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《从依赖RNA的RNA聚合酶中对NiRAN域的定性提供了对SARS-CoV-2的潜在治疗目标的见解-医学论文发表》

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《从依赖RNA的RNA聚合酶中对NiRAN域的定性提供了对SARS-CoV-2的潜在治疗目标的见解-医学论文发表》期刊在线投稿系统

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《从依赖RNA的RNA聚合酶中对NiRAN域的定性提供了对SARS-CoV-2的潜在治疗目标的见解-医学论文发表》期刊简介

从依赖RNA的RNA聚合酶中对NiRAN域的定性提供了对SARS-CoV-2的潜在治疗目标的见解-医学论文发表

· 阿比塞克·德维维迪

· 理查德·玛丽亚迪斯

· 穆罕默德·艾哈迈德

· 萨扬·查克拉博蒂

· 迪普西卡·卡尔

· 萨蒂什·蒂瓦里

· 桑卡尔·巴塔查里亚

· 苏迪普塔声纳，

· 谢伦德拉·马尼

· 普拉富拉库马尔裁缝，

· 坦迈·马朱姆达尔

· 杰亚拉曼·杰亚坎坦

· 比希特拉·库马尔·比斯瓦尔

· 发布时间： 2021年9月13日

数字

抽象

除了规范的手指，手掌和拇指域，RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）从病毒顺序尼多维拉斯拥有两个额外的域。其中，尼多病毒RdRp相关核苷酸转移酶域（NiRAN）的功能仍未得到解答。从严重急性呼吸系统综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）中阐明RdRp的3D结构，首次深入了解了NiRAN域的域组织和可能的功能特征。在硅化工具中使用，我们预测 NiRAN 域假设激酶或磷转移酶（如折叠）并在其提议的活动位点结合核苷三磷酸盐。此外，通过分子对接，我们预测了三种广泛使用的激酶抑制剂和五种功能良好的抗微生物化合物在NiRAN领域活性部位的结合及其药物的类似性。这项研究首次使用基本的生化工具，显示了像SARS-CoV-2 RdRp所表现出的活动一样的激酶的存在。有趣的是，一种著名的激酶抑制剂-索拉菲尼布在SARS-CoV-2受感染细胞中表现出显著的抑制和抑制病毒载量。根据当前全球COVID-19大流行紧迫性和感染率显著提高的新菌株的出现，本研究提供了新的抗非典-CoV-2药物靶点和潜在的铅化合物，用于药物对SARS-CoV-2的再利用。

作者摘要

2019年持续发生的冠状病毒病（COVID-19）由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒-2（SARS-CoV-2）引起的大流行正在严重影响世界健康。不幸的是，截至2021年6月，已报告了超过1.8亿例COVID-19病例，导致近400万人死亡。在这项研究中，我们使用生物信息学、生化和质谱法的组合，表明NIDO病毒RdRp与SARS-CoV-2的RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）的核苷酸转移酶（NiRAN）领域具有类似活性的激酶。此外，我们还表明，很少有广谱抗癌和抗微生物药物能像活动一样抑制这种激酶。值得注意的是，索拉菲尼布，FDA批准的抗癌激酶抑制药物显著减少SARS-CoV-2在细胞系的负荷。我们的研究表明，SARS-CoV-2 RdRp的NiRAN域是成功的病毒生命周期所不可或缺的，并且表明用小分子抑制剂消除RdRp的这种酶功能可能为COVID-19治疗开辟新的途径。

引文：德维维迪A，玛丽亚达斯R，艾哈迈德M，查克拉博蒂S，卡尔D，蒂瓦里S等人（2021年）从RNA依赖RNA聚合酶的NiRAN域的特征提供了对SARS-CoV-2的潜在治疗目标的见解。PLoS 计算生物 17 （9）： e1009384.https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384

编辑：阿夫纳·施莱辛格，美国西奈山伊坎医学院

接收：2020年12月25日：已接受：2021年8月26日：已发布：2021 年 9 月 13 日

数据可用性：图中显示的图的原始数据点为图5A、6A、6B 和 6C：S1 数据文件中提供了实时 PCR 分析的原始读数。质谱原始数据文件被提交到OSF存储库在-"https://osf.io/rt6aw/?view_only=815070ca377a4a6cb4aac2e56990152e"。多个序列对齐、结构对齐、结构折叠搜索和小分子对接的结果被提交到 OSF 存储库 https://osf.io/bvcq2/?view_only=1a002bc15cf94bb884df06bc7d7601bc"。

资金：BKB得到了印度新德里生物技术部国家免疫学研究所的核心资金的支持。JJ感谢泰米尔纳德邦高等教育委员会（文件。不。RGP/2019-20/ALU/HECP-0049）提供财政支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备手稿方面没有作用。

竞争利益：作者宣称不存在相互竞争的利益。

介绍

RNA 依赖性RNA聚合酶（RdRp）在所有 RNA 病毒超级家族中保存，除了逆转录病毒之外，这些家族都拥有正感或负感RNA基因组。RdRp 从 RNA 模板中促进 RNA 基因组的复制，从而在病毒生命周期和发病机制中发挥关键作用[1]。RdRp 的结构大致分为三个域 - 手指、手掌和拇指，形状类似于右手的形状。这种结构组织不仅保存在RNA病毒中，而且保存在所有生命王国的DNA聚合酶中[1，2]。然而，来自尼多维拉斯顺序的正链RNA（+RNA）病毒在其RdRp分子的结构组织上呈现出明显的差异[2=4]。众所周知，按顺序排列的病毒会感染广泛的宿主。虽然阿泰里维里达和科罗纳维里达家族成员感染脊椎动物，但梅索尼维里达和罗尼维里达的成员主要感染无脊椎动物[2]4]。尽管其基因组大小在 13 kb 到 35 kb 之间存在显著差异，但每个基因组编码的 RdRp 分子显示了一个共同的结构组织[2]。

除了由规范的手掌、拇指和手指域组成的基本 RdRp 结构组织外，Nidovirus RdRp 还拥有另外两个域 - 尼多病毒 RdRp 相关核苷酸转移酶域（NiRAN）和界面域[2]6]。接口域主要作为 NiRAN 和规范 RdRp 区域之间的连接器。然而，关于NiRAN域的功能方面的信息仍然有限。首次从马动脉炎病毒（EAV）的 RdRp/Nsp9 定义 NiRAN 域的研究演示了瓜诺辛磷酸盐和磷酸尿素与 NiRAN 域的不变赖氨酸残留物的锰依赖共价结合[3]。该研究提出了NiRAN域的三种可能的分子功能：作为韧带，作为GTP依赖5'核苷酸转移酶和作为UTP依赖蛋白启动功能，促进RNA复制的开始[2，3]。来自其他RNA病毒的各种研究已经证明了各自RdRp分子的N终端区域所表现出的核苷酸转移酶活动[7]9]。然而，这些转移酶活动被归因于5'原始以及终端核糖苷酸添加功能。此外，众所周知，RdRp 酶会表现出入门依赖性或入门独立启动 RNA 复制[1， 10]。有趣的是，尼多病毒RdRp分子已被实验证明具有两种启动模式，从而暗示了NiRAN域的可能UTP介质启动功能[11，12]。

早期从SARS-CoV（PDB ID-6NUR）复制多蛋白复合物的低温-EM结构中，有很大一部分NiRAN域名缺失，因此未能为该域提供任何功能关联[5]。然而，最近一项研究报告了SARS-CoV-2（PDB ID-7BTF，6M71）复制多蛋白复合物的低温-EM结构，为NiRAN域提供了完整的结构预览[6]。这些研究表明，界面域也作为多蛋白复合物Nsp8蛋白的结合伙伴。COVID-19，由nido病毒SARS-CoV-2引起的疾病是一个持续的全球危机，除了探索新的抗冠状病毒抑制剂脚手架[13]15]之外，还需要探索病毒蛋白功能。此外，最近出现的传染性显著较高的新型SARS-CoV-2毒株[16]进一步需要发现新的抗病毒靶点和针对病毒生命周期和代谢的小分子抑制剂。在这项研究中，我们利用硅和生化工具的结合，建议SARS-CoV-2的NiRAN域具有类似褶皱的激酶，并可能参与激酶/磷转移酶反应的催化。此外，我们表明，一些以前已知的激酶和核苷酸转移酶抑制剂抑制了NiRAN域和这些活性：索拉菲尼布展示了抗非典-CoV-2活动。

结果

尼兰和界面域的分析

正如最近的一项研究[6]所述，NiRAN 和界面域跨越 SARS-CoV-2 RdRp 多肽序列的残留物 1365。这两个域形成一个箭头状结构，作为蛋白质的RdRp区域（图1A）的基础。其中，氨基酸4/28和69+249被指定为NiRAN域，分别由7个α螺旋（H1-H7）和5-β链（S1-S5）组成。两个独立的β链（B1，B2）在NiRAN域附近形成类似结构（残留物29+68）的发夹，不被视为NiRAN域的组成部分。接口域从残留物 250 延伸至残渣 365，由 6 α-氦束（h1-h6）组成，然后是 3 个抗相比β链（s1-s3）。整体拓扑学表明，两个不同的域是由1个残渣（图1B）的小链接器连接的。正如 EAV-NiRAN 研究中建议的那样，在 SARS-CoV-2-NiRAN 中发现了几个关键残留物，如 K94、R124、S129、D132、D165 和 F166[3]，如两个序列的对齐对齐所揭示的那样。SARS-CoV-2-NiRAN的相应残留物为K73、R116、T123、D126、D218和F219。据预测，这些残留物对NiRAN域的酶功能至关重要。来自冠状病毒的17个RdRp多肽序列的多个序列对齐跨越多个宿主物种（人类、蝙蝠、牛、猪和啮齿动物），揭示了这些残留物的绝对保护（S1图）。包括上述残留物在内，在所有 17 种病毒的 RdRp 分子中发现了 84 种残留物（NiRAN 中有 45 种，界面域中有 39 种），暗示了这些残留物在 NiRAN 和界面域的酶和/或功能特性中的关键作用。NiRAN 域保存的残留物的可视化显示，这些残留物中的绝大多数位于四个搁浅的β片和以下的单数束（图 1B）之间。区域的表面潜在表示显示存在五个潜在入口口袋，表明 NiRAN 域的活跃站点可能由这些保存的残留物（S2A 图）侧翼。然而，界面域中保存的 39 个残留物分布在域架构（S2B 图）中。物种间残留物的保护表明，NiRAN域在RdRp介质RNA复制冠状病毒中的重要作用，如先前关于EAV-RdRp的研究[3]所暗示的那样。-医学论文发表

图1。CoV-2-RdRp 尼兰域提出了一种激酶/磷转移酶，类似于结构组织。

（A） NiRAN 和 CoV-2-RdRp 的界面域呈现一个箭头状结构（皇家蓝色螺旋、桃色链和绿色环）。（B） NiRAN 的整体拓扑学（棕色背景、标记为 H 和链的螺旋标记为 S）和界面域（灰色背景、标记为 h 的螺旋和链条标记为 s）以及β发夹结构（砖红色背景，链条标记为 B）。（C） NiRAN 域拥有拓扑学（左面板），该拓扑（左面板）从规范激酶折叠（中心面板）以及 TgBPK1（右面板）的非规范激酶折叠中借用元素。（D-I）CoV-2-RdRp NiRAN 的二级结构元素与已知激酶的结构叠加揭示了抗β片和随后的螺旋体中的显著对齐。（D）林 2 激酶域。（E）赛克激酶域（F） O-曼诺西尔激酶域。（G）伊拉克4激酶域。（H） FGFR2 激酶域。（一）胰岛素受体激酶域（上述激酶的结构元素以黄色显示的青色、CoV-2-RdRp NiRAN结构元素显示）。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.g001

尼兰域的似是而无的功能预测

对整体拓扑学的理解、保存残留物的定位促使对了解NiRAN域的酶功能进行了调查。为此，考虑了两种不同的方法，蛋白质数据库作为目标数据库。第一种方法利用了隐藏马尔科夫模型（HHPred）[17]的预测，而第二种方法则预测了类似折叠（ORION）[18]的存在。第一和第二种方法检索的前 15 次点击列表分别列在S1和S2表中。值得注意的是，这两种方法都预测了各种激酶和激酶，如转移酶（磷转移酶分子）。先前的一份报告已经证明，NiRAN域与已知伪多基酶分子塞洛的相似性[5];然而，由于没有NiRAN 3D结构，进一步的描述是不可行的。我们比较了尼兰域的地形与规范激酶折叠的地形。与规范激酶折叠类似，NiRAN 域包括一个抗β片，两侧是α螺旋。规范激酶域展示了一个5搁浅的抗平行β板，其两侧是两个平行运行的螺旋和一个螺旋垂直于β板（图1C，中间面板）[19，20]。但是，NiRAN 域显示了一个 4 搁浅的抗平行β片（S1-S4），两侧是一个平行（H2）和两个垂直螺旋（H1 和 H3）（图 1C，左面板）。对现有文献的进一步调查证实存在许多非规范激酶褶皱，其中一个呈4个搁浅的抗平行β片，两侧是三个平行和一个垂直的六边形（图1C，右面板）[21]。综合起来，这些结果表明，NiRAN域假定一个激酶像折叠，可能作为伪多基纳塞或磷转移酶的功能。

为了进一步研究这一命题，对 HHPred 和 ORION 搜索检索的 8 个随机选择的激酶分子进行了 NiRAN 域的结构对齐。分子林2激酶域（PDB ID-5NXD）（图1D和S3A和S4A），Syk激酶域（PDB ID-4YJR）（图1E和S3B和S4B），O-曼诺西尔激酶域（PDB ID-5GZ9）（图1F和S3C和S4C））和IRAK4激酶域（PDB ID-2NRU）（图1G和S3D和S4D）与 NiRAN 域对齐， rmsd （根平均方偏差）值从 0.6+4 + 和对齐分数≥ 0.5，表明这些分子中的激酶域与 NiRAN 域分几乎相似。作为原则证明，上述搜索结果中未列出的另外两个激酶分子 - FGFR2 激酶域（PDB ID-2PVF）（图1H和S3E和S4E）：胰岛素受体激酶域（PDB ID-1GAG）（图1I和S3F和S4F）与NiRAN域对齐。这两种分子都显示 rmsd 值，范围从 0.22+4 + 和对齐分数 +0.5，进一步突出了可能存在激酶，如折叠在 NiRAN 域。研究结果清楚地显示了两个分子的C+骨干的对齐和二次结构元素的保存。值得注意的是，单轴H2、氦H6、氦H8和抗相比β片（S1-S4）的对齐性非常明显。值得注意的是，前面提到的伪多基酶分子塞洛（PDB ID-6EAC）也与尼兰域一致。rmsd 值从 2+8 到对齐分数 0.42 之间，对齐表明，虽然两个分子大致假设相似的褶皱，但氨基酸保护差异很大。总的来说，对齐结果进一步突出了在 NiRAN 域内存在非规范激酶/磷转移酶（如折叠）。

预测尼兰域活动站点

早期与 EAV-RdRp 的研究实验性地证明了 GTP 和 UTP 核苷酸与 NiRAN 域的结合[3]。对 NiRAN 域内的这些核苷酸进行了对接分析，以划定可能的活动站点。Kinase 域名一般在抗与伦比β片和随后的氦束之间具有活跃的站点[19， 22， 23]。ATP （图 2A 和 2A'），GTP（图 2B 和 2B'）和 UTP （图 2C 和 2C'）在可能的活动场区域内对接良好，结合能量分别为 -8.726 kcal/mol、-9.84 kcal/mol 和 -6.59 kcal/mol。此外，与MMGBSA（分子力学泛化出生表面积）结合自由能量计算的终点表明，核苷酸和可能活动部位的残留物（分别为ATP、GTP和UTP的-17.84、-15.77和-17.67千卡/摩尔）之间的强相互作用。对分子相互作用的检查表明，ATP与K73和D208等关键尼兰残留物形成盐桥和H键。GTP 与 R116 和盐桥与 K73 形成可能的 H 键结合。然而，UTP只显示与K73的盐桥相互作用。利用上述相互作用和保存严重的残留物，我们计算预测了 NiRAN 域的活跃站点。预测的活动站点口袋内衬以下残留物：F35、D36、I37、Y38、N39、F48、L49、K50、T51、N52、R55、 V71， K73，R74， H75， N79， E83， R116， L119， T120，K121， Y122， T123，V204， T206， D208， N209， Y217， D218， G220， D221，F222和S236：在冠状病毒 RdRp 分子上严格保存的下划线残留物。K73 被预测为 NiRAN 活动站点的关键残留物之一。EAV-RdRp （K94）的相应赖氨酸被认为对 NiRAN 域的功能至关重要，因为它与 GTP 和 UTP 的相互作用。研究还表明，将赖氨酸变异为丙氨酸会导致RdRp功能完全丧失[3]。描绘静电表面潜力的活动站点口袋的概述表明，在站点的带电残留物的本地化，而口袋的内部仍然内衬着大部分非极性残留物（S2C 图）。

图2。CoV-2-RdRp NiRAN 域的活跃站点将 ATP、GTP 和 UTP 结合在一起，并像主题一样展示激酶。

ATP、GTP 和 UTP 在 NiRAN 域的可能活动站点绑定，具有显著低自由结合能量。（A）活跃站点口袋内的 ATP。（B）活动站点口袋内的 GTP。（C）活动站点口袋内的 UTP（蓝色表示带正电荷区域，红色表示带负电荷区域，绿色表示中性区域，灰色表示 GTP 绑定口袋以外的区域）。（A'）ATP 与 K73 形成盐桥，H 键与 D208 形成盐桥。（B'）GTP 绑定揭示了盐桥与 K73 的相互作用和 H 键与 Asp 116 的交互。（C'）UTP 绑定显示盐桥与 K73 的相互作用。-医学论文发表

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.g002

上述结果表明，像折叠这样的激酶和显示可能的GTP和UTP绑定函数的活跃站点，使用NiRAN、β发夹和界面域的完整序列进行了主题搜索。结果预测了激酶的存在，如属于蛋白质激酶C家族、蛋白质激酶A家族和Src激酶家族[24]等图案。也很少预测属于未指明的激酶家族的序列图案。有趣的是，没有像主题这样的激酶预测界面域和β发夹区域。值得注意的是，还预测了与未指明的激酶共识重叠的肌酸化共识序列。众所周知，宿主酶与病毒蛋白相互作用，在宿主或病毒介导信号后诱导转化后修改。特别是，宿主激酶已知张贴转化修改病毒蛋白往往导致增强的毒性或诱导各种代谢途径[25]27]。激酶位点预测表明，有六个不同的激酶磷酸化位点具有 eIF2 激酶家族的特异性。这些主题的序列可视化在S5A图中呈现。这些预测暗示了病毒蛋白的转化后可能的改变，由宿主SARS-CoV-2的相互作用进行调解，可能旨在调节宿主和病毒代谢。

为了进一步探索尼兰域的催化性质等激酶，随机选择并对接到尼兰域预测的活跃部位，随机选择三种广泛的特异性激酶抑制剂——苏尼蒂尼布、索拉菲尼和SU6656。所有三个激酶抑制剂显示强结合在预测的活跃部位，从低自由能量的结合（图3A-3C和S3表）明显可见。有趣的是，这些抑制剂还展示了潜在的H键与残留物衬里的活动网站。虽然苏尼蒂尼布和索拉菲尼布主要与阿斯巴丁残留物相互作用，但SU6656表现出H-bond与赖氨酸残留物73（图3A'，3B'和3C'）的相互作用，这是预测参与NiRAN域催化活性的关键赖氨酸残留物，如前所述。作为负控制，两种激酶抑制剂（Daidzein/PubChem ID-5281708和Geinstein/PubChem ID-5280961）的非活性类比被停靠到假定的NiRAN域活动站点[28]。这些化合物显示对接分数和结合能量低于索拉菲尼布，苏尼蒂尼布和SU6656（S5B和S5C图）。简言之，上述预测进一步表明，冠状病毒RdRp的NiRAN域具有激酶/磷转移酶，如催化活性。

图3。CoV-2-RdRp 尼兰域的活跃部位结合激酶抑制剂。

（A、C 和 E）广泛特异性激酶抑制剂结合在预测的NiRAN活性位点与显著低自由结合能量。（蓝色表示带正电荷区域，红色表示带负电荷区域，绿色表示中性区域，灰色表示 GTP 绑定口袋以外的区域）：（A）活动站点口袋内的 Sunitinib：（B）活动场地口袋内的索拉菲尼布：和（C）活动站点口袋里的 SU6656。激酶抑制剂显示与酶关键阿斯巴酸盐和赖氨酸残留物之间的H-键相互作用，在活动部位-（A'）苏尼蒂尼布：（B'）索拉菲尼布;和（C'） SU6656.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.g003

针对 NiRAN 域活动站点的抑制剂预测

如前所述，此域可能涉及 GTP 诱导蛋白磷酸化，从而实现引数独立RNA复制（G 封顶）[3]。此外，该域可能涉及UTP的磷酸化，从而作为终端核苷酸转移酶发挥作用。众所周知，具有DNA和RNA基因组的各种病毒都拥有多功能或专用蛋白质，这些蛋白质表现出上述活动[7，29]。有趣的是，许多致病细菌也编码的蛋白质具有G封顶和/或终端核苷酸转移酶活动[30， 31]。多年的研究还提出了大量的抑制剂分子，针对这些基本功能的病原体，导致人类和非人类哺乳动物的疾病[29]。经过仔细检查，一份77种化合物的清单，其中实验证明对弗拉维维里达、托加维里达成员具有抑制作用：人类巨细胞病毒，单纯疱疹病毒，和少数克阴性细菌物种被选中对接对CoV-2-RdRp尼兰域活动场址[29， 32×38]。选定的化合物列表在S4 表中显示。

此外，本研究将讨论最好的五种抑制剂的基础上，对上述77种化合物进行的对接分析。对接得分在递减顺序中得分最高的五个抑制剂是 - 65482、122108、135659024、4534 和23673624（数字表示 PubChem ID）。对接分析的结果在S5 表中显示。这五种抑制剂都占据活动站点口袋内的不同区域，其芳香环与未充电/非极性区域对齐，而带电的粘土则适合活动站点口袋的四肢（图 4A+4E）。所有五种抑制剂都表现出与活动站点残留物的 H 键结合相互作用。有趣的是，所有五种抑制剂都存在潜在的盐桥与活跃的站点残留物，也表现出与酶关键残留K73的相互作用，无论是通过H粘结或盐桥。除了上述相互作用，复合65482还展示了它自己的紫杉环和残留的F35和F48之间的pi-pi相互作用，这从其最佳对接得分中可见一斑。这些抑制剂与 CoV-2-RdRp NiRAN 域活动场点的分子相互作用以图 4A'、4B'、4C'、4D'和 4E 形式呈现。为了估计上述抑制剂的药物类似性，进行了ADME/T分析。ADME/T 分析未能为化合物135659024提供任何结果。根据利平斯基的五[39]规则和相关的药理动力学标准（如 H 键原子概率、人体口服吸收和 IC），其他四个分子的 ADME/T 特性在可接受范围内50人类以太相关基因（hERG） K 的阻塞值。此分析结果列在S6 表中。+

图4。在 CoV-2-RdRp NiRAN 的活跃部位预测的五种核苷酸转移酶抑制剂的结合和分子相互作用。

计算定向绑定 - （A） 65482：（B） 122108：（C） 135659024：（D） 4534：和（E） 23673624：在活动站点口袋内。（蓝色表示带正电荷的区域，红色表示带负电荷的区域，绿色表示中性区域，灰色表示 GTP 绑定口袋以外的区域）。抑制剂与活性部位口袋之间的分子相互作用揭示了H键、盐桥和pi-pi相互作用-（A'） 65482：（B'） 122108：（C'） 135659024：（D'） 4534：（E'） 23673624。值得注意的是，最好的预测抑制剂-65482呈现了上述所有分子相互作用。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.g004

SARS-CoV-2 RdRp 的 NiRAN 域表现出类似活性酶/磷转移酶

为了确定任何假定激酶，如由CoV-2 RdRp窝藏的活动，蛋白质被过度表达，纯化（S6A和S6B图），其身份通过质谱仪（S6C图和S7表）确认。CoV2-RdRp 缺乏任何已知的激酶/磷转移酶基板，这带来了不同的挑战。大多数激酶是特异性的，很少磷酸盐其他目标[40]。此外，在没有任何基质的情况下，激酶已被证明表现出残留的内在ATPase/GTPase样的活动[41×44]。在这里，酶酶从酶上切开核苷三磷酸盐分子，并将伽马磷酸酯组转移到微环境下的水分子[44]。此外，大多数已知的激酶抑制剂与ATP结合部位结合，从而废除了反应[45]。ADP-Glo 激酶检测套件[46]用于确定 CoV-2 RdRp 的激酶活性。使用已知的激酶-人类Akt2验证了准确确定激酶活性的检测效率。这种酶表现出与K的重要活性m价值 +300 μM 的 ATP （图 5A），这是非常类似于 Km在先前报告的研究中确定值（= 350 μM =47]。此外，牛血清白蛋白，一种结合ATP[48]的蛋白质表现出微不足道的活动（图5A），进一步验证了协议的特异性和选择性。值得注意的是，具有不同浓度ATP的CoV-2 RdRp的孵化显示出与人类Akt2（K）相当的重要活性m±500 μM （图 5A）。为了进一步确定观察到的激酶/磷转移酶（如活性）主要由NiRAN域表现出来，在拟建的NiRAN活性位点（K73和D218）的两个关键残留物变异为丙氨酸的情况下产生了突变蛋白。V 显著下降麦克斯观察到K73A和D218A突变体的值（图5A）。然而，RdRp 复制活性部位（D760 和 D761[49]）的关键阿斯巴丁染料的双突变体显示的活动与野生类型酶（图 5A）相似。荧光光谱表明，这些突变对酶的3D结构完整性没有影响，表明K73A和D218A突变体中观察到的活性丧失主要是由于它们在激酶/磷转移酶类型活性（S6D图）中的作用。这些结果共同构成了有史以来第一个关于内在激酶/磷转移酶的证据，就像冠状病毒RdRp分子的NiRAN域所展示的活动一样。-医学论文发表

图5。SARS-CoV-2 RdRp 表现出激酶/磷转移酶等活性。

（A） CoV-2 RdRp 表现出类似于纯化人类 Akt2 的活动一样的激酶。虽然可能的 NiRAN 活性位点（K73A、 D218A）中的突变会导致激酶的下降，如 SARS-CoV-2 RdRp 的催化活性，但变异 RdRp 复制活性位点（D760A+D761A）对同一点的影响微乎其微。ATP结合蛋白牛血清白蛋白作为负控制（数据点显示平均值和标准误差）。连接曲线表示非线性回归）。（B）来自希斯通 H1 的肽 Kslvskgtlvqtk 的 MS - MS 光谱配置文件，在 ATP 和 Mg 面前用 SARS - cov - 2 Rdrp 治疗2+显示两个丝氨酸残留物的磷酸化。（C）在ATP和Mg面前用人类Akt2治疗的Histone H1同一肽的MS-MS光谱配置文件2+显示单个肌酸残留物中的磷酸化。（D）仅在Mg在场的情况下，用SARS-CoV-2 RdRp治疗的Histone H1上述肽的MS-MS光谱剖面2+显示无磷酸化，确认SARS-CoV-2 RdRp NiRAN域的磷转移酶活性（详情请载于S7和S8图和S8表）。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.g005

为了评估磷转移反应的效率，脱磷人组蛋白H1在适当条件下用SARS-CoV-2 RdRp进行治疗，并给予适当的控制。对被消化的平石H1进行质谱分析，发现存在磷酸化肽：85-KS*LVS*KGTLVQTK-97（S86和S89的磷化）在ATP和Mg的治疗后2+（图5B和S7A和S8A和S8表）。同时，对希石H1试剂肽的分析检测出T92：85-KSLVSKGT*LVQTK-97存在相同的肽磷化物：在ATP和Mg面前与人类Akt2一起治疗后2+（图5C和S7B和S8B和S8表）。然而，在没有ATP的情况下，用RdRp或Akt2治疗的Histone H1的相同肽;用 ATP 和 Mg 治疗的希斯通 H12+在没有RdRp或Akt2的情况下;和希斯通 H1 只治疗 Atp 和 Mg2+任何血清和肌氨酸残留物（图5D和S7C以及S8C和S8表）中都没有磷酸化。这些观察进一步表明，SARS-CoV-2 RdRp的NiRAN域具有类似激酶活性的血清素-三氨酸。

抑制 NiRAN 域可减少 ACE2 表达细胞系中的病毒载量

为了进一步确定CoV-2 RdRp的可能激酶，CoV-2 RdRp和人类Akt2都孕育了过量的ATP，并在本研究中提到的三种激酶抑制剂中各用500纳米进行治疗-索拉菲尼布、苏尼蒂尼布和SU6656。有趣的是，所有三个激酶抑制剂显著废除了激酶，如CoV-2 RdRp （图6A）的活动。对于人类Akt2，索拉菲尼布和SU6656显著抑制其激酶活性，而苏尼蒂尼布治疗表现出轻度抑制（图6A）。这为COVID-19药物的再利用提供了关键见解，因为上述三种化合物都是经批准用于人类使用、耐受性高且无显著毒性的药物。由于 CoV-2 RdRp 的 NiRAN 域已被注释为核苷酸转移酶，我们试图确定通过硅化方法预测的前五种化合物的任何抑制功效。我们无法以商业方式采购该化合物23673624，因此我们使用了剩余的四种化合物，即135659024、122108、65482和4534。我们观察到前三种化合物对激酶的影响很小，如CoV-2 RdRp在浓度为500 nM（图6B）下的活动。然而，这些化合物是核苷类比/衍生物，在浓度为1000 nM（图5C）时表现出明显的抑制作用。第四化合物4534，一种儿茶酚衍生物未能抑制CoV-2 RdRp激酶，就像两种浓度（图6B）中的任何一种活动一样。这表明，这三种抑制化合物可能涉及阻止ATP以类似于特定激酶抑制剂的方式与各自的结合部位结合。

图 6.阻抗SARS-CoV-2 RdRp NiRAN域的活动可减少受感染细胞中的病毒载量。

（A）虽然所有激酶抑制剂的治疗都废除了激酶，如CoV-2 RdRp的活动，但索拉菲尼布和SU6656主要抑制了人类Akt2的活动，而苏尼替尼布只表现出轻微的抑制作用。（B）用核苷酸转移酶抑制剂治疗CoV2-RdRp，135659024、122108和65482表现出对微摩尔浓度激酶活性的明显抑制。然而，化合物4534没有表现出任何抑制潜力。（C） 5 μM 索拉菲尼有效减少 SARS-CoV-2 受感染的 Vero E6 细胞中的病毒复制。此外，索拉菲尼布与 1 μM Remremivir 的组合完全中和了 SARS-CoV-2，其 Ct 值与未受感染细胞的 Ct 值相似（这些条表示平均值和标准误差）就很明显了。符号"*" 和"**" 分别表示 p 值小于 0.05 和 0.005 的意义。符号"ns"表示非意义）。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.g006

为了确定抑制NiRAN域的活动是否对SARS-CoV-2的病毒周期有显著影响，用三种不同浓度的广谱激酶抑制剂对感染SARS-CoV-2的Vero E6细胞进行了治疗。苏尼蒂尼布和SU6656未能控制实验浓度的病毒繁殖。然而，索拉菲尼布阻碍病毒复制浓度超过2μM，其效率类似于已知的抗病毒药物，伦德西维尔（在1μM）（图6C）。我们观察到在索拉菲尼布5μM的病毒生长抑制，这是表现出最大抗病毒疗效的药物的最小浓度。Sorafenib 与 25 μM 和 50 μM 也阻碍病毒繁殖，虽然在 5 μM， 25 μM 和 50 μM 浓度的药物之间没有显著的病毒载量差异.

这些结果表明，索拉菲尼布阻碍了NiRAN域的活动，从而阻碍了病毒复制。先前的研究表明，伦迪西维尔废除了RdRp的规范复制活性[50，51]。值得注意的是，棕榈和NiRAN域氨基酸序列在为SARS-CoV-2[52， 53]确定的各种关注变种中都保存得非常节省。我们假设，伦迪西维尔和索拉菲尼的组合疗法可能显示出协同效应，以废除RdRp的双重酶活动。此外，5 μM 索拉菲尼和 1 μM Remdesivir 的组合治疗在中和病毒（图 6C）方面具有协同效应。值得注意的是，Vero E6细胞在用浓度为50、25和5 μM的索拉菲尼和浓度为25、5和1μM的Remdesivir治疗时没有表现出凋亡。这些结果表明，索拉菲尼布单独或与伦德西维尔联合可以证明在清除SARS-CoV-2感染方面是有效的。

讨论

SARS-CoV-2是持续全球大流行COVID-19的病原体，是最近出现的病原体，截至29日，已感染超过1.8亿例，导致400多万人死亡th2021年6月[54]。该病的基本繁殖数量从1.4到3.9不等，在过去的一年里迅速传遍了全球[55]。这种情况需要全世界研究人员的紧急关注，以便更好地了解该病的病毒发病机制、临床表现和生物学，以便开发针对病毒蛋白的疫苗和小分子抑制剂等治疗方法。普遍的假设表明，影响人类和蝙蝠宿主的冠状病毒之间的多个基因组水平重组和人畜共患事件导致了SARS-CoV-2[15]的进化。然而，值得注意的是，与以往的人类冠状病毒（如SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-Hku1）以及蝙蝠-CoV-Hku4和蝙蝠-CoV-ZC45等非人类冠状病毒相比，SARS-CoV-2的RdRp分子在蛋白质序列水平上基本保持不变，仅举几例[56]。

尽管是著名的病原体，但在2002年SARS-CoV爆发后，冠状病毒的RdRp分子的功能方面仍不清楚[5，6，11]。此外，关于独特的 NiRAN 和界面域的信息更少，这些域是针对尼多维拉莱斯顺序病毒的 RdRp 分子的[2， 3]。在这项研究中，我们建议NiRAN域窝藏一种非典型激酶/磷转移酶，如褶皱，具有核苷三磷酸盐结合活性。在预测的活动部位结合广泛特异性激酶抑制剂，进一步表明NiRAN域的可能酶作用。有趣的是，最近的一份报告提出了激酶抑制剂在COVID-19[57]的管理中的可能性。根据先前关于 EAV-RdRp 的研究，本研究划定了 NiRAN 活动站点 - F35、D36、F48、K73、R116、D218 和 D221 的可能催化残留物。此外，研究结果还表明，SARS-CoV-2 RdRp的NiRAN域表现出一种假定激酶/磷转移酶，其活性可与成熟的人类激酶-Akt-1相媲美。

利用计算对接和模拟，本研究预测了针对NiRAN域的可能抑制剂化合物。有趣的是，上述激酶，如RdRp的活动，在纳米摩尔浓度的这些抑制剂的存在下被显著抑制。复合苏尼蒂尼布是酪氨酸家族激酶的抑制剂[58];索拉菲尼布抑制血清素/肌氨酸和酪氨酸家族激酶的活动[59， 60];而SU6656抑制Src家族激酶[60， 61]。虽然索拉菲尼布和苏尼蒂尼布被批准用于肾脏癌、肝细胞癌和胃肠道癌的医学用途，但化合物SU6656是一种实验分子，用于研究Src激酶在细胞周期中的作用[61，62]。除了激酶抑制剂，化合物65482（西芬金），是广泛特异性微生物核苷酸转移酶抑制剂，已知可抑制RNA复制在黄病毒和疱疹病毒[63， 64]。该化合物122108（里巴韦林5'-三磷酸盐），抑制在广泛的病毒，如登革热病毒，汉坦病毒和丙型肝炎病毒[8，65，66]形成RNA的g-caping。正式名称为m7GTP，该化合物与PubChem Id 135659024，干扰RNA/DNA g封盖活性在许多病毒病原体，如裂谷热病毒，流感病毒，寨卡病毒和登革热病毒，仅举几例[67×69]。鉴于SARS-CoV-2特定疗法的不可用，以及新菌株[16]的出现，药物再利用可能证明对对抗持续流行至关重要，同时具有成本和时间效益。这项研究检查了研究良好的药物索拉菲尼布的抗SARS-CoV-2活性，该药物可能证明在COVID-19的中度和重度病例中有效控制疾病。其他最近的研究也暗示了NiRAN域的多才多艺。其催化功能包括 nsp9 的 NMPylation，从而形成复制转录复合体，这对病毒复制至关重要[70]。值得注意的是，这种NMPylation活动是在Mn在场的情况下特别观察到的2+，而激酶/磷转移酶活性在我们的研究中呈现，只观察到在Mg的存在2+离子。此外，另一项研究还显示了NiRAN域在形成帽芯结构中的作用 [71]。此外，来自SARS-CoV-2各种变种的RdRp分子的NiRAN域，包括关注的变种，表现出高度的保护，特别是在K73和D218[52，53]等假定的活跃部位残留物中。我们的报告和最近的这些研究共同暗示了RdRp NiRAN域在尼多病毒中成功复制病毒的不可或缺的性质，因此，在体内探索针对NiRAN催化功能的化合物的体内抗病毒功效是相关的。-医学论文发表

材料和方法

道德声明

所有实验程序至少进行了三次，具有独立获得的蛋白质和细胞系。所有实验协议均得到机构生物安全委员会的批准：IBSC#388/20（印度国家免疫学研究所批准为BKB）;IBSC#298/2021（印度转化健康科学与技术研究所批准为SM）;和 No.BT/Bs/17/458/2011-PID（印度生物技术部遗传操纵审查委员会批准SM）。

CoV-2-RdRp 的 NiRAN 和界面域的特征

SARS-CoV-2-RdRp的3D结构坐标是从蛋白质数据库（PDB ID-7BTF和6M71）[6]中检索的。数据集 7BTF 用于后续分析，因为它提供了 CoV-2-RdRp 的所有氨基酸残留物的信息。文件中的坐标数据被修剪为氨基酸 1-365（NiRAN 和界面域的序列）。此文件用于 NiRAN 和界面域的计算定性。对于序列分析，所有冠状病毒 RdRp 序列都是从 NCBI 数据库中检索到的，并使用 Clustal 欧米茄[72]和 Multalin[73]服务器进行多个序列对齐。序列对齐可视化是使用 ESPript 3.0 网络工具[74]生成的。功能分析使用 MPI 生物信息学工具包[17]、DALI服务器[75]和 DSIMB 服务器[18， 76]进行。从蛋白质数据库（PDB ID-1CSN、1GAG、2NRU、2PVF、3Q60 和 6EAC）检索了激酶的坐标文件，以便与 CoV-2-RdRp 的 NiRAN 和接口域进行结构对齐。对齐是使用爪哇应用程序中灵活的"jFATCAT"算法进行的，该算法在蛋白质数据库[77]中可用。使用了默认对齐参数（RMSD 切断 - 3 +、AFP 距离切断 - 5、最大扭曲数 - 5 和碎片长度-8）。所有可视化都是在皮莫尔[78]中执行的。Motif 预测和激酶功能预测是使用 Web 服务器执行的 - ELM[79]，PSIPRED[80]，CDD[81]，MyHits[82]，和磷预测[83]。

在硅基配体准备、活动站点口袋预测和分子对接方面

所有抑制剂的坐标文件从 PubChem 数据库和/或蛋白质数据库中检索。所有抑制剂都是通过使用"Schrodinger 套件 2019"[84]中实施的 LigPrep 模块分配适当的几何形状、债券订单、电工和电电化状态来制备的。NiRAN 和界面域的坐标文件用于使用"Schrodinger Suite 2019"的 SiteMap 模块预测可能的配体绑定口袋。使用 Phyre[85]和 CASTp 服务器[86]验证了这些站点的准确性，并比较了结果。这些站点用于生成抑制剂分子对接的网格。准备好的抑制剂使用"施罗德套件 2019"的滑翔 XP（额外精度）模块停靠在预测的绑定站点上。

MMGBSA 计算

MMGBSA（分子力学泛化出生表面积）计算[87]分析了抑制剂域复合物（NiRAN和带抑制剂的界面域）结合的自由能量。计算使用以下方程执行：

（\E毫米表示气体相中分子能量变化最小化;GSGB使用 GB 模型表示表面计算;和 G萨表示综合体的可访问表面积）[88， 89] 。

分子对接和MMGBSA计算协议通过与寨卡病毒甲基转移酶与核苷酸转移酶抑制剂西内芬金（PDB ID-5MRK）的可用共晶体结构进行比较得到验证。

ADME/T 属性预测

对对接得分最高、结合能量最小的前 5 种抑制剂进行了分析，以分析其药理动力学特性，如 ADME（吸收、分布、代谢、消除或毒性）和药物的类似性[90， 91]。"Schrodinger 套件 2019"的 QikProp 模块通过采用利平斯基的五[39]规则和各种药理动力学特性（如可能的氢粘合原子）来评估药物的类似性;人体口服吸收（<25%：贫乏;>80%：良好）：QP日志（预测化合物的水溶性，可接受范围为-6.0至-0.5）和IC50人类以太相关基因（hERG） K 通道（< -5：令人满意）的阻塞值[92]。+

SARS-CoV-2 RdRp 原生和突变蛋白生成

SARS-CoV-2 RdRp 的 ORF 编码使用基因特定引物（本节末尾提到）放大了 PCR，并使用质粒 pDONR223 SARS-CoV-2 NSP12 作为模板DNA（美国阿迪根）。将可乐编码为 deca-histidine 标签，并纳入前引物，以便获得带有 N 端分化丁标签的重组蛋白。一个进入克隆网站（CACC），一个限制内分泌酶NDI（CATATG）的识别网站和一个启动科顿也被纳入了前导入。反向引向包括一个停止科顿和限制内分泌印地语（AAGCTT）的识别站点。使用的引向器列在本段末尾。PCR 放大产品使用适当的协议（美国 Qiagen）被贴入进入载体 pENTR-D-TOPO 中。利扎德产品被转化为化学上称职的大肠杆菌菌株DH5+，生长在含有50μg/ml卡纳米辛的LB agar介质上，在310K时进行选择。正菌落使用菌落PCR进行筛选，重组质粒pENTR-D-TOPO-RdRp由质粒迷你制剂使用适当的协议提取。孤立的质粒受到限制消化与酶NDI和印地语使用适当的协议（新英格兰生物实验室，英国）。表达载体 pET-28b （+）通过酶NdeI和印地安人的限制消化进行线性化。含有RDRpORF和线性表达载体的消化片段由T4DNA韧带使用适当的协议（美国Qiagen）进行配体。利扎德产品被转化为化学能力强的大肠杆菌菌株DH5+，生长在含有50μg/ml卡纳米辛的LB agar介质上，在310K时选择。正菌落使用菌落PCR进行筛选，重组质粒pET-28b-RdRp由质粒迷你制剂使用适当的协议提取。质粒通过酶NDI和印地安人的限制消化和DNA测序（印度BioServe）验证。使用之前描述的嵌套 PCR 定向突变协议（93]使用适当的引物（本节末尾提到），对 K73A 和 D218A 进行了单次 codon 替换，并进行了双 codon 替换。突变质粒通过DNA测序得到确认（印度BioServe）。质粒 pET-28b-RdRp（原生和突变体）随后转化为具有化学能力的 Escherichia 大肠杆菌菌株 BL21-DE3，并在含有 50 μg/ml 卡纳霉素的 LB Agar 介质上生长，在 310 K 下进行选择。

从阿加介质中挑选出一个菌落，并接种成含有50微克/毫升卡纳霉素的LB液体介质，生长在310K。这些培养物是在 A 中用 0.5 mM 的 IPTG 诱导的6000.8.文化在301K的温度下感应后保持了3个小时。这些细胞通过离心采集培养物10000克，并重新悬浮在裂解缓冲器（50mM Tris， 500 m M NaCl， 30 m Imidazole， 2.5 mM DTT， 10% 甘油， PIC 1 片， 10 m M PMSF， 0.1% 纳德氧乔拉特， 0.3 毫克/毫升溶酶在 pH 8.0）.这些细胞使用 CF 细胞干扰器（英国恒定系统）进行解解。解糖在12000克离心一小时，超纳坦用于蛋白质纯化。蛋白质是使用快速性能液相色谱系统AKTA纯（GE医疗保健，美国）纯化。蛋白质是使用亲和色谱（HisTrap-FF列）纯化的;通用电气医疗保健，美国），其次是大小排除色谱（HiLoad 16/600 超级dex 200 PG 列，GE 医疗保健，美国）。在亲和色谱中，重组蛋白在上述缓冲器中被切除，缓冲器中含有300mM imidazole（梯度1至500mM）。在离子交换色谱中，蛋白质在上述缓冲器中蒸发，其中含有额外的 210 mM NaCl（梯度 1 至 1000 mM）。在大小排除色谱中，蛋白质以 +65 毫升的流量排出。完整的净化过程保持在277K的温度。重组蛋白的纯度在SDS-PAGE上进行了分析，并使用液相色谱-串联质谱法（超高分辨率纳米LC-MS/MS使用C18列和Q精确轨道测量质谱仪，美国热科学）在商业设施（印度新德里VProteomics）确认了蛋白质的特性。纯化蛋白浓缩到1毫克/毫升使用50kDa膜离心装置（美国米利波雷），并储存供进一步使用。本地和突变的RdRp蛋白使用上述相同的协议过度表达和纯化。原生和突变RdRp蛋白的荧光光谱是在30°C下利用荧光光谱仪（日本Horiba Fluromax4）获得的，激发波长为280纳米，蛋白质样本的发射光谱记录在300至400纳米之间。所有的光谱都被纠正为缓冲吸收，蛋白质被稀释到5μM的浓度。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.t001

SARS-CoV-2 RdRp 原生和突变蛋白的生化检测

ADP-Glo激酶检测系统（美国普罗梅加）使用纯化重组RdRp[46]用于所有生化分析。用于所有生化检测的酶浓度为100纳米。用于生化检测的缓冲器包含 20 m M Tris-Cl、300 mM NaCl、7.5 m MgCl2， 5 mM 2-甲醇和10%v/v 甘油。ATP （250，500，750 和 1000 μM）的不同浓度用于确定重组 RdRp 在 310 K 的酶活性。读数在开始反应后使用亮度计测量为 0、5、20、35 和 50 分钟（德国贝尔索尔德技术公司）。同样的协议用于突变体K73A、D218A和D760A+D761A的生化检测。净化人类Akt2（西格玛奥尔德里希，美国）在100 nM和牛血清白蛋白在100μM（印度HiMedia）浓度分别被用作激酶活动的正负控制。-医学论文发表

激酶抑制剂索拉菲尼布，苏尼蒂尼布和SU6656（西格玛奥尔德里希，美国）溶解在100%v/v DMSO（西格玛奥尔德里希，美国），并在浓度为500纳米。预测的核苷酸转移酶抑制剂135659024、122108、65482和4534（美国西格玛奥尔德里希）溶解在100%v/v DMSO中，在两种不同的浓度-500和1000 nM下使用。对于所有抑制研究，ATP浓度保持在100mM。图表是使用图形板棱镜 7.0 绘制的。为了获得迈克尔斯-门滕动力学，对酶活动进行了非线性回归。通过学生的t测试确定化合物抑制潜力的统计意义。

SARS-CoV-2 RdRp 尼兰域的激酶/磷转移酶活性质谱分析

脱磷的希斯通H1（美国西格玛奥尔德里希）用SARS-CoV-2 RdRp或人类Akt2、1000微米ATP和7.5mMgCl的不同组合进行治疗2;在含有 20 mM Tris-CL、300 m M NaCl、5 mM 2-甲醇和 10% v/v 甘油的缓冲器中。设置了六种反应混合物：（1）希斯通 H1 = Rdrp = Atp = Mg2+;（2）希斯通 H1 = Akt2 = Atp = Mg2+;（3）希斯通 H1 + Bsa + ATP + Mg2+;（4）希斯通 H1 = RdRp = Mg2+;（5）希斯通 H1 = Akt2 = Mg2+;和（6）希斯通 H1 = Atp = Mg2+.样品在310K下孵育1小时，蛋白质在SDS-PAGE上分离。随后的协议是在商业设施（新德里的V蛋白学）进行的。简言之，与Histone H1大小对应的感兴趣的波段从凝胶中切除，并处理了4mM的Tris（2-carboxyethyl）磷化物（美国西格玛·奥尔德里希）8mM碘酰胺（美国西格玛·奥尔德里希）。凝胶内消化是用uHPLC级试金石（西格玛奥尔德里希，美国）在50m铵碳酸氢酸酯（西格玛奥尔德里希，美国）在310K为12小时。文摘使用 C18 硅胶盒清洗，以去除盐，并使用速度真空干燥。干燥的颗粒被重新悬浮在5%的丙酮三叶酸（西格玛奥尔德里希，美国）和0.1%的富酸（西格玛奥尔德里希，美国）。液相色谱串联质谱是在终极 3000 RSLCnano 系统上进行的，并配以热 Q-Exactive Plus。1ug 样品被装载在 C18-50 厘米，3.0μm 易喷雾柱上（热费舍尔科学）。肽的梯度为80%的丙酮酸，0.1%为甲酸：流速 5 nls-1并注射用于MS分析。LC 梯度运行了 100 分钟。质谱仪采用数据依赖采集模式，使用热Xcalibur 2.1软件进行全频谱扫描，扫描范围为150-1200m/z。 MS1光谱以7万分辨率在轨道陷阱中获得。动态排除用于 10 s，不包括给定前体的所有收费状态。MS2光谱以17500个分辨率获得。数据是使用蛋白质组发现者2.2软件分析的，光谱是使用SEQUEST搜索引擎[94]对NCBI蛋白质数据库进行搜索的。前体和碎片质量容差分别设置为 10 ppm 和 0.02 Da。用于产生肽的蛋白酶，即酶特异性被设置为特普辛 / P （在 K / R ：除非后面跟着 P 的 C 终点站的），以及两个最大缺失的值。赛尔斯坦的卡巴米多美化被认为是固定的修改，而血清、肌氨酸和酪氨酸的甲氨酸和磷酸氧化则被视为数据库搜索的可变修饰。肽谱匹配和蛋白质假发现率被设定为0.01 FDR。

确定抑制剂在抑制前体内SARS-CoV-2感染的功效

Vero E6细胞，被认为是SARS-CoV-2感染的理想选择[95]，在 DMEM 中保持，辅以 10% FBS。这些细胞在生物安全控制3级设施中感染了SARS-CoV-2（孤立美国-WA1/2020）。感染后，细胞用磷酸盐缓冲盐水清洗，并维持在DMEM补充2%的FBS。在 24 井板的 400 TCID50 感染后 1 小时，细胞用无血清介质清洗，并在各自的井中加入 500 μl 的 DMEM，并辅以 2% FBS，其中含有索拉菲尼布、苏尼蒂尼布、SU6656 和伦德西维尔的不同浓度和组合。感染后48小时，收集了超高分子，并根据疾病预防控制中心指南[96]使用SARS-CoV-2核胶囊基因的引物进行了定量RT-PCR。未受感染的细胞和未经治疗的受感染细胞分别用作阴性和阳性对照组。Ct 值被用作病毒复制的标记。统计意义是通过学生的 t 测试确定的。

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来自冠状病毒RdRp分子的NiRAN和界面域的多个蛋白质序列对齐会影响各种脊椎动物宿主。

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S1 图。来自冠状病毒RdRp分子的NiRAN和界面域的多个蛋白质序列对齐会影响各种脊椎动物宿主。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s001-医学论文发表

（蒂夫）

S2 图。尼兰域的组织和保护。

（A）在 CoV-2-RdRp NiRAN 域的入口口袋的组织，内衬严格保存的残留物。（B）虽然界面域中保存的残留物分散在结构元件中，但 NiRAN 域中的大部分保存残留物位于抗相容β板和紧随的单数捆绑包之间，可能暗示了 NiRAN 域活动站点。（C） NiRAN 域预测的活动站点具有带电和未充电残留物，其中带电残留物主要排列口袋的入口点和深部分的未充电残留线（蓝色表示带正电区域，红色表示带负电区域，绿色表示中性区域，灰色表示 GTP 绑定口袋以外的区域）。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s002

（蒂夫）

S3 图。对对应对应对应的结构元素的CoV-2-RdRp尼兰与已知的激酶。

（A）林 2 激酶域。（B）赛克激酶域（C） O-曼诺西尔激酶域。（D） IRAK4 激酶域。（E） FGFR2 激酶域。（F）胰岛素受体激酶域。（颜色代码- 块 1：橙青;块2：黄绿松石：块3：石灰深蓝色：块4：绿深蓝色：块 5：绿色 - 紫色）。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s003

（蒂夫）

S4 图。CoV-2-RdRp NiRAN 的 C+ 链与已知激酶的结构叠加揭示了多肽链的显著对齐。

（A）林 2 激酶域。（B）赛克激酶域（C） O-曼诺西尔激酶域。（D） IRAK4 激酶域。（E） FGFR2 激酶域。（F）胰岛素受体激酶域。（上述激酶的 C+ 链以青色显示，CoV-2-RdRp NiRAN C+链以黄色显示。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s004

（蒂夫）

S5 图。激酶（如图案）的预测揭示了属于激酶家族PkA、PkC和Src的序列图案的存在。

（A）激酶共识站点搜索预测也预测多个磷化站点。（大胆 - 尼兰域名：意用 - 界面域;下划线：红-激酶共识序列，蓝色-PkC喜欢图案，紫色-PkA喜欢图案，绿色-Src激酶喜欢图案，灰色-未指明的激酶像图案，黄色-肌酸化网站共识序列）。（B） Daidzein 的非活动模拟停靠到 NiRAN 域假定活动站点。（C）格斯坦的非活动模拟停靠到 NiRAN 域假定活动站点。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s005

（蒂夫）

S6 图。净化非典-CoV2-RdRp。

A）重组SARS-CoV-2 RdRp的尺寸排除色谱（用蓝色箭头表示的峰值表示纯化蛋白质样本）。（B）纯化SARS-CoV-2 RdRp的SDS-PAGE型材（用蓝色箭头指示的带代表纯化蛋白质样本，分子重量标记用红色箭头表示）。（C）原生和突变SARS-CoV-2 RdRp的荧光光谱表明，合并的突变对蛋白质结构完整性的影响微乎其微。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s006

（蒂夫）

S7 图。来自希斯通 H1 的肽 Kslvskgtlvqtk 的 Ms - ms 光谱。

（A）在ATP和Mg在场的情况下用SARS-CoV-2 RdRp治疗的H1希斯通H12+.（B） Histone H1 在 ATP 和 Mg 面前用人类 Akt2 治疗2+.（C）在Mg存在的情况下用SARS-CoV-2 RdRp治疗的H1希石H12+仅（b 和 y 离子分别以红色和蓝色显示）。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s007

（蒂夫）

S8 图。从希斯通 H1 中检测到的肽 KslvskgTLVQTK 的 MS-MS 中检测到的离子系列。

（A）在ATP和Mg在场的情况下用SARS-CoV-2 RdRp治疗的H1希斯通H12+.（B） Histone H1 在 ATP 和 Mg 面前用人类 Akt2 治疗2+.（C）在Mg存在的情况下用SARS-CoV-2 RdRp治疗的H1希石H12+只。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s008

（蒂夫）

S1 表。HHPred 分析预测结构相似的 15 个分子。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s009

（XLSX）

S2 表。通过ORION_DSIMB分析预测结构相似的15大分子。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s010

（XLSX）

S3 表。在 NiRAN 域的拟议活动部位对激酶抑制剂进行对接分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s011

（XLSX）

S4 表。选择在 CoV-2-RdRp NiRAN 域预测活动站点进行对接的化合物的完整列表。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s012

（XLSX）

S5 表。在 NiRAN 域的拟议活动站点对最佳 5 个建议抑制剂进行对接分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s013

（XLSX）

S6 表。最佳5种建议抑制剂的ADME/T特性预测。-医学论文发表

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s014

（XLSX）

S7 表。LC-MS/MS对SARS-CoV-2路Rp的验证。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s015

（XLSX）

S8 表。质谱仪检测到的蛋白质Histone H1（K88-K100）的磷酸肽片段。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s016

（XLSX）

S1 数据。图中显示的图5A、6A、6B和6C的原始数据点：和实时 PCR 分析的原始读取。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009384.s017

（XLSX）

确认

JJ感激地感谢MHRD-RUSA 2.0 [F.24/51/2014-U，政策（TNMulti-Gen），印度政府Edn.省）为阿拉加帕大学生物信息学系提供的基础设施。以下试剂由疾病控制和预防中心储存，并通过北资源、NIAID、NIH获得：与SARS相关的冠状病毒2、孤立美国-WA1/2020、NR-52281。我们感谢苏伯尔·马朱姆达尔博士的鼓励和支持。

引用

00001. 1.文卡塔拉曼 S，普拉萨德 Bvls，塞尔瓦拉詹 R. RNA 依赖RNA 聚合酶：从结构，功能和进化的见解.病毒。2018. 下午：29439438

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从依赖RNA的RNA聚合酶中对NiRAN域的定性提供了对SARS-CoV-2的潜在治疗目标的见解-医学论文发表

数字

抽象

作者摘要

介绍

结果

尼兰和界面域的分析

尼兰域的似是而无的功能预测

预测尼兰域活动站点

针对 NiRAN 域活动站点的抑制剂预测

SARS-CoV-2 RdRp 的 NiRAN 域表现出类似活性酶/磷转移酶

抑制 NiRAN 域可减少 ACE2 表达细胞系中的病毒载量

讨论

材料和方法

道德声明

CoV-2-RdRp 的 NiRAN 和界面域的特征

在硅基配体准备、活动站点口袋预测和分子对接方面

MMGBSA 计算

ADME/T 属性预测

SARS-CoV-2 RdRp 原生和突变蛋白生成

SARS-CoV-2 RdRp 原生和突变蛋白的生化检测

SARS-CoV-2 RdRp 尼兰域的激酶/磷转移酶活性质谱分析

确定抑制剂在抑制前体内SARS-CoV-2感染的功效

支持信息

S1 图。来自冠状病毒RdRp分子的NiRAN和界面域的多个蛋白质序列对齐会影响各种脊椎动物宿主。

S2 图。尼兰域的组织和保护。

S3 图。对对应对应对应的结构元素的CoV-2-RdRp尼兰与已知的激酶。

S4 图。CoV-2-RdRp NiRAN 的 C+ 链与已知激酶的结构叠加揭示了多肽链的显著对齐。

S5 图。激酶（如图案）的预测揭示了属于激酶家族PkA、PkC和Src的序列图案的存在。

S6 图。净化非典-CoV2-RdRp。

S7 图。来自希斯通 H1 的肽 Kslvskgtlvqtk 的 Ms - ms 光谱。

S8 图。从希斯通 H1 中检测到的肽 KslvskgTLVQTK 的 MS-MS 中检测到的离子系列。

S1 表。HHPred 分析预测结构相似的 15 个分子。

S2 表。通过ORION_DSIMB分析预测结构相似的15大分子。

S3 表。在 NiRAN 域的拟议活动部位对激酶抑制剂进行对接分析。

S4 表。选择在 CoV-2-RdRp NiRAN 域预测活动站点进行对接的化合物的完整列表。

S5 表。在 NiRAN 域的拟议活动站点对最佳 5 个建议抑制剂进行对接分析。

S6 表。最佳5种建议抑制剂的ADME/T特性预测。-医学论文发表

S7 表。LC-MS/MS对SARS-CoV-2路Rp的验证。

S8 表。质谱仪检测到的蛋白质Histone H1（K88-K100）的磷酸肽片段。

S1 数据。图中显示的图5A、6A、6B和6C的原始数据点： 和实时 PCR 分析的原始读取。

确认

引用

S1 数据。图中显示的图5A、6A、6B和6C的原始数据点：和实时 PCR 分析的原始读取。