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《NuA4 与 DNA 损伤部位的非同源端连接机制的对抗关系-医学论文发表》

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《NuA4 与 DNA 损伤部位的非同源端连接机制的对抗关系-医学论文发表》期刊在线投稿系统

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《NuA4 与 DNA 损伤部位的非同源端连接机制的对抗关系-医学论文发表》期刊简介

NuA4 与 DNA 损伤部位的非同源端连接机制的对抗关系-医学论文发表

· 萨拉尔·艾哈迈德

· 瓦莱丽·塞塔，

· 薛成，

· 盖尔·布瑞昆

· 瓦西莱亚·萨蓬齐

· 穆罕默德·阿尔塔夫

· 雅克·塞泰

· 发布时间： 2021年9月20日

抽象

NuA4乙酰转移酶复合物，除了在基因调控中已知的作用外，还直接参与了DNA双链断裂（DSB）的修复，有利于在细胞周期内S/G2中的同源重组（HR）。在这里，我们调查NuA4与非同源端加入（NHEJ）因素的对抗关系。我们表明，萌芽酵母Rad9，53BP1矫形术，可以抑制NuA4乙酰转移酶活性时，绑定到色质体外。虽然我们之前报告说，NuA4 是在 S/G2 阶段在 DSB 招募的，但当 Rad9 和 NHEJ 因子 Yku80 和 Nej1 的基因发生突变时，我们还可以检测其在 G1 中的招募情况。同时结合单链DNA结合蛋白RPA和Rad52，表明G1的DNA末端剖析以及人力资源机制的招募。此次 NuA4 在 G1 中招聘到 Dsbs 取决于 Mre11 - Rad50 - xrs2 （MRX）和 Lcd1 / ddc2，与 Nhej 突变体的超切除表型有关。它还涉及 NuA4 在 Rad52 沿线基于剖腹的单链退火（SSA）修复路径中。有趣的是，我们确定了NuA4、Nej1和Yku80的两个新的非希石乙酰化目标。Nej1 的乙酰模仿突变体抑制 NHEJ 修复 DNA 断裂，减少其与其他核心 NHEJ 因子（如 Yku80 和 Lif1）的相互作用，并有利于端切除。总之，这些结果在修复路径选择中建立了 NuA4 和 NHEJ 因子的强烈对等对立调节功能，并建议 NuA4 在 G1 中可能发生某些 DNA 端切除的情况下，在替代修复机制中发挥作用。

作者摘要

DNA双链断裂（DSB）是DNA损伤最有害的形式之一。细胞采用两种主要的修复途径来解决 DSB：同源重组（HR）和非同源端连接（NHEJ）。在这里，我们想进一步剖析NuA4（Histone H4的核体乙酰转移酶）复合物在DSB修复中所扮演的角色。在这里，我们表明，确实萌芽酵母NuA4和NHEJ修复路径的成分有一个敌对的关系。删除 NHEJ 组件可通过两个独立机制增加 DSB 附近的 NuA4 的招募，其中 NuA4 赞成通过单链退火（SSA）进行最终切除过程，这是一种基于同源的替代修复途径。此外，我们还提出了两个NHEJ核心组件作为NuA4乙酰转移酶活动的新目标，并建议这些乙酰化事件可以拆解NHEJ维修综合体从DSB，赞成由HR修复。我们的研究证明了 NuA4 在调整 DSB 修复路径选择中的重要性。

引文：Ahmad S， Cété V，程 X，鲍里斯昆 G，萨蓬齐五世，阿尔塔夫 M 等人（2021） NuA4 与 DNA 损伤点的非同源端连接机制的敌对关系。PLoS基因 17 （9）： e1009816.https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816-医学论文发表

编辑：洛林·西明顿，美国哥伦比亚大学

接收：2021年2月7日：已接受：2021年9月9日;已发布：2021 年 9 月 20 日

数据可用性：所有相关数据均在手稿及其支持信息文件中。

资金：这项工作得到了加拿大卫生研究所（cihr-irsc.gc.ca）对J.C（FDN-143314）的赠款的支持。S.A. 举行了魁北克大学（fondationduchudequebec.org）学生会和.C魁北克-圣德意志基金会（www.frqs.gouv.qc.ca）学生会。J.C担任加拿大色度素生物学和分子表观遗传学研究主席（www.chairs-chaires.gc.ca）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备手稿方面没有作用。

竞争利益：作者宣称不存在相互竞争的利益。

介绍

细胞的基因组完整性不断受到来自各种内源和外源的攻击。最有害的表现之一是DNA双链断裂（DSB），因为未能修复DSB可能导致遗传信息的丢失，并成为肿瘤进展在更高的真核生物[1，2]的根本原因。细胞有两个主要途径来修复DSB。首先，在细胞周期的S/G2阶段进行同源重组（HR），依靠5'-3'切除破碎的DNA末端，并使用姐妹染色体上的同源性作为修复模板[3]。其次，非同源端连接（NHEJ）在整个细胞周期中执行，但它是 G1 阶段的主要修复形式。NHEJ 可能在结结之前使用或可能不会使用处理断裂端，使其成为比 HR[4]更容易出错的途径。单元格还具有备用修复路径，如单绞线（SSA）和 alt-NHEJ，它们分别与 HR 和 NHEJ 共享一些组件。这些通路在特殊条件下发挥作用，当主要修复途径因基因突变、没有姐妹染色体和细胞周期状态而受阻时[5，6]。

酵母NuA4组石乙酰转移酶复合物对细胞生存至关重要，由13个亚单位组成，与哺乳动物TIP60/p400复合物同源[7，8]。NuA4/TIP60 乙酰酸盐 H4 和 H2A N 终端尾部在染色质，以及变种 H2A。X/H2A。Z[9]13] 。NuA4/TIP60 在转录调节、启动和拉长步骤（14、15）中的作用已得到很好的记录。NuA4 也被称为乙酰酸盐非结石蛋白，并调节各种细胞过程，如自噬和葡萄糖生成[16，17]。Esa1、酵母催化亚基的温度敏感突变体，以及H4和H2A靶赖氨酸残留物的点突变体，在存在各种DNA破坏性化学制剂的情况下显示出生长缺陷，这巩固了NuA4和乙酰化对DNA断裂修复的重要性[7，9，1820]。NuA4 已被证明在将染色质改造者（如 INO80、SWI/SNF 和 RSC）招募到 DNA 修复站点[20+22]方面发挥了重要作用。我们已经表明，NuA4被MRS综合体（Mre11-Rad50-Xrs2）迅速招募到DSB，这很可能是通过DNA损伤引起的磷依赖性与Xrs2蛋白的相互作用[23]。最近，我们发现 NuA4 被招募到 DSBs 沿另一个重要的 HAT 复合体， SAGA，他们的联合行动是必不可少的 DNA 端剖截面发生和 HR[24]。此外，我们已经表明，NuA4直接乙酰酸盐RPA调节其动态关联与sDNA在维修过程中[23]。NuA4也涉嫌反对Rad9检查站的活动后，DNA损害在萌芽酵母[10，25]。这与哺乳动物 TIP60 复合物平行，该复合物在 DSB 附近与 53BP1 （酵母 Rad9 同源体）对抗，以有利于 HR[26，27]的修复。与TATM的Tip60相关乙酰化和激活也被认为是参与DNA损伤信号[28]。

在这项研究中，我们剖析了NuA4与NHEJ修复途径的功能关系。我们表明，在去除 Rad9 和 NHEJ 因子后，NuA4 在细胞周期的 G1 阶段，与 DNA 端切除一起，以 MRX-和 Lcd1/Ddc2 依赖的方式强烈地被招募到 DSBS 中。NuA4乙酰转移酶活性有缺陷的条件降低了NHEJ突变体的超切除表型，在G1基于切除的SSA修复通路中牵连到NuA4。此外，NHEJ核心因子Nej1和Yku80是NuA4依赖乙酰化的目标，这降低了NHEJ的效率，扰乱了物理相互作用，并增加了剖析。我们的研究结果支持了 NuA4 和 NHEJ 机械相互对立的模型，NuA4 赞成通过基于剖析的路径修复 DSB，部分通过抑制 NHEJ 因子。

结果

删除 Nhej 因素导致在 G1 的 Dsbs 招聘 Nua4

酵母Rad9，类似于其哺乳动物同源53BP1，已知会减慢或保持DNA末端切除率的检查[29]32]。53BP1 已被证明与哺乳动物 NuA4/TIP60[27]有敌对关系。他们竞相绑定 H4K20me 标记和目标 H2AK15 修改，从而影响他们选择 DSB 修复路径[26]。在酵母中，NuA4 突变细胞在 G2 阶段以不允许的温度以 Rad9 依赖的方式[10]积累。此外，在乙酰化方面有缺陷的 NuA4 突变体显示，DNA 损伤后，依赖 Rad9 的 G1 检查点显著增加，这暗示了 NuA4 在 DNA 损伤反应期间与 Rad9 的对抗关系[25]。

酵母 Rad9 通过双价相互作用将 DSBs 附近的色度素与两个 histone 标记结合， H3K79me 由其都督域和 H2as129ph 由其 BRCT 域（+H2A）[33+35]。为了确定Rad9与色质结合是否会影响NuA4活性（图1A），我们使用用DNA破坏剂彩信处理的细胞中纯化的原生色度进行体外平石乙酰转移酶（HAT）检测。野生类型和都督或BRCT突变重组Rad9（aa639-1308，S1A图）孵育与色度素和纯化原生NuA4复合物，其次是HAT检测与放射性乙酰-CoA。野生类型Rad9能够显著阻止核素的乙酰化由NuA4，而Rad9-Y798Q和Rad9-K1088E在这样做的效率明显降低，反映了他们结合染色质的能力下降（图1B和S1B）。-医学论文发表

图1。Nhej 因素抑制了 Nua4 的招聘，并在 G1 的 Dsb 上结束剖析。

（A）实验的示意图表示（B）。野生类型 Rad9 与色度素结合，抑制 NuA4 乙酰化组蛋白，而 Rad9 突变体无法有效地结合染色质，从而导致 NuA4 的组蛋白乙酰化。（B）体外HAT检测显示Rad9使用从彩信处理细胞中纯化的酵母色素和重组Rad9（野生类型、都督-Y798Q和BRCT-K1088E域突变体S1A图）抑制NuA4乙酰转移酶活性。重组Rad9野生类型和突变体孵育了500ng的染色质。之后，NuA4 随3H-乙酰-CoA随后在P81膜上发现并闪烁计数。错误条表示重复反应的范围。只有0.5ug的WT和都督突变体显示乙酰化与控制（BSA）相比在统计上显著下降。较高的 Rad9 量会导致更多的抑制（S1B 图）。（C-H）ChIP-qPCR 显示，与 G1 中由 HO 诱导的 DSB 的野生类型相比，在rad9+ （C-D）、yku80 +1 +9（E-F）和nej1+（G-H）中招募的 NuA4 （Eaf1 子联盟）和 Rfa1 （RPA）有所增加。使用 Eaf1 和 Rfa1 抗体执行 ChIP-qPCR 分析。具有bar1+ 背景的细胞在 G1 阶段使用α因子在 YP-Raffinose 中同步 6 小时，然后加入 3 小时的乳糖来诱导 DSB。这些数据表示两个独立的生物复制，错误条表示复制之间的范围。使用的酵母菌株具有类似的 HO 切割效率（S1E-S1I 图）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816.g001

我们和其他人已经表明，NuA4主要在细胞周期的S/G2阶段（23，36）被招募到DSB。为了研究Rad9是否会影响在体内的DSB招募NuA4，我们删除了RAD9，并在HO诱导的DSB异步和G1逮捕细胞中进行了色质素免疫沉淀（ChIP）-qPCR。重要的是要表明，本研究中提出的所有ChIP实验都控制在HO诱发DSB形成（S1Ee S1I图）的一致水平，以及G1细胞的紧密同步（bar1突变背景，FACS和微观分析）。虽然异步细胞在野生类型和RAD9删除突变体（S1C图）之间的NuA4结合上没有显著差异，但G1同步细胞在NuA4（图1C）的招募方面显示出小幅但显著的增加，同时与Rfa1（RPA最大的子单元）测量的DNA端切除的预期增加。

在异步细胞中删除酵母Ku（Yku）并没有显著影响在HO诱导的DSB[23]招募NuA4。然而，在G1阶段同步的细胞显示，在没有Yku80（图1E）的情况下，DSB的NuA4具有很强的招募力，这让人联想到在没有Yku70[36]的情况下，RPD3S、SWR-C和NuA4复合物共享的一些蛋白质的结合性增加。带有 Rfa1 的 ChIP 在 DSB 站点周围也显示出 RPA 信号的强烈增加，表明 G1 （图 1F）中异常的高 DNA 端切除。我们想知道这种敌对关系是针对 Yku 的，还是扩展到其他 Nhej 因素。在G1同步细胞中删除NEJ1（NHEJ核心因子），导致在HO DSB（图1G）周围NuA4招募量再次增加，以及在异步细胞（S1D图）中未观察到的更高切除（图1H）。

同时，RAD9在YKU80删除的后台中删除。先前的研究表明，RAD9和YKU70的双重删除导致DNA的超切除在细胞周期的G1阶段以DSB结束[37]。我们证实了这一发现，如在rad9=ku80+ 细胞（图 1F）中看到的 Rfa1 信号的非常强劲增加所表明的。有趣的是，NuA4也观察到了类似的效果，与单个yku80+细胞（图1E）相比，双缺失突变体发出的信号要强得多。总之，这些数据表明，在没有核心NHEJ因素（Yku80和Nej1）以及RAD9的删除的情况下，NuA4综合体可以在G1的DSB高效招募。这支持了 NuA4 与 NHEJ 修复 DNA 断裂的机器之间的敌对关系的概念。-医学论文发表

Xrs2 依赖在 G1 的 Dsb 招聘 Nua4

NuA4 子组 Tra1 显示与 PIKK 家族成员 Tel1/ Mec1 的高域同源性。Tel1 和 Mec1，就像它们的哺乳动物对应物阿塔夏泰兰吉拉西亚变异（ATM）、AT 相关（ATR）和 DNA 相关蛋白激酶（DNA-PK）一样，对于 DSB 的信号和下游修复蛋白的招募[38，39]都很重要。我们最近表明，Tra1在DNA损伤时获得磷酸化，其包含PI3K样域的C终点站可以直接在体外结合Xrs2，这种相互作用可能涉及在HO诱导DSB站点招募NuA4[23]。为了了解在 G1 的 DSB 招聘 NuA4 是否需要 Xrs2，我们在XRS2删除后台执行了 ChIP-qPCR。如（图 2A）所示，在 1 中检测到的 NuA4 信号在没有 Rad9 的情况下在XRS2被删除时完全丢失。用Rfa1/RPA（图2B）测量的末端剖析也是如此。引人注目的是，删除XRS2的背景与超切除（rad9+yku80+）也废除了NuA4招募和切除在G1细胞（图2C，2D和S2D）。我们以前已经表明，NuA4 是通过 S/G2 DSB 的两步机制招募的：首先，通过 MRX 复合体，通过与 Xrs2 的磷依赖性相互作用：其次，通过沿着DNA末端剖析在断裂的每一侧传播[23]。自从删除XRS2块剖析后，尚不清楚NuA4招聘的损失是否仅仅是由于与Xrs2失去互动，还是部分是由于解剖本身的损失。mre11-H125N核糖酶缺陷突变背景用于部分解决这一问题，因为它已知会降低G1同步细胞的分形速度[40]。如图2E和2F所示，虽然Rfa1信号在接近中断时有所减少，但NuA4检测似乎没有受到影响。这些结果表明，在 G1 的 DSB 招聘 NuA4 需要 Mre11/Rad50/Xrs2 （MRX）综合体的 Xrs2 子组，以独立剖析的方式进行。

下载：

PPT

电源点幻灯片

图2。Xrs2 依赖在 G1 的 Dsb 招聘 Nua4 。

（A-D）Rfa1 和 Eaf1 的 Chip - qpcr 显示 Nua4 的损失（A， C）和切除（B， D）在xrs2+， xrs2+rad9+ 和xrs2+rad9+ yku80+ 相比，野生类型在 HO 诱导 DSB 在 G1 同步细胞.另请参阅S2D 图，以便由 qPCR 直接测量 DNA 端截片。（E-F）mre11-H125N突变菌株中的 ChIP-qPCR 显示，与 G1 细胞中的野生类型相比，切除术减少，但 NuA4 招募未受影响。ChIP-qPCR 执行如图1所述。使用的酵母菌株显示出类似的 HO 切割效率（S2A°S2C 图）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816.g002

LCD1/Ddc2 依赖在 DSBS 招聘 NuA4

Xrs2 拥有 Mre11 进口到核中所需的核定位序列（NLS）。因此，Xrs2 的丢失导致 DSB[41]的 MRX 复合体组装失败。为了解决这个问题，我们使用了低拷贝数质粒表示Mre11融合到NLS（称为MRE11-NLS）。根据以前的研究，Mre11-NLS的表达抑制了xrs2+细胞的生长缺陷，在DNA破坏剂（MMS，S3A图）存在[41，42]。有趣的是，Mre11-NLS在G1细胞中的表现携带双删除rad9+ yku80+ 除了xrs2+ 导致 NuA4 招募和折射显著增加（图 3A 和 3B）。由于 Mre11-NLS 对xrs2+的抑制已知是局部的，我们还测试了 Mre11-NLS-X85 融合，该融合将 Xrs2 的 C 端终端 85aa Tel1 交互域添加到 Mre11 =43= （与 N 端 FHA-BRCT NuA4 交互域不同 [23]）。在没有Xrs2、Rad9和Yku80（图3C和3D）的情况下，这一构造导致在DSB的NuA4招募和切除工作更加强劲。这些结果表明，在DSB存在一种独立的NAA4招募模式。重要的是，这种Xrs2独立的机制并不局限于G1中的细胞，因为异步细胞也显示了通过在xrs2+细胞（图3E和3F）中引入MRE11-NLS对NuA4招募和切除的拯救。

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图3。在 Xrs2 功能旁路条件下， G1 中的 Nua4 招聘替代模式。

（A-B）切除和 NuA4 招聘部分恢复在xrs2+ rad9+ yku80+ 背景与 Mre11 - Nls 从低拷贝号 ARS：CEN 质粒的表达。Eaf1 和 Rfa1 的 ChIP-qPCR 在G1同步的细胞中执行（图 1）。（C-D）Ree11-NLS-X85 的表达方式在很大程度上恢复了xrs2+ rad9+ 2ku80+ 背景，从而更完全地绕过了 Xrs2 功能。（E-F）Mre11-NLS 的表达还部分地挽救了xrs2+ 异步细胞背景中的 NuA4 招募和切除（Rfa1 信号）（在 DSB 站点的左侧近端）。（参见S3 图 xrs2 +表型抑制 Mre11 - Nls 和 HO 切割效率）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816.g003

我们之前报告说，NuA4 的 Tra1 子组可以直接在体外与 Lcd1/Ddc2 （哺乳动物中的 ATRIP）[23]进行交互。Lcd1/Ddc2 是 Mec1（哺乳动物 ATR）的结合合作伙伴，负责将 Mec1 招募到由切除[44]产生的 RPA 涂层 ssDNA 中。重要的是，我们以前已经表明，删除LCD1/DDC2并没有显著影响NuA4在HO断断续续的异步细胞[23]（另见S4B图）的招募。为了确定 NuA4 与 Lcd1/Ddc2 的交互是否实际上是 Xrs2 功能被基因绕过时 NuA4 招募的替代机制（如上图所示），我们删除了LCD1（在SML1删除的背景中以克服合成杀伤力）[45，46]。然而，在此背景下引入MRE11-NLS不足以挽救剖析，使得NuA4招聘的结论变得困难（S4A和S4B图）。为了解决这个问题，我们过度表达长距离切除Exo1。Mre11-NLS 的表达以及 Exo1 的过度表达导致 HO 感应后断裂的每一侧的 DNA 信号减少，指示 DNA 端切除（图 4A 和 4C）。这取决于 Exo1 活性，因为蛋白质的核素死突变体（Exo1-D173A）的行为类似于空矢量控制（EV）。在XRS2删除部分被Mere11-NLS压制的情况下，主动Exo1的表达导致NuA4招聘（图4B）的进一步增加。然而，当LCD1/DDC2在这些条件下被删除，允许显着的DNA端切除（图4C），NuA4信号未能增加（图4D）。因此，这些结果表明，在Xrs2功能在基因旁路的情况下，在DNA断裂时，NuA4招募有一个替代的Lcd1/Ddc2依赖机制，很可能通过直接的物理相互作用。

下载：

图4。DSB 的 NuA4 招聘替代模式是 Lcd1/Ddc2 依赖。

（A-B）通过通过在催化活性 Exo1 上表达 Mre11-NLS，可以在xrs2+背景中进一步拯救斩波和 NuA4 招聘。末端剖析直接通过休息时DNA信号的减少来测量，NuA4的招募工作也像以前一样受到监控。催化死亡的 Exo1 的表达用作控制（Exo1-D173A）。（C-D）在 lcd1+xrs2+ 背景中，还通过pMRE11-NLS和 Exo1-WT 的过度表达（但未提供 Exo1-D173A 突变体）进行解剖，但 NuA4 招聘的情况并非如此。与 Exo1-D173A 突变体或空矢量相比，NuA4 信号不显示与 Exo1-WT 相关的剖析相关增加。在指示地点的基因组DNA上，由qPCR确定的断面DNA的百分比作为正位DNA的百分比呈现，并正常化为负控制间源V.细胞在YP-Raff中生长，直到早期日志阶段，然后加入乳糖3小时，以诱导DSB。使用的酵母菌株具有类似的 HO 切割效率（S4C 和 S4D 图）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816.g004

NuA4 依赖乙酰化对于 G1 细胞的超剖析和 SSA 通路的修复非常重要

由直接重复侧翼的 DSB 由称为单股退火（SSA）的 Rad52 依赖路径修复。被切除的末端在重复和干预DNA以及一个重复被核解过程删除[47]。有充分证据表明，Rad52 对于 SSA 在 G1 细胞中修复 DSB 至关重要[37]。为了调查 NuA4 在此类过程中的可能功能，我们执行了 ChIP-qPCR，以测量在 G1 和我们的突变背景中向 DSB 招聘 Rad52。正如在超切割rad9+ yku80+ 突变背景中所预料的，在 G1 细胞（图 5A）中检测到 Rad52 的招募量非常高。这也出现在nej1+背景中，虽然水平较低，类似于yku80+单突变体（图5A和5B）。与之前的研究[48]类似，我们还观察到在 yku80+ 和rad9=ku80= G1 阻塞细胞（S5A 图）中招募 Rad51。

下载：

图5。在 G1 中 NuA4 乙酰化缺陷突变体中减少超剖析，在 SSA DNA 断裂修复中出现缺陷。

（A-B）在 G1 阻塞细胞中，围绕 HO 诱导 DSB 的 Rad52 的 ChIP-qPCR。rad9= yku80= ， yku80+ （A）和nej1+ （B）显示与野生类型条件相比， Rad52 的招募率更高。（C）在半限制温度下降低esa1-ts背景中的平石 H4 乙酰化。从（D）中用于 ChIP-qPCR 的酵母菌株中对 WCE 进行西式污点分析。样品是在YP-Raff在允许温度（23°C）添加α因子之前收集的。增加了α因子，将培养物转移到半限制温度（32°C），然后加入乳糖诱导HO切口3小时。（D） Rfa1 的 ChIP-qPCR 围绕 G1 细胞中 HO 诱导的 DSB，随着 NuA4 esa1-ts缺陷等位基因的引入，在rad9+yku80+背景中显示出减少切除。使用的酵母菌株具有类似的 HO 切割效率（S5C 图）。（E） esa1-ts突变细胞对DNA损伤的敏感性因删除核心NHEJ因子而部分抑制。在缺乏或存在DNA破坏剂彩信的情况下，使用esa1-L254P、rad9 +ku80+ 和rad9+ 2ku80+esa1-L254P细胞进行了 10 倍串序稀释点检测。（F） esa1-ts突变通过基于剖析的单链退火导致 DSB 修复的减少。酵母菌株与直接重复 20kb 分开被用作 SSA 效率的记者。在没有 Rad51 的情况下， HO 之间重复诱导的 DSN 大多由 SSA 与 Rad52 修复。维修效率由生存监测与10倍稀释点检测在GAL-HO诱导或不条件。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816.g005-医学论文发表

为了确定 NuA4 是否在 DSB 修复的 G1 相机制中发挥作用，我们引入了esa1-L254P温度敏感（ts）突变等位基因，即使在半限制温度下也会影响 NuA4 的乙酰化能力（如图 5C中 H4ac 的西式污点所示）[10]。有趣的是，Rfa1 ChIP-qPCR测量三重 rad9+ yku80+esa1-ts三重突变背景中的超切除现象类型显示，与 rad9 + yku80+ 双突变（图 5D）相比，DNA端切除显著减少。这些结果表明，NuA4乙酰转移酶活性对刺激G1的DNA末端切除非常重要，可能部分通过切除机前染色质的乙酰化。这得益于rad9+ku80+删除（图5E）部分抑制了esa1-ts突变细胞的DNA损伤敏感性。另一方面，我们没有观察到NuA4部分功能丧失对Rad52招募在G1细胞（S5B图）的这些条件下的明显影响。

为了直接评估 NuA4 在 SSA 路径修复 DSB 中可能扮演的角色，我们使用了酵母记者菌株，该菌株携带两个区域的同源（直接重复）相隔 20 kb[49]。当 Rad51 重组从此背景中删除时，需要 Rad52 的 SSA 路径将修复 HO 中断。HO感应条件下的生长（点测定）用作DNA修复的测量。在此背景下删除RAD52在 HO 感应后产生了强烈的增长缺陷，正如预期的那样，因为 SSA 被废除（图 5F）。重要的是，esa1 ts等位基因与RAD51删除相结合，导致 HO 感应时出现类似的生长缺陷，这表明 NuA4 对于通过依赖切除的 SSA 通路（图 5F）修复 DNA 断裂非常重要。

Nua4 的 Nej1 乙酰化作为抑制 Nhej 的机制，赞成基于剖析的修复

酵母Nej1及其哺乳动物同源XLF/NHEJ1和PAXX已被NHEJ[50+53]证明对修复非常重要。Nej1 作为其他 NHEJ 因子的脚手架蛋白，Nej1 的 N 终端区域与 Yku 及其 C 终端区域与 Lif1[54]56]相互作用。XLF 也已被证明与哺乳动物 Ku 和 XRCC4[54]互动。Nej1 和 Dnl4 - Lif1 都需要在 Dsbs[48，57]保留 / 稳定 Yku 。Nej1，就像它的哺乳动物同源性一样，对于系绳DNA的两端很重要[58，59]，而且最近还被证明与MX复合体的Me11相互作用，因为它的系绳活动[60]。

在一次大规模体外乙酰化检测中，Nej1被证明是NuA4乙酰转移酶活性的目标[17]。为了进一步研究这一点，我们直接测试了乙酰转移酶检测中重组的Nej1蛋白，并进行了纯化NuA4复合物的体外检测。凝胶和荧光学放射性检测的迁移清楚地表明，NuA4（图6A）对Nej1进行了有效的乙酰化。为了确定Nej1是否确实在体内的赖氨酸残留物上乙酰化，我们在正常生长条件下或彩信诱发的DNA损伤后，对表达或不表达Nej1融合蛋白的细胞提取物进行了抗乙酰-赖氨酸抗体的免疫沉淀。结果表明，一小部分Nej1似乎确实乙酰化的体内，而DNA损伤没有影响修改水平（图6B）。然后，我们从酵母细胞中纯化这种Nej1融合蛋白，并比较了由来自野生类型的质谱仪和esa1-L254P NuA4突变背景（S2表）识别的含乙酰赖氨酸肽。在K18、K192和K234的位置，三个赖氨酸残留物被检测为在WT条件下的Nej1上乙酰化，但在突变背景（图6C和S6A）中未被检测到。为了确定这些乙酰化部位是否对Nej1功能很重要，我们生产了酵母菌株，用非乙酰化（K到R）或乙酰模仿（K到Q）替代来表达Nej1的生理水平。重要的是，点突变并不影响Nej1（图6D）的稳定性。接下来，我们测试了这些莱辛是否影响 NHEJ 的 DSB 修复效率。如图6E所示，Nej1的损失完全被NHEJ废除修复，通过消化的质粒模板的重新粘合效率来测量。有趣的是，乙酰（3KQ）和非乙酰（3KR）替代突变体都显示出NHEJ效率的显著下降。这些结果表明，在 NHEJ 修复 DSB 期间，Nej1 功能中这三种赖氨酸残留物的重要性。相比之下，Nej1野生类型和突变体在MAT点（S6B图）显示染色体DSB的修复效率相似。重要的是，在G1细胞中，围绕HO诱导DSB的NuA4和RPA的ChIP-qPCR显示出NuA4的招募量显著增加，以及乙酰模仿nej1突变体（图6F和6G：非乙酰nej1突变数据点与野生类型数据点重叠）的切除。另一方面，在nej1-3KQ背景中看到的增长没有达到内J1完全损失时获得的水平。这可能是由于 Nej1 - 3kq 仍然在休息时被招募，但功能受损。由于Nej1与其他NHEJ因子的相互作用对其功能很重要[55]57，60，61]，我们使用Nej1突变体与重组剂Yku80和Lif1进行了体外蛋白-蛋白相互作用分析。虽然野生型Nej1和3KR突变体与Yku80表现出类似的相互作用，但模仿3KQ突变体的乙酰则显示出较少的结合性（图6H）。同时，与野生类型（图6I）相比，Nej1与Lif1的相互作用在3KQ和3KR突变体中都显著减少。Nej1-3KR 与 Lif1 的结合性降低，但与 Yku80 的结合性降低，可以解释它对质粒重新结块分析（图 6E）的影响。Lif1 束缚了 Dnl4 韧带，失去与 Nej1 的稳定互动可能导致 Lif1-Dnl4 招募有缺陷，导致 DSB 重粘受损。然而，由于Nej1-3KR仍然能够与Yku80相互作用，在休息时稳定它，它可以解释与野生类型细胞（图6G）相比，对剖析没有影响的原因。此外，Nej1-3KQ乙酰模仿突变体也显示，与野生类型和3KR突变体相比，Mre11的C终端部分的结合性降低，这可能会影响其系绳活动（S6D图）。重要的是，Nej1磷酸化对DNA损害剂[62]没有受到 3 赖氨酸替代或 NuA4 乙酰转移酶活性（Esa1）的耗竭使用锚离系统[63，64]（细胞用 DNA 破坏剂彩信处理，磷化导致出现较慢的迁移Nej1信号（S6E/S6G图）。

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图 6.NuA4通过内杰1的乙酰化抑制NHEJ。

（A）使用纯化 NuA4 复合物和重组 GST-Nej1 进行体外乙酰化检测。与放射性乙酰-COA反应后，反应被装在凝胶上，在胶片上处理氟化/暴露。GST-Nej1蛋白明显由NuA4体外乙酰化。仅消费税就用作负控制。两个样品中标记的淡度带对应于已知的 NuA4 亚单位的自动乙酰化（例如 36kDa[17]的 Yng2）。（B） Nej1体内乙酰化。抗乙酰-赖氨酸免疫沉淀剂对多重复制载体中过度表达GST-NEJ1细胞的提取物进行。内1乙酰化水平由抗GST西在免疫沉淀材料上检测到。（C）图纸显示esa1-ts样品中未存在的质谱仪识别的乙酰化残留物的位置（另见S6A 图和S2 表，了解已识别的乙酰化肽的完整列表）。还指示了 Nej1 的已知功能域。（D）整个细胞提取物上的西性斑点比较本地野生类型和（E）中所用构造菌株中的突变Nej1表达水平。（E） nej1-3KR和nej1-3KQ突变细胞显示 EcoR1 线性 pSO98 质粒的质粒再结化效率降低。样品被规范化为野生类型，设定为100%。（F-G）与野生型NEJ1和nej1-3KR 突变背景相比，Nej1-3KQ突变体中的 NuA4 和截肢/RPA招募有所增加。ChIP-qPCR使用抗Eaf1（F）和抗Rfa1（G）抗体在G1同步细胞中如图1所述。使用的酵母菌株显示出类似的 HO 切割效率（S6C 图）。（H）与重组蛋白的 GST 拉下。重组的 Nej1 - 3kq 显示与 Yyku80 的交互减少相比， Nej1 - wt 和 Nej1 - 3kr 。rNej1 是 Gst 标签的拉下，而 rku80 是 6xhis 标记由西方检测。空消费税被用作负控制。（一） GST 拉低为（H）。与野生类型 Nej1 相比，重组者 Nej1 - 3kq 和 Nej1 - 3kr 显示与 rlif1 的交互减少。rlif1 是 6xhis 标签。空消费税被用作负控制。（J） Yku80 以 NuA4 依赖的方式在体内的赖氨酸残留物上乙酰化。乙酰-赖氨酸免疫沉淀在Esa1-FRB锚出+24+/Yku80-13myc背景显示，在拉帕霉素治疗后，Yku80的信号大大减少，从细胞核耗尽Esa1。DNA损伤的影响也通过用彩信治疗细胞来监测。Pgk1 被用作负载控制。Esa1耗竭的效率由显示H4乙酰化损失的西方污点（S6G图）监测。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816.g006-医学论文发表

在哺乳动物中，NHEJ核心因子Ku70已知通过CBP乙酰化，抑制DNA修复并调节巴氏介导细胞凋亡[65，66]。我们测试了酵母库是否也在酵母细胞中乙酰化，以及它是否可能与Nej1一起成为 NuA4 的非希石靶点。使用锚离系统耗尽Esa1（S6G图）和免疫沉淀与抗乙酰赖氨酸抗体，我们发现Yku80确实是乙酰化的体内和NuA4显然是需要为这种乙酰化发生（图6J）。有趣的是，Yku80乙酰化在DNA损伤条件下似乎略高。综合起来，这些数据表明Nej1和Yku80是NuA4乙酰转移酶活性非希石基质。Nej1 的乙酰化可能会破坏 Nhej 与 Yku80 和 Lif1 的互动，从而降低 Nhej 的效率。需要进一步的研究来描述乙酰化对Yku80功能的影响，但在高真核生物中工作也支持抑制作用。

讨论

总的来说，这项研究的结果使我们能够清楚地证明NuA4复合物和NHEJ机制之间的相互对抗关系，证实了早期的遗传相互作用数据和我们与哺乳动物同源的研究。体外和体内数据也走得更远，表明Rad9和NHEJ因素明显抑制了NuA4对染色质的招募和活动。引人注目的是，在另一个方向，我们的数据显示，NuA4可以通过乙酰化其中一些直接抑制NHEJ机械。通过这项工作，我们还发现了在特定条件下在 DSBS 为 NuA4 提供新的替代招聘模式。Xrs2 依赖路径负责在 G1 中首次招募 NuA4 （图 2），正如我们之前在 S/G2[23]中报告的那样。这发生在 DSB 信号和维修过程的早期，当 MRX 被招募到中断站点。据了解，PIKK家庭成员Tra1，NuA4的子组，可以直接与Xrs2[23]互动。酵母的另一个主要乙酰转移酶复合物，SAGA，也包含Tra1，并要求Xrs2在休息时招募[24]。因此，Tra1 不仅与 Tel1 （ATM）信号激酶有关，不仅在氨基酸序列上，而且在 DNA 断裂时也与其招募模式有关，依赖于 Xrs2[42]。Tel1 通过周围染色质[67]中 H2A-S129 （γ-H2A）的磷酸化向 DSB 发出信号。细胞核解剖处理，称为DNA断裂的剖析产生3'sDNA末端。此 ssDNA 由 RPA 涂层，以防止二次结构形成和降解。RPA 涂层 ssDNA 由各种修复蛋白识别，其中之一是 Lcd1/Ddc2 （ATRIP）[3，44]。我们以前已经表明，Tra1 也可以直接与 Lcd1体外[23]进行交互。我们的体内数据现在支持这个链接，因为 NuA4 仍然可以在休息时招募在特定条件下 Xrs2 功能被基因绕过和剖析可能发生，并且此招募需要 Lcd1/Ddc2 （图3和4）。由于在正常情况下简单删除LCD1/DDC2对 DSB[23]（S4B 图）的 NuA4 招聘没有影响，这表明 Lcd1/Ddc2 是仅在特定条件下发生的另一种招聘模式。然而，在MX最初招聘后，人们很容易推测，这种机制在NAA4沿休息的每一侧进行剖析（[23]中描述的两步招聘模式）的传播中具有一种功能。在Rad9缺席和NHEJ机械存在缺陷时，这种替代模式在G1超切除条件下可能也更为重要。-医学论文发表

重剖是标志着 DSB 维修对人力资源流程的承诺的事件。3'结束 ssDNA 搜索同源序列或姐妹染色体用作模板以完成修复过程[3]。切除是一个非常受监管的过程，在 Cdk1 活动高且在细胞周期的 G1 阶段（当 Cdk1 活动低[37]时受到抑制时，在 S/G2 阶段中处于活跃状态。但此前已经表明，通过删除Ku蛋白[37，48]，在G1阶段可以实现剖析。在哺乳动物细胞中，G1 阶段的 HR 需要删除RAD9同源 53BP1、KEAP1 耗竭和 CtIP 的磷模仿突变体[68]。在我们的实验中，我们检测到在G1的DSB高效的NuA4招募与剖头（图1）的外观同时出现。先前显示，在G1中删除NHEJ因子不仅会导致剖析，而且通过SSA修复DSB，依靠重组蛋白Rad52[37]。然后，我们的问题是评估 NuA4 是否在 G1 的这种基于剖析的维修中发挥作用。Esa1的温度敏感突变体，NuA4的催化亚组，减慢了切除速度，这可能损害这种需要延长端切除（图5D）的修复过程。事实上，使用SSA记者应变，esa1有缺陷的等位基因在该背景中诱导HO断裂时会产生明显的生长缺陷（图5F）。重要的是，这涉及到在人力资源旁边的另一个DSB修复路径的NuA4综合体。验证 SAGA HAT 综合体是否也与 NuA4 在此路径中协作会很有趣，就像在 HR[24]中所做的那样。

NuA4 与 NHEJ 机械/Rad9 之间的敌对关系似乎是调节维修路径选择的机制的核心。事实上，两个NHEJ核心因素，Nej1和Yku80，是NuA4乙酰转移酶活动（图6）的新非希石目标，可能是这些监管事件的重要组成部分。Nej1 是 NHEJ[50，51，53]的修复关键，我们的nej1乙酰突变体也显示受损的 Nhej （图 6E）。众所周知，Nej1 是 NHEJ 机械中结合和稳定其他蛋白质的脚手架[54]57]。Nej1乙酰模仿突变显示减少结合Lif1和Yku80体外，这与增加的剖析在体内看到（图6G）。确定这些单个裂解物如何影响Nej1与其他NHEJ蛋白质的相互作用，以及Nej1本身的系绳活性在这些突变体中是否受损，将是很有趣的[60]。在酵母和哺乳动物中，有文件证明Ku可能与各种结石脱乙酰酶（HDACs）相互作用，这些在NHEJ[69]71]的修复中起着重要作用。对 NuA4 与 NHEJ 相互作用的进一步分析将包括识别由 NuA4 乙酰化的 Yku80 上特定的莱辛。通过乙酰化去除赖清酶的正电荷可能会降低或废除Yku80在断裂部位对DNA的结合能力，从而导致DNA末端的处理/切除。乙酰化也可能影响与Yku70的结合和Ku复合体的形成，从而损害NHEJ。

图7根据我们的数据，为NUA4和Rad9/NHEJ因子在DNA断裂时之间的对抗关系提供了一个模型。NuA4 可在 DSB 形成后的早期步骤中由 MRX 综合体招募。由于Rad9和NHEJ因子在休息时组装，这些因素除了抑制切除外，还可能抑制NuA4的招募和染色素的乙酰化。如果 NuA4 能够直接乙酰酸盐 Nej1，这将阻止 NHEJ 维修机械的组装，从而有利于启动 DNA 端剖。切除后，导致 RPA 涂层 ssDNA，在休息时在两侧分别招募 Lcd1/Ddc2 （ATRIP）和 NuA4，帮助在染色质背景下进行远程切除。在 Xrs2 缺席或旁路的情况下，Lcd1/Ddc2 也可以招募 NuA4。我们的研究结果清楚地表明，NuA4 调节修复路径选择，远离 NHEJ，并在整个细胞周期中通过基于切除的过程进行修复。它支持并大大拓宽了我们以前工作的结论，突出了 53BP1 （哺乳动物 Rad9）和 NuA4/TIP60 之间的一场关键战斗，以规范 DSB 修复路径选择。未来的工作将验证哺乳动物 NuA4/TIP60 复合物在调节修复路径选择时是否也针对 NHEJ 蛋白质。有趣的是，最近已经表明，53BP1也可以乙酰化体内，这抑制了NHEJ的修复，有利于HR[72]。NuA4 也有可能参与其他 DSB 修复路径，如 alt-NHEJ，以巩固其在基于切除的修复中的作用。更好地了解 NuA4/TIP60 如何被招募到 DNA 损伤部位，以及乙酰酸盐特定的非结石蛋白如何调节修复，确定可用于治疗癌症等疾病的新分子靶点。-医学论文发表

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图7。NuA4 综合体与 NHEJ 机械之间的对等对抗：修复路径选择的中央监管机制。

模型：虽然染色质绑定 Rad9 可以抑制 NuA4 的招募和色度乙酰化，以有利于 NHEJ 的修复，但 MRX 招募 NuA4 可导致 NHEJ 核心因子（如 Nej1 和 Yku80）的乙酰化。这扰乱了NHEJ因子之间的相互作用，抑制了NHEJ，并促成了DNA的截流结束。由于剖析产生 ssDNA，NuA4 在断裂的每一侧都扩散，有利于基于剖析的修复路径，如 HR 和 SSA。还描述了 Lcd1/Ddc2 在特定条件下的 NuA4 招聘的可能替代模式。"Ac"代表 NuA4 执行的乙酰化。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816.g007

方法

酵母菌株和生长检测

当前研究中使用的酵母菌株列在S1 表中。使用醋酸锂方法进行相应的转化时，采用基于 PCR 的标准协议。酵母细胞生长在YPD（1%酵母提取物，2%肽，2%脱氧糖）在30°C或合成全媒体。对于DSB诱导，细胞在YP-Raffinose中在30°C的夜间生长，2%的乳糖被添加3小时，以诱导HO内啡带酶。

酵母点测定是在YPD在23°C和SC-URA在30°C的隔夜生长酵母培养物下进行的，早上在OD的YPD/SC-URA接种6000.3 和成长 3 至 4 小时。酵母培养物的10倍串联稀释用于在YPD/SC-URA板上发现，辅以甲基甲烷硫酸盐（MMS）。殖民地允许生长3~4天，YPD为32°C，SC-URA板块为30°C，生长敏感度与YPD/SC-URA控制板相比。

色度素免疫沉淀（ChIP）

ChIP-qPCR 按先前描述执行[15]。简言之，酵母细胞生长在YP-Raff中，直到培养物的光学密度（O.D.600）在+0.5到1之间。在指示的实验中添加了α因子6小时，以同步G1相中的细胞。之后，在 MAT 点添加 3 小时的乳糖，以诱导 DSB。接下来，细胞与甲醛交叉连接，细胞被珠子击打。进行声波（地名素生物破坏器），获得+200+500 bp的染色质大小。 100ug的染色质在4°C的车轮上用指示的抗体在一夜之间孵育。第二天，蛋白质A或G塞法罗斯珠被添加后，随后的洗涤步骤和夜间在65°C的去交叉链接。进行了氯仿提取，DNA样本溶解在NTE中，用于qPCR。LC480 光循环器（Roche）用于量化 DNA，引物对位于 MAT 点的指示区域（0.15bp、1Kb、3Kb、7Kb）和右侧（1kb、3Kb、7Kb）的引物对。MAT 位点的同质内分泌酶（HO）切割效率是使用 qPCR 计算的，底漆对跨越 HO 切割位点规范化到未切割控制位点、间歇（染色体 V 上的长间歇区域）。类似的 qPCR 方法也用于直接测量 HO 断裂两侧的切除，在与中断不同距离的模板数量上，一股的逐渐损失减少多达 2 倍。应要求提供引物序列。用于 ChIP 的抗体如下：抗 Eaf1[7]，抗 Rfa1 （阿格里塞拉 AS 07214），抗拉德 51 （圣克鲁斯 y-180），抗拉德 52 （圣克鲁斯 yC-17）.

重组蛋白纯化和拉下检测

重组蛋白是使用先前描述的标准协议从BL-21细菌中纯化的[73]。简言之，在IPTG的存在下，细菌培养在16°C的一夜之间生长。细菌颗粒用酶和声波处理。可溶性分馏分分别用硝基亚硝酸（NTA） - 阿加罗斯（Qiagen）珠子或谷胱甘肽 - 塞法罗斯（GE 医疗保健）孵育 3~4 小时，其蛋白质或 GST 标记蛋白分别在 4°C 下轮式。库马西蓝色染色是为了估计纯化蛋白浓度与已知的牛血清白蛋白（BSA）标准。经过 +300+600 ng 的他标记的蛋白质被预先清除与谷胱甘肽塞法罗斯珠和孵育与固定的 GST 标记蛋白质在结合缓冲（ 25 mM HEPES [ pH 7 . 5 ] ， 100 mM NaCl ， 10% 甘油， 100 微克 / 毫升 BSA ， 1 mM PMSF ， 0 . 5 m 二甲酸酯 [ DTT ] ， 0 . 1% Tween 20 ，和蛋白酶抑制剂）在4°C 3 小时，然后洗珠子三次 .1微克消费税只固定蛋白质用作对照。洗涤后 Laemmli 缓冲器 1X 被添加，然后在 SDS-PAGE 上沸腾和加载，以便使用抗他的（克隆技术631212）和抗 GST （西格玛 G1160）抗体进行西式印迹的可视化。

纯化乙酰化的Nej1进行质谱测量

GST 标记的 Nej1 是从野生类型和esa1-L254P （ts）背景中纯化的，然后是质谱分析，以识别以前描述的乙酰化部位，几乎没有修改[17]。简而言之，细胞生长在SC-Ura中，含有2%的拉菲诺，直到OD600±0.8=1.0。加入高乳糖（2%最终）用于感应GST标记的Nej1（从高拷贝2微米载体表达），细胞在37°C下生长两个小时。细胞在萃取缓冲器（10mM Tris-HCl pH 8.0，350mM NaCl，0.1% NP-40，10%甘油）中收获和裂解， 1mM DTT， 1mM PMSF， 2 μg/mL 脂蛋白， 2 微克/mL 肽 A， 5 μg/mL 丙丙丁胺， 5 mM β甘油磷酸盐， 10mM 丁酸钠， 5 m M Naf， 10mm 尼古丁胺， 15μM TSA）.在 4°C 下，以 10，000 克离心 30 分钟，然后在 45，000 克下进行 1 小时的超浓缩。在4°C的车轮上加入谷胱甘肽-塞法罗斯珠（GE医疗保健）3小时之前，超高超的珠子被预先清洁了CL6B珠子（西格玛）。绑定后，谷胱甘肽-塞法罗斯珠被洗5次用洗涤缓冲器（20mM疱疹pH7.5，200mMNaCl，10mM丁酸钠）。珠子与叶酸缓冲液（50mM Tris-HCl pH8.0，10mM谷胱甘肽，10%甘油，5mM钠但乙酸钠）混合在车轮上，第一次脱毛是在1小时后收集的，其他是在通宵孵育后收集的。接下来，蛋白质A-sepharose珠子用IP裂解缓冲器（75mM Tris-HCl ph 7.5，50mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，10%甘油，1%Tween-20，1mM DTT，1mMPMSF， 5mM NaF， 2 μg/mL 脂蛋白， 2 μg/mL 肽 A， 5 μg/mL 丙丙丁宁， 10mM 钠丁酸盐， 10mM，烟酰胺， 15μM TSA， 1 μM MG132）和 6μl 小鼠单克隆结合抗乙酰化赖氨酸（细胞信号9681S）。抗体结合蛋白A-sepharose珠子在4°C下与GST脱脂一起孵育，在轮子上孵育3小时。使用 IP 洗涤缓冲器（50mM 疱疹 pH 7.0、100mM NaCl、10 mM 钠但亚特酸盐）清洗 4 次后，添加并煮沸了 20 μl SDS-PAGE 样品缓冲器。样本由SDS-PAGE解决，然后是胶体库马西蓝色染色，以可视化和切割凝胶带，这些胶带在尝试素消化后发送质谱分析（芝加哥大学赵实验室）。获得的肽覆盖率为WT样本的77%，突变体的83%。 S2 表中列出了含有乙酰赖氨酸残留物的自信识别肽列表。-医学论文发表

色素结合和乙酰转移酶检测

按描述进行乙酰转移酶检测[9，74]。500ng从甲基甲烷硫酸盐彩信（0.05%）中纯化的短寡核苷酸经过酵母细胞处理，在30°C下用重组剂Rad9孵育30分钟。随后又添加了纯化 NuA4 复合物（23）和 0.125 μCi 的 [3帽子缓冲区（50 m Tris- hcl [ph 8]）中的乙酰同酶 A （[3H] 乙酰 - coa）， 50 mM KCl 加 NaCl， 0.1 m EDTA， 5% 甘油， 1 mM DTT， 1 mM PMSF 和 20 mM 丁酸钠）在 30°C 30 分钟.反应混合物被发现在p81过滤纸上，洗净和空气干燥。放射性标签乙酰化的结合是通过闪烁计数来测量的。对于凝胶内检测与重组剂 GST-Nej1，与 NuA4 的反应停止在 1X 莱姆利缓冲，煮沸，并加载在 10% SDS-PAGE.盖尔被恩3hance（珀金埃尔默）治疗，干燥和暴露在薄膜上。

非同源端加入（NHEJ）检测

普拉斯米德重新连体分析按描述进行[50]。0.4 μg 质粒 pSO98 超盘活或 EcoR1 消化用于转化nej1+ 酵母菌株，其中含有野生类型或突变形式的NEJ1基因在 CEN：ARS 低拷贝数质粒上。转化后的酵母在 SC-His-Leu 和 SC-His-Ura 上镀上，保持在 30°C。 3天后，菌落被计算在内，用消化的质粒转化为未消化的超级盘片的菌落比例被计算在内。数据表示两个独立的生物复制，错误条表示生物复制之间的范围。

染色体NHEJ检测按描述进行[51]。使用的酵母背景携带删除 HML和HMR以及可诱导乳糖的 HO 内分泌酶，从而在MAT点创建单个 DSB。内源性NEJ1基因被删除，NEJ1基因的野生类型或突变形式从低拷贝数CEN：ARS质粒中表达。酵母细胞在YP-拉夫菲诺斯介质中生长过夜。第二天，在日志阶段的适当数量的细胞被镀在YP-加拉克索斯和YP-葡萄糖板上，并保持在30°C。 3至4天后，对菌落数量进行量化，计算YP-加拉托斯菌落与YP-葡萄糖的菌落比例。数据来自三个独立的生物复制，错误条表示复制之间的标准偏差。

乙酰-赖氨酸免疫沉淀

免疫沉淀按先前描述执行[23]。细胞生长在YPD，直到OD600是+0.5，其次是拉帕霉素添加（1μg/ml决赛）30分钟。彩信（0.05%）或 DMSO 添加 2 小时。细胞被收集和折腾在10mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，10%甘油， 0.1% NP-40， 2 μg/mL 脂蛋白， 2 μg/mL 肽 A， 5 μg/mL 丙丙汀， 1 mM PMSF， 10 mM β甘油磷酸盐， 1 mM 丁酸钠， 0.5 mM NaF 和 1 mM DTT.4微克的WCE用抗乙酰（免疫化学ICP0380）孵育，在4°C过夜。蛋白质G Dynabeads（病毒素10004D）被添加到反应中，并在4°C的车轮上再保存4小时。IPs 被洗净，并添加了 1X 莱姆利缓冲器并煮沸。样品在SDS-PAGE上解决，然后用西式印迹进行反Myc（9E10巴布科彩信150R）和反pgk1（Abcam 113687）分析。

支持信息

Rad9 体外抑制 NuA4，但不抑制 NuA4，由 NHEJ 因子在异步细胞中解剖传播。

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S1 图。Rad9 体外抑制 NuA4，但不抑制 NuA4，由 NHEJ 因子在异步细胞中解剖传播。

与图1有关。（A）纯化重组 Rad9 野生类型和突变体由 SDS-PAGE 解决，并染有库马西蓝色污渍。已知的 BSA 浓度用于使用 ImageJ 软件估计纯化重组蛋白的浓度。（B） Rad9 体外抑制 NuA4 依赖性色素乙酰化。测定在图1B中执行，但使用更多的重组 rad9 蛋白质。在这些条件下，WT 和突变 Rad9 之间的差异由于质量效应而更加微妙，但使用 2ug 仍然可见。（C） ChIP-qPCR 显示在MAT细胞的 HO DSB 周围以野生类型和rad9+ 在异步细胞中富集 NuA4。（D） ChIP-qPCR 与 Rfa1 抗体，显示野生类型和异步细胞中的nej1+ 在MAT点的切除没有差异。（E-I）HO 在野生类型中 3 小时的乳糖诱导后，在MAT点切割效率， rad9+ 在异步细胞（E）， rad9+ 在 G1 同步细胞（F）， yku80+ 和 yku80+rad9= G1 同步细胞（G）， nej1+ G1 同步细胞（H），异步细胞（I）中的nej1+ 。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816.s001

（蒂夫）

**S2 图。NuA4 和切除信号之间的差异在野生类型和突变体之间看到，不是由MAT点的不均匀 HO 切割引起的，以及与 Chip - qpcr 与 Rfa1 平行测量 Dna 端切除的不同方法。**

（A-C）在野生类型和 xrs2 +rad9+ （A） 、xrs2+ rad9 +9+080+ （B）、 mre11-H125N （C）之间 3 小时的乳糖诱导后，在 G1 同步细胞的 MAT 点中切割效率。（D） DNA 末端剖析直接通过WT、xrs2+、yku80+ 拉德9+和 xrs2 + 9 = yku80 + 背景中断裂附近的DNA信号减少来测量。超切除表型与yku80/rad9双突变体清晰可见，但在没有Xrs2的情况下消失。切除在指示地点由qPCR在基因组DNA上确定为完整DNA的百分比，并正常化为负对照系基因V. 细胞在YP-Raff中生长，直到早期日志阶段，然后加入甘蔗糖3小时，以诱导DSB。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816.s002

（蒂夫）

S3 图。pMRE11-NLS抑制***xrs2*+ 的缺陷。**

（A）表型分析显示，引入 pMRE11-NLS抑制xrs2+ 细胞对 DNA 破坏性药物彩信的敏感性。在合成完整-URA板上发现了10倍的原木相细胞的连续稀释，有彩信和没有彩信。（B-D）在指示菌株中引入乳糖 3 小时后，MAT点的 HO 切割效率。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816.s003

（蒂夫）

S4 图。在异步细胞中，NuA4 的招募或剖析不需要 Lcd1/Ddc2。

（A-B）ChIP-qPCR 显示lcd1 +xrs2+ 背景导致 RPA 信号（A）损失，而 HO 在异步细胞中诱导 DSB 时导致 NuA4 （B）损失。单突变lcd1+ （Mec1 的损失）不会影响切除术，但与接近断裂的野生类型相比，NuA4 信号显示的 NuA4 信号略少。（C-D）在指示菌株中引入乳糖 3 小时后，MAT点的 HO 切割效率。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816.s004

（蒂夫）

**S5 图。esa1-ts等位基因不会影响在 G1 的超切除背景中重新组合蛋白 Rad52 的招募。**

（A）在 G1 同步细胞的 MAT点的诱导 DSB 周围具有 Rad51 抗体的 ChIP-qPCR。yku80+ 和 yku80+rad9+ 细胞显示更高的信号相比，野生类型，链接到超截流.（B）在 G1 同步细胞的 MAT点的诱导 DSB 周围带有 Rad52 抗体的 ChIP-qPCR。rad9+yku80+和rad9+yku80+1-ts细胞显示Rad52的信号高于野生类型，但加入esa1 ts等位基因没有显著差异。（C）在G1同步细胞的MAT细胞中，经过3个小时的乳糖诱导后，在G1同步细胞的MAT点，在野生类型、rad9+yku80+和rad9+yku80+1-ts细胞中切割效率。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816.s005

（蒂夫）

S6 图。Nej1乙酰化突变体不会破坏DNA损伤诱发的磷化，但会影响与Me11的结合。-医学论文发表

（A） Nej1 以 NuA4 依赖的方式在残留的 K18、K192 和 K234 的体内乙酰化。欧空局1野生类型和温度敏感（ts）突变体的Nej1赖氨酸乙酰化位点的质谱分析。请参阅S2 表中的完整肽序列。（B） Nej1野生型和赖氨酸突变体在没有HML/HMR供体序列的情况下，表现出类似的能力来修复由HO诱导在MAT点诱导的染色体DSB。（C）在指示的nej1+ 菌株中引入 3 小时后，在 G1 同步细胞的MAT点中降低 HO 效率。（D）体外蛋白质拉下测定表明，重组野生类型Nej1和Nej1-3KR与rMre11的C终端区域结合，而这种相互作用与Nej1-3KQ的相互作用大大减少。空消费税被用作负控制。（E） Nej1赖氨酸突变体不影响Nej1的DNA损伤诱发磷化。用彩信（0.05%）或DMSO（控制）治疗的指示酵母菌株中制备的整个细胞提取物（WCE）的西方污点分析2小时。Pgk1 被用作负载控制。（F） WCE上的西方污点分析显示，Esa1的耗竭并不影响Nej1的DNA损伤引起的磷化。Esa1 被 Frb 标记和耗尽从细胞核使用锚离开系统在拉帕霉素的存在[24]。随后，用彩信或 DMSO 治疗细胞。Pgk1 被用作负载控制。（G）酵母 WCE 的西式污点分析显示，在拉帕霉素治疗后，Esa1 FRB 标记的锚离背景中 H4 乙酰化程度降低。H2B 用作负载控制。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816.s006

（蒂夫）

S1 表。当前研究中使用的酵母菌株。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816.s007

（多克克斯）

**S2 表。欧空局1和esa1 ts菌株质谱检测到的乙酰化肽。**

Nej1 肽列表，其中含有乙酰化赖氨酸残留物，在从 WT 和esa1 ts细胞提取物和试丁香消化中经过亲和纯化后，经质谱学自信地识别。获得的肽序列覆盖率分别为77%和83%。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009816.s008

（多克克斯）

确认

我们感谢奥利维尔·约宾-罗比塔耶为这个项目的早期工作，邓志友和赵英明（芝加哥大学）对纯化GST-Nej1进行质谱分析。我们感谢詹姆斯·哈伯和詹妮弗·科布斯的鼓励讨论。我们感谢詹姆斯·哈伯和洛林·西明顿提供菌株和质粒。-医学论文发表

引用

00001. 1.哈纳汉 D，温伯格罗伯特 A. 癌症的霍尔马克：下一代。细胞。2011;144(5):646–74.下午：21376230

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NuA4 与 DNA 损伤部位的非同源端连接机制的对抗关系-医学论文发表

抽象

作者摘要

介绍

结果

删除 Nhej 因素导致在 G1 的 Dsbs 招聘 Nua4

Xrs2 依赖在 G1 的 Dsb 招聘 Nua4

LCD1/Ddc2 依赖在 DSBS 招聘 NuA4

NuA4 依赖乙酰化对于 G1 细胞的超剖析和 SSA 通路的修复非常重要

Nua4 的 Nej1 乙酰化作为抑制 Nhej 的机制， 赞成基于剖析的修复

讨论

方法

酵母菌株和生长检测

色度素免疫沉淀 （ChIP）

重组蛋白纯化和拉下检测

纯化乙酰化的Nej1进行质谱测量

色素结合和乙酰转移酶检测

非同源端加入 （NHEJ） 检测

乙酰-赖氨酸免疫沉淀

支持信息

S1 图。Rad9 体外抑制 NuA4，但不抑制 NuA4，由 NHEJ 因子在异步细胞中解剖传播。

S2 图。NuA4 和切除信号之间的差异在野生类型和突变体之间看到， 不是由MAT点的不均匀 HO 切割引起的， 以及与 Chip - qpcr 与 Rfa1 平行测量 Dna 端切除的不同方法。

S3 图。pMRE11-NLS抑制xrs2+ 的缺陷。

S4 图。在异步细胞中，NuA4 的招募或剖析不需要 Lcd1/Ddc2。

S5 图。esa1-ts等位基因不会影响在 G1 的超切除背景中重新组合蛋白 Rad52 的招募。

S6 图。Nej1乙酰化突变体不会破坏DNA损伤诱发的磷化，但会影响与Me11的结合。-医学论文发表

S1 表。当前研究中使用的酵母菌株。

S2 表。欧空局1和esa1 ts菌株质谱检测到的乙酰化肽。

确认

引用

Nua4 的 Nej1 乙酰化作为抑制 Nhej 的机制，赞成基于剖析的修复

色度素免疫沉淀（ChIP）

非同源端加入（NHEJ）检测

**S2 图。NuA4 和切除信号之间的差异在野生类型和突变体之间看到，不是由MAT点的不均匀 HO 切割引起的，以及与 Chip - qpcr 与 Rfa1 平行测量 Dna 端切除的不同方法。**

S3 图。pMRE11-NLS抑制***xrs2*+ 的缺陷。**

**S5 图。esa1-ts等位基因不会影响在 G1 的超切除背景中重新组合蛋白 Rad52 的招募。**

**S2 表。欧空局1和esa1 ts菌株质谱检测到的乙酰化肽。**