核糖核酸：一种低成本、先进和超高效的方法，用于去除细菌转录学的核糖体RNA-期刊杂志论文发表

· 崔东辉，

· 理查德·祖宾

· 索加特·普德尔

· 阿南德·萨斯特里

· 约塞布·宋，

· 李永杰，

· 赵秀雄，

· 伯恩哈德·帕尔松

· 赵永光

· 发布时间： 2021年9月27日

抽象

RNA测序技术使基因表达（RNA-Seq）、转录启动位点（微分RNA-Seq）、转录3+末端（术语-Seq）和转录后过程（核糖体分析）得以系统阐明。转录学研究的主要挑战是去除核糖核酸RNA（rRNA），核糖核酸RNA占细胞中RNA总数的90%以上。在这里，我们报告了一种低成本和强大的细菌rna耗竭方法，RiboRid，基于热敏RNA的酶降解由热性RNASH。这种方法实施了实验性考虑，以尽量减少mRNA的非特异性降解，并能够消耗通常占RNA很大一部分的RRNA前，即使在rna耗竭之后。我们演示了各种转录组研究（包括 RNA-Seq、Term-Seq 和核糖体分析）高效去除 rRNA 的去除效率高达 99.99%，每个样本的成本约为 10 美元。该方法有望成为大规模高通量细菌转录学研究的有力方法。

作者摘要

切除核糖核酸RNA，细胞RNA的主要成分（超过90%）是处理信使RNA的转录学研究的关键实验步骤。在这份手稿中，我们描述了从各种RNA样本中减去核糖核素RNA的有力方法。该方法基于目标RNA的酶降解，通过短补充DNA和RNA：DNA复式特异性核糖核酸。该方法包括精心设计的实验程序，以尽量减少实验偏见和不必要的删除信使RNA。我们验证了七种不同细菌物种的各类转录学研究方法。该方法成功地去除核糖核素RNA的效率超过99%，它可与商业系统相媲美，即使降解RNA样品的成本只是成本的一小部分。

引文：崔 D， Szubin R， Poudel S， 萨斯特里 A， 宋 Y， 李 Y 等人 （2021） 里博里德： 一种低成本， 先进， 超高效的方法， 以去除核糖体 RNA 细菌转录学.PLoS基因 17 （9）： e1009821.https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821

编辑：乐福兰，中国科学院，中国

接收：2021年5月25日：已接受：2021年9月10日：已发布：2021 年 9 月 27 日

版权 所有：?2021年 周美的）这是根据《知识共享归因许可证》条款分发的开放访问文章，该条款允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源被记入贷记。

数据可用性：作者确认，所有结论背后的数据都是完全可用的，不受限制。探头设计代码可在https://github.com/SBRG/RiboRid_Design访问。本研究产生的测序数据已根据PRJEB42756的加入编号提交给EMB核苷酸档案馆（ENA）和生物项目/SRA。所有图形的数字数据均在表1、2和 S7 表中提供。

资金：本研究由韩国生物大挑战赛（2018M3A9H3024759）支持， C1天然气精炼项目（2018M3D3A1A1A01055733）向BKC，韩国国家研究基金会通过韩国科学和信息通信技术部资助的国家研究基金会（https://www.nrf.re.kr/eng/index）向SC提供赠款（2021R1A2C1012589）。这项工作也得到了诺和诺德方登公司（NNF10CC1016517）（https://novonordiskfonden.dk/en/）对英国石油公司的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备手稿方面没有作用。

竞争利益：作者宣称不存在相互竞争的利益。

这是一篇PLOS计算生物学方法论文。-期刊杂志论文发表

介绍

基因组中编码的遗传信息通过信使RNA（mRNA）转移到蛋白质上。因此，研究 mRNA 是阐明细胞功能基本原理的中心方法。已开发了多种技术，如定量聚合酶链反应 （qPCR）、微阵列和 RNA 测序 （RNA-Seq），以定量测量细胞内的 mRNA 或它们的变化，以响应各种环境和遗传扰动[1，2]。由于核糖核酸RNA（rRNA）占细胞中RNA总数的90%以上，其有效去除是可靠的全基因组转录学研究最重要的任务之一[3]。与真核 mRNA 不同，细菌和古性 mRNA 不具有或很少具有此类特征，而这种 mRNA 可以通过其多 A 尾部结构[4]选择性地丰富：因此，从总RNA中去除主要的RNA物种对于下游应用至关重要。

已开发并商业化了几种去除细菌 rRNA 的方法。与核酸探针的减法杂交是与 rRNA 反向互补的，是多种系统（如 Ribo-Zero、MICROBExpress、核酸酶和核酸微子[5]7]中商业化的最流行方法。但是，由于列出的方法依赖于 rRNA 上的短保存区域，因此与探针序列相比，部分降解的RNA样本和物种的 rRNA 序列不同，因此它们往往不一致。在5+末端用单磷酸盐处理RNA的外核解分析也被设计为转录学[8]。然而，这种方法的效率相对较低，而且受到这样一个事实的限制，即由三磷酸盐保护的主要成绩单不受5+磷酸盐依赖终结者外显子（TEX）的保护，可能无法精确表示细胞中的mRNA水平，因为大量的mRNA作为处理形式存在。已提出几种方法，基于复式特异性核酸酶的消化，电泳大小选择和序列特定的阻塞反向转录，虽然它们不如商业系统有效[9×12]。

核素酶H（Rnase H）是一种内分泌核素酶，专门消化RNA链：DNA杂交体。RNase H 基于 rRNA 的选择性消化已被建议为消耗细胞 rRNA 的成本效益的替代方法，因为它具有很高的去除效率[3，13]。之前曾报道过使用 RNase H 对正式固定石蜡嵌入 （FFPE） 档案组织的 RNA-Seq 研究 [3]。然而，直到最近Ribo-Zero暂时停止，细菌样本才重新审视这种方法。虽然对细菌RNA-Seq的rRNA耗竭方法进行了评估，认为它是一种低成本的替代品[13]，但高效rna耗竭需要额外的优化。这些优化方法包括：（一） 优化反应条件，防止非特异性杂交：（二） 寡核苷酸探针的设计补充RNA：（三） 添加用于早期 rRNA （预 rRNA） 的探针，该探针包含来自 rRNA 操作器的操作结构的扩展序列;和 （iv） 将该方法应用于其他转录学研究，如对细菌成绩单（Term-Seq）的 3+ 末端进行测序和核糖体分析。为此，我们重新审视了 rRNA 耗竭方法，通过调整反应温度、离子强度、去除预 rRNA 和重新设计探头序列来改进和简化实验程序。这里提出的先进方法，称为RiboRid，可以去除细菌RNA高达99.99%，并防止寡核苷酸探针与其他细胞RNA物种的非特异性结合。此外，RiboRid 在进行具有技术挑战性的转录学研究（如术语-Seq 和核糖体分析）时，具有与最高效的商业方法 （Ribo-Zero） 相当的 rRNA 去除效率。

结果

核糖

使用 Rnase H 选择性地消化 rRNA 取决于 RRNAS 特有的短脱氧核苷探针的杂交和 Rnase H 的 RNA：DNA 异质双管素的消化。因此，将探针的非特异性杂交最小化到其他RNA物种对于高效和无偏见的转录体研究至关重要。因此，Ribo-Zero 方法的杂交反应是在高温 （68°C） 下进行的，以减少非特异性杂交。为此，我们旨在优化基于 RNase H 的 rRNA 耗竭方法中的实验条件，以防止不必要的RNA降解由非特定结合 （图1）。首先，RNA样本在 95°C 下变性，仅 1s。在变性温度下长时间孵育，可能会诱发RNA的自发水解，对于本研究中所有测试的样本来说都没有必要。接下来，我们在高温 （65°C） 下执行 RNase H 反应，以防止抗 rRNA 寡核苷酸探针 （ArOPs） 与 mRNA 的不需要杂交。为了支持这种反应，使用了混合酶热敏仪RNase H，其最佳反应温度在65°C或更高。熔化温度高于 68°C 的合成单链脱氧多糖苷酸用作 AROPs，用于支持在高反应温度 （65°C） 下高效杂交。

图1。里博里德的实验工作流程。

抗RNA寡核苷酸探针（ArOPs）是化学合成的。短变性时间，中性pH值，低Mg2+浓度和高反应温度提供了最小的实验偏差。

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我们使用 32 nt 长的单链脱氧核苷酸作为可与 rrna 结合的 Arops 。当探针的熔化温度低于 68°C 时，探头的位置移动到 rRNA，直到熔化温度达到 68°C。 但是，当找不到适当的探头或调整后的探头与相邻的探针重叠时，探头的长度缩短到 28 nt 或延长至 43 nt（参见方法）。这些探针设计用于将大约每 40 bp 的 rRNA 结合一次，并在已变性的 RNA 样本中混合到 rRNA 中。然后，RNA的RNA链：DNA异质复式受RSEH消化。与之前的方法相比，使用温和的温度（22~45°C）进行消化反应[3，13]，RNA在本研究中相对容易在反应温度升高时自发水解。由于镁离子（Mg）的存在，非酶RNA水解发生在高温下2+），这是RNase H活动所需的[14]。因此，反应缓冲器被修改为包含较低的Mg2+浓度，这是6.4倍低于以前报告的方法[3，13]。通过优化的协议，我们可以通过电泳分析（S1图）检测rRNA的去除，在进行下游研究之前，它可以是一个有用的检查点。随后，ArOPs 被 Dnase I 消化删除，然后通过柱基净化，以收集剩余的 mRNA。当 ArOP 的 3+ 端被 C3 间隔或二氧核苷酸修饰阻断时，可以避免这种额外的酶消化，因为它们不被韧带和聚合酶用作基板;因此，它们不会干扰下游图书馆的编写。-期刊杂志论文发表

简化大肠杆菌和密切相关物种RNA-Seq的RNA去除协议

我们首先检查了从大肠杆菌500 ng总RNA样本中去除RNA的能力，并将其与三种商业方法进行了比较，即MICROB快车、Ribo-Zero（使用减法杂交的传统系统）和RiboErase。在没有 rRNA 耗竭的情况下，rRNA 占序列读数总数的 97% 以上（表 1：未经处理）。商业套件显示成功去除 rRNA，但 MICROB快速方法（图 2A） [15，16]显示去除效率较低。使用 108 ArOP 集（S1 表） 的 Riborid 方法从E中删除 rRNA。大肠杆菌总RNA样本水平下降到1.63%，这与商业方法的一小部分成本相当（图2A和表1）。此外，RiboRid 方法成功地耗尽了整个 16S 和 23S rRNA 基因 （图 2B）的覆盖范围。技术模拟样品，经历了相同的RiboRid过程与无核糖酶，而不是杂交酶，显示几乎没有区别，未经治疗的控制。此外，我们检查了高度表达基因的RNA-Seq特征，以检查酶反应引入偏差或RNA降解如前所报告[17，18]，并没有检测到任何RNA降解或偏置的迹象（S2 图）。此外，我们没有观察到在以前的酶基rRNA耗竭方法（S3图）[17]中报告的短rna读数的非特异性浓缩。接下来，我们分析了使用不同rna去除方法执行的RNA-Seq基因表达。除了未经处理的模拟样品外，所有 rRNA 耗尽的样品和复制品都是线性相关性的，甚至跨越了不同的方法（S4 图）。使用 RiboRid 方法从两种不同的生物复制物中制备的 RNA-Seq 数据集具有较高的可重复性，相关性为 0.977（皮尔逊的 R2).

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图2。使用里博里德的核糖

（A） 商业套件和 RiboRid 方法去除 rRNA 的效率。误差条表示两个生物复制的标准偏差。圆圈是单个数据点。未经治疗：不治疗。模拟：用无核酸酶代替混合酶进行核酸疗法。（B） 控制和核照处理 rRNA 的 RNA 测序 （RNA-Seq） 配置文件。读取次数计为每百万次映射读取数 （RPM）。（C） 具有不同实验条件的核酸效率（输入RNA量、抗RNA寡核苷酸探针（ArOPs）量和温度）。（D） 序列与阿罗普斯相似的基因的RNA表达水平。序列相似性超过 15 nt 的连续匹配，E值低于 1 （BLASTN） 的基因在低杂交温度下表达水平明显较低 （*p = 0.027;威尔科克森的排名总和测试）。框限制、胡须和中心线表示 1圣和 3rd四分位数， 10th和 90th百分位数和分布中位数。。。点是单个基因。受试基因的数量在图表上方表示。

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表1。由各种rRNA减法方法和实验条件制备的埃舍里希亚大肠杆菌和克莱布西拉氧托卡RNA-Seq的核糖体RNA的分数。

I： 输入RNA（μg）。阿罗普： 使用的 Arop 量 （每个探头的 pmol） 。T：混合酶反应温度（°C）。百分比表示 rRNA 读取到所有绘制在基因组上的读数的分数。

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RNA-Seq 观察到的基因数量也因 rRNA 去除而显著增加。从Ribo-Zero、RiboErase或RiboRid处理样本的RNA-Seq结果中，分别观察到4，201、4，166和4，122个基因的表达，而对照样本中只检测到2，738个基因。

此外，根据 RNA-Seq 的 Poisson 过程的性质，通过多个复制物测量的基因表达水平显示异质性：即，随着表达水平的降低，在复制之间测量的基因表达差异会增加[19，20]。生物复制的变异是技术和生物变异的组合 [19]。鉴于实验设置，不同方法的观察变化差异源于不同的技术变化，因为库是从同一生物复制样品的引脚中准备的。因此，如果 rRNA 去除方法不成功或引入偏差，我们期望观察不同表达水平的不同分布。从没有rna耗竭的样品中产生的基因表达的变异比RRNA耗尽的样本高得多，而且不是异质的（S5图）。相比之下，使用Ribo-Zero、里博拉塞和里博里德制备的样本具有相同的实验变异分布。此外，对照样本的变异平均系数（标准偏差除以基因的平均表达，这意味着按表达水平调整的测量表达的方差）比rRNA耗尽样本高3.6倍以上，而这三种方法具有类似的值。考虑到检测到的基因数量和实验方差的分布，rRNA耗竭大大降低了RNA-Seq的计数误差，尤其是对于丰度低的基因。-期刊杂志论文发表

接下来，我们测试了RNA输入高达1微克和不同比例的AROP与总RNA。序列读取的 rRNA 内容几乎没有差异，表明 rRNA 耗竭方法适用于各种输入 RNA 和 AROP 与 RNA （图 2C）的比例。此外，这些技术复制样品之间的相关性高于0.989（S6A图）。这表明该方法足够坚固，足以适应生物实验中的实际变化。

为了检查 AROPs 对 mRNA 的可能非特异性结合，我们使用 45°C （图 2C）的 RiboRid 方法从同一 RNA 样本中重复 RNA-Seq。虽然RiboRid方法能够去除rRNA，但由于杂交酶的反应温度低于最佳，从rRNA读取的分数增加到27.4%。此外，样品与其他技术复制品的相关性相对较低（皮尔逊的R2= 0.744 ± 0.019）（S6B 图） 。更重要的是，我们使用基本本地对齐搜索工具 （BLAST）（S2 表） 预测了 46 个 AROP 对 mRNA 的非特定绑定（E值< 1）。其中18个探测器的连续匹配时间超过15个基点。与正常的RiboRid处理样本（p = 0.027;p = 0.027）相比，使用riboRid方法从rRNA减去的RNA样本中测得的18个基因的表达被大大低估了。威尔科森的排名总和测试） （图 2D）。相比之下，我们没有观察到未经治疗的模拟和RiboRid处理过的样本（S7图）在基因表达上有任何显著差异。这说明了高反应温度在防止探头与 mRNA 的非特定结合方面的重要性，并表明 RiboRid 的高反应温度能够避免实验偏差。

接下来，我们应用的方法和相同的阿罗普斯到K的RNA-Seq。氧托卡KCTC1686，一种与E密切相关的细菌物种。大肠杆菌。由于这两种细菌的序列相似，108种抗E细菌中有76种。大肠杆菌阿罗普斯匹配K的rRNA。催产素（图3）。虽然在K的差距。催产素rRNA ，其中没有 ArOP 杂交，跨度最大长度为 163 nt ， 76 AROP 密度足以去除 rRNA 到不到 3% 的可序列读取K的水平。氧托卡RNA-Seq，相关性为0.998（皮尔逊的R2生物复制之间 （表 1） 。rRNA 删除K。氧托卡使用抗E。大肠杆菌AROP 表示，AROP 的数量可能会减少到低得多的密度。因此，我们设计了一个新的探头集，每个探头在较远的距离间隔。新的探针集由55个探头组成，大约每80 nt在rna（S3表）上杂交一次。我们还进一步调整了协议，以减少 RiboRid 方法的成本和时间。首先，在 3+ 端用 C3 隔板合成了 AROP，在下游图书馆建设中，该垫片不用作韧带和聚合酶的基板。最初，寡核苷酸探针在核苷酸反应需要通过 DNase 消化去除后仍然存在，因为它们会干扰测序库建设的下游 PCR 放大步骤。然而，C3空间改性寡核苷酸不能用作DNA聚合酶的引物：因此，DNase I 在核动力学方法末端消化探头是可以避免的。或者，通过使用终端脱氧核苷酸转移酶而不是 C3 间隔器修改来附加二氧核苷酸类比，可以阻止预先存在的探针的 3+ 端。然后，基于柱的清理步骤被 SPRI 准磁珠净化所取代。加上这些修改，RiboRid 方法的成本和处理时间可以大大降低（S1和S2 协议）， 而不会增加 rRNA 分数或实验偏差 （表 1和S6C 图）。

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图3。将大肠杆菌抗RNA寡核苷酸探针（ArOPs）与E对齐。大肠杆菌或克莱布西拉催产核糖RNA（RRNA）。

红条表示 32nt Arops。

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从各种细菌物种的RNA样本中消耗rna

为了研究不同细菌物种的RiboRid方法的多功能性，我们应用RiboRid对两种革兰阴性细菌，伪多莫纳斯航空和细菌的泰奥托米龙，和两个革兰阳性细菌，利莫苏姆菌和金黄色葡萄球菌，与AROPs特定于每种细菌（表2）。P. aeruginosa是一种革兰氏阴性机会型病原体，是肺炎和身体各个部位其他感染的常见原因[21]。rRNA 被成功地从实验室衍生物 PAO1 隔离[ 22 ]中删除，使用标准的 RiboRid 方法，其 RRNA 在 RNA - Seq 中平均占可读数的 4% 。然而，我们遇到了一个有趣的rRNA操作机（图4A）的配置文件。在 RRNA 操作器的交源区域有大量的RNA片段。考虑到细菌的rRNA成熟和加工，据预测，这些片段是前RNA，由于缺乏补充性AROP而没有耗尽。RRNA 前平均占 RNA-Seq 中映射读数的 0.84%。虽然与 mRNA 读取相比，rRNA 读取量可以忽略不计的，但我们测试了两种不同的方法，以进一步去除 rRNA 前物种。首先，反应中混合酶的两倍增加并不影响非 mRNA 或 rRNA 读数（图 4A 和 4B）的总量。事实上，在混合酶反应中补充一些抗前RNA寡头（S4表）将RNA样本中的预RNA片段量减少到0.06%（图4B）。

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图4。假多莫纳斯航空器的RNA测序（RNA-Seq）实验中的核糖核（RRNA）含量。

（A） P中 rRNA 操作的 RNA-Seq 配置文件。阿鲁吉诺萨。阴影区域表示过早的 rRNA 片段。5U Hyb： RNA-Seq 通过治疗标准核糖（标准量;10U Hyb：用比标准方法（10个单位）多两倍的混合酶处理样品。RRNA 耗尽前：由核反应制备的样本的 RNA-Seq 配置文件，包括另外 10 个针对 rRNA 前物种的 ArOP。（B） 在 mRNA 和其他 rRNA 相关RNA 上映射的读数分数。误差条表示两个生物复制的标准偏差。-期刊杂志论文发表

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表2。多个细菌物种RNA-Seq中的rRNA分数，其中rRNA被里博里德方法去除。

百分比表示基因组所有映射读数的 rRNA 读数的分数

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我们进一步将RiboRid方法应用于两种革兰氏阳性细菌：S.aureus，一种常见的病原体，由于抗生素耐药性菌株的出现，它是对卫生保健系统的最大威胁之一[23，24]：和E.豪华轿车，CO的模型应变2- 修复致病细菌[25]。两种菌株中的 rRNA 均被 Riborid 方法（表 2）有效地去除。S.无论文化介质如何，RNA-Seq 中的尿素rRNA 都低于 1.72%，与 Pearson 的相关性 （R）2） 生物复制高于 0.955（S8 图） 之间。特别是，当RNA从RPMI介质中生长的细胞中制备时，rRNA仅占绘制总读数的0.02%。里博里德方法也能够减少从E的RNA。豪华轿车下降到 2.25% 具有高可重复性 （R2= 0.949） 之间的生物复制 （表 2）.

B.泰奥陶微子是人类肠道共生微生物群的主要成分之一[26，27]。与其他细菌物种不同，核糖核化物（RiboRid）方法从B的RNA样本中留下了相对较高的rRNA量。泰奥陶米龙。详细来说，来自RiboRid处理样本的RNA由27.20±5.03%（表2）组成，尽管从RiboRid处理样本中测量的RNA表达与Ribo-Zero处理样本的RNA表达与皮尔逊的相关性（R）高度相关2） 0.915 ± 0.01（S8 图） 。为了提高 rRNA 去除效率，我们设计了一个新的 ArOP 集 （ArOP Set 2）， 具有不同的 DNA 序列，具有较高的熔化温度，因此它们可以在 RiboRid 的高反应温度下混合到 rRNA 更强。虽然 rRNA 在映射读数中所占的比例降至 17.82 ± 0.05%，但其与 Ribo-Zero 或标准 ArOP （ArOP Set 1） 处理样本的相关性已降至 0.741 （R）2) ( S8 图） 。将反应温度降低到 58°C（比退火温度至少低 10°C）并不能提高 rRNA 去除效率（表 2）。最近的一份报告还表明，里博零和RNase H基去除rRNA细菌多利，是相对低效的，可能是由于其高基因组AT含量[13]。如基于复式核酸酶的rRNA去除方法[16]所示，对于 AT 含量高的生物体（如细菌）可能需要进一步的实验和探针优化：然而，核糖

将核糖的方法应用于术语-Seq

为了进一步验证RiboRid方法的其他具有挑战性的转录分析方法，我们进行了术语-Seq[28]。Term-Seq 技术捕获细胞中核苷酸水平[28]的 3+ 成绩单的末端。因此，它对RNA降解很敏感，产生错误信号。我们成功地检测到1，308个成绩单3+结束整个模型活性甲酰酸盐的转录本，S.大肠杆菌，这是一种以生产各种二次代谢物而闻名的革兰正土壤细菌[29]。在 rRNA 上映射的读数仅占映射到基因组的读数的 0.36% （表 3）。为了解决在RiboRid治疗期间可能的非特异性随机RNA降解，可能会降低单核苷酸敏感研究（如术语-Seq）的分辨率，我们检查了术语-Seq（S9图）的轮廓。例如，从两个生物复制品中检测到的3+端成绩单在核苷酸水平（S9A和S9B图）中相互重合。此外，来自两个复制的术语-Seq信号具有高度相关性（皮尔逊的R2在整个基因组中为0.9998（S9C图）。因此，我们得出结论，里博里德没有引入任何噪音的转录研究。随着 RRNA 从S的总 RNA 中成功耗尽。coelicolor具有高 GC 含量 （72.4%），我们能够在 110 成绩单 3+ 末端识别保存的 rho 独立转录终结者主题，这类似于密切相关的 actmycetes S.铁青人（图 5A） [30] 。此外，转录终止的位置发生在保存主题的 T 富区，这与上一份报告 （图 5B）[30]一致。这表明，除RNA-Seq外，核糖核化的方法

图5。从成绩单 3+ 结束位置 （TEP） 的上游序列中识别出的保存的 rho 独立终结者。

（A） 保存在上游的 110 个 TEP 的 32nt 终结者图案包括一个 GC 丰富的茎，然后是 U 丰富的区域。（B） 在图案上放置 TEP。

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表3。术语塞克和核糖体分析中 rrna 的分数与里博里德一起准备。

百分比表示基因组所有映射读数的 rRNA 读数的分数。

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将核糖核糖体分析方法应用于

核糖体分析是一种转录波测序技术，通过捕获核糖体保护片段 （RPF）[31]来调查正在积极翻译的 mRNA。这是最具挑战性的转录基因组分析技术之一，因为它在核糖体不受核糖体保护的RNA酶消化过程中生成高度分散的短rna片段。消耗高度分散的短rna片段是细菌核糖体分析中的一大技术挑战。我们进行了E的核糖体分析。大肠杆菌使用RiboRid方法，这是通过采用以前开发的流线型协议（见方法）修改[32]。最初，该方法未能从 RRPF 中删除 rRNA 片段，因此 95.6% 的测序读数被映射到 rRNA（表 3）。仔细检查测序配置文件表明，rRNA 的特定区域已丰富 （图 6A）。因此，我们设计并补充了六个针对丰富区域的附加探头（附加集 1）（S5表）。特定的RNA片段在RiboRid处理后明显耗尽，附加探头集1（图6B）。然而，另一个rRNA片段仍然存在，并变得更加明显相对于探针集1的目标片段。我们构建了六个额外的探头（附加集 2）和 RiboRid，另外两个探头集将 rRNA 上映射的读数分数降低到 Ribo-Zero 处理样本显示的水平，该水平约为 70% （图 6C和表 3）。编码序列上的核糖体配置文件的元分析显示了核苷酸分辨率的核糖体足迹和暂停启动科顿（图6D），这是可比的Ribo-Zero处理配置文件（S10图），说明RiboRid在核糖体分析[33]的能力。-期刊杂志论文发表

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图 6.大肠杆菌的核糖体RNA（rRNA）的核糖体特征。

（A） 从用标准核糖核生橙色条显示针对碎片的其他寡核苷酸探针（设置 1）。（B） 使用 RiboRid 与附加探头集 1 制备的 RNA 样本的核糖体配置文件。绿色条显示新丰富区域和附加探头集 2。（C） 另外两个特定于富集核糖体保护片段（阴影区域）的探针集可以有效地去除碎片。RPM：每百万次映射读取的读数。（D） 通过不同的读取分配方法，从RiboRid处理的样本中对准开始的核糖体配置文件进行元分析。测序读数的 5+ 或 3+ 末端用于确定核糖体的边界。核糖体密度 （RD） 是编码序列的平均核糖体轮廓，通过在 400 nt 窗口中将每个位置的最大峰值高度的核糖体轮廓划分为正常化。

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综合起来，RiboRid有效地从高度分散的多体RNA样本中取出了rRNA的片段，表明它可用于RNA-Seq以外的复杂转录学研究。研究 3+ 端信息所需的单基对分辨率和 RNA 上的精确多体位置不会因本研究中开发的方法而受到影响。

讨论

根据本研究中提供的转录测序结果，我们展示了有效消耗细菌RNA样本的rRNA的策略。RiboRid 方法是高度先进和有效的方法，能够从高度分散的RNA样本中去除 rRNA，同时不丢失 mRNA 的精确生物学信息。由于在杂交温度和探头设计方面有彻底的实验和协议设计考虑，细菌RNA样品中流行的rRNA物种可以有效地去除，而不会引入任何实验偏差或导致非特异性mRNA去除。此外，在变性温度下短的孵化时间、低浓度的二价镁离子和轻度pH值可防止以前酶方法中观察到的RNA降解[17，18]。更重要的是，高杂交和反应温度防止了探测器与 mRNA 的非特定结合，这在前几种方法中可能使用低杂交温度[13]发生。优化探头编号可以简化协议，以便与市售方法（Ribo-Zero;每反应 80 美元）相比，成本大幅降低（每次反应 10 美元），具有可比或更好的 rRNA 去除效率。虽然这种方法是基于酶RNA消化，但总实验时间只有1小时，动手时间为30分钟：这次可与杂交磁减法相媲美。

RiboRid 是高效的，可以去除 rRNA，在S的效率高达 99.99%。奥雷乌斯样品。然而，在B的情况下。rRNA占所有可读 rRNA 读数的 17%。这可能是因为生物体的AT含量高，在高温下，探针的杂交可能效率低下。但是，这可以通过使用稍高的测序深度来轻松补偿，因为测序成本远远低于 RiboRid 成本与商业方法之间的差额。

为了方便使用这种方法，S1议定书中提供了分步协议。该协议包含执行 RiboRid 反应所需的所有耗材、材料和设备。此外，内部 Python 脚本可通过公共存储库（https://github.com/SBRG/RiboRid_Design）免费获得：此脚本可以为任何自定义基因组或 rRNA 序列设计一个探针集。此外，我们为 RefSeq 数据库 （n = 5，467） 中可用的代表细菌物种设计并沉积了探针套。这种方法提供了一种具有成本效益、快速和强大的替代方法，以耗尽 RRNA，其性能优于以前开发和报告的方法。特别是，这种方法对于常规的大规模转录仪研究很有价值，并减轻了高成本商业套件的负担。

方法

细菌菌株和栽培

四种革兰阴性菌株（大肠杆菌MG1655，克莱布西拉氧托卡KCTC 1686，伪多莫纳斯航空航空PAO1，本研究使用了三种克阳性菌株（金黄色葡萄球菌脉动型USA300菌株TCH1516、欧菌株豪华轿车ATCC 8486和链球菌大肠杆菌M145）。大肠杆菌生长在卢里亚-贝尔塔尼（LB）肉汤在37°C.K. 氧托卡KCTC 1686 生长在 T1 半定义木糖介质（5 克/升酵母提取物，6.6 克/升 （NH） 的 37°C4)2所以4， 8.7 克/升 K2HPO4， 6.8 克/升 KH2波4， 0.25 克/升 MgSO4?7H2O， 0.05 克/升 FESO4?7H2O， 0.001 克/升 ZnSO4?7H2O， 0.001 克/升 MnSO4?H2O， 0.001 g/L CaCl2?2H2O，和20克/升的木糖）。P.阿鲁吉诺萨生长在37°C的M9介质（47.75 m M Na）2HPO4， 22.04 m KH2波4， 8.56 m M NaCl， 18.70 mM NH4Cl， 2 m Mgso4， 和 0.1 m Cacl2） 辅以 2 克/升的简洁。S. aureus是在 cation 调整的穆勒 · 欣顿兄弟 （CA - mhb） 或罗斯韦尔公园纪念研究所 （RPMI） - 1640 介质中培养的， 辅以 10% Lb 介质 （R10lb） 。CA-MHB 含有 2 克/升牛肉输液固体、1.5 克/升淀粉、17.5 克/升氢解剂、25 毫克/升钙和 12.5 毫克/升镁。E.豪华轿车在DSM135介质的37°C下培养，包括1克/升NH4Cl， 2 克/升酵母提取物， 10 克/升 NaHCO3， 0.1 克/升 MgSO4?7H2O， 0.3 克/升碳化物， 10毫微米维生素溶液（4毫克/升生物素，4毫克/升叶酸，20毫克/升苯丙胺-HCl，10毫克/升硫胺-HCl，10毫克/升核黄素，10毫克/升烟酸，10毫克/升潘托硫酸，0.2毫克/升维生素B12， 10 毫克/升p- 氨基苯甲酸， 和 10 毫克/升脂酸）， 4.6 m M KH2波4， 5.4 mM K2HPO4， 4 μM 雷萨祖林， 和 20 mL 微量元素溶液 （1.0 克/升亚硝酸， 3.0 克/升 MgSO4?7H2O， 0.5 克/升 MnSO4?H2O， 1.0 克/升 NaCl， 0.1 克/升 FESO4?7H2O， 180毫克/升 COSO4?7H2O， 0.1 克/升 CACL2?2H2O， 180毫克/升 ZnSO4?7H2O， 10 毫克/升 CuSO4?5H2O， 20毫克/升 卡尔（SO）4)2?12H2O， 10 毫克/升 H3博3， 10毫克/升纳2莫4?2H2O， 30 毫克/升 NiCl2?6H2O， 0.3 毫克/升纳2SeO3?5 H2O， 0.4 毫克/升纳2窝4?2H2O），辅以5克/升葡萄糖。E.豪华轿车在含有 100 mL 培养介质的 150 mL 血清瓶中进行厌氧培养， 用 N 清除2气体在200千帕的压力。B.在脑心输液补充肉汤 （BHIS） 中培养了泰奥陶米龙。一升 BHIS 肉汤含有 37 克脑心输液（BD Difco、富兰克林湖、新泽西州、美国）、5 克酵母提取物、0.5 克/升盐酸乙酰氨基苯甲酸酯单水合物、0.2 mM L-希斯蒂丁、1.9 μM 海明和 1 μg/mL 美纳迪恩，并调整为 pH 8。细胞在含有 100 mL 培养介质的 150 mL 血清瓶中培养，该培养体与 N 一起清除2/CO2（90：10） 气体在 37°C 的 80 kPa 压力下具有激动性。S. coelicolor在 30°C 下以 50 mL R5 介质培养，8 克玻璃珠（直径为 3 毫米）包含在 250 毫升的迷茫 Erlenmeyer 烧瓶中。一升R5介质由5.73克N-Tris（羟基甲基）甲基-2-氨基苯甲酸（TES;pH 7.2）、103克蔗糖、10克葡萄糖、5克酵母提取物、10.12克MgCl组成2?6H2O， 0.25 克 K2所以4， 0.1 克卡萨米诺酸， 0.08 毫克 Zncl2， 0.4 毫克 Fecl3?6H2O， 0.02 毫克 Cucl2?2H2O， 0.02 毫克 Mncl2?4H2O， 0.02 毫克纳2B4O7?10H2O， 和 0.02 毫克 （NH）4)6莫7O24?4H2O.-期刊杂志论文发表

RNA 提取

E的总RNA 。大肠杆菌， K.氧托卡和B。使用RNASnap方法[34]提取了尾微子，稍作修改。简言之，从 5 mL 中指数生长培养（OD） 收集的细胞颗粒600nm? 0.4） 在 100 μL RNASnap 溶液 （18 mM EDTA、 0.025% SDS、1% β-甲醇和 95% 甲酰胺） 中重新使用，并在 95°C 下孵育 7 分钟。根据制造商的说明，悬浮器以 16，000 ×克离心 5 分钟进行离心处理，在透明超高分子中尺寸大于 200 nt 的 RNA 使用 RNA 清洁和浓缩器-5 套件（美国加利福尼亚州欧文市的 Zymo）进行净化。E的总RNA 。豪华轿车从 100 mL 中端增长培养 （OD） 中提取600nm= 1.5）。收集的细胞被重新悬浮在 500 μL 裂解缓冲器 （20 mM Tris-HCl [pH 7.4]， 140 mM NaCl， 5 m M MgCl2， 和 1% 特里顿 X - 100） 和地面使用迫击炮和害虫后， 闪光冻结与液氮。RNA 使用 TRIzol 试剂（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）从地面样品的超高剂中分离出来，然后根据制造商的说明使用 RNA 清洁和浓缩器-5 套件。P的总RNA 。阿鲁吉诺萨和S.尿素是使用快速RNA真菌/细菌微普雷普套件（Zymo）从3 mL培养物中提取的，该培养物在OD中采样600nm0.4.简言之，细胞颗粒在 800 μL RNA 裂解缓冲器中重新悬浮。然后，悬念被转移到ZR BashingBead裂解管（0.1和0.5毫米），并在珠子搅拌机中均质。清除的 lysate （400 μL） 中的 RNA 通过柱子净化进行纯化。S.总RNA 。在早期指数、过渡、晚指数和静止生长阶段（OD）使用热酚方法从 50 mL 培养样本中提取了 coelicolor600nm= 0.6、2、3.5 和 5）。首先，收集的细胞在溶液 1 （25 mM Tris-HCl [pH 8.0]、10 mM EDTA、50 mM 葡萄糖和 2 毫克/mL 溶酶中重新使用），并在 30°C 下孵育 10 分钟。 通过离心去除混合物的超高分子，细胞颗粒在溶液2（50mM醋酸钠[pH 5.2]，10mM EDTA和1%的二乙酸钠）中重新使用。悬浮物与同等量的酚：氯仿（5：1）溶液混合，在65°C下孵育5分钟。 RNA被水相的异丙酚沉淀物分离，并通过离心分离。

抗RNA寡核苷酸探针（AROPs）设计

使用的探针是32 nt长脱氧核苷酸反向补充rRNA与融化温度至少3°C高于rRNA消化反应温度（68°C）。反rna寡核苷酸探测器是使用内部Python程序（https://github.com/SBRG/RiboRid_Design）设计的。该计划可以导入到其他管道中，也可以作为命令线的独立程序执行。作为基本输入，脚本将包含 GenBank 文件（带有注释 rRNA）或包含目标生物体的 rRNA 序列的 FASTA 文件。鉴于任一格式的 rRNA 序列，脚本首先为 rRNA 构建一个一致序列。然后，这些共识序列用于构建DNA探针库。要为每个 rRNA 类型构建库，我们从 50 开始thrDNA 的序列位置。第一个探头被定义为从此位置开始的DNA序列，并且是用户定义的探针的长度。默认探头长度为 32，探头从位置 50 开始，到位置 81 结束。如果探针的熔化温度高于定义的熔化阈值（本研究中使用的 68°C），则脚本会查找下游的下一个探头，该探头之间的用户定义的最大间隙（默认值为 50 nt）。通常，有效去除 rRNA（每 40/80 nt 一个探头）需要每 k b rRNA 12/25 个探头。探测器的熔化温度是使用奥利戈分析器工具（IDT，珊瑚维尔，IA，美国）计算的。如果探测器的熔化温度低于阈值，则脚本将寻找另一个探测器，直至启动搜索位置上游用户定义的最大搜索空间（默认值为 10 bp），并以最高熔化温度记录探测器。请注意，即使探测器的熔化温度低于阈值，也记录了熔化温度最高的探头。按照这些步骤，脚本会以步进方式生成探头，直到覆盖所有 rRNA。设计过程完成后，设计探头序列将记录在 FASTA 文件中，并将与每个探头相关的元数据（包含其熔化温度、起始位置、端位置等信息）记录在文本文件中.csv。使用该脚本，32 个 nt 长探针的熔化温度在 98.3% 的设计尝试中高于 68°C。在少数情况下（1.7%），通过手动将探针长度从 28 nt 调整到 43 nt（特别是在 AT 丰富的前 rRNA 区域），满足了熔化温度标准。

里博里德

在执行 rRNA 耗竭之前，使用 Qubit RNA HS 检测套件（热）和 Qubit 2.0 荧压仪 （热）测量 RNA 含量。RNA 提取物在 37°C 下接受 DNase I 处理，在 15 μL 反应混合物中去除 DNA 污染 10 分钟，其中含有 0.5+1 μg 总RNA、1.5 μL 10× DNase I 缓冲器和 2 U 无 RNase DNase I。然后，DNase I 在 75°C 下失活了 10 分钟，增加了 15 微升混合酶补充缓冲器，包括 90 mM Tris-HCl （pH 7.5） 和 200 mM KCl。ArOP 混合物 （1 μL） 包含每个探头的 5 pmol 和 100 m M MgCl2被添加到 Dnase I 处理RNA 样本中。为了将 ArOP 混合到 RNA，RNA-ArOP 混合物的温度被加热到 90°C 1s，并在热循环器上冷却到 65°C。当混合物的温度达到65°C时，在室温下添加了10U杂交酶热电压RNase H（美国威斯康星州米德尔顿市卢西根）预热。反应在 65°C 下进行 20 分钟，在 90°C 进行 1 秒，将 ArOP 重新润湿到剩余的 rRNA，然后在 65°C 下再进行 10 分钟。然后，使用 RNA 清洁和浓缩器套件提取大于 200 nt 的 RNA。保存了核酸结合列，供以后使用。其余的 ArOPs 由 Dnase I 治疗移除，反应由 10 U 无 Rnase Dnase I 和 5 μL 10 组成× DNase I 缓冲器，总反应量为 50 μL。DNase I 反应是在 25、30、35、40 和 45°C 连续 5 分钟孵化下进行的。 使用从上次清理中保存的核酸结合列再次用 RNA 清洁和浓缩剂套件净化了反应。 S1和S2协议中提供了分步协议。基于柱的RNA纯化步骤可以用固相可逆固定（SPRI）珠基纯化方法取代。在这项研究中，根据制造商的说明，RNA是使用1.8卷清洁DNA和RNA SPRI珠（斗牛犬生物，朴次茅斯，NH，美国）进行净化的。当使用不参与下游反应（反转录、适配器粘合和 PCR）的 3+-C3 碳垫片修改的 ArOP 时，DNase I 治疗步骤用于在未执行混合酶反应后去除残留的 AROP。

RNA-塞克

RNA-Seq 库由大约 100 ng rRNA 耗尽的 RNA 构建，使用 TruSeq 链状 mRNA LT 样品准备套件（美国圣地亚哥的伊卢米纳）或 KAPA RNA 超准备套件（瑞士巴塞尔的罗氏）。构建的测序库使用配备 Qubit 2.0 荧光仪的 Qubit dsDNA HS 检测套件和配备高灵敏度 D1000 屏幕磁带（安捷伦）的磁带站 2200（美国加利福尼亚州圣克拉拉）进行量化。该库使用 Illumina 平台进行排序。关于NGS（运行配方和仪器）的信息汇总在S6表中。-期刊杂志论文发表

学期赛克

总RNA提取物包含5微克总RNA在37°C下治疗15分钟，在50微升反应包括2U无RSAse DNase I和5 μL 10×DNase I缓冲。术语-Seq 图书馆是按照先前描述的[29]建造的。简言之，5+DNA适配器在25μL反应混合物中将5+DNA适配器连接到1微克的聚合RNA，其中含有150 pmol氨基阻塞3+DNA适配器（5+-p-NNAGATCGAGCGGGGTGT-Ammo），25U T4RNA利加塞1（NEB， 伊普斯威奇， MA， 美国）， 2.5 μL 10× T4 RNA 利加塞 1 缓冲区， 2.5 μL 10 mm ATP， 2 μL 二甲基硫氧化物， 和 9.5 μL 聚乙烯乙二醇 8000.反应混合物在23°C孵育2.5小时，然后使用2.2×卷AMPure XP珠子（美国马贝弗利阿根考特）进行RNA净化。然后，适配器利德RNA受到基于列的RiboRid方法的约束，如上所述。然后，rRNA 耗尽的 RNA 在 72°C 下孵育为 90s，总反应量为 1 μL RNA 碎片试剂，然后使用 2.2 × 卷 AMPure XP 珠进行 RNA 纯化。然后，cDNA 使用 200 U 超级脚本 III 反向转录酶和 10 pmol 氨基阻塞反转录引物（5-TTCTACACTCCACACACCTCTTC）从 rRNA 耗尽的 RNA 中合成，总反应量为 30 μL。合成的 cDNA 用 1.5 × 卷 AMPure XP 珠子净化。然后，cDNA 3 适配器（5-p-NNAGATCGGAGAGAGAGAGACCACCCAC-AmMO）在 23°C 时被粘合到 3-DNA 适配器结结混合物中，达到 8 小时。 结核产品使用1.8×卷AMPure XP珠子进行纯化，并使用普西翁高保真DNA聚合酶（热）进行放大。该库使用 Illumina 平台进行排序。关于NGS（运行配方和仪器）的信息汇总在S6表中。

使用 Ribo-Zero 进行核糖体分析

核糖体分析是使用上一份报告中描述的方法进行的[32]。简言之，50 mL E。大肠杆菌培养物是在指数生长阶段用氯霉素（34毫克/毫升）治疗5分钟后收集的。细胞被闪光冻结与0.5 mL裂解缓冲器（1% 特里顿X-100，34微克/mL氯霉素，133 mM NaCl，4.75 m MgCl2， 和 19 mm 特里斯 - 赫克， ph 7.5） 和莱什使用迫击炮和害虫。然后，含有100微克RNA的超高纳坦剂用2，000个微球核酸核酸（MNase;MNase;NEB）。使用 Illustra MicroSpin S-400 HR 列（GE 医疗保健公司、芝加哥、伊利诺伊州、美国）从 MNase 消化的样品中回收聚物，然后提取苯酚：氯仿：同酰酒精提取。rRNA 是根据制造商的说明使用 Ribo-Zero rRNA 去除套件从 1 μg 聚体保护的 RNA 中删除的。RRNA 减去的RNA样品通过在 37°C 下将 10 个 U T4 多核苷酸激酶 （NEB） 处理 1 小时，并用 RNeasy MinElute 柱（德国希尔登的 Qiagen）纯化。测序库是使用 NEBNext 小型 RNA 库针对 Illumina （NEB） 的准备集，根据制造商的说明，使用磷酸化 RNA 样本准备的。该库使用 Illumina 平台进行排序。关于NGS（运行配方和仪器）的信息汇总在S6表中。

使用里博里德的核糖体分析

聚索RNA是如前所述。多糖RNA样品在37°C下用10U T4多核苷酸激酶处理1小时，并用RNeasy MinElute柱纯化，在没有rna去除的情况下受到磷酸化。5° 测序适配器根据制造商的说明，使用 NEBNext 小型 RNA 库准备集连接到磷酸化 RNA 样品上。适配器结合后，RNA样本受到基于柱的RiboRid反应与二氧改性AROP和没有DNase I治疗。RNA 纯化步骤使用 RNA 清洁和浓缩器套件执行，用于 RNA 尺寸> 17 nt。经二氧改性ArOPs的培养品是在37°C下孵育5.4 nmol（每个探针50 pmol），4小时，50U终端脱氧核苷酸转移酶（TdT：热），20 μL 5×反应缓冲器，20 mM ddNTP（作为5mM每个dATP，ddTTP，ddGTP和ddCTP的混合物）在100微升反应混合物。改装后的 ArOP 使用制造商描述的奥利戈清洁和浓缩器套件 （Zymo） 进行净化。然后，使用 NEBNext 小型 RNA 库准备集对 Illumina 进行 3° RNA 适配器结化、反向转录和测序库放大。该库使用 Illumina 平台进行排序。关于NGS（运行配方和仪器）的信息汇总在S6表中。-期刊杂志论文发表

数据处理

测序数据在 CLC 基因组学工作台（丹麦奥胡斯 CLC Bio）上处理。原始读数使用 NGS 核心工具中的修剪序列工具进行修剪，质量限制为 0.05。丢弃了两种以上模棱两可的核苷酸读取，并使用以下参数在参考基因组或 rRNA 上绘制了质量修剪读取：不匹配成本 2，indel 成本 3，相似性和长度分数为 0.9。参考基因组序列从NCBI下载，加入编号NC_000913.3（E。大肠杆菌）， NC_016612 （K.催产素），NC_002516.2（P.阿鲁吉诺萨）， NC_010079 （S.奥雷乌斯NC_010063（S.奥雷乌斯质粒pUSA300HOUMR），NC_012417（S.奥雷乌斯质粒pUSA01-HOU），NC_004663（B.泰奥陶微子染色体DNA），NC_004703.1（B.台陶微粒质粒DNA），NZ_CP019962.1（E.豪华轿车）， 和NC_003888.3（S.科利色）。基因表达水平是通过计算基因（抗感）的链特异性读数和使用DESeq2[20]正常化计算的。非特异性 ArOP 结合是通过独立 BLASTN 探头与缺乏 rRNA 序列的基因组序列对齐来预测的。对于主题分析，使用 MEME 软件 （v5.0.4） 使用每个序列的零或一个站点模式分析成绩单 3+ 末端上游 40 nt 至下游 20 nt 的 DNA 序列[35]。发现的图案的电子值为 4.2 × 10+55并且每个序列都对齐到p值低于 1.32 × 10 的图案+4.核糖体配置文件的元分析是使用 STATR 管道进行的，如前所述[36]。威尔科克森的排名和测试是通过统计分析使用SciPy包 -37]

支持信息

基于列的里博里德。

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无花果份额

S1 协议。基于列的里博里德。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s001

（PDF）

S2 协议。C3 间隔修改了阿罗普和基于 Spri 的里博里德。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s002

（PDF）

S1 图。核糖核化物治疗前后的电泳大小分析。

（A） 使用的总RNA样本。16S 和 23S rRNA 的频段已注释。（B） 核糖没有可观测到的rna 和 mRNA 的显著退化。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s003

（巴布亚新几内亚）

S2 图。使用不同 rRNA 去除方法制备的 RNA 样本的 RNA-Seq 配置文件。

RNA-Seq 配置文件上 （A） rpsa基因和 （B） pdhr-王牌-lpd operon 。（C） 对rpsA基因上的 RNA-Seq 配置文件的累积读数进行配对比较。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s004

（巴布亚新几内亚）

S3 图。阅读从不同 rRNA 去除方法制备的 RNA 样本中执行的 RNA-Seq 的长度分布。

阅读长度分布的 （A） rRNA 读取和 （B） 非 rRNA 读取检测的RNA样本的RNA-Seq没有 rRNA 删除或处理与 MICROB快车。阅读 （C） rRNA 读取和 （D） 非 rRNA 读取的长度分布，由 RNA-Seq 检测到由 Ribo-Zero、RiboErase 或 RiboRid 编写的 RNA 样本。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s005

（巴布亚新几内亚）

S4 图。使用三种不同的 rRNA 耗竭方法之一的 RNA-Seq 库构建的可重复性。

（A） 配对皮尔逊的相关性 （R）2样品和生物复制之间。（B） 散射图，显示由RNA-Seq从不同的 rRNA 耗竭方法测量的 mRNA 表达水平。每个圆表示单个基因。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s006

（巴布亚新几内亚）

S5 图。采用不同 rRNA 去除方法制备的 RNA-Seq 样本的平均标准偏差图。-期刊杂志论文发表

平均值和标准偏差从日志 2 转换的伪计数（日志）计算2（表达级别+1）。排名表示按上升顺序排列的平均表达等级（排名越高，平均表达越高）。橙色线显示标准偏差的移动平均值，窗口大小为 50 个基因。n： 检测到的基因数量。平均CV：检测到的基因变异的平均系数（标准偏差除以基因的平均表达）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s007

（巴布亚新几内亚）

S6 图。使用不同实验条件的 Riborid 使用 RNA 构建的 RNA-Seq 库的可重复性。

（A） RNA-Seq 的可重复性与输入 RNA、使用的 ArOP 量和执行 RiboRid 的反应温度的不同组合。（B） 通过RNA-Seq结果的两种不同技术复制来测量的基因表达水平之间的配对比较。（C） 使用列或采用 C3 垫片修改的 AROPs 和基于 SPRI 珠子的纯化方法从标准 RiboRid 方法中制备的 RNA-Seq 的可重复性。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s008

（巴布亚新几内亚）

S7 图。用不同治疗方法从RNA样本中对RNA-Seq测量的基因表达水平进行配对比较。

序列相似度不同的基因（E-值：BLASTN）被比较为一组。E<1;≥15 nt： E值低于 1 的基因 （与 Arop 的 BLASTN 对齐）， 并且连续匹配 15 nt 或更多。ns： 折叠更改分布之间的差异并不显著（威尔科克森的排名和测试）。框限制、胡须和中心线表示 1圣和 3rd四分位数， 10th和 90th百分位数和分布中位数。。。点是单个基因。受试基因的数量在图表上方表示。ns： 不重要 （威尔科克森的排名和测试） 。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s009

（巴布亚新几内亚）

S8 图。P的 RNA-Seq 的可重复性。阿鲁吉诺萨， S.奥雷乌斯和B。泰奥陶米龙。

配对皮尔逊的相关性 （R）2（A） P之间的生物复制。阿鲁吉诺萨， （B） S.奥雷乌斯和（C）B 。泰奥陶米龙。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s010

（巴布亚新几内亚）

S9 图。术语-Seq的两种生物复制品的可重复性。

编码核糖体蛋白 （A） Rplt 和 （B） Rpmj 的基因的术语 Seq 配置文件。这两种生物复制物相互关联，具有单核苷酸精度，没有任何明显的噪音。（C） 两种生物复制品的术语-Seq信号的配对比较显示线性相关性（皮尔逊的R20.9998）整个基因组。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s011

（巴布亚新几内亚）

S10 图。通过不同的读取分配方法对开始时对齐的Ribo-零处理样品的核糖体特征进行元分析。

测序读数的 5+ 或 3+ 末端用于确定核糖体的边界。核糖体密度 （RD） 是编码序列的平均核糖体轮廓，通过在 400 nt 窗口中将每个位置的最大峰值高度的核糖体轮廓划分为正常化。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s012

（巴布亚新几内亚）

S1 表。本研究中使用的测序方法。

SE：单端食谱。PE：双端食谱。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s013

（XLSX）

S2 表。E.反RNA寡核苷酸探针。大肠杆菌。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s014

（XLSX）

S3 表。预测的E的绑定。大肠杆菌抗RNA寡核苷酸探针对mRNA。-期刊杂志论文发表

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s015

（XLSX）

S4 表。C3-太空器改装了E型反RNA寡核苷酸探测器。大肠杆菌。

3SpC3：C3 间隔在 3+ 端的修改。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s016

（XLSX）

S5 表。本研究中用于各种细菌物种的抗RNA寡核苷酸探针。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s017

（XLSX）

S6 表。额外的 ArOP 针对核糖体分析中核糖体 RNA 的丰富区域。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s018

（XLSX）

S7 表。数字数据支持数字。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009821.s019

（XLSX）

确认

我们要感谢季元查女士和基俊贞教授提供K文化。氧托卡KCTC 1686.此外，我们要感谢康三金先生提供B文化。泰奥陶米龙VPI-5482。

引用

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00006. 6.庞 X 、周 D 、宋 Y 、培 D 、王 J 、郭 Z 等人。通过磁性捕获-杂交法进行细菌mRNA纯化。微生物免疫。2004;48(2):91–96.下午：14978333

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00007. 7.库尔维纳 Ph， 盖格勒 Ck， 劳布 Mt 。在RNA测序研究中，一种简单、经济高效、可靠的rRNA耗竭方法。mbio 。2020;11(2).

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00008. 8.康 Y， 诺里斯 Mh， 扎日基 - 西克 J， 尼尔曼 Wc， 多纳奇 Sp， 黄 Tt 。从单个细菌中放大的脚本放大，用于转录体分析。基因组再一项 2011;21 （6）：925+935.下午：21536723

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00009. 9.朱利多夫·帕、博格达诺娃·埃亚、什切格洛夫·阿斯、瓦格纳·LL、哈斯佩科夫·格勒、科热米亚科·VB等人。使用堪察加蟹复式核素酶进行简单的 cDNA 规范化。核酸 Res. 2004：32 （3）：e37.下午：14973331

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00010. 10.易 H 、赵 YJ 、胜 S 、李杰、金宇 H 、金 S 等人。复式特异性核酸酶高效去除原核 RNA 的原核酸 RNA-seq。核酸 Res. 2011：39 （20）：e140.下午：21880599

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11.麦克格拉斯 Kc， 托马斯霍尔 Sr， 程 Ct， 利奥 L， 亚历克萨 A， 施密特 S， 等等。环境微生物群落的mRNA隔离和分析。J 微生物方法。2008;75(2):172–176.下午：18582973-期刊杂志论文发表

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00012. 12.旺萨努瓦特 C， Heom KA， 刘 E， 奥马利马， 戴 SS. 高效和经济高效的细菌 mRNA 测序从低输入样品通过核糖核流失.BMC基因组学。2020;21(1):717.下午：33066726

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00013. 13.黄 Y ， 谢斯鲁， 考夫曼 A ，王 H 。可扩展且具有成本效益的核素酶基 rRNA 消耗用于转录学。核酸 Res. 2020：48 （4）：e20.下午：31879761

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00014. 14.阿布海达尔 Mg， 伊万诺夫 Ig 。缓冲器和镁离子的联合催化活性促进的非酶RNA水解。Z 纳图尔福施 C J 比奥西。1999;54(7–8):542–548.下午：10488562

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00015. 15.彼得罗娃OE，加西亚-阿尔卡尔德F，赞帕洛尼C，索尔K.比较评价rRNA耗竭程序，以改进细菌生物膜和混合病原体培养转录体的分析。科学代表 2017;7：41114.下午：28117413

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00016. 16.吉安努科斯 G， 丘拉 Dm， 黄 K， 哈斯 Bj， 伊扎德 J， 莱文 Jz 等人。高效和坚固的RNA-seq工艺，用于培养细菌和复杂的社区转录体。基因组生物 2012：13 （3）：R23.下午：22455878

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00017. 17.普雷扎 G， 赫克尔 T， 迪特里希 S， 洪伯格 C， 韦斯特曼 Aj， 沃格尔 J. 改进细菌RNA - seq 由 Cas9 基于核糖体 RNA 读数的消耗。核糖核酸。2020;26(8):1069–1078.下午：32345633

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00018. 18.津施泰因 B， 万根 Jr， 华 B， 绿色 R. 核糖介质消耗偏差在核糖体脚印分析库。核糖核酸。2020;26(10):1481–1488.下午：32503920

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00019. 19.麦卡锡 Dj， 陈 Y， 斯密斯 Gk 。多因子RNA-Seq实验与生物变异的微分表达分析。核酸 Res. 2012;40 （10）：4288+4297.下午：22287627

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00020. 20.爱 MI， Huber W， 安德斯 S. 适度估计折叠变化和分散的 RNA - seq 数据与 DESeq2 。基因组生物 2014：15 （12）：550.下午：25516281

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00021. 21.盖尔斯 AC， 琼斯 RN， Turnidge J， 雷尼 R， 兰法尔 R.伪多莫纳斯航空隔离的特征： 发生率， 抗菌易感性模式， 和分子键入全球哨兵抗菌监测计划， 1997- 1999.克林感染迪斯 2001;32 Suppl 2：S146+155.

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00022. 22.斯托弗 Ck， 帕姆 Xq， 欧文阿尔， 三口 Sd， 沃伦纳 P， 希奇 Mj， 等等。伪多莫纳斯航空PAO1的完整基因组序列，一种机会型病原体。自然界。2000;406(6799):959–964.下午：10984043

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00023. 23.德雷辛斯基S.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：一种进化、流行病学和治疗性奥德赛。克林感染迪斯 2005：40 （4）：562+573.下午：15712079

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00024. 24.高地人斯克、赫尔滕克、秦 X 、江 H 、耶拉普拉加达 S 、小梅森 Eo 等人。微妙的基因变化增强了耐甲氧西林和敏感金黄色葡萄球菌的毒性。BMC微生物。2007;7:99.下午：17986343

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00025. 25.宋 Y ， 赵 BK. 化疗血清血细胞致病丁醇生产桉树ATCC 8486 的基因组序列草案。基因组年鉴。2015;3(1).下午：25676768

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00026. 26.信仰 Jj， 古鲁格 Jl， 夏博诺 M， 苏布拉马尼亚 S， 西多夫 H， 古德曼阿尔， 等等。人类肠道微生物群的长期稳定性。科学。2013;341(6141):1237439.下午：23828941

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00027. 27.韦克斯勒股份公司，古德曼阿尔。业内人士的观点：细菌作为进入微生物群的窗口。纳特微生物。2017;2:17026.下午：28440278

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28.达尔 D， 沙米尔 M， 梅林 Jr， 库特罗 M， 斯特恩 - 吉诺萨尔 N， 科萨特 P， 等等。术语 seq 揭示了细菌中抗生素耐药性的丰富核调控。科学。2016：352 （6282）：aad9822.下午：27120414-期刊杂志论文发表

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00029. 29.李 Y 、李 N 、黄 S 、金 W 、郑 Y 、乔 S 等人。链霉细胞基因组中RNA成绩单的5+和3+边界的基因组尺度测定。科学数据。2020;7(1):436.下午：33319794

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00030. 30.李 Y 、 李 N 、 郑 Y 、 黄 S 、 金 W 、 赵 S 等人。链球菌铁皮瘤TK24的转录单元架构。前微生物。2019;10:2074.下午：31555254

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00031. 31.英戈利亚 Nt， 盖马加米 S， 纽曼 Jr， 韦斯曼 Js 。使用核苷酸分析，在用核苷酸分辨率进行转化体内的全基因组分析。科学。2009;324(5924):218–223.下午：19213877

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00032. 32.拉蒂夫 H、 苏宾 R 、谭 J 、布伦克 E 、莱赫纳 A 、曾勒 K 等人。用于微生物特征的流线型核糖体特征分析协议。生物技术。2015;58(6):329–332.下午：26054770

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00033. 33.伍尔斯滕胡尔姆 Cj， 盖多什 Nr， 绿色 R， 布斯柯克 Ar. 高精度分析转化暂停通过核糖体分析缺乏 Efp 的细菌。细胞代表 2015;11 （1）：13+21.下午：25843707

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00034. 34.稳定MB，阿格拉瓦尔A，鲍登KE，纳西尔R，莫汉蒂BK，米格尔RB，等等RNASnap：一种快速，定量和廉价，方法，将总RNA与细菌分离。核酸 Res. 2012：40 （20）：e156.下午：22821568

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35.贝利 Tl， 博登 M， 布斯克法， 弗里斯 M， 格兰特 Ce， 克莱门蒂 L， 等人 Meme Suite： 主题发现和搜索的工具。核酸 Res. 2009;37 （网络服务器问题）：W202+208.下午：19458158-期刊杂志论文发表

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00036. 36.崔 D， 帕尔松 B， 乔 Bk. Statr： 细菌中里博 - 塞克的简单分析管道。J 微生物。2020;58(3):217–226.下午：31989542

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00037. 37.奥利芬特 · 特用于科学计算的 Python 。计算科学英 2007;9：10+20.

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