《来自水稻条纹病毒的siRNA靶基因eIF4A通过与ATG 5相互作用,负调控抗病毒自噬作用。[医]底氏烟草HSV 1在人角质形成细胞中的细胞间传递-沈阳医学论文发表》期刊简介
来自水稻条纹病毒的siRNA靶基因eIF4A通过与ATG 5相互作用,负调控抗病毒自噬作用。[医]底氏烟草HSV 1在人角质形成细胞中的细胞间传递-沈阳医学论文发表
· 张祥祥,
· 尹月燕,
· 苏云和,
· 赵兴佳,
· 梁良江,
· 吕玉文
· 郑红英,
· 彭洁军
· 饶绍飞,
· 吴冠伟,
· 陈建平,
· 飞燕
· 发布日期:2021年9月29日
摘要
自噬是由病毒感染引起的,在植物中具有抗病毒作用,但其机制尚不清楚。我们先前鉴定了一种从水稻条纹病毒(RSV)RNA 4中提取的病毒小干扰RNA(VsiRNA),该RNA通过靶向宿主真核翻译起始因子4A(EIF4A)mRNA来抑制水稻条纹病毒引起的叶片扭曲和发育障碍。此外,自噬通过降解RNA沉默抑制因子RSV p3蛋白而发挥抗病毒作用。在这里,我们证明eIF4A在[医]底氏烟草。铌的沉默EIF4A激活自噬,抑制RSV感染,促进p3的自噬性降解。进一步分析表明,铌EIF4A与铌ATG 5并干扰其与ATG 12的相互作用。过度表达铌EIF4A抑制铌ATG 5-激活的自噬。此外,针对NB的vsiRNA-4A的表达EIF4ANb沉默诱导的自噬自噬mRNA的研究EIF4A。最后,我们还演示了RSV的天然宿主水稻的eIF4A也与OSATG 5和抑制OSATG 5-激活的自噬,指出eIF4A作为抗病毒自噬的负调节因子的保守功能。综上所述,这些结果表明eIF4A通过与ATG 5相互作用而负调控抗病毒自噬,其mRNA被病毒源siRNA所识别,从而导致其沉默,从而诱导抗病毒感染的自噬作用。
作者摘要
自噬是由病毒感染引起的,在植物中具有抗病毒作用,但其机制尚不清楚。在这里,我们证明eIF4A是自噬的负调节因子。N. 底栖动物水稻通过抑制ATG 5的功能发挥作用,ATG 5是自噬的关键成分。我们以前报道过NbeIF4A转录本被水稻条纹病毒(RSV)来源的siRNA切割,这种自噬作用是通过降解RNA沉默抑制因子RSV p3蛋白而发挥抗病毒作用的。同时,我们的发现揭示了一种新的机制,在这种机制中,抗病毒自噬的负调节因子识别病毒来源的siRNA,并牺牲自身来诱导自噬,从而抑制病毒感染。
引用:张欣,尹英,苏勇,贾Z,姜丽,陆宇,等。(2021)eIF4A是水稻条纹病毒siRNA的靶标,通过与ATG 5相互作用而负调控抗病毒自噬作用。[医]底氏烟草。PLOS病理图17(9):e1009963。Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963
编者:Savithramma P.Dinesh-Kumar,加利福尼亚大学戴维斯基因组中心,美国
收到:2021年7月7日;接受:2021年9月21日;出版:(2021年9月29日)
版权:2021岁,Zhang等人。这是一篇以CreativeCommonsAttribution许可证,允许在任何介质中不受限制地使用、分发和复制,只要原始作者和源被记入帐户。
数据可得性:所有相关资料都在手稿中辅助信息档案。
供资:这项工作由国家自然科学基金授予F.Y.(31772239)和S.R.(31901849)、国家转基因科技项目授予F.Y.(2016ZX08001-002)、宁波自然科学基金授予S.R.(2019A610408)、宁波大学K.C.Wong Magna基金授予F.Y.,资助方在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
相互竞争的利益:提交人宣布,不存在任何相互竞争的利益。
导言
真核起始因子4A(EIF4A)是死盒rna解旋酶蛋白家族中的一员,被认为是利用ATP水解产生的能量来解构mRNA结构,并与其他组分一起为翻译启动过程中核糖体的合成制备mRNA模板[1]。这个拟南芥基因组编码两种eIF4A亚型,其中一种(eIF4A-1)是细胞周期进程与细胞大小协调所必需的[2]. Eif4a1突变体生长缓慢,侧根形成减少,开花延迟,胚珠发育异常。2]。T-DNA突变EIF4A相形见绌[医]远核以剂量依赖的方式[3]。因此,eIF4A对于植物的生长和发育是必不可少的[2,3]。我们之前确定EIF4A从…N. 底栖动物(NB)EIF4A)由水稻条纹病毒(RSV)基因组RNA 4片段经mRNA切割产生的病毒小干扰RNA(vsiRNA-4A)。4]。铌的沉默EIF4A引起植物矮化,这与B. 远子[3,4]。然而,eIF4A在植物-病毒相互作用中的作用尚不清楚。
自噬是一种进化上保守的机制,它利用双膜水泡自噬体包裹和传递细胞质物质,用于液泡或溶酶体的降解和再循环。5]。自噬相关基因(ATGS)编码这一过程中的关键因素。在植物中,自噬在发育、繁殖、新陈代谢、衰老以及对非生物和生物胁迫的耐受性等方面起着至关重要的作用。6,7]。自噬是对病毒感染的反应;越来越多的证据表明,自噬参与植物-病毒相互作用期间的抗病毒反应[7–10]。例如,在对烟草花叶病毒(TMV)的抗性反应中,自噬被诱导,而缺乏ATG活性的植物则表现出增强的病毒积累[11].
最近发现有几种病毒蛋白被自噬作为降解的靶点,从而限制了病毒的感染。例如,乳腺癌的自噬受体近邻(NBR 1)针对花椰菜花叶病毒的衣壳蛋白(CP)。s(CaMV)和芜菁花叶病毒(TuMV)辅助组分蛋白酶(TuMV)对病毒的自噬性降解和抑制病毒的积累[12,13]。Tumv蛋白nib是Beclin 1(也称为ATG 6)的靶点,它是介导nib降解的核心自噬成分[14]。棉花卷曲马尔坦病毒(CLCuMuV)毒力因子βC1与ATG8的关键自噬蛋白ATG8相互作用,并被自噬机制降解[15]。我们曾证明,来自水稻条纹病毒(RSV)的RNA沉默病毒(Vsr)的病毒抑制剂p3与nbp3ip相互作用。[医]底氏烟草,并被送到自噬小泡中降解[16]。此外,黄瓜花叶病毒(Cmv)蛋白2b被认为是通过钙调素样蛋白rgs-CaM[自噬]被靶向降解的。17].
虽然自噬的抗病毒功能已在植物中得到很好的证实,但病毒感染是如何诱导自噬的尚不清楚。13–15,18]。司马义力等人最近报道了CLCuMuVβC1蛋白与负自噬调节因子甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPC)相互作用,诱导植物自噬[19,20]。我们先前发现RNA 4是一种来自RSV的小干扰RNA,它靶向并沉默了编码eIF4A的宿主mRNA,从而导致了rsv感染期间观察到的扭叶和发育障碍症状。4]。在这里,我们发现eIF4A作为抗病毒自噬的负调节因子。N. 底栖动物因此,定义了一种机制,在这种机制中,抗病毒自噬的负调控者识别出病毒来源的siRNA,并牺牲自身来诱导抗病毒感染的自噬。
结果
铌的沉默EIF4A抑制呼吸道合胞病毒感染[医]底氏烟草
我们之前确定EIF4A从…N. 底栖动物由RSV基因组RNA4片段产生的病毒小干扰RNA(vsiRNA-4A)以mRNA切割为靶点。4]。在这里,我们测试了EIF4A对RSV感染有任何影响。我们沉默了N. [医]eIF4A底栖动物(NB)EIF4A)在植物中烟株病毒基于TRV的病毒诱导基因沉默(VIGS)系统EIF4A转化到VIGS载体TRV的RNA 2中,生成TRV:4A结构。我们在TRV:4A感染植物和对照植物中监测与RSV感染相关的症状的进展.在侵染后15d,仅受TRV:4A感染的植株表现为扭叶,而感染空VIGS载体的植株则无明显的形态学变化(P>0.05)。图1A)。RT-qPCR分析显示NB减少。EIF4A与TRV:00对照相比,TRV:4A感染植物的转录水平约为60%(图1B)。这些结果与上一份报告一致[4].
图1.铌的沉默EIF4A预防呼吸道合胞病毒感染N. 底栖动物.
(A)NB的扭叶表型EIF4A-沉默N. 底栖动物植物通过TRV诱导的基因沉默在15 dpi。底盘:一片叶子的近景.(B)铌的RT-qPCR分析EIF4ATRV:00和TRV:4A感染的转录水平N. 底栖动物植物。NbActin作为内部控制。条形图表示来自三个单独实验的标准错误。(C)对照植物RSV感染的强典型症状(TRV:00)和硝基苯的轻度症状EIF4A-沉默植物(TRV:4A)20 dpi与RSV。底盘:一片叶子的近景.(D)NB的RSV感染率EIF4A-沉默的植物。条形图表示来自三个单独实验的标准错误。每个实验使用20株植物。(E)RSV CP在对照和对照中积累的免疫印迹分析NbeIF4A-沉默的植物。采用抗RSV CP抗体。星号显示学生的显著差异t-对照试验(**,p<0.01). Band intensity was analyzed by ImageJ.
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.g001
接下来,我们接种了NBEIF4A-用RSV沉默(TRV:4A-感染)或对照(TRV:00-感染)植物。在20 dpi伴有RSV时,所有TRV:00对照植物均出现典型的RSV症状,如矮小和黄斑扭曲等。图1c和1d)。相比之下,只有20%的RSV接种了NB。EIF4A-沉默的植物在叶片中出现黄化和嵌合体,比对照(无花果)更不明显(无花果)。1C, 1D和沙一)。RT-PCR证实了呼吸道合胞病毒(RSV)的系统性感染(图S2)。在NB中,RSV的毒力和全身感染均降低了。EIF4A-沉默植物与对照植物。免疫印迹分析显示RSVCP在RSV感染的NB中的聚集率较低。EIF4A-相对于TRV:00对照植物而言,沉默植物。这些结果表明Nb的沉默EIF4A抑制RSV感染N. 底栖动物植物(无花果)1E和S2).HSV 1在人角质形成细胞中的细胞间传递-沈阳医学论文发表
铌的沉默EIF4A激活自噬
在我们最近的报告中,自噬在植物防御RSV感染中起着关键的作用。16]。确定自噬途径是否有助于预防NB的RSV感染EIF4A-沉默的植物,我们研究了NB上自噬基因的表达。EIF4A沉默。结果表明,基因在自噬中起作用,例如NB。ATG 2NbATG 3NbATG 5NbATG 6NbATG 7,和磷酸肌醇3激酶(NB)P13K),在NB中显著上调。EIF4A-静音植物(S3图),表明自噬在这些植物中可能被激活。
为了直接检验这个假设,我们标记了N. 底栖动物ATG8f在其N端(cfp-)含有青色荧光蛋白(Cfp)铌(ATG8f)监测NB的自噬活性EIF4A-先前所述的沉默细胞[20]。我们观察到在感染空载体TRV:00的植物中有一个扩散的荧光信号,而NB的沉默。EIF4A导致更多的荧光灶,提示NB有活化的自噬作用。EIF4A-沉默细胞(图2A和2B)。我们用在酸性自噬液泡中积累的染色单樟脑碱(MDC)独立验证了这些结果。图2C和2D)。最后,我们观察到NB的多个自噬结构。EIF4A-透射电子显微镜(TEM)沉默细胞,而TRV:00对照工厂的细胞则少得多(图2e和2f)。这些结果支持了我们的假设,即自噬在NB中被激活。EIF4A-沉默的细胞。
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图2.铌的沉默EIF4A激活自噬。
(a,B)具有代表性的动态自噬活动共焦图像,如特异性自噬标记物CFP-NbATG8f所揭示的那样(A)或MDC染色(B)控制(TRV:00),NBEIF4A-沉默(TRV:4A)植物和NBATG 3和NBEIF4A(TRV:4A+ATG 3)共沉默植物。CFP-NbATG8f标记的自噬体和自噬体(A)或MDC染色(B)叶肉细胞以白色箭头表示。青色:CFP-铌ATG8f标记的点状自噬体和自噬体;绿色:MDC标记的点状自噬体和自噬体;红色:叶绿素自荧光。TRV:4A感染细胞中观察到大量的自噬体和自噬体,而TRV:00或TRV:4A+ATG 3感染细胞中的自噬小体和自噬体较少。酒吧,10μm。(c、D)相对自噬活性在沉默的细胞,归一化为控制TRV:00-感染的细胞,这是设置为1.0。CFP-ATG8f标记物的定量研究(C)或MDC染色(D)每个细胞的自噬灶是通过计数自噬体作为自噬活动的代表来实现的。每次处理超过150个细胞进行定量。条形图表示来自三个单独实验的标准错误。星号显示学生的显著差异t-对照试验(**,p<0.01). (E)TRV:00-和TRV:4A-接种后的TEM分析N. 底栖动物细胞。白色箭头表示自噬体。(F)NB的相对自噬活性EIF4A-透射电镜分析显示,与TRV:00对照植物标准化的沉默植物为1.0。约有20个细胞被用于量化自噬结构在每一个治疗。实验重复三次。星号显示学生的显著差异t-与模拟接种相比的测试(**,p<0.01).
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.g002
排除Nb沉默的可能性EIF4A我们研究了NB的沉默是否影响了细胞的一般翻译。EIF4A。为此,我们开发了一种表达NB发夹RNA的RNAi结构。EIF4A(4A-发夹)沉默NBEIF4A。作为阴性对照,我们构建了表达β-葡萄糖醛酸酶(GUS-发夹)发夹RNA的结构。作为阳性对照,我们使用一种表达NB发夹RNA的结构。EIF6A(6A-发夹),在蛋白翻译中起关键作用[21]。通过农杆菌介导的渗透,构建了35S驱动的绿色荧光蛋白(GFP),将这三种构建物分别渗透到一株植株的单叶中。在3 dpi处,在表达6A-发夹的区域,NB的表达EIF6A在静默状态下,GFP的积累水平低于表达GUS-发夹或4A-发夹的区域。相反,Gus-发夹区和4A-发夹区的gfp积累量无显著差异(P>0.05)。S4图)。这些结果表明,NB的沉默对蛋白质翻译没有显著影响。EIF4A,表明在NB中激活的自噬EIF4A-沉默细胞并不是由于蛋白翻译受到抑制。同时,结果也不能排除NbeIF4A在RSV翻译中的作用。
进一步表征Nb中自噬的激活EIF4A-沉默的植物,我们也沉默了NBATG 3,它编码自噬的一个关键组成部分。使用CFP-铌ATG8f作为一名自噬活性的报告者,我们建立了植物共同沉默的两种NB。EIF4A和NBATG 3累积较少的荧光灶(代表CFP-铌ATG8f-阳性自噬体)与NB比较EIF4A-沉默的植物,支持我们的假设:Nb的沉默EIF4A激活自噬2A, 2B和S5).
NIB是TuMV的一种依赖RNA的病毒RNA聚合酶(RdRp),它与Beclin(ATG 6)相互作用,并通过自噬降解。14]。我们认为如果沉默的话NbeIF4A诱导的自噬、沉默植株应比对照更能抵抗TuMV的侵染。为了检验这一假设,我们接种了NB。EIF4A-农杆菌用TuMV控制植物和TRV:00对照植物根癌农杆菌)介导的浸润和监测感染的进展与绿色荧光蛋白报告。3 dpi,NBEIF4A-与对照植物相比,沉默的植物在局部渗透的叶子上积累的荧光灶较少(S6A图).
与这一观察相一致的是,TuMV在当地沉默的叶片中积累的水平低于对照,从gfp标记的tumv中提取的绿色荧光蛋白(Gfp)信号就证明了这一点。22] (S6B图)。在6 dpi时,GFP荧光已扩散到对照植物的新生叶片,表明TuMV(S6A图)。与之形成对比的是,在Nb的新叶中,GFP荧光很弱。EIF4A-沉默的植物,表明TuMV的传播有限。实际上,从NB的新叶中发现了TuMV。EIF4A-相对于TRV:00对照植物,沉默植物的累积水平要低得多(S6B图)。我们还评估了nib的退化程度。NbeIF4A-沉默的植物。我们在NB中瞬时表达带有gfp标记的nib。EIF4A-农杆菌介导的入渗沉默或对照叶。在3 dpi时,Nb中nib-gfp的积累显著减少。EIF4A-相对于TRV:00对照植物而言的沉默叶(S6C图)。这些结果进一步支持了Nb沉默的假设。EIF4A激活自噬。
抑制呼吸道合胞病毒感染NbeIF4A-沉默的植物需要活化的自噬
我们最近报道了自噬通过降解RSV p3蛋白来对抗RSV感染。自Nb沉默以来EIF4A活化自噬,我们认为在NB中,p3的自噬性降解应得到增强,而抑制RNA沉默的p3的活性则应减弱。EIF4A-沉默的细胞,这将解释RSV有限的传播在这些植物。为了验证我们的假设,我们将np4A发夹和gus发夹分别表达在N. 底栖动物植物(16C)通过农杆菌介导的渗透。一天后,p3和GFP在同一片叶子中表达。在p3和gfp表达的3 dpi区,表达4A-发夹的区域的绿色荧光比表达gus-发夹的区域弱。图3A)。分别用抗p3抗体和抗gfp抗体免疫印迹法测定p3和gfp的积累。P3和gfp在4A-发夹区的累积量均低于Gus-发夹区(图3B)。在对照试验中,当gfp仅在4A-发夹或Gus-发夹区表达时,gfp的积累不受4A-发夹的影响。图3C)。这些结果表明,在NB中,p3的自噬性降解增强,RNA沉默的抑制活性减弱。EIF4A-沉默的植物。这些发现支持了这样的观点,即在NB中抑制RSV感染。EIF4A-沉默的植物是由活化的自噬引起的。
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图3.NB对RSV感染的抑制作用EIF4A-沉默的植物需要活化的自噬。
(A)表达NB发夹RNA的RNAi结构EIF4A分别在16C植物的一片叶片中瞬时表达β-葡萄糖醛酸酶(GUS-发夹)的发夹RNA(4A-发夹)和发夹RNA(GUS-发夹),共表达1d。P3和(或)GFP的表达持续3天。在紫外下检测到绿色荧光。(B)抗p3或抗GFP抗体检测蛋白表达的免疫印迹分析。以Rubisco大亚基作为加载控制。(C)用抗GFP抗体进行对照实验中GFP的免疫印迹分析。(D)共沉默植物(TRV:4A+ATG 3和TRV:4A+ATG 5)、对照植物(TRV:00)和NB的RSV症状的发生EIF4A-沉默植物(TRV:4A)。(E)RSV在不同植物中的感染率。误差条表示来自三个单独实验的标准错误。每个实验使用20株植物。(F)用抗CP抗体对受侵染植物RSV CP积累水平的免疫印迹分析。用ImageJ分析波段强度。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.g003
为了进一步验证我们的假设,我们沉默了关键的自噬基因NB。ATG 3或NBATG 5,和NB一起EIF4A,并监测这些植物的RSV感染情况。铌ATG 3-或NBATG 5-沉默N. 底栖动物植物在表型上没有明显的变化,但在RSV感染时表现出严重的症状。S7A-S7D图),与对照植物相比,病毒通过系统感染传播得更快(S7E图)。与感染严重程度一致,在NB中RSV CP积累到较高水平。ATG 3或NBATG 5-20 dpi的沉默植物与TRV:00对照植物相比(S7F图)。这些结果与以往观察到的自噬降解病毒蛋白与病毒感染程度有关[16]。当NbEIF4A是和NB一起沉默的ATG 3或NBATG 5,典型的RSV症状出现在所有植物20 dpi,而只有大约20%的NB。EIF4A-沉默的植物有轻微的呼吸道合胞病毒症状(图5)。三维空间, 3E和S8)。根据rsv cp的积累,我们确定在共沉默植物中rsv感染比在NB中更明显。EIF4A-沉默植物,强调联合沉默植物对病毒感染的抗药性受损(图1)。3F和S8)。这些结果表明,编码关键自噬成分的基因共沉默不利于抑制NB的RSV感染。EIF4A-沉默的植物,进一步证实了抑制NB中RSV感染的概念EIF4A-沉默的植物依赖于诱导的自噬反应。然而,我们也注意到Nb的沉默ATG 3不足以抵消NB的影响EIF4A沉默对RSV积累的影响,提示NBEIF4A在RSV感染期间可能还有另一种功能。HSV 1在人角质形成细胞中的细胞间传递-沈阳医学论文发表
铌EIF4A与铌ATG 5
接下来,我们探讨了铌EIF4A与自噬通路的其他成分相交。为此,我们测试了铌EIF4A和ATG 3、ATG 5、ATG 6、ATG 7和ATG8在酵母菌-双杂交(Y2H)和双分子荧光互补(BIFC)分析中在病毒与自噬之间的相互作用中发挥作用。只铌ATG 5与铌EIF4A(图4)4A, 4B, S9A和S9B)。我们用共免疫共沉淀(co-ip)和萤火虫荧光素酶互补成像(Lci)检测证实了这种相互作用。图4c和4d).
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图4. 铌EIF4A与铌第五组。
(A) 铌ATG 5和铌用BIFC法检测表达nYFP-4A细胞的eIF4A相互作用(铌(EIF4A)和cYFP-ATG 5(铌在共聚焦显微镜下表达nYFP-GUS和cYFP-ATG 5或cYFP-ATG 5和cYFP-GUS的对照细胞。酒吧,20μm.(B)铌EIF4A与NBATG 5在Y2H中相互作用。PBT3-4A(铌(EIF4A),pPR3-ATG5(铌ATG 5)、pPR3-N、阳性对照或阴性对照构建物共转化酵母细胞。将样品镀入无色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)的选择性培养基上,加入10 mm3-AT。(C)交互作用的协IP分析铌ATG 5和铌EIF4A.在60 HPI条件下,提取含有不同结构的农杆菌细胞悬液浸润的叶片组织。用抗GFP微球免疫沉淀总蛋白。用抗GFP和抗myc标记抗体进行免疫印迹分析,对输入和免疫沉淀蛋白(IP)进行分析。(D)间相互作用的LCI分析铌ATG 5和铌EIF4AN. 底栖动物。在表达nLUC-4A和cLUC-4A的浸润区进行了发光测量。铌ATG 5,nLUC-4A和cLUC,cLUC-铌ATG 5,或nLUC.(E)间潜在相互作用的BIFC分析铌ATG 5和铌EIF4A突变体的示意图铌左边显示eIF4A突变体。酒吧,20μm。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.g004
中的域映射为铌EIF4A负责与铌ATG 5,我们生成了一系列截断的铌根据蛋白中保守结构域的EIF4A突变体:4A(Δ40-68)、4A(71-241)、4A(252-413)、4A(71-187)、4A(195-241)和4A(Δ187-195)(图4e)。在BIFC分析中,铌ATG 5与截断铌EIF4A蛋白4A(Δ40-68)、4A(71-187)、4A(71-241)、4A(Δ187-195)、4A(195-241),但与4A(252-413)无关。铌(EIF4A)与铌ATG 5(图4f).
过度表达铌EIF4A抑制铌ATG 5-激活的自噬
基于NB的发现EIF4A沉默激活的自噬铌EIF4A与铌5,我们假设铌EIF4A可能会抑制铌ATG 5,从而抑制自噬。因此,我们研究了铌EIF4A在细胞自噬过程中对ATG 5功能的过度表达。用红色荧光蛋白(Rfp)标记NbATG 5,并共同表达。铌ATG 5-RFP与CFP-铌ATG8fN. 底栖动物农杆菌介导的叶片渗透。在2.5dpi时,与仅表达对照蛋白rfp的细胞相比,共表达这两种蛋白的细胞自噬小体数量显著增加,这与自噬的激活是一致的。5A, 5B和S10).
图5.NbeIF4A的表达抑制NBATG 5激活的自噬。
(A)自噬标记物cfp-显示的具有代表性的自噬活动共焦图像铌ATG8f或MDC染色。Rfp或atg 5-rfp与4A-myc、4A(71-241)-myc、4A(252-413)-myc和空载体(Vec)共同表达。N. 底栖动物农杆菌介导的叶片渗透。青色:CFP-ATG8f信号;绿色:MDC染色结构;红色:叶绿素自荧光。20μm.放大区域用白色虚线框表示.(B)相对自噬活性,与表达RFP的细胞和空载体的相对自噬活性一致,设为1.0。用计数自噬体的方法对CFP-ATG8f标记的或MDC染色的细胞自噬灶进行定量,计算自噬活性。每次处理超过150个细胞进行定量。误差条表示来自三个单独实验的标准错误。星号显示学生的显著差异t-与表达rfp和vec的对照细胞进行比较(**,p<0.01). (C)本实验检测的蛋白质积累的免疫印迹分析。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.g005
接下来,我们单独地共同表达了myc标记。铌EIF4A及其突变体4A(71-241),保留了与铌ATG 5;或其突变体4A(252-413),不能再与铌ATG 5,与铌ATG5-RFP和CFP-铌ATG8f.细胞共表达myc标记铌EIF4A或4A(71-241)和铌ATG5-RFP产生的自噬小体少于表达的细胞铌ATG5-仅限RFP。然而,在共表达myc标记4A(252-413)和铌ATG 5-rfp与表达ATG 5-rfp的细胞相似。铌ATG5-RFP单独(图5)5A, 5B和S10)。MDC染色产生类似的结果(图5c和5d)。这些结果表明,铌EIF4A抑制了铌ATG 5启动自噬。而且,这种抑制依赖于铌EIF4A铌第五组。
我们还研究了铌EIF4A对甲基紫精(MV)诱导的自噬作用,引起严重的氧化应激并诱导自噬[23,24]。MV处理的细胞与未处理的细胞相比,自噬小体的数量急剧增加(S11图)。相比之下,mv处理不能诱导细胞自噬小体的形成。铌EIF4A(S11图),建议铌EIF4A也抑制MV激活的自噬。
在自噬过程中,ATG 5与ATG 12相互作用,形成ATG 12-ATG 5结合。我们想知道铌EIF4A会干扰这种相互作用,从而抑制自噬。为了检验这种可能性,我们研究了表达的效果。铌EIF4A通过BIFC检测ATG 5与ATG 12的相互作用。铌ATG 5与铌BIFC分析中的ATG 12(S12A图)。此外,当铌在bifc检测中,eIF4A-myc与这些蛋白共同表达,荧光信号明显减少,说明相互作用受损。铌ATG 5和铌ATG 12(S12A图)。始终如一地,在co-ip分析中,当铌表达了eIF4A,铌ATG 5是免疫沉淀的,但很难免疫沉淀。铌ATG 12在本分析中(S12B图),表示表示铌EIF4A干扰铌ATG 5和铌ATG 12
综合来看,这些结果表明过度表达铌ATG 5激活自噬和表达铌EIF4A通过与铌ATG 12用于与铌第五组。
靶向NB的vsiRNA-4A的表达EIF4A切割诱导自噬mRNA
我们以前发现从rsv RNA 4(vsiRNA-4A)中提取的siRNA是针对NB的。EIF4A切割mRNA[4]。自Nb沉默以来EIF4A诱导自噬,我们推测表达vsiRNA-4A也可以通过下调NB来诱导自噬。EIF4A表情。为了验证这一假设,我们用同样的方法表达vsirna-4A。N. 底栖动物叶子[4]。在2.5dpi时,细胞共表达vsiRNA-4A和CFP-铌ATG8f显示Nb下降了40%EIF4A与对照细胞共同表达小RNA和cfp-的转录水平铌ATG8f,演示Nb的沉默EIF4A由vsiRNA-4A(S13图)。用共聚焦显微镜观察了共表达vsiRNA-4A和cfp-的细胞自噬小体和自噬能小体。铌ATG8f,但控制单元中这些结构中的结构较少(图6a和6B)。我们通过mdc染色独立地验证了这些结果(图6c和图6d)。这些结果表明,表达vsiRNA-4A可诱导自噬。
图6.靶基因vsiRNA-4A的表达NbeIF4AMRNA切割,诱导自噬。
(a-D)VsiRNA-4A表达诱导的自噬。自噬标记物cfp-显示的具有代表性的自噬活动共焦图像铌ATG8f(A)或MDC染色(C)。将处理后细胞的相对自噬活性归一化为表达空载体(Vec)的对照细胞,即1.0。CFP-铌ATG8f标记(B)或mdc染色(D)每个细胞的自噬灶通过计数自噬体来计算自噬活动。每次处理超过150个细胞进行定量。条形图表示来自三个单独实验的标准错误。星号显示学生的显著差异t-对照试验(**,p<0.01). (e-H)表达vsiRNA-4A不能诱导过表达NB的转基因植株自噬EIF4A(OE4A)自噬标记物cfp-显示的具有代表性的自噬活动共焦图像铌ATG8f(E)或MDC染色(G)。将处理后细胞的相对自噬活性与表达空载体(Vec)的野生型细胞的相对自噬活性标准化为1.0。CFP-铌ATG8f标记(F)或mdc染色(H)每个细胞的自噬灶通过计数自噬体来计算自噬活动。每次处理的细胞数超过150个。条形图表示来自三个单独实验的标准错误。星号显示学生的显著差异t-与表达空载体的对照细胞(**,p<0.01).
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.g006
进一步支持我们的假设,即自噬的诱导依赖于NB的下调。EIF4A,我们共同表达vsiRNA-4A和cfp-铌转基因叶片中的ATG8fN. 底栖动物过表达NBEIF4A产生于我们先前的研究[4]。VsiRNA-4A基因表达对NB的抑制作用EIF4A转基因植株转录水平低于野生型,不诱导自噬。图6e和6F)。我们用mdc染色得到了类似的结果。图6G和6H)。这些结果表明,vsiRNA-4A的表达通过下调NB的表达而诱导自噬。EIF4A.HSV 1在人角质形成细胞中的细胞间传递-沈阳医学论文发表
水稻eIF4A与OSATG 5和抑制OSATG 5-激活的自噬
最后,我们找了大米。稻谷)正交铌EIF4A.OSEIF4A(Os06g0701100)与NB的核苷酸序列同源性为81%EIF4A,编码蛋白的氨基酸序列同源性为74.6%。铌EIF4A(S14A和S14B图)。此外,OseIF4AVsiRNA-4A也针对mRNA进行切割(S15图)。因此,我们测试了是否OSEIF4A执行类似的功能铌EIF4A.的确,OSEIF4A与水稻ATG 5(OSATG 5)(图7a和7B). OSATG 5与铌ATG 5在蛋白质的N端(S16图)。瞬时表达OSATG 5N. 底栖动物活化自噬(图7C-7e)。此外,OSEIF4A有效抑制OSATG 5或铌ATG 5(图5)7C-7e和S17)。这些结果表明OSEIF4A的作用类似于铌EIF4A,即它的转录本被vsiRNA-4A靶向,并通过与之相互作用而抑制自噬。OS第五组。这些发现突出了eIF4A在自噬调控中的功能保护作用。N. 底栖动物还有米饭。
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图7.水稻eIF4A(OseIF4A)与OSATG 5和抑制OSATG 5-激活的自噬。
(a-C)相互作用OSEIF4AOS由BIFC评估的ATG 5(A)LIC(B),以及Co-IP(C)化验。(d、E)具有代表性的自噬活动共焦图像N. 底栖动物细胞表达OSATG 5与共表达OSATG 5和OSMDC染色显示eIF4A(D),以及相对归一化的自噬活动(E)。绿色:MDC染色结构;红色:叶绿素自荧光。将相对自噬活性归一化为空载体表达细胞的自噬活性。对MDC染色的结构(每个细胞的自噬能灶)进行定量,通过计数自噬能体来计算自噬活性。每次处理的细胞数超过150个。误差条表示来自三个单独实验的标准错误。星号显示学生的显著差异t-测试(**,p < 0.01) compared to the control. (F)农杆菌渗入植物蛋白质积累的免疫印迹分析。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.g007
讨论
我们之前报道过NB的下调EIF4AVsirna-4A转录本与RSV感染的病毒症状有关。N. 底栖动物。在这里,我们发现了下调的NB的生物学功能。EIF4A*它调节通常抑制RSV感染的自噬反应,指出其复杂的作用铌RSV感染期间eIF4A。EIF 2α是真核细胞翻译起始因子家族成员,与内质网应激诱导哺乳动物细胞自噬有关。25,26]。EIF 2α可被pkR样ER激酶磷酸化[25]。PERK/eIF 2α磷酸化在微管相关蛋白1(MAP1)轻链3(LC3-Ⅰ)向LC3-Ⅱ转化过程中起着关键作用。26]。EIF5A最近被认为是ATG8蛋白家族成员通过翻译哺乳动物细胞中E2泛素连接酶样ATG 3蛋白而形成自噬体的关键因素。27,28]。然而,人们对EIFS在植物自噬中的作用知之甚少。我们的结果提供了第一个证据,证明eIF4A在调控植物抗病毒自噬中起着重要作用。
EIF4A被认为利用ATP水解产生的能量来释放mRNA结构,并与其他组分一起,为翻译起始阶段核糖体的合成准备mRNA模板。1]。目前的研究结果表明,eIF4A作为自噬的负调节因子,通过降解蛋白质在蛋白质代谢中起着重要的作用。这些发现指出eIF4A在蛋白质生产中的复杂作用:它不仅在翻译起始过程中起作用,而且在抑制蛋白质降解机制自噬方面发挥作用。我们也注意到虽然NB的沉默EIF4A引起侏儒表型N. 底栖动物,这与B. 远子 [3),对蛋白质翻译没有显著影响。S7图)。我们认为其他成分可以补充沉默的NB的功能。EIF4A翻译。
多项研究表明,自噬在病毒感染过程中受到调节。徐等人证明植物bax抑制剂-1(BI-1)与ATG 6相互作用,调节自噬[29]。BI-1沉默可降低N基因介导的TMV抗性诱导的自噬活性,过高表达的植物BI-1可增强自噬活性。29]。胞浆甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPC)通过与ATG 3相互作用而负调控自噬[20]。沉默GAPC显著激活ATG 3依赖性自噬,同时过度表达GAPC抑制自噬N. 底栖动物植物[20]。在目前的研究中,我们确定铌EIF4A通过干扰ATG5-ATG 12相互作用,抑制ATG 5的活性,从而证明其作为植物自噬的新负性调节因子的作用。此外,目前及以往的研究结果亦显示,自噬因子可能是其他宿主因素所针对的,以调节自噬[16,20,29]。预计今后将发现更多的宿主因素,这将有助于进一步剖析调控自噬的机制。
自噬对CaMV、TuMV和CLCuMuV感染起着重要的防御作用。12–15,18]。此外,越来越多的证据表明,自噬有助于病毒感染[7,30]。实际上,VSRP0来自Polerovirus触发Argonaute 1(Ago 1)的自噬性降解,这是抗病毒RNA沉默途径的关键成分[31]。TuMV VPG通过泛素化和自噬介导基因沉默抑制因子3(SGS 3)的降解,促进病毒感染。32]。βC1番茄黄曲叶病毒(TYLCCNV)卡姆表达,从而介导自噬性降解铌SGS 3N. 底栖动物 [33]。用ATG8f富集的病毒诱导的小泡提供了另一个可供选择的位置竹花叶病毒(BaMV)RNA复制或躲避宿主沉默机制[34]。这些发现共同揭示了自噬可以被病毒操纵,甚至被病毒用来感染,这突出了自噬在植物-病毒相互作用中的复杂作用。9,10].
我们先前和目前的研究结果表明,自噬在植物-RSV相互作用中也起着防御RSV感染的作用,说明了自噬在植物-RSV相互作用中的复杂作用。16]。Fu等人报道了RSV编码的NSvc 4蛋白干扰了受体蛋白的S-酰化,这通常会阻止病毒的运动,从而通过自噬途径诱导其降解。35]。这一观察还表明,自噬可以在植物-RSV相互作用中间接发挥作用,从而有利于RSV感染。这也可能是自噬参与植物-病毒相互作用的一种常见方式。例如,在Polerovirus、TuMV或TYLCCNV感染[31–33]。这一观察也有助于解释为什么RSV保留了一个可以诱导自噬的序列。也许诱导的自噬有利于RSV的运动。HSV 1在人角质形成细胞中的细胞间传递-沈阳医学论文发表
感染CLCuMuB、TuMV和RSV会导致自噬,但其潜在机制尚不清楚。14,15]。上调表达ATGS它被认为与诱导TuMV和RSV感染的植物自噬有关[12]。司马义力等人报道CLCuMuBβC1与负自噬调节因子GAPC相互作用,诱导植物自噬,提示CLCuMuB诱导自噬的机制[19,20]。在这里我们证明了铌EIF4A负调控抗病毒相关自噬N. 底栖动物。此外,针对SNB的vsiRNAEIF4A切割mRNA诱导自噬。这些发现提示了一种机制,在这种机制中,抗病毒自噬的负调节因子(铌EIF4A(EIF4A)通过允许其转录本被vsiRNAs识别和切割,从而诱导其对病毒感染的自噬作用。
越来越多的证据表明,vsiRNAs通过调控宿主基因的表达,在病毒与宿主植物的相互作用中发挥作用。36–40]。例如,vsiRNA-20来自中国小麦花叶病毒(CWMV)对CWMV侵染小麦(CWMV)中焦磷酸水解和H(+)浓度的影响小麦)细胞通过调节液泡H的mRNA积累+-为CWMV复制创造更有利的细胞环境[41]。目前的研究结果支持vsiRNAs间接参与自噬调控。
在此基础上,我们提出了自噬在RSV感染中的作用模型。根据该模型,eIF4A通过与ATG 5的竞争作用抑制植物的自噬,从而干扰其与ATG 12的相互作用。一旦感染RSV,EIF4AMRNA成为vsiRNAs切割的靶点。EIF4A的下调释放ATG 5激活自噬,进而通过降解抑制抗病毒RNA沉默的p3蛋白来防止RSV感染。图8)。也许可以利用这种机制来设计提高植物病毒抗性的方法,例如通过编辑。EIF4A.
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图8.提出的自噬诱导模型及其在RSV感染中的抗病毒作用。
在植物中,eIF4A起负调节作用,通过与ATG 5相互作用抑制自噬。一旦感染RSV,EIF4AMRNA被vsiRNAs靶向进行切割。EIF4A的下调释放ATG 5激活自噬,通过降解抑制抗病毒RNA沉默的p3蛋白来抑制RSV感染。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.g008
材料和方法
植物生长条件与病毒接种
我们成长[医]底氏烟草植物在生长室内24°C和60%相对湿度条件下,在16h光/8h暗周期下生长。将pTRV 1和pTRV 2或其衍生物导入农杆菌根癌农杆菌)GV 3101菌株。在VIGS检测中,我们重新悬浮了含有pTRV 1和pTRV 2-VIGS的农杆菌细胞颗粒(TRV:00,TRV:Nb)。EIF4A,TRV:NbATG 3,TRV:NbATG 5,TRV:NbEIF4A+NbATG 3,TRV:NbEIF4A+NbATG 5)在渗透缓冲液中(10毫米MgCl)2、10 mm MES(pH5.6)和10 0μM乙酰环酮,按1:1比例混合细菌悬液。在室温下培养2-4h后,将混合的农杆菌细胞悬液浸润到细胞中。N. 底栖动物植物叶片在5-6叶期。入渗后10~15d,上部叶片出现沉默表型(Dpi)。
对于RSV的接种,我们用机械的方法接种每一种病毒的中间。N. 底栖动物带有RSV感染水稻汁液的叶片。在指定时间用佳能550 D数码相机拍摄症状。对于tumv-gfp的接种,我们将携带tmv-gfp质粒的农杆菌细胞悬液渗透到N. 底栖动物如前所述的树叶[25,26]。在紫外光下对GFP进行了成像。
质粒构建
我们PCR扩增突变体NBEIF4A和NBEIF4A以克隆的cDNA为模板,将得到的PCR产物克隆到pJG 045载体上。我们为NB生成了DNA片段EIF4A-GFPNbEIF4A-myc, NLUC-铌EIF4A, NYFP-铌EIF4A, CYFP-NBEIF4A突变体和NbEIF4A突变体-MYC采用重叠PCR。我们PCR扩增了NBATG 5将PCR产物克隆到pJG 045载体上。我们获得了NB的DNA片段ATG5-GFPNbATG5-RFP, NYFP-NBATG 5, CYFP-NBATG 5,和CLUC-NBATG 5通过重叠PCR。我们放大了OSEIF4A安多ATG 5将PCR产物克隆到pJG 045载体上。我们产生了DNA片段CYFP-OSEIF4A,OsEIF4A-myc,OsEIF4A-RFP, NLUC-OSEIF4A,OsATG5-NYFP,OsATG 5-旗帜,和CLUC-OSATG 5通过重叠PCR。
含Nb的TRV重组VIGS载体的构建EIF4ANbATG 3,或NBATG 5我们用合适的引物对每个基因进行了部分片段的PCR扩增,并将PCR产物克隆到pTRV 2-ic载体中。NB的两个融合DNA片段EIF4A+NbATG 3和NBEIF4A+NbATG 5经重叠PCR扩增,克隆入pTRV 2-ic载体。
用于这些载体的引物列于S1表.
双分子荧光互补法
对于bifc实验,我们渗透了三周大的完全膨胀的叶子。N. 底栖动物农杆菌株(GV 3101)在细胞密度OD上构建的植物600=0.5。在农杆菌介导的浸润后36~72h,我们用共聚焦显微镜(Leica TCS SP5,Mannheim,德国)观察了25px浸润叶片外植体的表皮细胞。
共沉淀和免疫印迹分析
在瞬时农杆菌介导的渗透后48~72h,用3 Laemmli缓冲液按1:1的比例(w/v)混合提取冷冻、地面组织中的总蛋白5 min。细胞碎片经12,000离心收集。g在4℃下培养5 min,用Bio-Rad蛋白法测定上清液中蛋白质的浓度。取等量蛋白质,用蛋白提取缓冲液将总蛋白调至40μL,与10μL 5×SDS-PAGE负载缓冲液混合。在100°C下煮沸10 min后,将总蛋白溶解液在冰上快速冷冻5分钟,然后在12,000℃离心。g在4℃下作用1 min,在SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质.我们用抗myc(美国圣路易斯)、抗rfp(美国圣路易斯)和抗gfp(美国圣路易斯)一级抗体和抗兔或鼠(美国圣路易斯)二次抗体(1:10 000稀释)进行免疫印迹。本实验室制备了TuMV CP、RSV CP和P3蛋白的抗体。
蛋白提取液与抗GFP抗体在4℃孵育4h,4°C用冰凉的IP缓冲液洗涤6次,用SDS-PAGE分析,免疫印迹用抗myc抗体免疫印迹法检测,皮尔斯ECL Westernblotting底物(AmericshimImage680)检测。
荧光素酶互补成像(LCI)检测
在LCI检测中,我们将质粒组合引入N. 底栖动物农杆菌介导的叶片渗透。我们将浸润的叶子在黑暗中保存了24次,然后用白光照射48次。在72 HPI条件下分离叶片,喷1mm荧光素酶。将材料置于黑暗中5 min,使叶绿素自荧光猝灭后,用微光冷却CCD成像仪采集荧光素酶信号。
RNA提取与RT-qPCR
我们从N. 底栖动物叶组织使用TRIzol试剂,用无RNase的DNase I处理RNA(TAKARA,中国)以去除潜在的DNA污染。我们用1μg的总RNA和寡核苷酸(Dt)进行了第一链cDNA的合成。12–18引物使用钛一步RT-PCR试剂盒(Takara,日本)。中列出了用于rt-qPCR的引物。S1表.
共聚焦显微镜和透射电镜
我们使用Leica TCS SP5进行了共焦显微镜检查(曼海姆,德国)。我们将测试的所有组合引入N. 底栖动物农杆菌介导的叶片渗透。对于GFP、RFP、CFP和YFP成像,在488 nm(GFP)、514 nm(RFP)、405 nm(CFP)和514 nm(YFP)处用LD激光激发荧光蛋白。为避免放射出血,对每个荧光载体组的检测带进行了优化。
用100 mM E-64D(Sigma)浸泡叶片,在黑暗中孵育8~12h,立即用50 mm MDC(Sigma)真空浸泡叶片,然后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗两次。MDC的激发波长为405 nm,检测波长为450~550 nm。叶绿素自荧光在543 nm处激发,580~700 nm范围内检测到。
为了利用自噬标记cfp-atg8f观察自噬小体,我们将cfp-atg 8f导入到5-6叶期的叶片中。N. 底栖动物农杆菌介导的植物渗透。48 h后,用100 mm E-64D(Sigma)浸泡叶片,在黑暗中孵育8~12h。我们用共聚焦显微镜观察叶片,激发波长405 nm,在454~581 nm处捕捉到的辐射(Leica TCS SP5,Mannheim,德国)。
电子显微镜下,我们把叶子切成小碎片(1-2毫米)。2)用含2.5%戊二醛的0.1M PBS缓冲液浸润固定。我们把样品固定在2%的Oso中。4,然后在乙醇和丙酮中脱水,然后嵌入Spurr树脂(SPI供应品)。我们用金刚石刀在一个超微电脑上切割切片(EM UC 7;Leica,德国),并将它们收集在铜栅格上。检查前用醋酸铀酰钠和枸橼酸铅双染。HSV 1在人角质形成细胞中的细胞间传递-沈阳医学论文发表
加入号
本研究分析的基因和病毒序列的GenBank登录号如下:EIF4A(XM 019409915),NbATG 2(KU 561373),NBATG 3(KX 369396),NBATG 5(KX 369397),NBATG 6(AY 701316),NBATG 7(KX 369398),NBPI3K(KX 120977),NbATG8f(KU 561372),TuMV(NC 002509),NB肌动蛋白(AY 179605),OsEIF4A(XM 026026114),OsATG 5(XM 015771963)。NB的核苷酸序列ATG 12这里的克隆与烟草ATG 12(XM 016602097)。
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TRV:00和TRV:4A感染RSVN. 底栖动物.
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图S1.TRV:00和TRV:4A感染RSVN. 底栖动物.
典型的呼吸道合胞病毒症状,如矮小、扭叶、黄色嵌合体等,均出现在所有TRV:00对照植物上,而只有25%的rsv-接种NB。EIF4A-沉默的植物在20 dpi的叶片上表现出黄色的嵌合体,这一现象不像对照那么明显。铌的沉默EIF4A引起扭叶,可能干扰RSV症状的观察。呼吸道合胞病毒侵染最明显的症状是黄叶和花叶。EIF4A-沉默的植物。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s001
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图S2.TRV:00和TRV:4A感染RSV的确认N. 底栖动物.
(A)逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析呼吸道合胞病毒感染。结果显示了三个重复(R1,R2和R3)。每株20株受TRV:4A或TRV:00感染。(B)RSV感染NB中RSV CP积聚的免疫印迹分析EIF4A-在三个复制体(R1、R2和R3)中沉默的植物。以受RSV感染的TRV:00株为对照.用ImageJ分析波段强度。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s002
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图S3.自噬相关基因在NB中的相对表达水平EIF4A-沉默N. 底栖动物植物。
RT-qPCR检测自噬通路中基因的相对转录水平.铌肌动蛋白作为内部控制。误差条表示来自三个单独实验的标准错误。星号显示学生的显著差异t-对照试验(*,p<0.05; **, p<0.01).
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s003
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图4。铌的沉默EIF4A不影响蛋白质翻译。
(A)绿色荧光蛋白在NB中表达的免疫印迹分析EIF4A-沉默细胞(4A-发夹),NBEIF6A-沉默细胞(6A-发夹),或非沉默细胞(GUS-发夹).以Rubisco大亚基作为加载控制。铌的沉默EIF6A被用作阳性对照,因为它损害了蛋白的翻译。(B)铌的RT-qPCR分析EIF6A在NB中的表达EIF6A-沉默的细胞。星号显示学生的显著差异t-试验(*,p < 0.005) compared to the control. (C)铌的RT-qPCR分析EIF4AMRNA水平NbeIF4A-沉默的细胞。星号显示学生的显著差异t-试验(*,p < 0.005) compared to the control. (D)Rt-qPCR分析绿色荧光蛋白NB mRNA水平EIF6A-沉默的细胞。星号显示学生的显著差异t-测试(*,p < 0.05) compared to the control. (E)Rt-qPCR分析绿色荧光蛋白NB mRNA水平EIF4A-沉默的细胞。星号显示学生的显著差异t-试验(*,p < 0.005) compared to the control.
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s004
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S5图5.NB的相对表达水平ATG 3和NBEIF4A在共同沉默的植物中。
(A)相对表达水平NbATG 3在……里面NBATG 3-和NbeIF4A共沉默N. 底栖动物植物。(B)NB的相对表达水平EIF4A铌ATG 3和NBEIF4A共沉默N. 底栖动物植物,用RT-qPCR法测定。NbActin作为内部控制。误差条表示来自三个单独实验的标准错误。星号显示学生的显著差异t-对照试验(*,p<0.05; **, p<0.01).
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s005
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图6.铌的沉默EIF4A抑制萝卜花叶病毒感染N. 底栖动物植物促进病毒NIB蛋白的降解。
(A)TuMV-GFP在NB中的感染EIF4A-沉默(TRV:4A)植物。以非沉默(TFV:00)植物为对照。在TuMV-GFP-接种的NB叶片中EIF4A-沉默植物,感染灶数在3 dpi时显著减少。紫外线照射下荧光灶显示绿色荧光蛋白阳性感染灶。在6 dpi时,对照植株顶部的叶片出现强烈的荧光,表明TuMV-GFP对植物的系统侵染。Nb顶叶出现弱荧光EIF4A-沉默的植物。(B)TRV:00和TRV:4A感染TuMV-GFP积累的免疫印迹分析N. 底栖动物有抗TuMV CP抗体的植物。(C)GFP融合的TuMV nib蛋白在NB中瞬时表达的免疫印迹分析EIF4A-用农杆菌介导的2.5 dpi入渗沉默和对照叶片。用ImageJ分析波段强度。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s006
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图7.NB的RSV感染ATG 3和NBATG 5-沉默N. 底栖动物.
(A)铌的沉默ATG 3和NBATG 5个别没有引起明显的表型N. 底栖动物. (b、C)NB表达降低ATG 3和NBATG 5在相应的沉默植物中,如RT-qPCR所揭示的,表明这些基因的有效沉默。NbActin作为内部控制。误差条表示来自三个单独实验的标准错误。星号显示学生的显著差异t-对照试验(*,p<0.05; **, p<0.01). (D)NB的RSV症状ATG 3-或NBATG 5-20 dpi的沉默植物。(E)沉默植物和对照植物的系统性RSV感染。误差条表示来自三个单独实验的标准错误。每个实验使用20株植物。(F)沉默植物RSV积累的免疫印迹分析。用ImageJ分析波段强度。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s007
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图8.铌的共沉默ATG 3或NBATG 5与NbEIF4A在……里面N. 底栖动物植物和免疫印迹分析RSVCP在沉默植物中的积累。
(A)NB表型ATG 2NbATG 3,或NBATG 5和NBEIF4A共同沉默的植物。(B-D)NB表达水平降低ATG 3 (B)NbATG 5 (C)和NBEIF4A (D)在相应的共沉默植物中,如RT-qPCR所揭示的,表明这些基因的有效沉默。铌肌动蛋白作为内部控制。误差条表示来自三个单独实验的标准错误。星号显示学生的显著差异t-对照试验(*,p<0.05; **, p<0.01). (E)其他两次重复试验中RSV CP在受侵染植物中积累水平的免疫印迹分析。用ImageJ分析波段强度。
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图9.Y2H和BIFC识别铌ATG 5作为铌EIF4A.
(A) 铌与ATG交互作用的ATG 5,但不包括其他ATG。铌EIF4A.在无色氨酸和亮氨酸(SD/-Trp/-Leu)和色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)的选择性培养基上镀10 mm3-AT。(B)BIFC检测证实了Y2H的结果。酒吧,20μm。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s009
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图S10。免疫印迹分析证实蛋白质在分析中的表达铌EIF4A-介导抑制ATG 5激活的自噬。
在分析NbeIF4A介导的抑制ATG 5激活的自噬过程中,用相应标记的抗体证明了蛋白质的表达。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s010
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图11.表达铌EIF4A抑制MV诱导的自噬。
(a、C)Mv处理细胞、空载体对照(EV)和myc标记细胞动态自噬活动的典型共焦图像铌EIF4A-表达细胞,由特异性自噬标记cfp-铌ATG8f(A)或MDC染色(C)。青色:CFP-铌ATG8f;绿色:MDC染色结构;红色:叶绿素自荧光。酒吧,10μm。(b、D)处理细胞的相对自噬活性,与EV细胞的相对自噬活性相同,设定为1.0。CFP-铌ATG8f标记(B)或mdc染色(D)每个细胞的自噬灶通过计数自噬体来计算自噬活动。每次处理超过150个细胞进行定量。条形图表示来自三个单独实验的标准错误。星号显示学生的显著差异t-对照试验(**,p<0.01).
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s011
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图12.铌EIF4A干扰铌ATG 5和铌ATG 12
(a和B) 铌ATG 5与铌在BIFC分析中ATG 12,而相互作用信号被铌EIF4A表达(4A-myc)。酒吧,20μm。(C)在co-ip分析中,当铌表达了eIF4A,铌ATG 5是免疫沉淀的,但很难免疫沉淀。铌ATG 12
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s012
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图13.VsiRNA-4A表达下调NB的表达EIF4A.
内源性铌的相对转录水平EIF4A在通过人工miRNA表达vsiRNA-4A的细胞中检测。以表达于载体(Vec)中的不相关小RNA(UUAAGGUAAGUUUUCCGCAU)为对照。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s013
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图14。氨基酸与核苷酸序列比对OSEIF4A和铌EIF4A.
氨基酸(A)和核苷酸(B)序列比对。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s014
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图15。OSEIF4AVsiRNA-4A对mRNA进行切割。
(A)OSEIF4ARSV感染水稻14 dpi的转录水平。(B)GFP标记的免疫印迹分析OSEIF4A(OS(eIF4A-GFP)对于对照组,使用一个突变体制备了一个类似的结构。OSEIF4A(OSEIF4Am-GFP),其中vsiRNA-4A结合位点的核苷酸9-13与野生型互补。VsiRNA-4am代表核苷酸9-13(红色核苷酸)上的vsiRNA-4A突变体.(C)Gfp标记OSEIF4A与vsiRNA-4A共同表达时和在对照组(vsiRNA-4A/OSEIF4Am-GFP或vsiRNA-4am/OSEIF4A-GFP(5 Dpi)。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s015
(TIF)
图16。氨基酸序列比对OSATG 5和铌第五组。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s016
(TIF)
图17。OSEIF4A抑制铌ATG 5-激活的自噬。
(a,B)具有代表性的自噬活动共焦图像铌ATG8f-CFP(A)或MDC染色(B). (C)相对自噬活性,与表达RFP和空载体的细胞相一致。通过计数自噬体来计算自噬活性,对每个细胞的自噬灶进行定量。每次处理的细胞数超过150个。误差条表示来自三个单独实验的标准错误。星号显示学生的显著差异t-测试(**,p < 0.01) compared to the control. (D)蛋白质积累的免疫印迹分析。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s017
(TIF)
S1表用于分析的引物。
Https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009963.s018
(Docx)
致谢
我们感谢清华大学的刘玉乐教授提供了所有用于自噬分析的载体。我们感谢英国Minehead的M.J.Adams教授纠正了手稿中的英语。HSV 1在人角质形成细胞中的细胞间传递-沈阳医学论文发表
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