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《汉坦病毒利用内源性宿主因子P58IPK对抗PKR抗病毒反应-医学论文发表范文》

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《汉坦病毒利用内源性宿主因子P58IPK对抗PKR抗病毒反应-医学论文发表范文》期刊在线投稿系统

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《汉坦病毒利用内源性宿主因子P58IPK对抗PKR抗病毒反应-医学论文发表范文》期刊简介

汉坦病毒利用内源性宿主因子P58IPK对抗PKR抗病毒反应-医学论文发表范文

· 王泽坤

· 松阳任，

· 李启明，

· 奥斯汀·D·罗斯特

· 雷林，

· 刘思成

· 萨夫德·S·加纳伊

· 邱建明，

· 希玛米尔,

· 穆罕默德·米尔发表日期：2021年10月15日

摘要

汉坦病毒核衣壳蛋白(NP)通过一种未知的机制抑制蛋白激酶R(PKR)在病毒感染过程中的抗病毒反应。在这里，我们证明NP利用内源性PKR抑制剂P58。IPK抑制PKR。P58活性IPK通常在细胞中受到抑制，形成一种不活跃的复合物，其负性调节因子为HSP 40。另一方面，PKR仍与40年代的核糖体亚单位有关，这是一个独特的战略位置，方便其自由进入下游目标eIF 2α。虽然NP和Hsp 40都与P58结合IPK与Hsp 40相比，NP的结合亲和力强得多。p58IPK包含一个np结合位点，跨越N端tpr子域I和II.p58上的hsp 40结合位点IPK定位于tpr子结构域Ⅱ.np与p58的高亲和力结合IPKNp和hsp 40结合位点的重叠释放了p58。IPK通过竞争抑制形成负调节。NP-P58IPK复合物是通过NP与核糖体蛋白S19(RPS 19)的直接相互作用而选择性地引入到40年代核糖体亚基中的。RPS 19是40年代核糖体亚基的一个结构成分。NP与P58有不同的结合位点IPK和RSP 19，使它成为P58之间的桥梁。IPK和40年代的核糖体亚单位。缺乏与P58结合的NP突变体IPK或RPS 19不能抑制PKR，表明P58的选择性接触IPK到40年代，PKR的抑制需要核糖体亚单位。缺乏P58的细胞IPK安装一个快速的PKR抗病毒反应，并建立抗病毒状态，观察到全球翻译关闭和快速下降的病毒载量。这些研究揭示了一种新的病毒策略，其中np释放p58。IPK从它的负调节剂，选择性地与它在40年代核糖体亚单位，以迅速对抗PKR抗病毒反应。

作者摘要

在病毒感染过程中，PKR的激活会关闭宿主的翻译机制，并产生一种抗病毒状态，从而为病毒蛋白的合成制造障碍。我们的结果表明，汉坦病毒劫持了内源性PKR抑制剂P58。IPK来对抗PKR的抗病毒反应。PkR仍与宿主核糖体相关联，以获得对eIF 2α的自由访问，从而使宿主翻译设备在病毒感染期间迅速关闭。本研究揭示了汉坦病毒NP阻止PKR诱导的病毒感染细胞翻译关闭的一种新机制。Np分解不活跃的hsp40-p58IPK复杂和招募释放的P58IPK到40年代的核糖体亚单位，一个战略性的PKR位置。这种招募P58的策略IPK迅速抑制PKR，防止宿主干扰病毒蛋白合成。

引用：王Z，任S，李Q，公鸡AD，林L，刘S，等。(2021)汉坦病毒使用内源性宿主因子P58IPK来对抗PKR的抗病毒反应。PLOS病理图17(10)：e1010007。Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010007

编者：Juan Carlos de la Torre，Scripps研究所，美国

收到：(二0二二一年六月十九日)接受：(二0二二一年十月四日)出版：2021年10月15日

版权：(2021)Wang等人。这是一篇以CreativeCommonsAttribution许可证，允许在任何介质中不受限制地使用、分发和复制，只要原始作者和源被记入帐户。

数据可得性：所有相关资料都在手稿内。

供资：Mam感谢NIH/NIAID资助(1R15AI1128529-01)进行本手稿中的研究。SM和MAM还感谢西方卫生科学大学提供的研究设施和设备方面的支持，以开展本手稿中所报告的研究。资助组织在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。-医学论文发表范文

相互竞争的利益：提交人宣布，不存在任何相互竞争的利益。

导言

汉坦病毒是人畜共患病的负性RNA病毒。汉坦病毒科家庭，布尼亚病毒秩序。它们的基因组由三个RNA片段S、M和L组成，分别编码核衣壳蛋白(NP)、糖蛋白前体(GPC)和RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)。1]。GPC在翻译后被切割成Gn和GC两种糖蛋白.人类被吸入受病毒感染的啮齿类动物的喷雾剂排泄物[2]。最近，南美洲的安地斯汉坦病毒(Andes Hantavirus)物种报告了人与人之间的传播[3]。汉坦病毒感染引起肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒心肺综合征(HCPS)，死亡率分别为15%和40%。4]。尽管全世界每年报告15万至20万例汉坦病毒感染病例，但没有抗病毒治疗或FDA批准的这种病毒感染疫苗。

病毒与宿主的相互作用决定了病毒疾病的结果。宿主Ⅰ型干扰素(IFN)反应刺激干扰素刺激基因(ISGS)的表达[5]。ISGS的抗病毒效应促进宿主细胞建立抗病毒状态，为病毒复制制造障碍[6]。虽然汉坦病毒Gn的胞浆尾结构域在病毒感染早期抑制IFN的诱导[7–9在汉坦病毒感染后期，可观察到大量IFN和ISG的表达。10]。延迟但强劲的IFN反应未能对抗汉坦病毒感染宿主中的病毒复制[7,10,11]，表明汉坦病毒已经进化出了对抗ISG抗病毒作用的策略。

蛋白激酶R(proteinkinase R，PKR)是eIF 2α激酶家族的经典ISG之一，具有C末端激酶结构域(KD)和N端dsRNA结合结构域(DsRBD)，由两个串联的dsRNA结合元件组成。DsRBD与KD分子间的相互作用使该酶保持潜伏形式。Pkr与dsRNA或其激活物PACT蛋白结合后，发生构象变化，形成同二聚体[12,13]。二聚PKR经过自磷酸化以获得活性。14在宿主的抗病毒防御中扮演着不同的角色。例如，活性PKR磷酸化eIF 2α，诱导宿主翻译关闭，目的是中断病毒蛋白的合成[15]。PKR还激活NF-κB，积极调节干扰素和炎性细胞因子的诱导[16]。激活凋亡通路以限制病毒复制和传播是PKR调控的抗病毒防御的另一个方面。17]。PKR在宿主细胞内的位置可能与PKR的多种功能有关。有趣的是，PKR仍然与宿主细胞核糖体有关，特别是40年代的核糖体亚单位[18,19]。与核糖体的关联已被提出，以促进PKR与其主要下游目标eIF 2α的自由连接，尽管这个战略位置在PKR的其他抗病毒功能中的作用尚不清楚。病毒是一个关键的抗病毒宿主因子，它已经进化出多种策略来对抗PKR的抗病毒活性。20,21]。另一方面，pkr的激活也受到宿主细胞因子的严格调控，如hiv-1 tar RNA结合蛋白(Trbp)、糖蛋白p 67、核蛋白p67、黑色素瘤分化相关基因-7蛋白、热休克蛋白hsp 90、hsp 70和p58。IPK [14].

P58IPK，内源性PKR抑制剂[22]从四肽重复序列(TPR)中，含有9个排列整齐的N端34个氨基酸重复序列(TPR1-9)。DnaJ热休克蛋白的C端结构域与J结构域的同源性也使p58蛋白具有同源性。IPK属于热休克蛋白家族的成员[23]。P58IPK通过直接结合和阻断PKR二聚来抑制PKR[22]。P58的PKR结合区IPK已被映射到其TPR6主题[22]。有趣的是，P58的活性IPK是由它自己的抑制剂hsp 40负调控，而hsp 40与p58形成一个不活跃的复合物。IPK(22)。我们以前曾报道过，汉坦病毒NP通过一种未知的机制中断PKR二聚，以确保宿主细胞中病毒蛋白的持续合成。24]。在这里，我们演示了汉坦病毒NP释放P58的一种新机制。IPK从Hsp 40的离合器中招募到40年代的核糖体亚单位来抑制PKR二聚。我们的结果表明np与p58结合。IPK与Hsp 40相比具有更高的亲和力。NP和Hsp 40在P58上有一个共同的结合位点。IPK。我们的结果表明NP与hsp 40竞争与p58的结合。IPK，导致hsp40-p58的解离。IPK复杂。产生的NP-P58IPK复合物是通过NP与核糖体蛋白S19(RPS 19)之间的直接相互作用而选择性地引入到40年代核糖体亚基的。RPS 19是40年代核糖体亚基的一个结构成分。NP与RPS 19和P58有不同的结合位点。IPK。NP与P58的同时结合IPKRPS 19有助于迅速征聘P58IPK到40年代核糖体亚单位。招募过程中的中断阻止了PKR在细胞中的抑制。总之，我们的研究揭示了汉坦病毒np释放p58的一种新机制。IPK从它的负性调节剂的离合器，并招募它在40年代的核糖体亚单位，以有效地对抗PKR抗病毒反应。

结果

NP与P58结合IPK并抑制PKR

我们以前报道过汉坦病毒NP通过抑制PKR的二聚和随后的自磷酸化而抑制PKR的激活。不活动的pkR不能磷酸化其下游目标，如eIF 2α。确定NP是否使用P58IPK为了抑制PKR的激活，我们击倒了P58IPK用shRNA在HEK293T细胞中稳定表达SNV的NP或EGFP作为阴性对照。在收获前3h用PolyI：C转染细胞，激活PKR，Western blot分析PKR的磷酸化情况。从图1A和1A1)由于P58的下调，稳定表达NP的细胞不能很好地抑制PolyI：C诱导的PKR自磷酸化。IPK(比较6号和8号车道)。另一种针对p58不同区域的shRNA证实了这一结果。IPKMRNA(图1B和1b1，比较第4条和第6条)。这个实验表明NP需要P58。IPK熟练地抑制PKR。与许多其他汉坦病毒NPs不同，来自SNV的NP不阻断Rigi/MDA 5介导的干扰素β途径[25,26]，表明通过这条途径抑制PKR活化的可能性较小。确定NP是否与P58相互作用IPK，将p58标记的质粒与HEK 293 T细胞共转染。IPK以SNV或ANDV(Andes病毒)或Hantaan病毒或Myc标记的SUFU(融合同源性抑制基因)蛋白的NP标记为阴性对照。图1c2号至5号车道)。SUFU蛋白的分子量与汉坦病毒N蛋白相似。同样，细胞共转染表达标记p58的质粒。IPK来自SNV、ANDV或Hantaan病毒的NP没有任何标记(图1c、6至8车道)。细胞共转染表达p58的质粒。IPK从SNV或ANDV或Hantaan病毒或Myc标记的SUFU蛋白(图1c、第9-12号车道)。以抗标志抗体或IgG为对照，免疫沉淀细胞裂解液。用抗Myc抗体对免疫沉淀材料进行westernblot分析，揭示了p58之间的相互作用。IPK来自SNV、ANDV和Hantaan病毒的NP。图1c)。用抗Myc抗体对细胞裂解物进行反向免疫沉淀，用免疫沉淀材料进行westernblot分析，进一步证实了结果。P58的相互作用IPK三种汉坦病毒(SNV、ANDV和Hantaan病毒)的NPs与先前报道的PKR抑制作用一致。24].

图1.NP新兵P58IPK抑制PKR活化。

A和B.表达EGFP或SNV NP的HEK293T细胞株被慢病毒转导，以稳定表达抗P58的shRNA或shRNA#1(A板)或shRNA#2(B板)IPK。ShRNAs#1和#2针对的是p58的不同区域。IPKMRNA序列细胞经模拟转染或用聚I：C(400 ng/ml)转染3h后收获。细胞裂解物检测磷酸化PKR(p-pkr)、总pkr、p58的表达。IPK、NP、EGFP和β-actin的免疫印迹分析。看见材料和方法用于抗体A1和B1。用ImageJ对P-PKR的波段强度进行量化，并与第2车道的强度进行归一化，绘制出归一化强度值。A1和B1分别代表A和B组的相对p-PKR带强度。通过两个或两个以上的独立实验，计算了误差条显示的标准偏差。差异的显着性是通过以下方法计算出来的。t试验，如先前所报告的[24]. C.共转染HEK293T细胞，共转染表达1-12通道蛋白的质粒。细胞裂解物与图中的抗体共转染，用图中的抗体进行免疫沉淀(IP)和免疫沉淀材料的免疫印迹分析(IB)。D。HUVEC细胞感染Andes病毒或Hazara病毒。从感染细胞中提取的细胞裂解物由图中所示的抗体免疫沉淀(IP)，但HZVNP的IP是用抗CCHFVNP抗体进行的。免疫沉淀裂解物采用免疫印迹分析(IB)检测，抗体如图所示。E。用兔抗CCHFV多克隆抗体(Ab 190657)对HZV NP和ANDV NP进行Westernblot分析，检测HZV NP和ANDV NP的细菌表达和纯化。

Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010007.g001

进一步确认P58IPK-NP相互作用后，HUVECs感染ANDV或HZV(HZV)，HZV是一种具有类似汉坦病毒的三段负性RNA基因组的蜱媒直链病毒。HZV是研究克里米亚刚果出血热病毒(CCHFV)的模型病毒。CCHFV是一种引起人类重大疾病的BSL 4型原病毒。使用HUVECs是因为这些细胞对汉坦病毒和HZV感染都是允许的。由于CCHFV与HZV NPs具有显著的序列同源性，细胞裂解物采用抗ANDV NP抗体或IgG或抗CCHFVNP抗体进行免疫沉淀，与HZVNP交叉反应。我们证实了抗CCHFVNP抗体与细菌表达和纯化的hzvnp的交叉反应性。图1E)。这些抗CCHFVNP抗体以前曾用于hzvnp的研究[27]。交叉反应的CCHFV抗体被使用，因为HZVNP的抗体还没有上市.抗P58免疫沉淀材料的westernblot分析IPK抗体证实P58之间的相互作用IPK和感染细胞中的ANDV NP图1d)。抗P58细胞裂解物的反向免疫沉淀IPK用抗ANDV np抗体或抗CChfvnp抗体对免疫沉淀材料进行免疫印迹分析，进一步证实了p58的存在。IPK-感染过程中ANDV NP相互作用(图1d).

NP释放P58IPK它的负调节剂HSP 40

在没有病毒感染或细胞压力的情况下，P58IPK与负调节剂热休克蛋白HSP 40形成非活性复合物。因为NP与P58结合IPK (图1)，我们询问NP是否影响Hsp 40与P58的结合IPK，这可能导致不活跃的P58的解离。IPK-Hsp 40综合体抗p58抗体免疫沉淀hzv感染细胞株hvc细胞裂解液(Hzv)和hzv细胞裂解液(Hzv)。IPK用抗Hsp 40抗体进行免疫印迹分析。从图1dHsp40-P58IPK与hzv或未受感染的对照细胞相比，ANDV感染细胞的相互作用受到显著影响(比较通道7、8和9)。图1d)。进一步证实np对hsp40-p58有影响。IPK相互作用，细菌表达和纯化的gst-p58IPK将融合蛋白固定在谷胱甘肽Sepharose微球上。用材料和方法中提到的稳定表达EGFP或NP的HEK293T细胞裂解液孵育珠子。通过westernblot分析发现hsp 40与gst-p58有很强的结合。IPK在对照组中表达EGFP的细胞裂解物。然而，在表达np的细胞裂解物中，这种相互作用受到了影响。图2A)。Gst-p58共纯化np和hsp 40IPK表明np可能与hsp 40竞争与gst-p58的结合。IPK。接下来我们比较了np和hsp 40与p58的结合。IPK在牢房里。表达标记p58的质粒共转染HEK 293 T细胞IPK与Myc标记NP或Myc标记Hsp 40一起使用。细胞裂解液用抗Myc抗体免疫沉淀，并与标记为p58的标志结合。IPK用抗标志抗体进行westernblot分析。Myc-np与旗标p58的强共纯化IPK表明NP很可能与P58结合IPK与hsp 40相比，MOR比较紧(比较第5和第6车道)图2B)。Np和hsp 40有可能在p58上共享一个共同的结合位点。IPKNP与hsp 40竞争与p58的结合。IPK。还需要进一步的研究来证明NP是否竞争性地抑制hsp 40与p58的结合。IPK。Np的结合也有可能引起p58构象的改变。IPK和构象改变的P58IPK不绑定到Hsp 40。

图2.NP释放P58IPK它的负调节器Hsp 40。

A。细菌表达和纯化gst或gst-p58IPK融合蛋白与谷胱甘肽Sepharose珠孵育。经洗涤后与HEK293T细胞裂解液共同孵育，稳定表达EGFP(1-3)或Myc-NP(4-6)。用相应的抗体对洗珠洗脱的结合物进行westernblot分析。输入代表整个细胞裂解液。B.重组质粒p58与HEK293T细胞共转染IPK或者是Myc-Hsp 40或者Myc-NP。用抗Myc抗体免疫沉淀细胞裂解物。用适当的抗体对全细胞裂解液(WCL)(通道1-3)和免疫材料(通道4-6)进行Western blot分析。C、D、E和F。具有代表性的Bli感官图显示N蛋白与GST-P58的时间关联和解离IPK(C)含GST标签的N蛋白(D)，带有GST-P58的HSP 40蛋白IPK(E)和带有GST标签的Hsp 40(F)。在gst-p58的两种浓度下产生了图像。IPK和gst标签，在面板C-F中用红色和蓝色显示(见材料和方法详细情况)。G.HEK293T细胞共转染表达标志-NP或Myc标记野生型p58的质粒IPK或P58IPK缺乏TPR重复序列1-3(ΔTPR 1-3)或由TPR重复序列1-6(ΔTPR 1-6)组成的两个子结构域I和II的突变体。用抗Myc抗体免疫沉淀细胞裂解液.用抗标志抗体或抗Myc抗体对整个细胞裂解液(Wcl)或免疫沉淀材料进行westernblot分析。H。实验结果与C板完全相同，但用旗标-Hsp 40代替旗-NP。I。P58的TPR结构域的示意图表示IPK. J。分析了C-F板的动力学分布，以计算材料和方法中提到的结合参数。计算出的K的百分之五D增加值为标准差。

Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010007.g002

接下来，我们量化了P58的结合亲和力。IPK在闪电式(ForteBio)仪器上使用生物分子层干涉技术的NP和HSP 40，如前所述[28,29]。通过对纯化的gst-p58的缔合和解离动力学的研究，将细菌表达和纯化的c-端His标记的np和hsp 40固定在Ni-nta生物传感器上。IPK和GST(对照)与固定化蛋白(见材料和方法详细情况)。有代表性的动力学剖面显示在图2c-2f绑定数据显示在图2j。从图2c-2f这与gst控制gst-p58不同。IPK与NP和HSP 40相互作用。GST-P58IPK与Hsp 40相比，Np的速率要慢一些。然而，GST-P58的解离动力学IPK-np复合物比gst-p58慢。IPK-Hasp40建筑群GST-P58动力学数据分析IPK与NP和Hsp 40结合的解离常数(K)D)分别为0.8μM和2 0 4μM.图2j)。大多数调节蛋白和信号蛋白之间也有类似的结合亲缘关系[30–33]。这个实验清楚地证明了P58IPK与NP结合的亲和力比HSP 40强250倍。

我们在p58上绘制了np和hsp 40的结合位点。IPK采用缺失突变和免疫沉淀分析。P58的N端TPR结构域IPK由9个TPR主题(TPR1-TPR9)组成。结构单元TPR1-TPR3、TPR4-TPR6、TPT7-TPR9分别由三个子结构域I、II和III组成(图2i)。两个P58IPK在HEK293T细胞中，缺失突变体TPR1-TPR3和TPR1-TPR6均以N-末端Myc标记融合蛋白和标记NP的形式表达。用抗Myc抗体免疫沉淀细胞裂解物，用免疫印迹法检测标志NP的结合。从图2G缺失的子结构域I(ΔTPR 1-3)显著抑制了P58的结合。IPK到NP，这进一步损害了删除子域I和II(ΔTPR1-6)。这表明NP结合位点位于第一和第二子域，尽管子域I可能在结合中起主要作用。对hsp 40在p58上的结合位点进行了类似的定位。IPK。从图2H子域I的缺失不影响P58的结合IPK去Hsp 40。然而，由于删除了两个子域i和ii，这种结合受到了很大的损害，这表明hsp 40结合位点很可能位于子域II中。图2证明np结合位点可能与p58上的hsp 40结合位点重叠。IPK。因为NP与P58结合IPK与Hsp 40相比具有更高的亲和力(图2c-2f)，np可能会竞争性地阻断hsp 40与p58的结合。IPK，尽管还需要进一步的研究来证明一种可能的竞争性抑制。宿主因子间接介导NP与P58相互作用的可能性较小IPK 体内不能排除。

NP与P58的结合IPK是必要的，但不足以抑制PKR

为了进一步了解分子机制，我们对p58进行了映射。IPK免疫沉淀和westernblot分析在NP上的结合域。重组质粒p58与HEK293T细胞共转染IPK与野生型Myc-NP或Myc-NP截短突变体包括N-端175氨基酸(NP1-175)或C-末端175-428氨基酸(NP 175-428)或C-末端230-428氨基酸(NP 230-428)。用抗Myc抗体免疫沉淀细胞裂解物。抗旗标抗体免疫沉淀材料的westernblot分析表明，N端175个氨基酸与p58不结合。IPK (图3A)。相比较而言，C端突变体(NP 175-428和NP 230-428)与p58有很强的结合。IPK，证明P58IPK结合位点位于NP的C端.类似的分析表明，缺乏rna结合结构域(氨基酸175-230)的np突变体与p58结合。IPK类似野生型NP(图3B)。结果图3A和3B经GST下拉试验进一步验证。细菌表达和纯化gst-p58IPK固定化于谷胱甘肽Sepharose微球上。用表达野生型Myc-NP或Myc-NP截短突变体的HEK293T细胞裂解物孵育微球。用抗Myc抗体对洗涤珠中洗脱物进行westernblot分析，进一步证实了p58的存在。IPK结合位点位于NP的C-端(图3C).

图3.NP窝藏P58IPKC端的绑定点。

一个。重组质粒p58与HEK293T细胞共转染IPK与野生型Myc-NP或NP截短突变体NP1-175或NP 175-428或NP 230-428与Myc标记融合。免疫沉淀材料或全细胞裂解液(WCL)的westernblot分析采用合适的抗体。用抗Myc抗体对免疫沉淀材料进行westernblot分析，发现NP1-175和NP 230-428突变体大小与轻链抗体一致(2)。Nd自上而下)。用抗NP抗体对杂交结果进行了检测，发现突变体np 1-175和np 230-428(3)。RD自上而下)。在NP车道的下频带显示一个退化的产物。B.本实验在A板上重复进行，以检测另一个缺乏Δ结合区(NP)的NP突变体(NP)，并与野生型NP进行比较。C。细菌表达和纯化gst或gst-p58IPK固定化于谷胱甘肽Sepharose微球上。用含有野生型NP或NP突变体的HEK293T细胞裂解液进行洗涤和培养。用抗Myc抗体进行Westernblot分析。D。Hela细胞共转染表达mCherry-p58的质粒IPK与野生型NP或NP截短突变体一起与Myc标记融合。用抗Myc抗体检测Myc标记蛋白，并与Alexa Fluor 488结合的二次抗体进行观察。合并面板中的框状区域被放大并侧显示标签I、II、III和IV。利用ImageJ软件，通过两个或两个以上点绘制了一条线，该线下的荧光强度用对应于第一、第二、第三和第四面板的侧图表示，如下所示。红线是mCherry-P58IPK的荧光强度，绿线代表Alexa Fluor 488的荧光强度。与第二面板不同，第一、第三和第四面板中的红色和绿色荧光信号显示出强烈的共定位性，这一点可以从两个信号明显高于背景并在同一位置增加这一事实来证明。

Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010007.g003

接下来，我们用共聚焦显微镜观察p58的位置。IPK在表达野生型NP或NP截短突变体的细胞中。Hela细胞共转染表达mCherry-p58的质粒IPK融合蛋白与野生型Myc-NP或Myc标记的NP突变体(图3)。利用抗Myc单抗和与Alexa粉488结合的二次抗体对融合到Myc标签上的野生型NP或NP突变体进行了观察。与myc-np1-175突变体不同，野生型突变体和np突变体(NP 175-428和NP 230-428)与mCherry-p58具有较强的共定位性。IPK的结果与图3A和3B。我们以前曾报道过，NP通过核糖体蛋白S19与40年代的核糖体亚基结合，S19是40年代核糖体亚基的一个结构成分。NP含有RPS 19结合区，位于151-175个氨基酸之间。从图3具有RSP 19结合结构域的野生型NP和NP1-175突变体可能与内质网相关核糖体有关，具有核周点形态。缺失RSP 19结合区的NP突变体NP 230-428和NP 175-428分布于细胞质各处，断点形态完全消失。MCherryP 58IPK在缺乏NP表达的细胞中定位于细胞质(图3)。Np突变体在图4e。然而，mCherryP 58IPKNP表达细胞采用明显的点状周细胞形态，与野生型NP相似。尽管MCherry-P58IPK与NP突变体(NP 175~428和230~428)强共定位，保持了亲本细胞质形态。这些观察表明野生型np可能针对mCherry-p58。IPK到40年代核糖体亚单位。

图4.NP同时需要RPS 19和P58IPK结合结构域抑制PKR。

A。HEK293T稳定表达EGFP或野生型NP或NP截短突变体的细胞系，在收获前3h用PolyI：C进行模拟转染或转染，以刺激PKR的自磷酸化。取细胞，用相应的抗体进行Westernblot分析，检测所指示蛋白的表达。A1。用图像J对A面板中的ppkr带强度进行了量化，并绘制了相应的归一化强度值，并在面板中进行了讨论。图1. B。HEK293T细胞要么单独转染或单独转染转染试剂(TurboFect)，要么单独转染含有空载体的TurboFect(pcDNA3.1)或表达缺失突变体的野生型NP或NP缺失突变体(NPΔ175-230)，即NP截短突变体(NP1-175、NP 175-428或NP 230-428)。收集细胞，用适当的抗体检测指示蛋白的表达。B1。用图像J法对B板P-PKR的谱带强度进行量化，并绘制出归一化强度值。误差条是归一化强度值的10%。C和D.将HEK293T细胞模拟转染或转染表达野生型NP或NP截短突变体NP 151-428、NP 175-428(面板C)或缺失缺失突变体(NPΔ151-175)的缺失突变体(NP 151-175)的空载体或表达载体。用适当的抗体检测细胞裂解物中指示蛋白的表达。C1和D1。用图像J法对C&D面板中P-PKR的波段强度进行量化，并绘制出归一化强度值。误差条是归一化强度值的10%。E。野生型NP和NP突变体的图形表示。水平线表示从氨基酸序列中删除的区域。F。蔗糖密度梯度离心法检测野生型NP及其突变体的寡聚形式。在5%~50%蔗糖梯度上对蛋白质(GST、BSA、ADH、W.T NP、Δ175-230、Δ151-175、NP(151-428))进行Western blot分析。注：M，D和T代表蛋白质的单体、二聚体和三聚体形式，根据使用图4G. G。GST、BSA和ADH的分子量图是这些蛋白质在梯度中洗脱的分数。这些蛋白质在梯度中洗脱的分数也用红色箭头表示。图4f.

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确定NP与P58的结合IPKHEK293T稳定表达野生型NP或NP截短突变体的细胞系在收获前3h转染多聚I：C启动PKR活化。用westernblot法检测细胞裂解物，检测PKR的自磷酸化。图4A和4A1)。如所料，np1-175突变体缺乏与p58的结合。IPK，不能抑制PKR的自磷酸化。令人惊讶的是，NP 175-428和NP 230-428突变体与p58紧密结合。IPK也未能抑制PKR的自磷酸化，表明与P58的结合IPK可能是必需的，但不足以抑制PKR。据报道，瞬时质粒转染可触发PKR在细胞中的活化。34,35]。以进一步验证图4A，将表达野生型np或np截短突变体的空载体或质粒瞬时转染HEK293T细胞。图4A或缺失NP缺失突变体(NPΔ175-230)。Westernblot分析发现，转染空载体可诱导PKR活化，野生型NP和NP突变体的表达均抑制PKR的激活，而NP突变体缺乏RNA结合域。图4B和4B1)，与我们先前报告的类似观察结果一致[24]。此外，C端np突变体(NP 175-428和NP 230-428)与p58结合。IPK再次未能抑制PKR，从而验证了图4A。战略图4B用于测试另一个NP突变体(NP 151-428)的活性，该突变体包含完整的RPS 19结合区[36]。令人惊讶的是，这个突变体抑制了PKR的激活，类似于野生型NP(图4C和4C1)。RPS 19结合域的缺失使NP抑制PKR的活性降低。图4d)。加在一起，结果图4证明NP同时需要P58IPK与RPS 19结合域抑制PKR。

NP的寡聚不需要抑制PKR的激活

汉坦病毒NP在表达过程中形成二聚体和三聚体，由此产生的NP单体、二聚体和三聚体仍处于动态平衡状态。最近，X射线晶体学研究表明，连接N端盘管结构域和核心区的C端连接区和螺旋区是np齐聚的必要条件。37]。此外，从病毒中提取的天然核蛋白复合物(Rnp)的电镜(EM)显示，单体大小的np-RNA复合物是病毒rnp的组成部分。37]，证明单分子形式的NP是功能性的。研究了野生型NP及其突变体在蔗糖密度梯度上的寡聚状态，以确定NP是否需要寡聚才能抑制PKR的激活。如图所示图4f，野生型NP(~53 KDa)形成二聚体(~106 KDa)和三聚体(~159 KDa)，抑制PKR的活化。图4A、4B和4C)。然而，NP突变体(npΔ151-175)形成了类似于野生型np的二聚体和三聚体。图4f)但未能抑制PKR的激活(图4D和4D1)。相比之下，NP突变体(NP 151-428)没有形成二聚体和三聚体(图4f由于缺乏N端盘管结构域，需要进行齐聚，但抑制了PKR的激活。图4C和4C1)。这清楚地表明，NP的寡聚不需要抑制PK的激活。

NP新兵P58IPK到40年代核糖体亚基与核糖体蛋白RPS 19的辅助作用

无花果观测4和三维空间暗示NP有可能招募P58IPK到40年代的核糖体亚单位，这是以前已知的PKR的一个位置。为了验证这一假设，我们用表达标志p58的质粒共转染了HEK293T细胞。IPK与Myc-NP或Myc-NPΔ151-175缺失突变体一起出现.用抗Myc抗体免疫沉淀细胞裂解液.免疫沉淀物的westernblot分析表明，野生型np与rps 19和标志p58共纯化。IPK，显示P58有可能被招募IPK至40年代核糖体亚基(图5A)。相比之下，npΔ151-175突变体与p58发生了相互作用。IPK但没有像预期的那样绑定RPS 19。进一步核实NP是否招募了P58IPK对40年代的核糖体亚单位，HEK293T细胞进行了上述转染。用抗RPS 19抗体将40年代的核糖体亚基RPS 19拉下来。通过westernblot分析发现rps 19与p58相互作用。IPK在NP中表达的细胞(图5B)。转染空载体的细胞或表达npΔ151-175突变体的质粒均未观察到这种相互作用。图5B)。这些结果表明NP招募了P58。IPK到40年代核糖体亚单位。确认国家警察招募了P58IPK针对病毒感染细胞中的40年代核糖体亚单位，采用抗p58抗体免疫沉淀hdv或hzv感染细胞的hvc细胞裂解液。IPK抗体。对免疫沉淀材料的检查显示，P58IPK在ANDV感染细胞中，NP和RPS 19共同作用，显示P58被招募。IPK到40年代核糖体亚基的NP(图1d).

图5.NP新兵P58IPK到40年代核糖体亚单位。

一个。重组质粒p58与HEK293T细胞共转染IPK与Myc-NP或Myc-NPΔ151-175缺失突变体一起出现.用抗Myc抗体免疫沉淀细胞裂解液.用抗RPS 19或抗标志标记或抗Myc标记抗体进行免疫印迹分析(IB)，检测细胞裂解液(WCL)或免疫沉淀材料。B.用RPS 19抗体免疫沉淀HEK293T细胞。用抗RPS 19或抗标志标记或抗Myc标记抗体进行免疫印迹分析(IB)，检测细胞裂解液(WCL)或免疫沉淀材料。C.Hela细胞共转染表达mCherry-p58的质粒IPK与Myc-NP或Myc-NPΔ151-175缺失突变体一起出现.共聚焦显微镜观察细胞。利用抗Myc单抗和与AlexaFluor 488结合的二次抗体对野生型NP和NPΔ151-175突变株进行了观察。使用ImageJ对合并面板中的框形缩放区域进行量化，如图3并显示为底部的线状图。红绿两种荧光信号在背景上方同一位置的荧光信号明显增加，表现出强烈的共定位性。D.MCherry-p58共转染HeLa细胞IPK表达质粒和表达野生型NP或NPΔ151-175缺失突变体的空载体或质粒。共聚焦显微镜观察细胞。RPS 19用一种主要的抗RPS 19抗体和一种与AlexaFluor 488结合的次级抗体来显示。使用ImageJ对合并面板中的框形缩放区域进行量化，如图3横向表示为线状图。与第三和第五面板不同，第四面板中的红色和绿色荧光信号显示出共定位现象，这是因为在背景上方同一位置的两种荧光信号的增加都证明了这一点。

Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010007.g005

我们用共聚焦显微镜进一步评价了这一假说。从图5c由于NPΔ151-175缺失突变体位于细胞质上，核仁周围呈点状形态，缺失RPS 19结合结构域而丢失。这表明野生型NP的核周形态可能是通过RPS 19与40年代核糖体亚基的结合所致。虽然P58IPK与野生型np和npΔ151-175两种缺失突变体强共定位的p58亲本细胞质形态。IPK在NP表达细胞中被改变为点状核周形态，类似于野生型NP(图5c)的类似结果。图3。这一观察再次表明np可能会招募p58。IPK到40年代核糖体亚单位。为了验证这一观察，我们检查了mCherry-p58的定位。IPK在表达野生型NP或NP缺失突变体的细胞中，RPS 19与RPS 19融合蛋白，RPS 19是40年代核糖体亚单位的一个结构成分。从图5d樱桃-P58IPK在缺乏np表达的细胞中不与rps 19共定位，表明mCherry-p58IPK它本身并不与核糖体结合。MCherry-P58的共域化IPKRPS 19在np表达细胞中的表达表明np特异性地介导了p58之间的相互作用。IPK和40年代的核糖体亚单位。这一点得到了以下观察的支持，即缺乏与40年代核糖体结合的np缺失突变体未能介导这种相互作用，这显然是因为p58之间缺乏强的共定位。IPKRPS 19在表达NPΔ151-175缺失突变体的细胞中表达。图5d).

确认国家警察招募了P58IPK对于40年代的核糖体亚基，在rps 19的帮助下，我们询问了p58是否。IPKNP表达细胞与40年代核糖体亚单位共纯化。分别在5-40%蔗糖梯度上分离表达np或npΔ151-175突变体或gfp的细胞裂解物，在260 nm(A 260)处记录核糖体沉淀谱。图6a)。通过对40和60年代核糖体亚基RPS 19和RPL 4的鉴定，对RPS 19和RPL 4梯度组分中的40和60核糖体亚基进行了监测。图6B)。PKR主要存在于含有40年代核糖体亚基的梯度组分(图6B)。有趣的是，P58IPK共纯化了40年代核糖体亚基及NP和PKR(图6B、中间面板)。这种共纯化在表达gfp或npΔ151-175突变体的细胞裂解物中没有观察到，该突变体缺乏与rps 19的结合，rps 19是40年代核糖体亚基(图6B，顶部和底部面板)。这个实验清楚地表明NP在rps 19的帮助下招募了p58。IPK到40年代，PKR所在的核糖体亚单位。

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图6.p58IPK在NP存在下与40多个核糖体亚基共分裂。

A。核糖体亚基蔗糖密度梯度分馏。绘制了260 nm处蔗糖密度梯度组分的吸光度值。B。将表达EGFP、NP或NPΔ151-175突变体的质粒转染HEK293T细胞。在蔗糖密度梯度上对细胞裂解物进行分馏，生成核糖体亚基和多体沉淀图，如A组所示，B板显示基于A组图对40和60年代核糖体亚基相关蛋白的westernblot分析，选择的各组分与相同体积的SDS样品缓冲液混合，煮沸后用SDS-PAGE进行处理。输入表示已清除的单元格裂解液。RPS 19、RPL 4、GFP、PKR和P58IPK用其特异性抗体进行检测。用抗Myc标记抗体对NP和NPΔ151-175进行了检测.

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p58IPK敲除诱导细胞翻译关闭和限制安第斯病毒在细胞中的复制

P58辅助对PKR的抑制作用IPK导致假设P58IPK缺乏的细胞会在汉塔夫里病毒感染时激活PKR，并经历翻译关闭以建立抗病毒状态。为了检验这个假设，P58IPK用慢病毒shRNA给药系统对HUVEC细胞进行敲除。由于高MOI区的慢病毒转导可诱导PKR活化，一项仔细的滴定显示，长至3.0的慢病毒转导可降低P58的活性。IPK而不影响eIF 2α的磷酸化图7a)。在6个井板中生长的HUVECs被慢病毒感染，表达置乱或p58。IPK特定的shRNA。转染后24h，细胞被汉坦病毒感染，用代谢标记法监测细胞在感染后不同时间点的蛋白质合成。从图7B和7cP58IPK缺陷细胞诱导宿主翻译关闭病毒感染，在增加感染后的时间点时更有效。细胞裂解物的westernblot分析显示P58IPK敲除触发eIF 2α的磷酸化(图7d)，导致被病毒感染的细胞中宿主翻译机器的关闭。细胞裂解物的实时PCR进一步分析表明P58IPK敲除细胞不能有效地支持病毒复制。我们观察到病毒复制在感染后48和72小时急剧下降(图7e)。共同的结果图7演示汉坦病毒使用P58IPK抑制PKR，防止病毒感染细胞建立抗病毒状态。

图7.P58的击倒IPK诱导细胞翻译关闭，抑制Andes病毒在细胞中的复制。

一个。HUVECs在moi为3的情况下被慢病毒转导，表达针对p58的杂乱shRNA或shRNA。IPK。在不同的时间点采集细胞，用相应的抗体对细胞裂解物进行Westernblot分析。B.如A组所述，用慢病毒转导HUVECs，慢病毒转导后0.5，24h，细胞被Andes病毒感染。细胞被标记为代谢35S-蛋氨酸-半胱氨酸40 min。在采收前的不同时间点后安第斯病毒感染。用SDS-PAGE法分离细胞裂解液，用考马斯兰染色(底部)观察。同样的柯马西染色凝胶被干燥并暴露在X射线胶卷(顶部)中。C.利用Imag-Pro PLUS软件对自显影图的波段强度进行量化，并将其归一化为模拟控制。两个独立实验的结果被用来计算标准偏差，显示为误差条。显着性(*)是由学生计算出来的。t测试一下。D.B组细胞裂解液用免疫印迹法检测。E.用慢病毒转导HUVECs，然后按B板中提到的方式感染Andes病毒。从细胞裂解物中提取总RNA，并按材料和方法部分的实时PCR方法定量检测每个样品中病毒S段RNA的含量。病毒RNA水平的翻倍变化与每组1.0小时的时间点有关。三个独立实验的结果被用来计算标准偏差，显示为误差条。折叠变化的显着性(*)由学生计算。t测试一下。

Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010007.g007

讨论

在病毒感染过程中，通过天然免疫反应激活PKR-eIF 2α通路，其主要目的是通过诱导宿主翻译关闭和建立抗病毒状态来限制病毒在宿主体内的传播。然而，病毒已经进化出许多策略来对抗这种抗病毒反应。我们以前的研究表明，汉坦病毒NP通过抑制PKR的二聚作用而对抗PKR的抗病毒反应，其机制尚不清楚。在这里，我们证明NP激活内源性PKR抑制剂P58。IPK抑制PKR的自磷酸化。

尽管是PKR抑制剂38]，P58IPK主要作用是分子伴侣，在向内质网(ER)施加压力时被转录上调[39,40]。P58IPK与错误折叠的蛋白质结合，并在未折叠蛋白质反应中协助其正确折叠[39,40]。此外，P58IPK抑制ERK，另一种eIF 2α激酶，在ER应激期间调节蛋白质合成[39,40]。人们一直认为P58IPK通过未知机制阻断病毒感染细胞的PKR抗病毒反应，促进流感病毒mRNA的翻译41]。有趣的是，分子伴侣hsp 40与p58形成不活跃的配合物。IPK限制其活动[42]。P58之间的相互作用IPKPKR是由P58的9个排列有序的TPR结构域之一介导的。IPK [43]。另外，P58IPK在其C-末端包含一个J-结构域，这是PKR抑制所必需的体内 [44]。热休克蛋白hsp 70也与p58形成复合物。IPK通过它的C端J-域[23]。类似于其他含有J结构域的蛋白质，P58IPK已被报道能刺激Hsp 70的ATP酶活性[45]。这些观察已经导致假设P58IPK可能使用HSP 70改装PKR并中断其二聚。有趣的是，PKR仍然与细胞中的40多个核糖体亚单位有关。虽然这个战略位置很可能促进pkr在被激活到下游目标eif 2α时容易进入，但p58是如何被激活的尚不清楚。IPK可以进入这个战略位置来中断PKR二聚。此外，缺乏释放P58的分子机制IPK从其负性调节因子来看，Hsp 40在P58抑制PKR的机制中显示出明显的空白。IPK.

有趣的是，NP未能抑制P58的PKR自磷酸化IPK击倒细胞，表明NP需要P58IPK为了活动。进一步的研究表明，NP与P58结合。IPK在p58的N端，结合位点跨越到tpr子域i和ii。IPK。Hsp 40在P58上的结合位点IPK被定位到TRP子域II，清楚地证明NP结合位点与Hsp 40的结合位点重叠。因为NP与P58结合IPK与hsp 40相比，NP具有更高的亲和力，很可能是NP竞争性地抑制了hsp 40与p58的结合。IPK。竞争性抑制释放P58IPK从hsp 40的离合器和由此产生的np-p58IPK复合物通过RPS 19与40年代核糖体亚基相互作用。汉坦病毒进化为P58IPK和NP中的RPS 19结合域，使其成为P58之间的桥梁。IPK和40年代的核糖体亚单位。P58的选择性接触IPK有了40年代的核糖体亚基，在NP的帮助下，P58可以自由进入。IPK敬库尔德工人党。这一点得到了以下观察的支持：缺乏p58的np突变体。IPK或RPS 19结合域不能抑制PKR的自磷酸化。这些研究为np解离p58提供了分子机制。IPK-Hsp 40复合物在病毒感染的细胞中，并招募释放的P58IPK到40年代核糖体亚基对PKR的迅速抑制作用。这种独特的pkr抑制策略在汉坦病毒复制中的意义表现在诱导宿主快速翻译关闭和在p58中建立抗病毒状态。IPK缺乏细胞。

基于这些观察，哺乳动物细胞携带PKR抑制剂P58似乎令人惊讶。IPK通过抑制PKR抗病毒反应，有利于病毒在宿主体内的复制。最近的研究表明P58IPK在宿主的抗病毒防御中也起着重要的作用。体内 [38]。PKR激活NF-κB，积极调节干扰素和炎性细胞因子的诱导[16]。PKR激活引起的剧烈炎症反应可能对宿主致命。P58中PKR的快速激活IPK流感病毒感染过程中的基因敲除小鼠无疑控制了病毒的复制，但PKR激活引起的炎症反应增加，引起严重的肺组织病理改变和细胞凋亡，增加了感染小鼠的死亡率。38]。这些观察表明正常的P58IPK其作用是在控制病毒复制后，使宿主的PKR抗病毒反应平静下来。然而，汉坦病毒利用P58IPK以防止PKR在病毒感染细胞中的激活，以确保持续复制而不中断PKR的抗病毒反应。

病毒编码蛋白含有多功能结构域，由于其基因组较小，使其在病毒感染过程中能够与多种宿主细胞因子相互作用。汉坦病毒NP是汉坦病毒复制周期中具有多种功能的蛋白质之一。NP与RdRp一起参与抢夺帽子[46]，病毒mRNAs的翻译控制[47]，病毒基因组的包封和包装。已提出NP的RNA螺旋展开活性与RdRp在基因组复制中的作用。48]。汉坦病毒NP的PKR抑制作用进一步证明了病毒蛋白的多功能性及其独特结构域与多种宿主细胞因子相互作用的灵活性，通过对抗宿主细胞的多方面抗病毒防御，支持病毒复制。

材料和方法

质粒

从Andes病毒、Sin NAME病毒和Hantan病毒构建了表达Myc标记核衣壳蛋白的质粒pMyc-ANDVNP、pMyc-SNVNP和pMyc-HTNVNP。24]。通过PCR扩增并将相应的序列插入到pcDNA3.1-Myc主干中，构建了NP截短突变体。质粒pMyc-p58IPK和PFLAG-P58IPK是通过插入P58构建的IPK将阅读框(ORF)分别打开至pcDNA3.1-Myc和pcDNA3.1-标志骨架.P58IPK从体外培养的HUVEC细胞中提取RNA样品，从cDNA中扩增ORF。质粒pGST-p58IPK通过插入p58克隆IPKORF转入pGEX-4T-3载体。P58IPK通过PCR扩增并将合适的基因序列插入到pcDNA3.1-Myc主干中，构建了截短突变体。将Hsp 40 ORF分别插入pcDNA3.1-Myc和pcDNA3.1标记的骨干骨中，构建pMyc-Hsp 40和PFLAG-Hsp 40质粒。Hsp 40 ORF也是从HUVEC细胞RNA样品的逆转录产生的cDNA中扩增出来的。表达Myc标记的SUFU蛋白的质粒pcDNA3.1myc His SU(Fu)(Addgene质粒#13855)是Cliff Tabin[49]。用Genscript构建了pET-Hsp 40质粒。质粒pLKO.1-扰码shRNA是David Sabatini(Addgene质粒#1864)的礼物[50]。PLKO.1-P58IPKShRNA是通过将发夹序列插入到david root的礼物pLKO1.-trc克隆载体(Addgene#10878)中构建的。51]。已知P58基因的shRNA靶序列IPK分别为：5‘-CAG、TCG、CAG、AAA、CGA、GAT-3’和5‘-gag CCA、AGC、ATT、GCT、GAA、TAT-3’。

细胞培养与病毒

人胚肾293 T(HEK293T)和HeLa细胞在37°C加湿空气中加入10%热灭活胎牛血清(Invitrogen)、2mm谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素在37°C条件下培养。取人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，在Lonza的EGM BulletKit培养基(CC-3124)中培养。以前曾描述过安第斯病毒(智利-9717869株)在细胞培养中的繁殖。24]。HEK293T稳定的细胞系是由慢病毒感染和普罗霉素选择(3μg/ml)产生的，正如以前报道的那样.24]

Westernblot和抗体

细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗一次，用放射免疫沉淀试验缓冲液(RIPA缓冲液)加蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(Roche)溶解。将澄清后的细胞提取物与同等体积的2×SDS负载缓冲液混合，在95℃下煮5 min。用SDS-PAGE法分离蛋白质，并将其转移到PVDF膜上.在PBST缓冲液(1倍PBS，0.05%吐温20)中用5%脱脂乳阻断膜，然后与阻断缓冲液中稀释的第一抗体和第二抗体共同孵育。用ECL(增强化学发光)显影，并在X光片上曝光.PKR(12297S)、eIF 2α(5324S)、磷酸化eIF 2α(Ser51)(9721 S)和P58的原代抗体IPK(2940 S)来自细胞信号技术。磷酸化PKR的主要抗体来源于ABCAM。标记标记(F 1804)、β-actin(A 5441)和GFP(G 1546)的主要抗体来源于Sigma。抗c-Myc标记RPS 19(sc-100836)的主要抗体来源于圣克鲁斯.Hsp 40(ADI-SPA-400)的第一抗体来源于Enzo生命科学(Enzo Life Science)。RPL 4(11302-1-AP)的一次抗体来源于蛋白质.本实验制备了抗ANDV和SNVNP的多克隆抗体。CCHFVNP(Ab190657)抗体来源于ABCAM。

免疫荧光染色

用mCherry-p58共转染HeLa细胞。IPK与Myc-NP或Myc-NP突变体一起使用TurboFect转染试剂作用36h。细胞用PBS洗涤一次，室温下用4%多聚甲醛固定15 min。过量多聚甲醛在PBS中用0.1M甘氨酸中和，然后用PBS进行广泛洗涤。固定细胞在PBS中用0.5%TritonX-100渗透5 min，室温下用3%BSA封闭2h。细胞与抗Myc抗体和Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(生命技术)连续孵育。在含有DAPI(载体实验室)的安装介质中安装COVERLIP。共焦图像用Nikon DigitalEclipseC1显微镜记录。

免疫共沉淀

共免疫沉淀如先前所述[24]。简单地说，HEK293T细胞与所需的质粒共转染。NP-40裂解缓冲液(50 mm Tris-HCl pH7.5,150 mm NaCl，0.5%NP-40，10%甘油，1mM EDTA)加蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(Roche)。10%的澄清细胞裂解物被保存作为输入。其余的细胞裂解液与1μg必需抗体在4°C温和旋转下孵育4h。抗原抗体复合物用40μ1的蛋白G琼脂糖珠(50%浆料)在4℃连续旋转1h，用裂解缓冲液洗涤4次，再悬浮于1×SDS负载缓冲液中，在95°C下煮5 min。离心后，将上清液装入SDS PAGE凝胶中。HUVEC细胞裂解物的共沉淀同样进行，但细胞在MOI为1时感染Andes病毒或Hazara病毒，感染48h后细胞溶解。-医学论文发表范文

蔗糖密度梯度分馏

用蔗糖密度梯度法分离核糖体亚基和多聚体。将HEK293T细胞接种10 cm培养皿，转染EGFP、NP或NPΔ151-175突变体。转染48小时后，用100μg/ml浓度的环己酮处理细胞5 min。用含100μg/ml环己酰亚胺的冰冷pBS清洗细胞两次。用含100μg/ml环己酮的冰冷pBS 5ml刮除细胞，5 0 0xG离心5 min。细胞颗粒在低渗缓冲液(5 mm Tris-HCl，pH7.5，2.5mm MgCl)的500μl中重新悬浮。21.5 mM KCl，加入1倍蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)，1 0 0μg/ml环己酰亚胺，2 mm DTT，1 0 0单位RNA酶抑制剂，再加入Triton X-100和去氧胆酸钠，在4°C下溶化核糖体20 min。细胞裂解液在16 0 0×g，4°C下离心15 min，上清液用37000 rpm离心，4°C离心3.5小时。利用生物分离器采集了300μ1蔗糖梯度的馏分，测量了2 6 0nm处的光密度。

蛋白质的纯化与GST的提取

GST和GST-P58IPK蛋白在BL 21(DE3)pLysS细菌细胞(Novagen)中表达。在37°C条件下，在500 ml培养条件下，对细菌进行剧烈摇动培养，直至光密度达到600 nm(OD 600)时达到0.6。在终浓度为1mm的培养基中加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。培养基在25℃下摇动5小时。在水解缓冲液(1×PBS，1mm DTT，1mm EDTA，1%TritonX-100，蛋白酶抑制剂鸡尾酒)中悬浮培养细菌颗粒。澄清后的细胞裂解物被负载在谷胱甘肽HICAP基质(Chiagen)上，然后按照制造商的指示用还原型谷胱甘肽洗涤和洗脱结合蛋白。洗脱蛋白以1×pbs，1mmDTT为透析液，浓缩保存于-80°C，进行gst-下拉试验，20μg gst或gst-p58。IPK用50μl谷胱甘肽HICAP基质(50%浆料)在5 0 0μl GST拉紧结合洗涤缓冲液(5 0mm Tris·HCl，pH8.0，2 0 0mm NaCl，1 mm EDTA，0.5%NONIDT P-40，1 mm DTT+1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒)4°C条件下孵育2h，将谷胱甘肽HICAP基质洗净并保存为诱饵。另一方面，表达我们感兴趣的蛋白质的HEK293T细胞用GST下拉结合和洗涤缓冲液进行裂解。将HEK293T细胞裂解液在4°C下澄清，与鱼饵混合1h，用洗涤缓冲液洗涤4次，再悬浮于1×SDS负载缓冲液中，在95°C下煮5 min。离心后，将上清液装入SDS PAGE凝胶中。

35S代谢标记

在6孔板中培养的细胞，用饥饿培养基(缺乏蛋氨酸和半胱氨酸的DMEM)冲洗两次，在同一培养基中培养30 min，消耗细胞内的蛋氨酸和半胱氨酸。细胞用含300μci的1毫升饥饿培养基孵育40分钟。35S-蛋氨酸和半胱氨酸(PerkinElmer)。用PBS洗涤细胞，再用100μl的RIPA缓冲液溶解细胞。细胞裂解液与2×SDS负载缓冲液混合，在95℃下煮5 min，用10%SDS-PAGE凝胶分离。凝胶用考马斯亮蓝染料染色，滤纸干燥，晚上-80°C暴露在X光胶片下。

实时PCR

用RNeaseKit(Chiagen)纯化细胞总RNA，M-MLV逆转录酶(外显子)根据制造商的指示进行反向转录。在ABI 7500实时PCR系统(应用生物系统)上，采用SYBR绿色PCR主混合物(ROCHE)进行实时PCR反应。每一反应分三次进行。将管家基因β-actin的mRNA水平作为内部对照进行定量分析.按照以前的报告，使用相对量化方法进行数据分析。24]。用于定量检测β-actin mRNA和ANDV-S段RNA的引物已在我们以前的出版物[24].

生物层干涉法

利用blitz系统(ForteBio Inc.)，利用生物层干涉技术(Bli)，对其标记的NP和Hsp 40与GST-P58IPK融合蛋白和GST标记的结合亲缘关系进行了检测。28,52,53]。简单地说，表达和纯化了他的标记NP和HSP 40的细菌被装入NiNTA生物传感器(Forte Bio Inc.)，正如以前报道的那样[28,52,53]。所有反应均在室温下在1倍PBS中进行。安装His标记蛋白后，生物传感器在1xPBS中进行平衡，然后在不同浓度的GST-P58IPK或GST纯化的蛋白质溶液中浸泡，以测定缔合动力学。反应周期如下：初始基线50秒钟，在Ninta生物传感器上加载他的标记蛋白420秒，基线50秒，gst-p58的结合。IPK在NiNTA生物传感器上负载其标记蛋白42 0 s，解离期为600 s。动力学参数K驴(联合速率常数)，KDIS(解离速率常数)与结合亲和力(Kd=K)DIS/K驴)是在内置数据分析软件(Blitz Pro)的帮助下计算的，如以前所报告的[28,52,53].

蔗糖密度梯度离心

用蔗糖梯度法检测了野生型NP及其缺失突变体的寡聚型。将含C端His标记的40微升纯化蛋白(110μM)在1xPBS中加入5%~50%蔗糖的线性梯度中，在4°C的S120AT3-0098转子上以90,000 rpm离心6小时，用SorvallDiscoveryM120SE分析超速离心。收集30μ1梯度组分。对蛋白质分子质量标记牛血清白蛋白(BSA；82 kDa)、乙醇脱氢酶(ADH)(150 KDa)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)(27 KDa)进行了同样的分级。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析各组分.利用抗His标记单抗对野生型NP及其缺失突变体进行westernblot分析。GST、BSA和ADH的洗脱谱图4G)测定NP及其缺失突变体的寡聚状态。

参考文献

00001. 1.题名/责任者：[by]Vavheri A，Strandin T，Hepojoki J，Sironen T，Henttonen H，Makela S，等。揭开汉坦病毒感染的神秘面纱。自然回顾微生物学。2013年；第11(8)段：539-50。PMID：24020072。

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