度剖面中的平台决定)，调节拉力，使逆行流量达到几十nm/s的数量级，这是XTC/成纤维细胞的典型特征。10, 15] (S1电影)。在此范围内，我们改变了粘着力与细胞质粘稠度的比值，从而改变了焦斑粘着强度。κFA=1?500(图2)。最低值，κFA=1，等于没有焦粘着区。
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图2.新生粘着区的强度影响流动和浓度分布。
(A)逆流速度与前缘距离的关系(y-位置)显示，逆行流速在前缘附近最高(灰色阴影区，增加的细丝致密)，该区域与红色阴影区之间平坦，这表明新生的焦点粘着区。褪色(实心)线表示拉回(拉均匀)模拟。(B)时间平均逆行流速分布基本上是均匀的，无论是拉模式(均匀的还是向后的)，在前面和向后的逆行速度略高。(C)肌动蛋白网络密度与前缘距离的函数(y-位置)褪色(实心)线表示拉回(拉均匀)模式。肌动蛋白网络在长丝加成区(灰色区域)外稳定，而焦斑粘附强度决定平台值的高度。虚线水平线表示密度为800。μM，这是层合物的典型值[3]。(D)无论拉模如何，肌动蛋白网络的密度图在空间上是一致的。与逆行速度相对应，网络边缘的肌动蛋白密度较低。在B和D中，沿垂直方向的尺度(y)和水平(x)轴在μm。所有从模拟中计算出来的数据至少平衡了300 s，平均超过了30秒。
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逆流速度的函数y-位置显示在图2A灰色阴影框表示添加了细丝的区域，粉红色框表示新生粘着斑的位置。全彩色线图2A指示模拟运行在拉均匀模式(对应于均匀电机分布)，而褪色线表示模拟运行在拉回模式(反向偏置电机分布)。有趣的是，逆行流速度与κFA不管是什么拉力模式。
在大多数模拟平板上，平均逆行流廓线几乎是恒定的(忽略前0.5)。μm，这是一个受我们实施新的长丝加成影响的地区)。作为.的功能κFA，全球逆行流速度从50下降。NM/s至15NM/s，类似于XTC细胞新生灶粘连附近的逆行血流速度[10]。因此，我们可以再现FA作为离合器的作用，同时保持稳定的网络和近似均匀的逆行速度，这是通过单分子成像观察到的。10]。在0.5至1之间μm纤维致密导致逆行速度的相对较小的下降，这可能是很难检测到的。这种逆行流的减少甚至发生在κFA=1(无附着力)，表明在不受新生焦粘着区影响的情况下，仅靠推力就能发生压实。逆流速度的急剧增加，层板网络最末端的幅度和波动，是由于其分裂成不同的阻力和扩散系数的分离碎片所致。在细胞中，板层后面的区域被板层或肌动蛋白皮质所占据，这种逆行血流速度的增加是不存在的。
确定在焦斑粘着周围的区域是否存在任何局部2D空间变化(按焦斑粘附区宽度的顺序，0.25)。μm)，在图2B我们给出了逆流速度的剖面图，其中逆流速度在时间和时间上都是平均的。z-轴心。在这些血流剖面中，在粘着灶区域内或周围的逆行血流在任何值下都没有明显的变化。κFA，与实验结果一致[10]。流型表明，我们模拟的肌动蛋白网络有足够的交联度，可以近似地表现为一种均匀的弹性凝胶。58]，见建模方法和图S1.
为了在模拟中进一步探讨肌动蛋白网络的结构，我们绘制了肌动蛋白网络密度与前缘距离的函数。图2C。全彩色线图2C指示模拟运行在拉均匀模式，而褪色线表示模拟运行在拉回模式。灯丝浓度在800左右。μm(虚线)，这是光表盘肌动蛋白网络密度的典型值[3]。在长丝加成区的后面，肌动蛋白网络的密度几乎是稳定的，这是从几乎空间上均匀的逆行流(图2A)。如κFA增加，平台值增加(因为纤维总是以相同的速度和逆行速度减少)，导致整个网络长度的减少(因为肌动蛋白段的寿命保持固定)。为了确定在焦斑粘连区域前面是否存在局部密度增加，我们绘制了时间平均F-actin密度。x和y在……里面图2D。在粘着灶附近几乎没有任何密度的增加，这与我们测量的速度一致。图2B。在最高处κFA值为500时，焦点粘附边界处的密度略有增加，但这是由于我们实现了对肌动蛋白珠子产生轻微吸引力的粘着斑区域。
粘着力对力分布的影响
虽然局部网络的速度和密度对新生的粘着斑的存在并没有明显的影响(图2B和图2D)，肌动蛋白网络中的局部力平衡受到新生的粘着斑的影响，如图3A。在这里，我们计算了肌动蛋白丝段内的平均张力，并将其归类为如果键合力为正(用红色表示)，则为压缩力。图3A(如果键的力为负值(用蓝色表示)，则为拉伸。图3A)。张力开关在板层中的标志，在那里，网络中最靠近前缘的区域正在受到压缩，而超过了焦斑粘着区(足够大)。κFA网络正在扩展。有趣的是，这种张力信号发生在两种拉力模式下，甚至在反向拉力不起作用时也会发生，因为网络处于高位。κFA不伸入后拉区(见拉回箱，κFA=500)。网络中的力量随着κFA增加，进一步表明焦粘着有助于从压缩到延伸(κFA=1网络几乎完全处于压缩应力之下；未显示)。
图3.模拟的肌动蛋白网络在焦斑粘附区前面受到压缩，在焦斑粘附区后面受到延伸。
(A)长丝张力(在时间和时间上的平均值)z稳态方向表示在粘着区的前部和内部发生压缩(用红色表示)，而在该区域下面(用蓝色表示)有较小的伸长率。压缩量随粘着强度的增加而增大，在粘着区内最大。两种牵引方式之间没有显着性差异。沿垂直方向的尺度(y)和水平(x)轴在μm。(B)长度为0.5的长丝段之间的弯曲角μm(在时间和x, z在稳定状态下方向)显示在焦点粘附区域内的增加依赖于较高的粘着强度。在所研究的最高粘着强度处，弯曲角在粘着区中部处达到峰值。实心(褪色)线表示均匀(背向)拉力。连续(虚线)线显示平均值(上四分位数)。所有从模拟中计算出来的数据至少平衡了300 s，平均超过了30秒。
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由于大量的压缩应变可能导致长丝弯曲，这对切断长丝很重要。59]，测量了1端肌动蛋白丝段之间的平均弯曲角。μm长丝作为与前缘距离的函数，以确定是否存在长丝屈曲(图3B)。两种拉力方式都提供了相似的曲线。弯曲角在焦斑粘着处增大到最大。κFA=100，而弯曲较大，发生在焦斑粘着区中部最高。κFA价值调查。长丝在上四分位数处的弯曲角接近30度，预期在此时可加强切断[)[。59]。这些数据表明，强的焦粘连可能导致弯曲引起的切断和可能的肌动蛋白网络的重新配置(在这些模拟中没有包括在内)。
在我们的模拟中，稳态是通过力的平衡达到的。图4)。为了研究这种平衡，我们将网络中的粘性和推拉力量化为焦距粘着强度的函数。部队被标准化为μM的前缘或向每个肌动蛋白珠施加力的模拟。
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图4.肌动蛋白网络中的力平衡随粘着强度的增加而变化。
这些图中的力是肌动蛋白网络上的净力，除以前缘宽度2。μm(力)μm)或在模拟中的肌动蛋白珠数(每珠力)。(A)粘滞力与焦斑粘着强度之比。在拉伸均匀(实心线)和拉回(虚线)模式下，由于焦粘着区引起的阻力随附着力强度的增加而增大，而由于周围流体的作用而减小。(B)外力与焦斑粘着强度之比。随着附着力的增加，推力增大，对于拉力均匀的情况，拉力降低到零。根据定义，每个珠的拉力是固定在均匀的情况下，所以它保持不变。(C)逆流速度随外力的作用。较高的推力和较低的逆行速度对应着更高的粘着强度。图显示一条递减的凸曲线。在所有面板中，力按压片中的每一珠显示，或按每一次力表示。μm沿着前缘。若要检查可复制性，请运行κFA=100和500在拉力均匀的情况下，并在所有面板上显示单独的数据点；在力量或两轮之间的逆流速度方面没有什么差异。所有从模拟中计算出来的数据至少平衡了225秒，平均超过30秒。
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如κFA两种拉力模式下，由于粘着区而引起的阻力增大，而由流体胞质引起的阻力减小。图4A)。还测量了网络上的推(聚合)力和拉力(马达)的大小。图4B)。随着粘着强度的增大，推丝区有较多的细丝，并以固定的速率插入细丝，从而使推进力增大。对于均匀拉伸，每个珠的拉力定义为常数，而不考虑焦粘着强度。相反，在拉回的情况下，拉力随着焦点粘附强度的增加而减小，因为在拉回区有较少的肌动蛋白珠。
我们的模型还可以构造前缘推力与速度曲线。图4c)。我们注意到，这条曲线依赖于我们模型的简化假设，包括固定的聚合速率(即灯丝插入率)，而在实际情况下，我们预期聚合会减少力。50, 58]。对于肌动蛋白网络来说，前缘外力之间的关系，肌动蛋白网络的延伸速度应该是凹的还是凸的，一直是争论的焦点。40, 41, 49, 60]。我们的模拟结果是一个凸曲线的逆行流速作为一个函数的推动力上的肌动蛋白网络。
对聚合抑制的响应
一种常见的实验扰动对片状体动力学是药物的加入，以抑制聚合。实验上，细胞松弛素D的加入会导致肌动蛋白网络从膜上脱离，减少逆行流，最终导致网络解体[55, 56]。这些实验揭示了前缘推和电机牵引对逆行流的相对贡献。在达到稳态后，我们通过停止丝丝和膜推进力的添加来再现细胞松弛素D的作用。在模拟细胞松弛素D的影响时，逆行流速在背拉时约为初始值的55%，均匀拉下时为45%。κFA = 1 (图5A)。随着粘着强度的增加，在停止添加长丝后，逆流下降了50%以上，说明这些情况下的推力要比稳态时的拉力大(如图1所示)。图4B)。这种逆行流减少程度与粘附强度的关系可以解释为什么在先前的实验研究中细胞松弛素D治疗后逆行流减少到不同水平。55, 56]。层板网络的图像显示，随着时间的推移，网络从网络的前缘和后部撤退，这是由于消除了前面添加的细丝，以及由于老化而逐渐去除了后面的细丝。图5B和S2电影)。不像[61].
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图5.模拟细胞松弛素D对逆行血流速度的影响可获得实验结果。
(A)细胞松弛素D的添加效应被模拟为在达到稳态后停止细胞丝的添加。逆行流速v复古,细胞D在30-35之间s在停止添加长丝后，在稳态下与先前的逆流速度进行比较，v复古，作为焦斑粘着强度的函数。两种速度都是所有丝状珠的平均速度。(B)细胞松弛素D添加时模拟效果的典型快照(t=0)和att = 50 s从拉回模拟。微扰导致肌动蛋白网络在不加丝的情况下从前缘退却，而从背面则因丝的解体而退却。沿垂直方向的尺度(y)轴在μm。蓝色(绿色)线段代表永久(动态)交联剂。
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层状界面的弧形成
在生成了一个稳态灯丝级模拟之后，我们接下来检验了我们的模拟是否可以应用于其他与层压板相关的共同特征的建模，这些特征取决于灯丝分布的变化。这样的现象之一，就是在薄片区的边界处，将细丝束成弧形结构。56, 62–64]。在描述弧形几何形成的连续凝胶模型中，也可以看到这些近成熟的焦斑粘连的形成。32].
为了研究板层背面肌动蛋白网络的重组，我们将粘着斑进一步移回原点。y = 2.375 μm (图6)，并使用了κFA=250，提供相对较大的运动阻力。在这组模拟中，我们使用了均匀拉力机构。
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图6.肌动蛋白束在板层边界形成弧形。
纤维重排导致肌动蛋白纤维在局部粘附区的捆绑，但前提是永久交联剂的限制随着时间的推移而减轻。通过启动粘着区，模拟了一个成熟的粘着斑在片状脂肪层背面的粘着性。y= 2.375 μm使用焦距粘着强度κFA=250。对于这些模拟，我们使用了均匀拉力机构。(A)永久交联剂和动态交联剂相结合的快照(左)和浓度剖面(右)。动态交联剂数量的增加使纤维束更紧密，而丝丝的整体空间浓度相对不变，在粘着区附近没有丝束的捆绑。蓝色(绿色)线段代表永久(动态)交联剂。(B)与A小组相同，但以寿命有限为20的交联剂取代永久交联剂s。在中间动态交联剂浓度下，结合肌动蛋白浓度峰值出现在粘着区前的捆绑。在模拟快照中，沿垂直方向的比例尺(y)轴在μm。蓝色(绿色)线段代表长寿命(动态)交联剂。所有从模拟中计算出来的数据至少平衡了140 s，平均在至少35秒以上。
Https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009506.g006
我们发现，在这种情况下，肌动蛋白束弧可以通过动态交联剂和长寿命交联剂结合而形成，这意味着Arp 2/3复合物具有有限的去分支率。我们首先研究了动态交联剂的浓度C动态(1、10和30μm)影响网络，使长期使用的交联剂与无花果相比保持不变。2–5 (图6a和S3电影)。在稳态条件下，尽管瞬态密度在低密度下不均匀C动态，当地的捆绑在很高的时候C动态，该网络通过焦斑粘附区保持了大致均匀的浓度(图6a)。相反，如果我们允许永久交联剂以固定速率去除，平均寿命为20s，所述网络在中间靠近焦点粘附区重新排列。C动态 (图6B和S4电影)。在中间动态交联剂浓度情况下，纤维在粘着灶前有较强的聚集形成电弧，肌动蛋白密度有一个明显的峰值。长丝张力的轮廓也会根据以下情况而变化C动态 (图S2)：细丝从压缩向拉伸的转变C动态 = 1 μm虽然他们大多是压缩在10和30μm。电弧束本身内有少量的细丝拉伸或压缩。
我们还进行了同样的模拟图6在拉回模式下(S3图)。一个肌动蛋白束弧仍然形成在板的背面。C动态 = 10 μm长寿命的交联剂。但是，当比较时，包的定义就不那么明确了。图6B带着S3(B)图：拉回力更强地作用于板层的后半部，破坏了粘着区致密束的形成。这是一个例子，拉均匀和拉回模式导致不同的片状物质的形态。
的结果图6B展示肌动蛋白束是如何通过重组板层背面的分支网络而形成的[62, 64](例如通过去分支[13, 65分布营业额[66, 67]，以及动态交联)。实验观察到的电弧形成机制之一是，即使肌球蛋白Ⅱ受到白比司他汀的抑制，也会使微尖束在片状层-层膜界面处崩解成弧[68, 69]。然而，我们注意到，建议的纤维对齐和紧实机制可能与肌球蛋白-Ⅱ结合(或帮助触发)形成横向弧[12, 62, 63这两种机制不一定是相互排斥的。虽然我们不模拟离散肌球蛋白，动态交联剂在我们的模拟中可能发挥类似的捆绑作用。肌球蛋白Ⅱ收缩形成束以前是在离散丝水平[70，包括胞质分裂中actomyosin束形成的相关模型[71, 72]。我们的模型显示，捆绑也可以由逆行的力量，焦点粘附几何，和交联。
椎板内微穗形成
在层板内形成的其他常见束状结构有丝状束(突出于前缘的束)和微刺(嵌在片状层内的束)[19]。在我们目前模拟的固定前沿，我们探讨了产生微穗束的可能性。已证明微刺是通过Ena/Vasp-介导的在最前沿的聚合反应而形成的。19]。在高动态交联的情况下，已经可以看到令人联想起微钉的捆绑肌动蛋白(C动态 = 30 μm)图6。但是，图6是沿着多个方向定向，而不是主要沿逆行方向定向，这是典型的微尖。
我们进行了模拟，以确定在我们的模拟中是否能形成和保持稳定的微穗束，其取向类似于在实验中看到的方向。为了表示Ena/Vasp在前缘的作用，我们改变了在前缘添加细丝的方式(图7a)。一半的长丝是以与无花果相同的方式添加的。2–6，而另一半则以垂直方向添加，即其轴线沿y (图7a)。我们进一步研究了两种不同的垂直取向加成方式：在现有长丝附近添加垂直长丝(新添加的长丝的尖端置于35处)。NM远离现有的长丝)或随机添加垂直长丝x-坐标(图7B).
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图7.如果对细丝加成的方法进行改进，垂直纤维束会使人联想到微钉的形成。
逆行流模拟显示局灶性粘连时出现微钉样束。κFA=250，顶部边缘在y = 2.375 μm，并采用均匀拉法，如图6。动态交联剂浓度固定在10。μm。(A)纵向长丝加成模式示意图：如先前的图所示，添加的长丝中有一半最初具有垂直方向，而其余一半添加的初始取向在-70°至70°之间。(B)纵向加法时，长丝或加有尖头的长丝35NM远离现有的长丝x方向，或随机的x就位。(C)稳态模拟快照。纵向长丝的加入，无论是在现有的长丝附近，还是在随机的情况下，都会产生类似于微刺的垂直长丝束，而“近存在”的长丝添加方式则会导致细丝沿垂直方向的尺度(y)轴在μm。蓝色(绿色)线段代表永久(动态)交联剂。模拟快照在275秒的模拟时间后拍摄。
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生成的网络显示在图7c和S5电影在垂直长丝添加的两种模式中，都可以看到微穗状束，但当在现有长丝附近添加垂直丝时，可以更好地定义它们。类似于实验(见例如S3电影在[45))，这些束的寿命很长，因为它们贯穿于整个板层，延伸到网络解体的边界。类似于实验中的微电脑和丝状脚印[18, 45, 68, 69]，它们相互合并，形成倒Y结构，在随机加法情况下更常见。
模拟图7和S5电影指出在丝状丝交联剂存在的情况下，改变在前缘引入丝的角度对网络拓扑有持续的影响。因此，我们的模型表明，微刺(可能是丝状足)可能是由前缘丝方向的微小变化而形成的。事实上，两种拟议的角质层形成、收敛伸长和新形核的相互竞争模型，对这种取向变化是如何产生的，作出了不同的假设。18, 19, 73]。我们还没有在我们的模型中实现足够的分子分辨率来解决这两种机制之间的问题；但是，图7可以认为是这两种机制之间的中间部分：垂直长丝加成是一种全新的机制(虽然不一定是沿着x前缘方向)，而捆绑与预先存在的长丝有相似的特点，收敛伸长率.
在两个图中我们模拟的网络中的束的形成6和7令人联想到在紊乱的皮质肌动蛋白网络中，actomyosin束的形成[74, 75]。虽然我们没有明确地模拟肌球蛋白马达，但我们的模拟显示动态或永久的被动交联剂，再加上肌动蛋白的周转和流过的排列(图6)或聚合(图7)能够促进和维护无序网络中的捆绑结构。
模型对变化的鲁棒性
作为对模型鲁棒性的检验，以及对未来改进的初步研究，我们还进行了额外的仿真，我们改变了模型的一个方面，并研究了对网络内逆行流、网络密度和力传递的影响。
为了研究我们的参考模拟如何依赖于肌动蛋白珠之间距离的选择(l0 = 100 NM或者37个肌动蛋白亚单位)，我们把间隔缩小到l0 = 48.6 NM(18个肌动蛋白亚基)。这个值接近成纤维细胞板层中分支点之间的间距，主要发生间隔为36次。NM沿母丝(等于螺旋螺距)[15]，在1μm到最前沿。为了补偿模拟中较多的丝珠数，我们将每个珠体的阻力系数和拉力及推力降低了一半。为了与我们的模拟结果进行比较，我们测量了在均匀拉力的网络中，纤维键的逆行速度、密度和压缩/延伸。κFA=100。这两宗个案只有轻微的分别(图8)。逆流速度略低于参考模拟(图8a)，导致局灶粘连前的肌动蛋白密度稍高，但在焦斑粘连后的密度较低(图8B)。在l0 = 48.6 NM模拟纤维的张力比在焦斑粘着后要高。l0 = 100 NM模拟(图8d)。这种较高的延伸水平可能是由于在长丝插入过程中有更高的交联机会所致，这导致～的永久交联剂增加了20%。l0 = 100 NM模拟。
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图8.模拟研究模型修改。
模拟研究了将肌动蛋白珠间距减小约一半的效果，在模拟盒的下十分之一只施加马达力对肌动蛋白珠的作用，并采用分支代替永久交联剂来表示Arp 2/3复合物。模拟运行时κFA=100，从y = 1 μm，除膜拉力模拟外，还采用了拉力均匀模式。(A)三种改进模拟的逆流图作为距离前缘距离的函数，显示了与参考模拟在定性上的相似之处。l0 = 100 NM。灰色区域表示添加花丝的区域，而红色区域表示焦点粘附位置(B)、肌动蛋白密度作为距离前缘的函数，在四种模拟中再次显示出相似的行为。(C)网络快照，在达到稳定状态后，肌动蛋白在灰色，永久(动态)交联剂，蓝色(绿色)。分支模拟在母子丝上有两个肌动蛋白丝段，构成蓝色的分支。每次模拟至少运行190 s，平均超过20s。(D)四个模拟的长丝张力图，其中压缩为红色，扩展为蓝色。
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接下来，我们研究了我们的均匀拉力假设是如何影响我们的结果的。有助于逆行流动的马达可以与质膜相结合，例如某些肌球蛋白I马达。53, 54]。我们更详细地研究了这种可能性(“膜拉”)，方法是只在模拟盒底部的20 nm范围内(表示附着在外部基材上的膜)以外的焦点粘着区外拉动蛋白珠(见建模方法(第一节)。不管这些变化，这些模拟得到的逆行流量，网络密度和平均灯丝张力与拉力均匀模拟在相同的焦点粘着强度。图8a，8B和8D)。除了这三个数值参数外，拉力均匀和薄膜拉力情况下的片状层的结构也很相似。图8c).
最后，我们研究了加入永久交联剂的方法对我们的模拟结果的影响，与Arp 2/3复合物的分支相比，Arp 2/3复合物保持了～70°的分支角。有关分支实现的详细信息，请参阅建模方法和S4图。在相同的纤维加成率和粘着强度下的逆行流，κFA，类似于永久交联剂的模拟，但速度更快y=0和更远的较低速度(图8a)。花丝密度峰值在FA区中部附近(图8B)。分支所产生的网络内部的力分布也类似于永久交联剂(图8d)在前缘附近可见压缩，在粘着区后部附近有延伸。总的来说，由分支组成的网络的行为与具有永久交联剂的网络相似，至少就逆行流、密度和力剖面而言是如此。
讨论
我们模拟了在单个细丝水平上的层状肌动蛋白网络，在粘着斑的情况下，在稳态下进行逆行流动，以研究板层内的力和变形。我们假设前缘保持在一个固定的位置，就像静止细胞的板片一样，并实现了聚合在前缘施加的力，以及简化的外部电机拉力。出现新生的粘着斑，表现为摩擦增强的区域，与参考实验一致，不存在局部扰动的逆行流[10]。随着粘着强度的增加，包括整体逆行速度的降低，符合分子离合器假说。焦斑粘着强度的提高也增强了粘着区前的压缩，使前、内的细丝弯曲到易被切断的粘着斑区。作为对模型中力平衡的检验，我们模拟了细胞松弛素D的加入导致逆行流减少50%-100%的效果，正如以前的实验所看到的那样。最后，我们发现在我们的模拟中，肌动蛋白束可以形成，这让人联想到横向弧或微钉/丝状足，当改变长寿命/永久交联剂(Arp 2/3复合物)的寿命或长丝加成法时，提示了这些结构如何通过肌动蛋白丝交联剂和聚合蛋白的微小变化而容易形成的机制。
这一工作强调了薄片如何可能经历压缩或拉伸应力取决于距离前缘，位置和强度的焦点粘着，和交联剂的浓度。靠近前缘的聚合通常会导致压缩，然而模拟马达的拉力也会在片状物质的背面产生拉应力，在新生粘着的后面(图1和图S2)。据我们所知，在肌球蛋白Ⅱ支配的收缩板/皮质区之前，这种拉应力支配区域的可能性在先前的模型中没有考虑过。然而，这种从压缩到伸展的功能改变到离前缘的距离，可能表明不同的力学要求跨片层，调节局部粘附成熟和翻转的周期。
在先前的几项建模研究中，曾考虑过快速移动的角化细胞板层的机制，尽管不是在单丝水平上。76]。与我们所认为的静止的板层不同，角化细胞是运动的，逆行速度较低，很少有局灶性粘连，细胞体上有较大的片状层，细胞后方有最高的牵引力。76, 77]。有趣的是，布比司他汀对角化细胞的作用降低了肌动蛋白斑点的寿命[78]，这可能表明角化细胞肌动蛋白网络在很大程度上处于拉伸应力之下，在存在着cofilin的情况下，在体外的某些条件下，这种张力被发现减少了断裂[79](虽然不是由其他团体[80, 81])。随着距离前缘距离的增加，从压缩到延伸的变化可能说明为什么电子显微术中有片状层[12]从前缘的短分支丝，能够在不明显屈曲的情况下支持压缩，过渡到较长、较少的分支细丝，使其更深，能够支撑伸展。我们注意到，一些研究得出结论，角化细胞层脂体受肌球蛋白Ⅱ驱动的压缩，除了在μm正在扩展的前沿[48, 82]。拉伸应力在最前沿；然而，这意味着聚合并不是施加在膜上的推力。
上述说明显示，运动细胞的力学模型可能需要扩展层层模型，以考虑结构网络的变化(例如，通过细丝切断、去分支和退火等方式)。47, 83]、明显的板层和板层/皮质网络[56]，以及整个细胞的细胞骨架和粘附性能[84]。这些方法将解决本工作范围以外的现象，包括牵引应力与通过板层/板层区的逆行流的两相行为[24, 25细胞速度与粘附强度的关系[84].
我们在一些模拟实验中观察到的压缩力的扩展区域，将粘着放置在板层的背面，例如在第二种情况下。S2(B)图，可能会导致网络的屈曲，这一点在我们的机械压缩模拟中也可以看到(S1(D)图、无平板边界约束的情况)。事实上，成纤维细胞片在纤维连接蛋白包覆的圆柱体上从顺行运动向静止运动过渡时，曾因膜张力的作用而发生弯曲，表明在前收缩周期的某些时期，在前缘附近有较大的压缩力。85, 86]。在角化细胞中，也可以看到垂直于前缘的屈曲[87].
在长丝水平上建立了一个稳态模型后，未来的改进和完善将考虑到更接近分子水平的重要调控机制。在……里面图8我们发现，该模型的许多方面对肌动蛋白丝离散化、均匀拉力方式和分支机制的变化具有很强的鲁棒性。今后的工作可以包括更详细地描述前沿的依赖于力的聚合，就像在其他几种模型中所做的那样。36, 39, 41, 49, 50, 58]。汽车也可以在以前的工程中被明确地建模[70, 88]考虑到由于拉力而产生的信息更丰富的力剖面和网络形态的变化，而不是在我们目前的模型中。这些导致逆行运动的马达的特性尚不清楚，但有几个肌球蛋白I马达将肌动蛋白连接到膜上，使肌动蛋白能够在膜上施加力，并向逆行方向拉动肌动蛋白。53, 54]。另外，还可以添加一种响应于层板网络的力的膜，以模拟突出和其他非稳态条件。由于肌动蛋白网络对其施加的力的影响，使其大小/形状发生变化，也可以改进粘着斑的模型。一种实现更复杂的粘着性的方法是将分散的距骨素和维管蛋白分子结合起来，这些分子被吸收到焦斑粘附区，这是由于焦斑粘附力的增加而产生的。
在本工作中，层板网络被广泛交联，表现为一个单一的内聚网络，即使在所研究的焦点粘着强度最高的情况下，对新生灶粘附区附近的逆行流的局部扰动也相对较小。图2B)。因为成熟的局灶性粘连局部改变了血流[10，这表明这些区域的板脂网络可能会发生重大重塑，这可能是由于不稳定[89]或弯曲或用cofilin切断[20]。我们的模型可以扩展到允许在显著弯曲应力下的细丝有更高的被切断的概率来观察这种行为。
本文所建立的模型使我们能够在模拟的稳态层合物中考察纤维水平上的力平衡，包括交联剂、前缘力、拉力和焦斑粘着力的影响，以找出板层内的压缩/伸展区域和束形成方式。如上文所述，对该模型的若干改进可使人们能够进行更详细的调查，以促进对层状物质如何形成和产生力量的理解。我们计划将这些改进纳入模型的未来实现中。
建模方法
我们在一个具有周期性边界条件的矩形模拟箱中模拟了一个固定的薄板。x宽度为2的方向μ，没有长度限制。y方向，高度0.2μm在z方向。在我们的模拟中，逆行流的方向是正的。y方向(朝向细胞中心)，前缘位置在y=0，如下所述。
灯丝表示
在我们的布朗动力学模拟中图1)肌动蛋白丝被模拟为通过弹簧连接的离散珠，每个丝段(珠-弹簧珠)代表37个肌动蛋白单体[90, 91]。在我们的模拟中，力可分为四类：灯丝内力、丝间力、外力和热力。灯丝内力包括每对相邻珠子之间的弹簧力和相邻珠子之间的弯曲力。丝间力包括交联剂弹簧力，它作用于指定的珠子对之间，排除体积力作用于独特的肌动蛋白长丝段之间。作用在单个肌动蛋白珠上的外力包括在前缘聚合所产生的表示力的推动力、代表马达的拉力和(光滑的)硬壁边界力，它们作用于z方向的珠子。每个珠子上的力之和i用来进化珠子的位置，ri，随着时间的推移，根据以下方程，通过三维布朗动力学：(1)哪里ζb圆柱段在圆柱长轴和短轴上的平均阻力系数。特别是，ζb = 4πη流体 l0/[in(l0/d)+0.84]η流体是细胞质环境的粘度，l0 = 0.1 μm是圆柱形段的长度，并且d是圆柱形段的直径(7.0)NM) [72]。我们用的粘度是η流体 = 0.3 帕 ? s约为水的350倍[90].
丝内力
弹簧力图1B，可以写为[72, 91]:(2)哪里k肌动蛋白是肌动蛋白珠之间的键弹簧常数，l0 = 0.1 μm平衡键分离，dIJ = |ri ? ri，和是珠的单位向量。j珠子i。对于我们使用的大多数模拟k肌动蛋白 = 103 PN/μm，该值高于[90, 91]但小于k肌动蛋白=1.69?104 PN/μm在[27]。所有这些数值均小于考虑肌动蛋白单丝弹性模量的数值[72]，以牺牲肌动蛋白丝更容易扩展为代价，允许更大的模拟时间步骤。的含义k肌动蛋白数值将在下面的“模拟层状网络的力学特性”一节中讨论。弯曲力可以写成(3)哪里κ = kBTlp是弯曲刚度和lp = 17 μm是长丝的持久性长度(我们使用的值略高于9.8μm裸肌动蛋白和2.2μm-肌动蛋白(Cofilin-actin)[59, 92–94].
交联剂、排除体积和限制力
我们模拟的交联剂作用于肌动蛋白丝，代表Arp 2/3复合物，α-放线菌素、丝素或塑化剂。它们被模拟为连接肌动蛋白丝状丝珠的弹簧，没有弯曲刚度，一些先前的工作包括[27, 29并且只允许与肌动蛋白珠结合，而不允许在丝上任意位置[27, 29, 88]。我们允许交联剂形成或打破随着时间的推移，详细在“网络生成，交联，和拆卸”一节下面。交联剂弹簧力的计算方法与纤维弹簧力的计算方法相同。EQ 2，但是用一个更柔软的弹簧常数k交联 = 100 PN/μm和平衡长度，我们选择的距离要短于长丝段的长度。l0的长度α-放线菌素[95].
当两个细丝段时，排除体积力，α和β，重叠，并沿向量的方向施加。dαβ，它将两个段之间最接近的接近点连接起来，如[27]，并在图1d。排除的体积力定义为当dαβ| < d排除在外和等于零，否则，在d排除在外 = 7 NM和k排除在外 = 1690 PN/μm [27]。这种力分布在两个线段两端的四个珠子中的每一个，与它们与最近点的距离成比例。dαβ。被排除的体积力是将模拟中的时间步长限制在10以内的主要力。?5S是为了减少非物质键的交叉。我们用96]并确保在使用一个数量级较小的时间步长时，此值不会有显著差异。
围边力z-对任何在z < 0 or z > 0.2 μm力为1PN朝向模拟箱的内部[91].
薄膜和电机拉力
肌动蛋白聚合在细胞前缘的膜上聚合，在此工作中假定是静止的，因此产生了一种推动力(如下图所示)。F推在……里面图1A)，这有助于网络的逆行流动。本文以整个肌动蛋白网络动力学为研究对象，采用一种简单的方法，在肌动蛋白网络上产生边界推力。前缘膜力作用于每个灯丝上的所有珠子，在顶端0.5中至少有一个珠子。μm(在-0.5之间的区域)μm和0图1A)。除非另有说明，每1人的总兵力-μM长丝1.5PN(每粒0.136 pn)，按肌动蛋白聚合产生力的顺序[50, 97]并接近于角化细胞中1.7 Pn丝失速力的估计值[60]。推动力沿带刺向尖头方向移动，这是由最接近尖端的灯丝段所定义的。将力均匀地分配给灯丝中的每一个珠子，避免了在前缘的人工弯曲和屈曲，我们假设在我们的条件下不会发生这种情况。
我们对导致反流的分子运动力进行了近似描述，类似于肌动蛋白聚合所产生的拉力。我们考虑了一种动力(如F拉在……里面图1A)作用于两种模式中的一种：均匀的或反向的，这意味着代表逆流马达的不同的空间分布(图1A)。在均匀拉力模式下，一种力F马达0.002级PN添加到模拟框中的每个肌动蛋白珠中，其方向为正向。y-轴心。在后拉模式下0.004级的力PN沿着正方向y-每颗珠的轴向加在3.25以上μm从最前沿。
热力
热力计算为高斯分布的随机值。(4)(5)哪里是二阶单位张量(α和β标记x, y或z方向)。
焦粘连区
我们假设肌动蛋白网络和局灶性粘连之间存在着简单的摩擦作用。新生的粘着区是一个囊状区域。XY高度0.1的平面μm从z=0表面，如图1E宽度为0.25μm长度为1.25μm)。这一区域内的肌动蛋白珠既可以与新生的粘着斑结合，也可以不与之结合。有黏性的珠子，ηFA大于或等于周围流体，η流体所以这些珠子上的粘性力更高。我们定义κFA = ηFA/η流体。绑定状态和非绑定状态之间的转换是通过Gillespy算法的离散时间实现来处理的。98]具有每个珠的绑定和未绑定速率常数，如表1。这些速率常数值允许在焦斑粘附区的肌动蛋白网络中有相当一部分参与到焦斑粘附中，但不足以使肌动蛋白网络沿z方向。成熟的局灶性粘连模型与新生的粘连相似，且较高。ηFA被放置在离前缘更远的地方。
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表1.仿真参考参数值
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网络生成、交联和拆卸
中所示区域的模拟盒前缘附近添加了长丝。图1A固定费率为23.4/s保持800的浓度μm肌动蛋白单体的逆行流速为30NM/s。每加一根长丝的长度为1.0μm由11颗珠子组成。这些细丝的尖端最初处于.的位置。y=0.5，并在x和z这是在模拟框的范围内。灯丝的取向XY平面和负y方向均匀分布在-70°~70°之间.长丝的角度YZ平面和负y方向均匀分布在-10°~10°之间，与电子显微镜断层图中的灯丝取向一致[15].
在添加长丝后，在新添加的长丝和相邻的长丝之间添加多达五种永久交联剂键。这些连接通过交联剂(如Arp 2/3复合体)模拟连接。这些键只加入到肌动蛋白珠上，相隔的距离在0.03-0.04之间。μm(即周遭))。除非另有说明，这些键是永久的，只有当这个键连接到的两个肌动蛋白珠中的一个从模拟中移除时，这些键才会被移除。XTC细胞中Arp 2/3复合物的浓度估计为2.3。μm[67，它相当于每0.9中大约有一个Arp 2/3复合体。μm肌动蛋白丝，接近每支0.75-0.8的距离。μm成纤维细胞层膜的电镜观察[15]。内分支网络中肌动蛋白丝的平均长度μm到前缘可以小到0.2μm [15, 99]。在典型的模拟中κFA=100，永久交联的平均密度为每0.3μm，一个与这些实验测量值相当的值。
动态键，表示动态肌动蛋白交联剂，如α-随着模拟过程的进行，肌动蛋白或丝素不断地被引入和去除。从每一对相隔0.03-0.04的珠子中随机选择新的动态键。μm目前没有相互联系。我们假设有固定的最大动态交联，，只要允许这样的连接，我们就把它放在网络上。而不是报告，我们用等量的浓度，C动态，超过一卷模拟框9.5μm从最前沿。在我们的模拟中，我们各不相同。C动态在1至30之间μm，包含净估计值的范围。α-放线菌素和丝素交联剂浓度为2.9μm，由使用100确定。μm整个细胞和实验测定的肌动蛋白浓度α-巨噬细胞中的放线菌素和丝素交联剂与肌动蛋白摩尔比[100]。由于寻找彼此相近的珠子在计算上花费很大，因此添加动态交联剂只需每0.025次执行一次。s而不是在每一步。每次添加动态交联剂时，最多可在允许的长丝珠对之间随机引入新的动态键，其中N动态(t)是时间模拟中的动态键数。t之前添加了新的动态交联剂。虽然这一机制并不严格地满足详细的平衡，如101]，我们期望它对这项工作来说是足够的(即没有工件)。--医学论文发表投稿
肌动蛋白和交联剂键的拆卸是通过选择键寿命来处理的，τ，当时t它的创建，以及当模拟进展到更远的时候移除它。t + τ。对于肌动蛋白片段，我们假设一个年龄依赖的拆卸，最小寿命为τ年龄= 125 s其次是速率的指数衰减r年龄 = 0.2/s。因此，每个长丝段的寿命计算为τ = τ年龄?ln(u)/r年龄哪里u是一个随机变量，均匀分布在0到1之间。如果去除肌动蛋白片段会产生一个单一的肌动蛋白珠丝，那么这个珠子和任何相关的交联剂也会从模拟中去除。对于动态交联剂，我们假定具有衰减率的指数寿命分布。.
逆流电机的膜拉力
从膜中引入一种拉力。图8表示膜约束马达(如肌球蛋白I)所产生的拉力作用。53, 54]。只有底部1/10以内的珠子TH模拟箱(z珠子组分z=0至0.02μm)并在焦斑粘连区域外拉扯。每珠拉力的大小为0.02。PN，是原来均匀拉力的10倍。拉力沿细丝有刺对尖端轴方向，而不是沿逆行方向。
有角度约束的分支模拟
在分支模拟中图8，新长丝被添加为长度为1的子长丝。μm致母丝肌动蛋白珠(S4图)。在无分支的模拟中，纤维被引入，它们的尖端末端在y = 0.5 μm，主要是在0?0.5之间形成的永久交联剂。μm。为了获得与分支丝相似的模拟结果，支点位于母丝的珠子上。y=0.25和0.20μm (S4图)。推动力，F先导，在其他模拟中将其值降低到其值的30%，以实现类似的逆行流速度。与母丝相比，长丝的添加角度为70°，与不分枝的模拟结果相同。增加的细丝沿板盘面定向(但总体上覆盖了沿板盘的限制区)。z轴)母女丝的角度，θIJK，被形状的角力限制在70°以内。(6)哪里?夹角 = 1 PNμm, θ0=70°，{i, j, k}是组成分支的肌动蛋白珠的指数，是珠的单位向量。i珠子j。我们发现?夹角将分支角保持在60~80°之间。子丝绕母丝的扭转旋转不受此角度势的限制，而扭转旋转受垂直于分支面的模拟盒的薄维以及不包括丝间体积相互作用的限制。这一限制是从分支模拟的快照中提出的。图8c大多数分支都在XY飞机甚至远离他们的引进接近前沿。
模拟层状网络的力学特性
测量模型中肌动蛋白网络的弹性性质，与实验值进行比较，并与实验测得的肌动蛋白纤维刚度比较，检验肌动蛋白键弹簧常数软化的效果。27, 72]。测试了4x4x0.2的弹性性能。μm(WxHxD)肌动蛋白网片。该贴片是在拉伸均匀模式下模拟新生的粘着斑产生的，宽度为2。μm的引用参数值。表1带着κFA=1.0，演化为稳定状态。这个模拟焦斑粘附的网络随后被平衡了50。s在不受推拉力的情况下，长丝的添加/去除或交联链的改变(即保持所有已形成的永久和动态交联)。形成4μm宽肌动蛋白网络，我们在x-指向平衡的肌动蛋白网络和在新生成的界面上重新连接的周期键。作为最后一步，我们将肌动蛋白网络切割成4x4x0.2形状，将肌动蛋白珠子移除在y=?0.5μm, y = 3.5 μm在x=?1.0μm, x = 3.0 μm与珠子的结合也被移除。
为了测量拉伸下的单轴弹性模量，我们移动了最初在0.25以内的肌动蛋白珠。μm任一种y=?0.5μm或y = 3.5 μm以相反方向的固定速度沿y给出0.2的应变率μm/s，最大拉伸应变为0.5(S1(A)图)。在这些模拟中，我们不包括肌动蛋白丝的拆卸或加法，而是允许现有的动态交联(形成于C动态 = 1 μm)在网络中解除绑定和重新绑定。我们保持不包括体积相互作用和热波动。我们计算了网络上的拉应力之和(不包括最初在0.25以内的珠子)。μm在任何一个边缘)从病毒应力张量，σIJ，如σT = σYY?0.5(σXX + σZZ) [102]。从相同的初始网络出发，我们模拟了几种不同的肌动蛋白键弹簧常数、永久交联弹簧常数和动态交联寿命的应力-应变关系。S1(B)图)。如我们所料，我们观察到了一种非线性的应力-加劲行为.我们报告的弹性模量值是拉应力除以应变为0.2的比例。103]。对于本文中的参考参数(表1，曲线k肌动蛋白 = 1000 PN/μm在……里面S1(B)图)弹性模量为1355帕。我们发现，随着肌动蛋白键弹簧常数的增加，永久交联剂的弹簧常数增加，或者不允许现有的动态交联剂解除束缚(保持顺序)，网络就会变硬。人民军中的参数更改范围。S1(B)图).
我们还模拟了在压缩下的肌动蛋白网络，压缩应变达到0.5(S1(A)图)。对于这些模拟，我们报告?σT(压应力)σT在压缩下是负的。对于大多数模拟中使用的模拟参数，我们发现模数为663。帕在压缩下。在拉伸条件下，压缩模量小于模量。S1(C)图)，反映肌动蛋白纤维的非线性弹性特性[104]。对于压缩模拟，我们也不需要z = 0.2 μm边界，这允许肌动蛋白网络(S1(D)图如活细胞中所见，当膜张力从快速向缓慢突出转变时，膜张力增加[85, 86]。作为.的价值C动态增加，这些网络变得越来越像薄板(S1(D)图)。在没有边界稳定力的情况下，这些网络的屈曲z = 0.2 μm的应力应变图很明显S1(E)图在屈曲开始时有一个峰值。--医学论文发表投稿
模拟网络的弹性模量值与985值相差不大。帕用AFM探针振荡测量Arp 2/3复合物网络的体外报道[104]，或1?10的测量值人民军的肌动蛋白尾弹性模量单核细胞增生李斯特菌 [105]。模拟模量值明显低于爬行角化细胞前缘的弹性模量，34。人民军 [106]，但我们注意到，后一种测量方法可能包括聚合力和粘附力的贡献。考虑到这些数字，并考虑到计算效率的原因，我们进而得到了表1.
模拟
用一个C++自定义代码和OpenMP实现对力的并行计算进行了布朗动态仿真。在XSEDE/SDSC-Comet上使用12个核心48小时就可以实现～65s仿真时间取决于系统的密度。为了达到稳态，模拟通常要重新启动5次左右，因此典型的总模拟时间约为300 s。
辅助信息
模拟中使用的肌动蛋白网络弹性特性的量化。
显影1/9: Pcbi.1009506.s001.tif
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图S1.模拟中使用的肌动蛋白网络弹性特性的量化。
(A)从模拟到的靠近前沿的肌动蛋白网络样本κFA=1.0，当应变率为0.2时，均匀拉力在拉伸或压缩应变下的值可达50%。μm/s。(逃离网络的扩散丝是当网络被切断时断开的细丝。)蓝线段代表永久交联剂，绿色线段代表动态交联剂。(B)拉应力σT通过网络的扩展来测量应变。弹性模量用除法计算。σT在0.2的菌株中。我们研究了改变肌动蛋白键弹簧常数的影响。k肌动蛋白，永久交联剂弹簧常数k烫发，动态交联剂离解率关于弹性模量。中使用的其他参数表1，其中蓝色曲线具有所有参数(包括k肌动蛋白)如表1。微预应力k肌动蛋白 = 5000 PN/μm的非零值。σT零应变。(C)拉应力σT通过对网络的压缩来测量应变。边界约束力z=0和z = 0.2 μm防止薄片沿z方向。为压缩测量的弹性模量值低于(A)中相同的条件，并且不依赖于k肌动蛋白, k烫发。(D)不受排斥边界稳定作用的压缩网络z = 0.2 μm展示屈曲。增加C动态导致更有凝聚力的网络。颜色指示z价值。(E)拉应力σT无排斥边界的网络压缩测得的应变z = 0.2 μm.
Https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009506.s001
(TIF)
图S2.肌动蛋白丝张力和浓度模拟导致弧和束。
(A)在不同动态交联剂浓度下的肌动蛋白网络图像，与图6B，结合了长寿命和动态交联剂和焦斑粘着剂，代表了一种成熟的粘附。采用均匀拉法。蓝线段代表永久交联剂，绿色线段代表动态交联剂。(B)肌动蛋白丝珠之间的张力(平均时间和时间)zA中相应的模拟结果表明，肌动蛋白纤维主要处于压缩状态。(C)肌动蛋白浓度值(时间和时间平均)z-稳态时的轴)用于A中的相应模拟。沿垂直方向的尺度(y)和水平(x)轴在μm.
Https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009506.s002
(TIF)
图S3.肌动蛋白束弧形在板层边界与拉回模式下形成，与均匀拉模比较图6.
(A)永久交联剂和动态交联剂相结合的快照(左)和浓度剖面(右)。动态交联剂数量的增加使纤维束更紧密，而丝丝的整体空间浓度相对不变，在粘着区附近没有丝束的捆绑。蓝色(绿色)线段代表永久(动态)交联剂。(B)与A小组相同，但以寿命有限为20的交联剂取代永久交联剂s。在中间动态交联剂浓度下，结合肌动蛋白浓度峰值出现在粘着区前的捆绑。与均匀拉箱相比，产生的束不那么紧凑(图6B)。在模拟快照中，沿垂直方向的比例尺(y)轴在μm。蓝色(绿色)线段代表长寿命(动态)交联剂。所有由模拟计算的数据至少平衡165秒，平均在至少24秒内。
Https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009506.s003
(TIF)
在分支模拟中图8，将分支添加到随机选择的肌动蛋白珠之间。y=0.25和y = 0.20 μm，由绿色区域突出显示。分支被一个角力固定在70°的指定角度上，F夹角，定义为EQ 6它作用于构成角度的三颗珠子上。如蓝色所示，来自前缘的推动力作用于女儿丝上的所有珠子。在此示例中，由于母灯丝没有珠子延伸到前缘区域，因此在连接子灯丝的母灯丝珠子上没有打孔力。
Https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009506.s004
(TIF)
S1电影。拉拔均匀条件下的层合物。
稳态图2在拉均匀条件下κFA=50以上30s和其他参数，如表1.
Https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009506.s005
(MP4)
细胞松弛素D的模拟作用超过100秒。时时t=0在电影中，添加和推动长丝停止在一个模拟κFA=50在拉回模式中，参数如下所示表1，以前已经达到了稳定的状态。蓝线段代表永久交联剂，绿色线段代表动态交联剂。
Https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009506.s006
(MP4)
S3电影。变动态交联剂浓度模拟成熟粘着剂和永久交联剂。
第一行图6为C动态 = 1, 10, 30 μm超过30秒。蓝线段代表永久交联剂，绿色线段代表动态交联剂。
Https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009506.s007
(MP4)
S4电影。变动态交联剂浓度模拟成熟粘着剂和长寿命交联剂。
下排图6使用寿命较长的交联剂寿命为20。s和C动态 = 1, 10, 30 μm超过30秒。蓝线段代表长寿命交联剂，绿色线段代表动态交联剂.
Https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009506.s008
(MP4)
S5电影。模拟显示微穗状束的形成。
微尖形成图7。蓝线段代表永久交联剂，绿色线段代表动态交联剂。
Https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009506.s009
(MP4)
致谢
我们感谢渡边直木、山一郎和Kazuma的讨论激发了这项工作，感谢Danielle Holz的讨论和反馈。
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