Rhoa - 和 Cdc42 诱导的对抗力是小鼠卵母细胞对称性断裂和主轴旋转的基础-医学论文发表
· 贝诺伊特·德哈皮奥特
· 拉斐尔·克莱门特，
· 布尔代斯·安妮
· 维珍妮·卡里埃
· 休特·塞巴斯蒂安
· 哈莱特·纪劳
· 发布时间： 2021年9月7日
抽象
哺乳动物卵母细胞的分化高度不对称，并产生一个大的类人猿游戏和两个小极性体。这依赖于细胞在发生相位之前打破对称性并将主轴定位到皮层附近的能力。在元相II+小鼠卵母细胞中，主轴与皮层保持密切和平行，直到受精触发姐妹染色体分离和主轴旋转。后者确实必须重新定向垂直于皮层，使细胞因子环关闭在极地身体的底部。然而，对称性断裂和主轴旋转的机制仍然难以捉摸。在这项研究中，我们表明主轴旋转来自2种对抗力。首先，细胞因子的内收缩依赖于RhoA信号，其次，由Ran/Cdc42依赖的肌膜素皮层极化对两组染色体施加了外在的吸引力。通过将实时分割和跟踪与数字建模相结合，我们证明此配置会随着入侵的进展而变得不稳定。这导致自发对称性断裂，这意味着旋转方向和最终被丢弃的染色体集在生物学上都是预先确定的。
引文：德哈皮奥特B，克莱门特R，安妮B，卡里埃五世，塞巴斯蒂安H，纪劳姆H（2021）RhoA-和Cdc42诱发的对抗力基础对称性断裂和主轴旋转在小鼠卵母细胞。PLoS 生物 19 （9）： e3001376.https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376
学术编辑：丽贝卡·赫尔德， 美国
接收：2020年10月2日：已接受：2021年7月30日：已发布：2021 年 9 月 7 日
版权所有：2021年?德哈皮奥特等人。这是根据《知识共享归因许可证》条款分发的开放访问文章，该条款允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源被记入贷记。
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资金：作者从以下来源获得资助： - 科学研究中心/CNRS（2009年;HG）：https://insb.cnrs.fr/fr/atip-avenir - 癌症联盟的研究补助金（2015年;HG）：https://www.ligue-cancer.net/article/27236_appels-projets-recherche - 生殖和生育学会学术奖学金（2013年）： HG）：法国研究和高等教育部（BD）的 https://srf-reproduction.org/grants-awards/grants/academic-scholarship-fund/-博士奖学金（3年）：https://www.enseignementsup-recherche.gouv.fr/-博士奖学金（6个月），从Médicale/FRM基金会（BD）：https://www.frm.org/chercheurs/appel-a-projets-frm 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定发布方面没有作用， 或准备手稿。
竞争利益：作者宣称不存在相互竞争的利益。
缩写：EDM，欧几里德距离图;F-行动素，作用性长丝;PB2，第二极地体;PIV，粒子图像速度：PLK1，马球状激酶1：ROCK1， Rho 相关蛋白激酶 1;RT，室温;sPB，小极地体：t我旋转，初始旋转时间
介绍
梅病是进化保存的细胞分裂过程，通过这个过程，白化病游戏是由二头肌生殖细胞产生的。由于梅病是普遍启动后，益生菌S相，连续两轮细胞分裂梅病I和梅病II-需要生成游戏，每个染色体只有一个副本。在哺乳动物雌性生殖系中，雌性分裂高度不对称，产生大卵母细胞和2个较小的极性体。这使得卵母细胞能够保存其大部分细胞质资源（例如mRNA、线粒体和核糖体），同时在父母基因组融合之前丢弃超数遗传物质。卵母细胞分化的不对称性依赖于细胞在发生相位之前打破对称性并将主轴定位到皮层附近的能力。主轴确实负责设置平面[ 1 ] ，因此必须偏离中心，以便对游戏进行不均匀的分割。在间质细胞中，主轴定位主要通过与细胞皮层的相互作用来实现，后者对从主轴两极投射的中核星体微管施加拉力[2，3]。有趣的是，来自大多数物种的卵母细胞缺乏中心，因此缺乏真正的星体微管[4]。因此，卵母细胞必须依靠替代策略来定位其主轴。
在过去的20年里，开创性的研究揭示了在小鼠卵母细胞美学分裂期间，作用素丝（F-actin）在定位主轴方面如何发挥关键作用[5]在早期元相 I 期间，主轴聚集在卵母细胞的中心区域，并缓慢地向最近的皮质区域迁移[8]。主轴迁移依赖于由 Formin-2 和 Spire1+2 核体[9]12]组装的细胞质丝网络。这个网络确实支持转移主轴所需的推力和拉力[13]17]。一旦完全迁移，主轴进入第一阶段，一半的同源染色体被丢弃到第一极地体中。排卵卵母细胞然后进入长期元相II逮捕，在此期间，游戏积极保持其主轴偏离中心和平行的皮层，直到受精发生。元相 II 主轴定位还取决于细胞骨架和染色体定位与皮质极化之间的积极反馈的出现。事实上，已经表明，染色质产生活性Ran GTPase（RanGTP）的梯度，从而以剂量和距离依赖的方式触发皮层的极化[18，19]。这种两极分化的特点是F-actin的积累，称为F-actin帽，被激活肌素II环包围[19]。值得注意的是，F-actin帽反过来又能够吸引皮质附近的染色体，从而通过局部增加RanGTP的浓度来巩固极性。这可以通过F-actin帽产生两极分化的细丝流的能力来解释。事实上，通过这样做，F-actin促进了细胞质材料横向流的出现，这种流体聚集在游戏的中心，然后将主轴推回两极分化的皮层[14，20]。建议使用类似的定向推力来加速梅病I的主轴迁移，一旦母体染色体距离皮层约25μm[14]。虽然皮质活性肌素极化背后的分子细节尚未完全阐明，但我们和其他人已经表明，F-actin帽的形成需要 Cdc42 GTPase （Cdc42GTP） 和 Arp2/3 复合物的极化激活，该复合体在 RanGTP 下游[19]26]。抑制 Ran GTPase，通过过度表达占主导地位的负形式 （RanT24N）， 导致皮质行为肌酸极性完全丧失和细胞质流的缺乏[19，20]。-医学论文发表
第二个美血分裂是由精子进入触发的，导致受精卵母细胞和第二极性体（PB2）之间的姐妹染色体（后来称为DNA簇）的分离。这个部门的成功依赖于主轴的能力，它与元相II期间的皮层平行，能够重新定位自己垂直于细胞外围，使细胞因子环在极地体的底部关闭[27]。正如 Maro 及其同事最初描述的那样，这个过程伴随着卵母细胞皮层的重组，主轴上方出现了 2 个 F-actin-丰富的突起，其中一个在成为 PB2 之前，而另一个在分裂的后期阶段缩回[28]。虽然证据表明，主轴旋转是防止通过行为素去聚合，肌素II抑制或RhoA灭活[29]31]，这个独特的对称性断裂事件的基础一直难以捉摸。在最近的一项研究中，王和他的同事对这一机制提供了新的见解，表明旋转是通过沿第二阶段主轴（32]的力的不对称分布实现的。有人建议，主轴旋转产生于主轴两端相反方向的细胞质流动，在 Arp2/3 和肌素-II 在皮层[32]的分布中连续到自发对称性断裂。
在本研究中，我们发现主轴旋转来自2种对抗力。首先，在中央主轴区域对细胞动力学沟的RhoA依赖性入侵，其次，对DNA簇对极化皮层的依赖性吸引。使用数值建模，我们注意到，随着入侵的进展，第二阶段主轴配置变得不稳定。最轻微的初始不对称导致对称性断裂和主轴旋转。我们开发了一个实时的3D分割和跟踪程序，以确认这些观点在体内，并表明，例如，DNA簇相对于皮层的早期定位偏向主轴旋转的方向。总体而言，我们的数据表明，主轴的旋转是随机和自发对称断裂过程的结果。
结果
随机对称性断裂是主轴旋转的基础
为了监测活卵母细胞的主轴旋转，我们注射了代谢II-逮捕卵母细胞与cRNA编码H2B-mCherry和eGFP-MAP4，分别标记染色体和主轴微管。经过一个3小时培养期，允许蛋白质表达，我们通过在乙醇补充培养介质中孵育卵母细胞[22]而触发了美化II的恢复。这种快速诱导的部分遗传激活的游戏，它继续PB2发射。我们使用共聚焦激光扫描显微镜（参见图 1A、S1（亮场）和S2胶片（微管）中的选定示例，以及方法中的整体过程，在 37°C 下对卵母细胞进行成像。
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图1。随机对称性断裂是主轴旋转的基础。
（A） 接受主轴旋转的激活元相 II 卵母细胞的实时成像。卵母细胞被注射或单独与H2B-mCherryDNA标记（主亮场时间系列，S1电影）或结合eGFP-MAP4 MT标记，以遵循主轴动力学（插入主轴时间系列，S2电影）。白色箭头显示导致 PB2 关闭的膜入侵。（B） A 面板中显示的主要亮场时间系列的高时间分辨率蒙太奇，其中突出了第二个美学分区的关键事件。（C） PIV 测量显示在元相 II 和相二（S3 电影） 之间的过渡期间发生的细胞质流的倒置。矢量场颜色代码表示跟踪粒子的速度。右上箭头显示 0.3-μm.min-1 向量的大小和颜色。（D） 在选定的卵母细胞（主图）中DNA簇距离d的变异。红线显示用于卵母细胞群（插入图）时间登记的线性拟合。（E） 主轴旋转角度的变异α在选定的卵母细胞中。红色曲线显示用于提取旋转参数的物流拟合。t我旋转的定义是旋转达到总安装旋转的 5% 的时间。（F） H2B-mCherry 表达卵母细胞的两个例子，说明主轴旋转的随机触发（见S6 电影）。白色箭头表示旋转的大致开始。（G） t 的频率分布我控制卵母细胞种群的旋转（n = 70;9个独立实验）（主图）。t 的 Pdf我旋转分布用于确定 3 个可装备类别的增加 t我旋转（插入图）。（H） 随着时间的推移 ±，DNA星团距离d（上图）和主轴旋转角的 SD变化α（下图）在面板 G 中定义的每个类别的平均值。 秤杆 = 10μm。MT，微tuble;PB2，第二极地体;PDF，概率密度函数：PIV，粒子图像速度：t我旋转，初始旋转时间。-医学论文发表
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.g001
在相位开始时，分离的染色体开始向主轴两极移动，形成2个DNA簇（见3分钟，图1B）。同时，面向中央主轴的皮质区域被入侵，每个DNA簇上方聚集了2个不同的膜突起（见3至15分钟，图1B）。紧接着是第二阶段主轴的旋转，使其中一个DNA簇被挤出在新生的极地体内，而另一个则留在卵母细胞内（见20至30分钟，图1B）。值得注意的是，内化星团的皮质突起在主轴旋转的后一阶段坍塌（见35至45分钟，图1B）。最终，第二个美学分裂以极地体底部细胞动力学环的关闭而告终（见60分钟，图1A）。
使用粒子图像速度（PIV：见方法），我们表明，解剖相的触发也伴随着细胞质流模式的戏剧性变化（图1C和S3电影）。事实上，与元相II卵母细胞[20]中观察到的后激活流相比，激活后流是倒置的，细胞质物质从极化域流出，向游戏中心移动（见 t = 15 分钟，S1A 图和S4 电影）。流量反转的峰值显然与发生在中央主轴区域（见S1B/S1D图）的皮质入侵相吻合，并在控制卵母细胞群（S1E和S1F图）中持续观察到。值得注意的是，皮质突起（见 t = 40 分钟，S1A 图）和细胞因子环闭合（见 t = 55 分钟，S1A 图）的崩溃也与旋转后阶段出现不同流量的时间相关。
接下来，我们设计了一个自动的3D分割和跟踪程序，以监测DNA簇在卵母细胞体积（S2A和S2B图，S5电影和方法）中的位置。使用此方法，我们测量了 2 个 DNA 星团之间的距离，并线性地安装了早期点，以便实现所有记录的时间注册（图 1D和方法）。我们还测量了主轴旋转角度（如S2B 图所定义），并使用适合提取单调平滑轮廓的物流曲线。这使我们能够定义旋转的初始时间（以下简称 t）我旋转），对应旋转达到总安装旋转的 5% 的时间（图1E和方法）。通过查看各种示例 （图 1F和S6 电影） 或更具体地说， 在 t 的分布我旋转（图1G），我们观察到卵母细胞没有触发主轴旋转同步有关DNA簇分离（这里用作我们的时间参考）。这一点在将卵母细胞种群分成3类时尤为明显我旋转（见图1G）。这样做，人们可以很容易地观察到，虽然距离曲线完全对齐，旋转曲线在类别之间的时间转移（图1H）。这种高度的变异性表明对称性断裂过程相当随机，旋转的动力学没有受到严格控制。这促使我们进一步研究对称性断裂的根本机制。
主轴旋转所需的中央主轴/RhoA 通路
RhoA GTPase 是动物细胞细胞因子的保守调节器，通过在皮质区域组装收缩，在中央主轴上侧[ 33 ]35 ]。因此，在小鼠卵母细胞中，极性身体细胞因子（31、36、37）需要RhoA活动。规范的 RhoA 激活通路涉及瓜氨酸核苷酸交换因子 ECT2[38]40]，它由所谓的中央针柱复合体 （MKLP1， MgcracGAP）[41]43]招募到中央主轴。ECT2 的招募依赖于马球状激酶 1 （PLK1）[44，45]的 MgcracGAP 子组的磷化。此通路在图 2A图中的鼠标卵母细胞上下文中进行回顾。
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图2。主轴旋转需要中央主轴/RhoA 通路。
（A） 导致 RhoA GTPase 激活和细胞因子环组装的中央主轴通路的简化图。（B） 固定RhoA（免疫染色）和DNA（至Pro-3）成像的微分阶段卵母细胞进行主轴旋转。顶部面板显示单个共聚焦平面，并叠加图，说明细胞因子环的逐渐关闭。底部面板表示多个共焦平面的最大强度 z 投影，以更好地可视化 RhoA 的半环分布。（C） 使用 Bi-2536 （PLK1 抑制剂） 抑制中央主轴通路，防止 RhoA 的招募和皮质入侵（见白箭头）。C 中显示的荧光模式在 33 个对照和 25 个 Bi-2536 治疗卵母细胞中持续观察，这两个模式均来自 3 个独立实验。（D） PB2排放率在81控制和105 Bi-253-6处理卵母细胞，都收集从4个独立的实验。（E） 激活控制和Bi-2536-治疗卵母细胞的实时成像（S7电影）。卵母细胞被注射了H2B-mCherryDNA标记。在Bi-2536+治疗的卵母细胞中，大约三分之一（n = 10/35约29%）的主轴围绕细胞外围旋转，而其他主轴（n = 25/35约71%）只是与皮层平行。（F） 控制主轴旋转角的平均变化± SD α控制和 Bi-2536+治疗卵母细胞。（G） 显示早期（0+20 分钟）和后期（100+120 分钟）主轴旋转角度α控制和 Bi-2536+治疗卵母细胞分布的框图。分别从9个和6个独立实验中收集了70个对照和35个Bi-2536-治疗卵母细胞的F和G测量结果。（H） PIV矢量场显示32个控制和13个Bi-2536-治疗卵母细胞的平均细胞质流模式，两者都来自5个独立的实验。G 中的框图从第一个 （Q1） 扩展到第三个 （Q3） 四分位数（其中 Q3-Q1 是 IQR）;胡须为第一季度或第三季度± 150×IQR：水平线表示中位数;黑色正方形代表平均值。G中的 p 值是使用双面曼恩 -惠特尼测试获得的。此数字背后的数据可以在S1 数据中找到。秤杆 = 10μm。IQR，四分位数范围;PB2，第二极地体;PIV，粒子图像速度：PLK1，马球状激酶1：ROCK1，罗相关蛋白激酶1。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.g002
我们在微分阶段卵母细胞上对 RhoA（参见方法）进行了免疫染色，并成功地在整个第二个美血分裂中监测了 GTPase 本地化。我们的实验表明，虽然在元相 II 逮捕期间没有显示任何特定的本地化，但 RhoA 在分析 II （图 2B）期间强烈地积聚在面向中央主轴的皮质区域。这种积累与其他经典细胞因子的招募有关，如ECT2、脚手架蛋白海宁和Rho相关蛋白激酶1（ROCK1）（S3A图）。RhoA GTPase 在覆盖分离的 DNA 簇的 2 个皮质突起之间组装了一个六环（参见 z 形投影，图 2B）。半圆环一直开放到主轴旋转结束，之后它关闭在极地体基座的中央主轴周围（见第二阶段，图2B）。
接下来，我们试图抑制中央主轴/RhoA 路径，以检查其对主轴旋转的贡献。因此，我们用Bi-2536治疗卵母细胞，这是一种小分子抑制剂，据报道，它特别针对体细胞中的PLK1[46]和小鼠卵母细胞[47]。不出所料，PLK1 抑制阻止了 ECT2 的招募到中央主轴，同时保留了其绑定合作伙伴 MgcRacGAP（S3B 图） 的本地化。因此，在这种情况下， RhoA 的皮质积累和中央沟的入侵都被废除了（图 2C ）。这导致PB2挤出率急剧下降（控制n = 68/81 约 85% PB2，Bi-2536 n = 3/105 约 3% PB2） （图 2D）。
当现场监测时，Bi-2536-治疗的卵母细胞显示铬聚类分离，但未能旋转主轴。令人惊讶的是，其中一些主轴（n = 10/35 约29%）相当从事围绕细胞外围旋转，然后停止在分裂的后期阶段（图2E，S3C图，和S7电影）。在旋转方面，围绕中央主轴， 这转化为条件之间的明显差异，与主轴在控制进行约50°角的变化，而处理后的几乎平行皮层（平均角度后120分钟，控制33.7°±14.1 SD，Bi-2536 78.0°±10.3 SD）（图2F和2G）。有趣的是，我们也注意到，细胞质流反转在经过处理的卵母细胞中不再可见，这表明，事实上，细胞动力学沟的收缩是造成这种现象的原因（图2H）。相反，Bi-2536-治疗卵母细胞相当显示元相状的流动与细胞质物质向极化皮层移动。
总体而言，这些数据表明，促进细胞动力学环组装和皮质入侵的中央主轴/RhoA 通路是推动主轴旋转的必要方法。有趣的是，在 RhoA 抑制下，主轴仍然启动围绕卵母细胞的方向性但非生产性的旋转运动。这表明，额外的机制可能有助于对称性的突破。
皮质电极化在分析阶段 II 期间重组
如介绍中所述，元相 II 主轴携带的染色体生成 RanGTP 的梯度，以剂量和距离依赖的方式触发行为肌素皮层的极化[18，19]。值得注意的是，极化皮层反过来又能够吸引染色体到细胞外围，使卵母细胞在元相 II 逮捕期间保持主轴偏离中心[20]。这种调节主轴定位的能力鼓励我们研究DNA诱导的极性通路是否在分析二期间仍然运行，因此可能参与主轴旋转过程中发生的对称断裂。
与先前的观测结果[18]一致，元相 II 卵母细胞在主轴上侧的皮质区域（见顶部面板，图 3A）中表现出一个极化的 F-actin 帽，周围环绕着一环激活的肌素-II。在皮质荧光强度剖面（见方法）中，这形成了一个宽阔的F-actin峰值，两侧是2个较小的肌素-II峰，对应于环的对立面（图3B）。这种模式在相位发病后持续存在，但分离成两个小帽/环，覆盖每个分离的DNA簇（见中间面板、图3A和3B）。然而，在分析阶段II的后期，皮质肌素-II分布的不对称变得明显。事实上，虽然环配置保持在新生的极地体中，肌素-II侵入了内化DNA簇（见底部面板，图3A和3B）的极化皮层。结果，F-actin和肌素-II在坍塌的突起中形成了一个上限。重要的是，另一个皮质的皮质电氧辛亚聚合物在分析阶段 II 期间出现在中央主轴前面的补丁（图 3A 和 3B中间面板中的箭头）。第二个子人口可能属于细胞因子环，因为它与活性 RhoA（参见方法、S4A 和 S4B 图）共用。这被证实使用PLK1（Bi-2536）和ROCK1（Y-27632）抑制剂，这两者都防止了行为肌素斑块形成（S4C和S4D图）。请注意，RhoA 激活持续在拉伦库林 A-治疗卵母细胞中，进一步表明 RhoA 位于 F-actin 贴片（S4C 和 S4D 图） 的上游。有趣的是，覆盖DNA簇的F-actin帽和肌素-II环不受PLK1和ROCK1抑制剂在元相II或相二（S4E和S4F图）的影响。这表明这2个皮质皮质亚聚合素是差异调节的。
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图3。皮质行动肌酸极化在分析阶段二期间重组。
（A） 固定F-actin（法洛丁染色）、肌素-II（pMLC2免疫染色）和DNA（至Pro-3）不同阶段卵母细胞的成像，这些卵母细胞进行主轴旋转。图像的左 2 列显示单焦平面，而最右侧的列显示多个共焦平面的最大强度 z 投影。灰点和箭头分别表示DNA诱导和中央主轴诱导皮质肌素-II亚种。白色箭头显示折叠的皮质突起。最右侧列中的叠加图总结了观察到的皮质电异素定位。（B） 皮质荧光强度配置文件，回顾在A中观察到的F-actin和肌素-II极化模式。荧光强度正常化为每个轮廓的均值。灰点和箭头分别显示DNA-和中央主轴诱导的皮质肌素-II种群（如A）。用于提取荧光强度轮廓的拉直皮质图像显示在图形上方。（C） 图显示元相 II（上）和相二卵母细胞中与 DNA 簇的颜色编码皮层距离。灰线将卵母细胞区域与DNA簇等距。（D） 线图：平均±SD皮质F-actin（法洛丁染色）和肌素-II（pMLC2免疫染色）荧光强度，作为皮层与DNA簇距离的函数。荧光强度正常化为每个轮廓的均值。框图：皮质肌素-II的分布峰值距离DNA簇（见方法）。从2个独立实验中收集的12个元相II和11个相二卵母细胞进行了量化。（E） 图说明以染色体为中心的 RanGTP 梯度如何在第二次肌酸分裂期间形成皮质电极化。皮质F-actin在梯度的近端部分（区域2）积聚，而肌素-II集中在外围（区域1）。另请注意由于细胞因子环（区域 3）导致的皮质富集的皮质富集。D 中的框图参数如图 2所述。此数字背后的数据可以在S1 数据中找到。秤杆 = 10μm。F-行动素，作用性长丝;PB2，第二极地体;pMLC2，磷酸肌素光链2。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.g003
接下来，我们将平均皮质F-actin和肌素-II水平量化为固定卵母细胞中皮层和DNA簇之间的距离函数（参见方法和图3C和3D）。在元相II和分析二卵母细胞中，皮质F-actin强度随着皮层和DNA簇之间的距离的增加而降低。相比之下，皮质肌素-II与DNA簇（19.9 μm ±元相II中的1.6 SD和相二中的1.8 SD±1.8 SD±13.5μm）达到最大强度。这表明，像在元相II中一样，皮质活性肌素极化主要受激活卵母细胞中染色质的接近性调节。在近距离，RanGTP 是高和皮质 F - actin 是强烈丰富。随着距离的拉近，F-actin 水平降低，肌素-II 在梯度的远端部分（顶部面板，图 3E）中组合成环。由于姐妹染色分离，将第二相簇中的DNA量减半不会改变这种模式，但只会减少极化域（中间面板，图3E）的大小。后来在折叠的皮质突起中招募肌素II与这些观察结果一致。事实上，随着主轴的旋转，皮层和内化染色体之间的距离会增大。因此，只有低剂量的RanGTP到达皮层在这个阶段，这促进肌素II（底部面板，图3E）的皮质招募。
我们通过用编码 H2b - mcherry DNA 标记和 egfp - utrch F - actin 探针[48]的 crnas 来进行我们的调查。这使我们能够在整个部门过程中监控活皮质 F-actin 动态。我们的电影回顾了我们在固定实验中观察到的情况，在隔离的染色体上出现了两个偏振的F-actin帽，其中一个成为PB2，而另一个在分裂的后期阶段崩溃（图4A和S8电影）。接下来，我们试图将F-actin的皮质水平与DNA簇与皮层分离的距离联系起来。为此，我们生成了两极分化域的彩色编码地图，显示这 2 个数量的空间变化（参见方法和图 4B）。我们还确定了受限的皮质域，覆盖内侧和外侧星团，以平均结果并生成 1D 配置文件（参见方法和图 4C）。使用这两种方法，我们观察到DNA簇的接近程度和皮质F-actin极性水平之间的明显相关性。我们也注意到，正如稍后将要讨论的，外皮质域往往更偏振（更接近DNA簇，并呈现更多的F-actin）在主轴自转开始（见时间 = 30分钟在图4C）。-医学论文发表
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图4。DNA簇定位控制皮质F-actin极化。
（A） 接受主轴旋转的激活卵母细胞的实时成像。卵母细胞被注射了H2B-mCherryDNA标记和eGFP-UtrCHF-actin标记（S8电影）的组合。图像显示了多个共聚焦平面的最大强度 z 投影，其中突出了第二个混焦分区的关键事件。（B） 极化域的二元地图，显示皮层距离与DNA簇（颜色编码顶板）和皮质F-actin水平（底部面板）的变异。地图是从左面板上显示的图像中提取的。等距线被用作地标，从DNA簇中划定皮层等距区域。虚线为每个DNA簇绘制了最佳焦点平面。（C） B 中显示的数据的 1D 表示（参见方法）。内化DNA簇和挤出DNA簇分别被指定为进出。 图表显示DNA簇距离到皮层的时间变化（顶部面板，d在和d外）和每个偏振域的皮质F-actin水平（底部面板，F在和F外).主轴旋转角度α的变化也表现在两个图形上。相应的图表显示在左面板上。此数字背后的数据可以在S1 数据中找到。秤杆 = 10μm。F-行动素，作用性长丝;PB2，第二极地体。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.g004
总的来说，上述发现表明，在元相II期间运行的DNA诱导极性通路在分析阶段发作后仍在发挥作用。第二阶段的不同之处在于，极化皮层分裂成两个较小的域，高于每个分离的DNA簇。亚领地的极化强度在旋转过程中进化，取决于染色质的接近程度。
极化皮层对色状星团施加吸引力
接下来，我们想知道偏振的相位II皮层是否对染色体产生有吸引力的力量，就像在晚期元相I[14]和元相II[20]中所做的那样。我们发现惊人的证据支持这一假设，治疗卵母细胞与低剂量的诺可达佐尔，而他们已经从事主轴旋转（图5A和S9电影）。事实上，通过这样做，我们能够稍微破坏主轴的完整性，偶尔触发DNA簇从美学仪器分离。当内化星团分离时，它以高度定向的方式系统地向皮质突起移动（见图5A中的底部面板）。这导致内化星团和皮层之间的距离急剧缩短（见d在在图5B），这是发现显著减少，相比之下，控制，在分裂的末尾（图5C）。有趣的是，我们也注意到，随着内化星团，许多细胞质粒子被吸引到极化皮层。为了说明这一现象，我们手动跟踪其中一些粒子，以揭示局部流已建立向皮质突起（见图5D和S9电影）。这种局部流也可以在PIV分析中检测到，特别是当倒置细胞质流不是太占主导地位（见图5E中的低诺科达佐尔）。重要的是，控制卵母细胞也显示在内化DNA簇上方同样方向的流动（见图5E中的控制）。总之，这些结果表明，DNA簇在相位发病后仍然受到来自偏振皮层的诱人力量。这些力很可能来自局部向外的元相状流动，尽管细胞质流由于细胞动力收缩而普遍逆转，但这种流动仍然存在。
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图5。诺科达佐尔诱导的DNA簇分离揭示了皮质吸引力。
（A） 活体卵母细胞在接受低剂量诺可达佐尔治疗时进行主轴旋转的活成像（同时补充培养介质 = 34 分钟）。卵母细胞被注射了H2B-mCherryDNA标记和eGFP-MAP4MT标记（顶板和S9电影）的组合。底部面板显示放大倍数，以突出内化DNA簇从主轴的分离及其向覆盖皮质突起的迁移（见白圆）。（B） 显示DNA簇距离到皮层的变异图（d）在和d外） 和在 A.（C） 盒图中显示的诺科达佐尔处理卵母细胞的旋转角度α，显示内化 DNA 簇距离与皮层的分布（d）在） 在第二个美学分裂结束时， 在 70 控制和 8 个诺科达佐尔处理卵母细胞， 其内化集群已经脱离主轴。这些卵母细胞分别来自9个和4个独立实验。（D） 亮场延时序列，从 A（参见S9 Movie）中显示的诺科达佐尔处理卵母细胞中提取，显示手动跟踪的细胞质粒子向皮质突起移动的示例（参见白圆中的粒子和点状线作为空间参考）。（E） PIV 测量，在控制上执行，并在 A 中显示的诺科达佐尔处理卵母细胞，显示面向皮质突起的局部元相状流。C 中的框图和统计数据参数如图 2所述。P-值在C是通过双面曼恩-惠特尼测试获得的。此数字背后的数据可以在S1 数据中找到。秤杆 = 10μm。山，微管;PIV，粒子图像速度。
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作为下一步，我们希望防止这些元相状的流动，看看干扰皮质的吸引力力量如何影响主轴旋转。为此，我们试图抑制皮质F-actin极性，因为后者被描述为造成这些流动在元相一和二[14，20]的出现。为了实现这种抑制，我们通过过度表达兰GTPase本身或其下游效应器Cdc42（分别为RanT24N[49]和Cdc42T17N[50]）来瞄准 Ran 信号通路（见图表，图 6A）。Cdc42 通过激活 N-WASP 和 Arp2/3 复合物[20+24]促进元相 II 卵母细胞的皮质 F-actin 极化。因此，任一显性阴性形式的表达导致F-actin和肌素-II皮质极性在元相II卵母细胞（S5A和S5B图）中完全丧失。
·
图 6.Cdc42 通过 F-actin 极化促进皮质吸引力。
（A） 简化Ran/Cdc42信号图，从染色体发出，并通过激活Cdc42、N-WASP和Arp2/3通路导致F-actin的皮质积累。（B） 单独（控制）或与Cdc42T17N（S10电影）联合注射H2B-mCherryDNA标记的活性卵母细胞的活成像。Cdc42T17N 注射卵母细胞呈现 2 种特征表型：第一组挤出小 PB2（浅蓝色 sPB），与对照组相比，第二组主轴移向细胞中心（深蓝色迁移）。（C） 框图，显示激活后 90 分钟后从卵母细胞中心到 DNA 聚类中点的距离分布。分别对67个对照、27个Cdc42T17N和14个Cdc42T17N+Y-27622+治疗卵母细胞进行了测量，分别从9个、3个和4个独立实验中采集。（D） 盒子图，显示激活后 90 分钟从卵母细胞中心到 DNA 聚类中点的距离分布。分别对55个对照、34个CK-666+和34个CK-666+Y-27632+治疗卵母细胞进行了测量，分别从8个、3个和2个独立实验中采集。图像（右面板）：选定示例，显示来自不同实验条件的固定卵母细胞中 DNA 簇的本地化。（E） Y-27632-治疗卵母细胞（激活）的实时成像，单独注射H2B-mCherryDNA标记（对照）或与Cdc42T17N（S11电影）结合。（F） PIV 矢量场显示 32 个控制、29 个 Cdc42T17N、12 个 Y-27632+治疗和 14 个 Cdc42T17N = Y-27632 治疗卵母细胞的平均细胞质流模式，分别从 8、3、3 和 4 个独立实验中收集。C 和 D 中的框图参数如图2所述。C 和 D 中的p 值是使用双面曼诺惠特尼测试获得的。此数字背后的数据可以在S1 数据中找到。秤杆 = 10μm。F-行动素，作用性长丝;PB2，第二极地体;PIV，粒子图像速度：sPB ，小极地体。
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使用相同的策略，我们接下来检查了 Cdc42 抑制活性卵母细胞的影响。我们没有考虑抑制上游的 Ran GTPase，因为 RanGTP 在保持主轴完整性方面扮演了额外的角色[18，51]。因此，我们获得了一系列表达Cdc42T17N和H2B-mCherry的活性卵母细胞，并观察到2种不同的表型（图6B和S10电影）。在第一组卵母细胞（n = 19/27 约 70%）中，相主轴保持偏心（主轴中心距离> 20 μm）和 PB2 突出，尽管尺寸小于对照组。在第二组（n = 8/27 约 30%）中，相主轴大量向卵母细胞中心（主轴中心距离< 20 μm）移动，并且未发射 PB2（参见方法和图 6C）。由于过度表达 Cdc42T17N 单独已知可以抑制大多数激活卵母细胞[22]中的 PB2 排放，因此我们认为小极体 （sPB） 表型是不完整的 Cdc42 抑制。我们通过使用CK-666抑制剂瞄准下游Arp2/3核子（见图，图6A）来支持这一想法。事实上，我们的实验表明，CK-666-治疗卵母细胞的主轴同样被转移到细胞中心（图6D）。这验证了 Cdc42 抑制后观察到的主轴迁移表型，并进一步表明此效应是由于 GTPase 的皮质 F-actin 极化活动造成的。
我们还注意到，同样控制卵母细胞，Cdc42T17N注射卵母细胞经历了细胞质流的逆转后，解剖发作（图6B和6F和S10电影）。这一观察促使我们调查这种流量反转是否可能在 Cdc42 抑制后导致主轴迁移。事实上，这将进一步表明，Cdc42和皮质F-actin极化产生有吸引力的力量，这是抵消恢复的细胞动力流动所必需的。为了解决这个问题，我们使用 PIV 测量细胞质流速（参见方法和S1 图的程序），并将其与 cdc42T17N 卵母细胞中的肌质主轴迁移速度进行比较（参见S5C 图中的 PIV 测量和S5E 图中的线性拟合）。我们观察到这两个参数之间有明显的相关性，主轴迁移卵母细胞平均经历更强的反向流动（迁移。 0.31 μm.min）+1± 0.07 SD） 比卵母细胞挤出 sPB （0.21 μm.min）+1± 0.08 SD）（S5D， S5F 和 S5G 图） 。然而，单凭这种增加的流动速度无法解释主轴迁移表型。事实上，许多控制卵母细胞显示的流速与主轴移位卵母细胞中测量的流速一样高。这表明，其他参数，如缺乏有吸引力的力量，涉及这种表型。-医学论文发表
最后，为了确认主轴迁移和倒置细胞质流之间的因果关系，我们通过使用 ROCK1 抑制剂 Y-27632 治疗卵母细胞来防止细胞动力收缩。不出所料，这种治疗导致Cdc42T17N卵母细胞（图6E和6F和S11电影）细胞质流完全丧失，并拯救了Cdc42T17N和CK-666-治疗卵母细胞（图6C和6D）的主轴迁移表型。有趣的是，当单独应用于控制卵母细胞时，Y-27632也阻止了逆转细胞质流，但无法观测到元相状流（图6E和6F和S11电影）。这再次表明，元相状的流动在第二阶段期间持续存在，并进一步表明这些流动是 Cdc42 活动的结果。
总的来说，我们的诺科达佐尔和Cdc42抑制实验表明，极化皮层在分析II阶段仍然对染色体产生有吸引力的力量。这些力是必要的，以保持主轴在细胞外围在分裂期间，并出现，最有可能，从Cdc42活动产生的元相状流及其两极分化F-actin皮层的能力。然而，由于Cdc42抑制时观察到的主轴迁移表型，我们无法得出这些有吸引力的力量可能参与对称性断裂的结论。因此，我们设计了一个数值模型，我们面对我们的实验结果，以提供进一步的见解，这一特定方面。
对抗力产生对称性断裂和主轴旋转
根据我们的发现，我们认为第二阶段主轴主要受2种对抗力的影响：（1）细胞因子环的内收缩发生在中轴区：和 （2） DNA 星团对各自极化皮质域的外在吸引力。为了用数学术语来翻译这一点，我们设计了一个简化的模型，其中半灵活的主轴连接了2个DNA簇封装在圆形卵母细胞（见方法和图7A）。为了模拟细胞动力学沟进，我们规定了主轴中点的恒定向向内速度，定向垂直于主轴轴。另一方面，我们使用有效的潜力（类似于软核电位）对DNA簇的吸引力进行建模（见图7B中的潜在特征），从而考虑了反馈，使星团的吸引力随着它们与皮层距离的减少而增加。请注意，使用有效的潜力，加上物理数量（力、粘度等）在数量上不为人所知，使得模型本质上是定性的，并呈现在任意单位中。因此，其目的主要是概述对称性断裂的基本机制。
图7。对抗力产生对称性断裂和主轴旋转。
（A） 图表，回顾数字模型中使用的主要元素。一个恒定的内向速度，被应用到主轴中点，以重新概括细胞动力学沟的入侵。DNA簇对皮层的吸引力是通过有效的潜力V（r）进行建模的。 随着DNA簇与皮层距离的增加，这种潜在强度呈指数级下降（见r）
1和r2).有关进一步解释，请参阅方法。（B） 有效潜力的形状，V（r），模拟DNA簇对皮层的吸引力。（C） 将（上排）或无（中排和下排）高斯噪声添加到DNA聚类位置（S12电影）的典型模拟延时序列。（D） 初始旋转时间（t）的实验（顶部）和模拟（底部）分布我旋转）。（E） 实验（左列）和模拟（右列）随着时间推移的变化，±主轴旋转角的SD α（上排）、DNA簇与皮层（中行）的距离以及卵母细胞中心和DNA簇中点（下排）之间的距离。对于每个图表，卵母细胞种群被分为 3 类增加 t我旋转（见图1H）。（F） 在记录的前 10 分钟中，平均 DNA 聚类距离与皮层比率（进/出）的实验（左）和模拟（右）分布。值 >1（见灰色背景）表示挤出的星团（出）在开始旋转之前更接近皮层。（G） 实验（左列）和模拟（右列）DNA星团与皮层比（进/出）与t的距离我旋转，显示为散射图（上排）或装箱框图（下排）。散射图中的红线表示点云的线性拟合。普通的黑线划定了 95% 的信心区间，而虚线划定了 95% 的预测区间。D-G的实验结果来自70个对照卵母细胞，从9个独立的实验中收集。D-F 中的模拟结果来自 1，000 次模拟，而在 G 中，此数字减少到 70 次，以匹配实验数据的大小。G 中的框图参数如图 2所述。G（上排）中的p值是使用单向ANOVA来测试DNA簇距离对皮层比（进/出）对t的影响我旋转。G（下排）中的p值是使用双面曼恩-惠特尼测试获得的。此数字背后的数据可以在S1 数据中找到。t我旋转，初始旋转时间。
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随着入侵的进展，吸引域和主轴中点不再对齐，这防止DNA簇将两者都保留到皮层上。在没有数字噪声的情况下，模拟保持完全对称，主轴被简单地推，平行于皮层，在卵母细胞内（顶部面板，图7C和S12电影）。然而，这种配置实际上是不稳定的，并增加了一个小的高斯噪音到集群的位置（见方法）足以打破对称性，并系统地触发主轴旋转（中下面板，图7C和S12电影）。旋转产生了一个更有力的有利配置，其中一个DNA簇回到其潜力井，而另一个最终逃脱它（见箭头在图7B）。请注意，生物系统中可能存在许多噪声源。这些可能包括（但不限于）初始配置的不对称、吸引力的不对称、集群位置的热或活动波动，以及中央主轴或入侵的不完美中心。在这里，为了简单起见，我们只考虑星团位置的噪声，尽管任何噪声源都会导致对称性断裂。
接下来，我们分析了模拟中对称性断裂的动态，并观察到，如实验中所见，t的分布我旋转（定义为图1E）随着时间的推移被分散，并偏向右侧（图7D）。我们利用这种时间差异将我们真实和模拟的卵母细胞群分为 3 类，根据它们打破对称性的速度。这使我们能够测试我们的模型，并比较如何 t我旋转影响相关的几何数量，如主轴旋转角度α，DNA星团距离皮层，以及入侵深度在真实和模拟卵母细胞（图7E）。我们发现，我们的模型很好地概括了对称性断裂的动态，如延迟旋转卵母细胞（见左上角面板中的缓慢体群），该组在较长时间（中间面板）中保持其簇与皮层的相似距离，并经历细胞动力学沟（底部面板）的更深层侵入。
根据这个模型和我们的实验观测结果（见图4C），一个直截了当的预测是DNA簇位置的初始不对称应该偏向旋转的方向。为了验证这一假设，我们测量了两个DNA簇（进进出出）与皮层比（进/出）的平均DNA星团距离的分布情况（入/出）。我们观察到，在模拟和实验中，分布偏右，表明挤压的星团（出）往往在旋转开始前更接近皮层（实验76.4%;模拟83.7%右偏）。此外，我们还预测，较高的初始不对称应导致更早开始旋转。因此，我们绘制了与旋转启动时间的进/出比率，发现这 2 个数量在模拟和实验 （图 7G）中呈负相关。这证实了延迟的旋转卵母细胞最初更对称。
最后，这使我们怀疑这种简单的不稳定机制是否也可以概括t的右尾分布我旋转（顶部面板，图7D）。运行一批模拟与高斯噪音，我们发现，t的分布我旋转不是高斯式的，而是向右倾斜的，正如实验观察到的（底部面板，图7D）。为了进一步理解这种非微小的观察，我们设计了一个对称断裂的简化分析模型，其中我们计算了从稍微偏离不稳定平衡的初始配置中达到任意对称断点所需的时间。然后，我们可以计算初始偏移具有高斯分布时的对称断裂时间的分布。我们发现对称断裂时间具有右尾分布，这是初始偏移时旋转时间非线性依赖的直接结果（参见方法和S6 图）。
总体而言，此模型表明，主轴旋转是由于平行配置的不稳定性，因为沟渠入侵进一步推进。一组最小的成分，即向内收缩和横向向外景点，足以概括主轴旋转的动态和随机方面。
讨论
总体而言，本研究表明，在元相II中运行的DNA诱导极性通路在分析阶段发作后仍然活跃，并且是主轴旋转过程中发生的对称断裂的基础。第二阶段的不同之处在于，极化皮层分裂成两个小域，将每个分离的DNA簇过度。与元相 II 一样，偏振皮层对星团施加有吸引力的力量，再加上中央主轴区域细胞因子皱眉的侵入，导致不稳定的配置导致主轴旋转。通过理论建模，我们发现这种不稳定性源于在细胞动力学入侵时将两个DNA簇保持在皮层的几何不相容性。因此，系统中的任何初始不对称都足以打破对称性并触发主轴旋转。我们的体内测量证实了这些观点，因为DNA簇在旋转前与皮层的初始相对距离被证明是其方向的良好预测标记。
与王先生及其同事（32岁）意见一致，我们认为细胞质流和由此产生的流体动力在主轴旋转中起着关键作用。然而，从我们的角度来看，Ran/Cdc42诱发的肌素-II环（见图3中折叠突起）的单边收缩可能不负责流反转，这些作者描述为主轴旋转的关键。事实上，我们的PIV分析表明，反转发生在分析第二阶段的早期，当时没有皮质突起尚未崩溃（S1图）。这意味着肌素-II在突起中仍然形成环，其收缩不能对流量逆转负责。此外，Cdc42 灭活卵母细胞仍然经历反细胞质流，尽管失去了 F-actin 帽和肌素-II 环（见图 6）。因此，细胞动力学沟渠入侵在恢复流动方面的贡献似乎以前被忽视了[32]。
这就是说，我们要强调，我们认为，倒置的细胞动力学流动本身对对称性断裂没有帮助。事实上，在一些PLK1抑制卵母细胞中观察到的定向主轴旋转表明，在没有沟槽入侵和回流的情况下，可以发生对称性断裂（图2）。根据我们的模型，是皮质吸引力产生不稳定的配置，导致主轴旋转（图7）。这大概涉及另一种类型的细胞质流，我们称之为元相状流（也称为Arp2/3流在[32]）中，在 Ran/Cdc42 信号和皮质 F-actin 极化（图5和6）下游出现） 。这些流动面向极化皮层，先前被描述为在晚期第一阶段和元相 II[14，20]期间促进主轴和染色体偏离中心位置。我们在这里表明，元相状的流动在第二相（图5和6）期间持续存在，尽管它们往往被沟渠入侵产生的更强反向细胞动力学流动所掩盖。需要进一步调查，以充分了解这些对抗性流动如何相互干扰，并在第二阶段期间影响主轴和染色体定位。改善共焦采集的空间分辨率，以及使用更离散的跟踪算法，可能有助于解决整个第二个介质分区的短程元相状流动。
如果Ran/Cdc42诱发的肌素-II环的收缩不负责早期倒置的流量，因此我们可以推测其功能。首先，我们不能排除环的收缩在一定程度上促成了细胞质流，以及在第二阶段的后期主轴旋转。环收缩也有可能推动内化皮质突起的快速崩溃，从而防止其干扰PB2挤压。最后，更笼统地说，两极分化的肌素-II环可能是细胞在空间上限制F-actin帽，从而更好地控制皮层产生的吸引力的一种手段。无论如何，如果不能确定抑制这种肌素-II亚人口的具体方法，就很难对肌素-II环的作用及其随后的收缩得出结论。不幸的是，广泛的抑制剂，如白细胞素和ML-7，有效地防止肌素-II环组装在元相II卵母细胞，也被证明可以防止细胞因子环收缩[19，30]。另一方面，我们表明，ROCK1抑制目标，特别是肌素II在细胞因子（S4图）。这提出了一个想法，另一个激酶，作用于Ran/Cdc42的下游，可能特别促进两极分化肌素-II环的组装。-医学论文发表
最后，正如活系统中通常的情况[52]一样，主轴旋转背后的对称性断裂过程产生于卵母细胞检测和放大初始不对称的能力。梅西斯一号的情况也是如此，在此期间，元相I主轴建立在轻微的偏离中心位置，以确定其迁移的方向[8]。在梅病II期间，我们的研究结果最终表明，旋转的方向，从而最终丢弃哪组染色体，不是生物学上预先确定的，而是随机的、自发的对称性断裂过程的结果。
方法
卵母细胞恢复与文化
所有动物程序均按照欧洲实验室动物使用和护理指令（2010/63/EU）进行，并经法国高等教育、研究和创新部下属的当地动物伦理委员会批准（项目许可证 APAFIS#11761）。OF1菌株的雌性小鼠（8至10 wk老;查尔斯河）的腹内注射了5至7单位的PMSG（计时，MSD），随后48小时后第二次注射5IU hCG（巧克力，MSD）。从M2介质（西格玛）的卵石中回收了元相II卵母细胞，辅以3毫克/毫升透明质酶（西格玛），然后洗涤。为了诱导复发甲基乙型，元相II卵母细胞用7%乙醇治疗7分钟，如前所述[22]。当注明时，培养基辅以PLK1抑制剂Bi-2536（250 nM：阿克森美化#1129），F-actin聚合抑制剂拉特伦库林-A（2 μM;恩佐#BML-T119+0100），ROCK1抑制剂Y-27632（50 μM;默克米利波雷#688000），微管聚合抑制剂诺科达佐尔（1微米;卡尔比奥切姆#487928），或Arp2/3抑制剂CK-666（100μM;西格玛#SML0006）。对于第二阶段实验，抑制剂在乙醇激活后立即添加到培养介质中，但图5中的诺可达佐尔除外，该酶在分裂过程中被添加。对于S4E图中的元相II实验，卵母细胞在固定前用Y-27632孵育2小时。
质粒、cRNA 制备和微注射
使用了以下质粒：PCDNA3中的H2B-mCherry（罗伯特·贝内兹拉;阿迪金质粒#20972;[53]），pgemhe - egfp - map4 （简 · 埃伦伯格;欧洲卡夫质粒#P30518;[54]），egfp - Utrch 在 pcs2] （威廉 · 贝门特;阿迪金质粒#26737;[48]），prk5 - myc - cdc42 - t17n （加里 · 博科奇;阿德金质粒#12973），pEGFP-RhoA生物传感器（迈克尔·格洛策;阿迪金质粒#68026）， 和兰特 24n 在 pcDNA3.1 （本马戈利斯的礼物;[55]）所有插入都按要求分包到 pcDNA3.1 中。全长ECT2序列从小鼠卵母细胞cDNA中放大，克隆成eGFP下游的pcDNA3.1，生成eGFP-ECT2结构。由于表达EGFP-Ect2的卵母细胞在激活后被发现高度变形，我们截断了其催化半部分（Ect2N;aa 1+452）的Ect2生成EGFP-Ect2N，这足以研究中央主轴的本地化和PLK1[45]的监管，同时保持卵母细胞的形状。聚酰基化 cRNA 由线性质粒在体外合成，使用 mmesage mMachine T7 套件和保利 （A） 尾矿套件 （Ambion），用 RNeasy 纯化套件 （Qiagen） 纯化，并存储在 +80°C 下。 使用电气辅助显微注射技术，允许高卵母细胞存活率[56]，元相 II 卵母细胞被注射约 5pl cRNA，培养约 3 小时，以允许蛋白质表达。
免疫荧光
对于活性肌素染色，卵母细胞在室温下固定25分钟（RT），PBS中甲醛为3%，新鲜制备自16%的无甲醇副畸醛溶液（电子显微镜科学），并与NaOH调整为pH值约7.5。对于 RhoA、Anillin 和 ROCK1 染色，卵母细胞在 4°C 下固定 10 分钟，预冷 10% 三氯乙酸 （西格玛）。接下来，固定卵母细胞在 PBS 中渗透 0.1% 特里顿 X-100 （西格玛）， 在 Rt 15 分钟， 以 3% BSA （分数 V;西格玛）在PBS为2小时在RT，并在4°C与PBS-BSA3%的原位抗体在夜间孵育。第二天，卵母细胞在PBS-BSA中清洗3%，并在PBS-BSA 1%中用次要抗体稀释1：1，000，在37°C下45分钟。 使用以下主要抗体：磷-肌素光链2（Ser19）、pMLC2（1：200、兔多克隆、细胞信号技术#3671）、RhoA（1：100、鼠标单克隆：圣克鲁斯 sc-418）， 阿尼林 （1：100， 兔子多克隆;圣克鲁斯 sc-67327）， ROCK1 （1/100， 山羊多克隆;圣克鲁斯 sc-6056） 和拉克 Gap1 （MgcracGAP; 1：100， 鼠标单克隆;圣克鲁斯 sc-271110）。二级抗体是亚历克萨氟488结合驴抗山羊，驴抗兔，山羊抗鼠（病毒原）。F-actin 沾染了亚历克萨氟 568-法洛丁 （1：50， 生命技术）.色素被染色为Pro-3（1：200，病毒原T3605）。
活显微镜
卵母细胞被放置在玻璃底菜肴（马特克，阿什兰，马）在一小滴中覆盖着矿物油。对于抑制剂的活成像，卵母细胞被放置在聚氨酯涂层玻璃底盘（马特克，阿什兰，MA）上，总体积为3毫升，没有油。使用 63× 或 20× 的浸油目标，使用 Leica SP5 或 SP8 共聚焦显微镜对卵母细胞进行成像。对于 63×实时成像，每 1 分钟获得一架同焦 Z 平面。对于 20×实时成像，每 2 分钟获取 20 台分离 3.2μm 的共聚焦 Z 平面。在这两种情况下，温度都保持在37°C，使用安装在显微镜舞台上的舞台顶部孵化器（INUBG2E-GSI，东海打，静冈根，日本）。
图像处理和数据分析
软件。
所有图像处理和数据分析均使用 ImageJ 1.52t 或 Matlab 2015a 单独或一起使用 MIJ 插件（D. Sage、D. Prodanov、C. Ortiz 和 J. Y. Tivenez，从http://bigwww.epfl.ch/sage/soft/mij检索）。图形使用 OriginPro 9.0 制作，并导出到 Adobe 插画师 CS6 进行最终图形布局。
实时 3D 分割和跟踪程序。
为了监控血细胞内染色体的位置，我们开发了一个自动的 3D 分割和跟踪程序，该程序在 Matlab 和 ImageJ 中编码。这种方法基于灰色水平阈值，使我们能够提取H2B-mCherry-注射卵母细胞中的DNA簇和细胞轮廓。简言之，我们使用高斯模糊过滤图像以平滑边缘，并应用自适应阈值来解释 Z 堆栈更深部分的整体亮度降低。然后，我们使用不同的阈值参数将DNA簇与细胞质信号分离，最后使用接近标准跟踪DNA簇。此方法使我们能够提取以下参数：（1） DNA簇之间的距离d，这是通过测量 2 个 DNA 簇之间的 3D 欧几里德距离获得的。我们利用这一距离的变化及时登记卵母细胞种群。为此，我们手动选择距离线性增加的早期时间点。接下来，我们安装了前几个时间点，并将线性拟合的拦截和时间轴定义为 t = 0（参见图 1D）。（2） 主轴自转角α，通过3D测量染色体内部化簇（C）形成的角度获得在），主轴中点（等距从2个集群），和卵母细胞中心（见图1E）。（3） 主轴自旋角β，通过 3D 测量旋转开始时主轴中点形成的角度、旋转结束时的主轴中点和卵母细胞中心（见S3C 图）获得。（4） DNA簇与皮层的距离，这是通过平均DNA簇与其1%最接近的皮质像素之间的3D欧几里德距离获得的，由细胞质轮廓分割产生。（5） 主轴中点距离卵母细胞中心，这是通过测量主轴中点和卵母细胞中心之间的3D欧几里德距离获得的。在S5E 和 S5F 图中，我们线性地安装此距离的时间变化（在 10 到 50 分钟的分析窗口内）以提取被解释为主轴向卵母细胞中心移动速度的斜坡。（6） t我旋转，定义为主轴达到其总安装旋转的 5% 的时间。为了适应旋转，我们手动选择与实际旋转对应的时间点，并使用 Matlab 实施的 5 参数物流模型（G. Cardillo，从https://github.com/dnafinder/logistic5检索）中安装结果。
皮质F-actin和肌素-II水平和距离DNA簇。
在这项研究中，我们反复评估皮质F-actin和肌素-II（pMLC2）水平，并最终将其与皮层和DNA簇的距离相关联（见图3C、3D、4B和4C）。 为此，我们首先使用上述程序对卵母细胞进行分割，并根据细胞轮廓定义了 10 到 20 像素宽的线选择。接下来，我们生成了以DNA簇中心为中心的欧几里德距离图（马特拉布和图像J中的EDM命令）。这些地图使用灰度来编码先前定义的点（例如DNA星团中心）与其他图像像素之间的距离。最后，我们提取了 F-actin、肌素 II 和 EDM 通道的沿线选择值。在图3B（皮质荧光强度剖面）中，我们只是绘制了皮质F-actin和肌素-II水平，作为线性皮质距离的函数，与位于与2个DNA簇等距离的皮质点。在图3D和S5B中，我们平均从不同的卵母细胞中分析，显示皮质F-actin和肌素-II水平，作为欧几里德从皮层到DNA簇的距离的函数。在图4B中，我们生成了两极分化域的二维颜色编码地图，显示皮质F-actin水平或与DNA簇的皮质距离的变化。在图 4C中，我们通过平均结果为 25%（皮质 F-actin 水平）或 1%（与 DNA 簇的皮质像素距离）来重新概括 1D 中的颜色编码地图。
粒子图像速度 （PIV）。
为了测量细胞质材料在卵母细胞中的流动，我们设计了一个基于PIV[57]PIVlab实现的Matlab常规。我们使用面罩消除了卵母细胞外的载体，并根据运行平均值定制过滤器在空间和时间上平滑了矢量场。在图1C，2H，5E，6F和S1E图，我们使用80×80像素的第一关和第四十×40像素的第二次通过的审讯窗口。 我们使用空间中的 3 × 3 向量内核和 9 个时间点内核来平滑矢量场。在S1A 图中，我们使用 160 × 160 像素的第一关和第二关的 80 × 80 像素的审讯窗口。我们使用空间中的 5 × 5 内核和时间的 1+3 时间点内核平滑矢量场。最后，出于显示目的，我们使用"颤动"功能（B. Dano，从https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/3225-quiverc检索）对矢量规范进行颜色编码。为了平均图2H、6F和 S1E 图中的矢量场，在运行 PIV 分析之前，我们将所有卵母细胞定向在同一方向，并针对所有审讯窗口对平均矢量。为了提取S1D、S1F和S5C无花果中的流速曲线，我们将 PIV 分析限制在卵母细胞的中心部分（见S1B 图中的 PIV ROI），并沿极化域和细胞另一侧定义的轴提取速度载体的组件。 通过这样做，正值表示流向卵母细胞中心（倒流），而负值表示流方向朝向两极化域（元相状流）。为了提取S5D 和 S5G 图中的最大 PIV 速度，我们在激活后 10 到 50 分钟的分析窗口中平均记录了 10% 的最大速度。
数字建模
在模型中，我们考虑了圆形卵母细胞中固定长度的主轴。DNA簇在主轴末端进行定位。如主文所述，主轴基本上被提交给两个对立的力：每个星团对局部极化皮层的吸引力，以及细胞动力学入侵将中央主轴向内推入。模型几何的示意图被描绘成图7A。
吸引皮层。
我们通过有效的潜力模拟了DNA簇对皮层的吸引力。简单来说，我们使用了软核，如形态的潜伏V（图7B）：r是到皮层吸引区的距离，而"是潜在"的典型衰变长度。r一个是V（r） 最小值，通常对应于 DNA 星团的半径：当星团应用到吸引区时，V是最小值。
每个景点区对相应星团施加的力只是V（r）的梯度：
中央入侵。
细胞动力学入侵作为主轴中点（对应于中央主轴）的推动力。简单来说，我们在模型中假设入侵速度是恒定的。从数字上讲，我们只是规定了中央主轴的速度，其移动速度与主轴垂直。重要的是，如果没有这种规定的入侵，星团仍然停留在皮层，什么也没有发生。-医学论文发表
主轴刚性。
我们允许主轴稍微弯曲，如实验中观察到的。主轴弯曲产生弹性恢复力的集群，这是成正比的偏转主轴和主轴刚度k，使弹性力是。偏转等于连接 2 簇的直线中点与主轴中点之间的距离。请注意，这与连接群集的直线垂直。正是由于主轴的刚性（由弹性恢复力所占），集群跟随中央主轴的运动。
时间演变。
我们使用过分戳的动态获得每个聚类的运动：给定星团的速度在哪里，并α阻尼系数。为了计算每个聚类在每个步骤中的新位置，我们使用简单的 Euler 方法将此方程数集成在一起。
噪声。
这个问题有一个不稳定的解决方案，其中主轴保持平行的皮层，而被推入。在这种情况下，两个集群最终都逃脱了吸引力的潜力。这种不稳定的溶液在体内是无法观察到的，因为任何噪音、不对称或扰动都会导致对称性断裂。如果没有任何噪音（图6C），可以从数字上观察不稳定的溶液，因为模拟是完全对称的。然而，一旦引入很小的噪声，系统最终就会打破其左右对称性，其中一个星团会失去吸引力潜力，而另一个星团会返回其吸引区（图 7C）。
生物系统中有许多可能的噪声源，其中可能包括（但不限于）初始配置的不对称、衰变长度的不对称、吸引力的不对称、星团位置的热或活动波动、中央主轴的不完美中心或入侵等。在这里，我们只考虑集群位置动态上的噪声。
在运动方程的集成后，我们在每个星团的位置上每次添加一个正常分布的随机噪声，标准偏差σ。即使与系统大小相比，σ非常小，这也足以打破系统的对称性。请注意，这也引入了通常分布的初始不对称，这不可避免地为旋转方向设置了偏差（图 7F）。
参数值。
在模拟中，我们基本上使用了相同的参数集。唯一的变化是引入的噪声，以便更好地了解对称断裂机制和实验观察到的变异性。请注意，距离在R单元中奥沃，卵母细胞的半径（我们设置R奥沃? 1）。时间尺度是任意的，因为我们将阻尼系数设置为 1。
在整个研究中使用的参数如下：
?1×10+1
α = 1
A = 1.5×102
k = 2×102
u细胞? 1/3
噪声：
图 7C（模拟、顶板）：σ = 0
图 7C（模拟，其他面板）：σ = 1×10+3
图 7D+7F （角度和距离动态）： σ = 1×10+3
图 7G （直方图、进出和旋转时间）： σ = 1×10+2
"对称中断时间"分布的简化分析模型。
为了更好地理解对称断裂时间的长尾分布，在体内和硅胶中观察到，我们设计了对称断裂过程的简化模型。让我们考虑一个物体在潜在V的局部二次颠簸上的动态：r是对象的位置，而a是常数。物体的过度动态只是给出的：α是阻尼系数，是放松时间尺度。因此，T时间对象的位置由：
如果r0 = r（t = 0） = 0， 解决方案是r（t）= 0 （对象保持在最大V（r）上） 。显然，这是一个不稳定的解决方案，因为任何从r的微小偏差0= 0 将随着时间的推移呈指数级增长，对象将远离最大V（r）。现在让我们考虑一下时间c（对称破碎"时间）对象达到任意距离 r 所需的时间c考虑对称的突破距离， 从r开始0≠0.以上面方程的日志为例，我们有：
现在让我们假设0具有高斯概率密度函数（标准偏差σ），如我们一批卵母细胞模拟： 。使用t的表示c以上和r的概率密度函数0，可以直接计算对称断流时间t的概率密度函数c， 内容如下：
通过上面的分析表达，我们直接恢复长尾分布p（t）c） 在我们的模拟和体内观察， 从高斯噪音（S6 图， 顶部和中间面板） 开始。请注意，计算p（t）c） 从r的正常分布中数0产生了相同的结果。p的长尾c） 可被视为t非线性衰变的直接后果c(r0）接近不稳定的解决方案。r的小型值0导致一个漫长的对称断裂时间（S6图，底部面板）。对于S6 图中显示的情节，我们使用了σ= 1、+ 1 和r c= 10.
p-值和可重复性
汇集了来自不同卵母细胞的数据点来估计平均值和标准偏差。这些量化是在至少2个独立实验中对至少10个卵母细胞进行量化的。使用曼恩-惠特尼测试（假设非正常分布和等差）测试统计意义。对于图 7G和S5G 图（上排）中的数据，我们进行了单向 ANOVA 测试 Cortex/DNA 星团距离比对 t 的影响我旋转。没有使用统计方法预先确定样本大小。实验没有随机化，调查人员在实验和结果评估过程中也没有对分配视而不见。
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主轴旋转期间的细胞质流。
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S1 图。主轴旋转期间的细胞质流。
（A） PIV 测量显示细胞质流在分析阶段过程中（S4 电影）。静止图像显示细胞动力学沟渠入侵（t = 15 分钟）、折叠突起（t = 40 分钟）和细胞因子环（t = 55 分钟）引起的逆流。（B） 图示用于 1D 流速测量的方法（参见方法）。虚框表示 PIV 测量的投资回报率。正值表示指向卵母细胞中心的流（反向流），负值表示流向偏振域（元相状流）。（C） 图示与皮质入侵（红点）或折叠突起（蓝点）的中心距离。（D） 显示流速（黑色曲线）和皮质入侵（红色曲线）或折叠突起（蓝色曲线）的中心距离的流动时间变化图。（E） PIV矢量场显示元相 II 和第二卵母细胞的平均细胞质流模式（参见方法）。（F） 随着时间的推移，±元相 II（浅灰色曲线）和相 II 卵母细胞（深灰色曲线）的流速 SD 的平均变化。分别对2个和5个独立实验中的11个元相II和32个相二卵母细胞进行了E和F测量。此数字背后的数据可以在S1 数据中找到。秤杆 = 10μm。PB2，第二极地体;PIV，粒子图像速度：投资回报率，感兴趣区域。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s001
（蒂夫）
S2 图。自动 3D 分割和跟踪程序。
（A） 自动3D分割和跟踪程序，以监测卵母细胞内DNA簇的位置（有关详细信息，请参阅方法和S5电影）。（B） 显示用于量化DNA簇距离d的方法和主轴自转角α的图表。秤杆 = 10μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s002
（蒂夫）
S3 图。在分析第二阶段期间招募规范细胞因子。
（A） 固定RhoA、肛列素、ROCK1（免疫染色）、DNA（至Pro-3）和元相II（插入）和相位II卵母细胞（主要图像）的eGFP-ECT2N成像。在从至少2个独立实验中收集的至少14个卵母细胞中，持续观察到A中显示的荧光模式。（B） 控制和双2536-治疗卵母细胞的固定eGFP-Ect2-N和MgcRacGAP（免疫染色）成像。PLK1 抑制阻止了中央主轴（顶板）的 eGFP-ECT2N 招聘，而相比之下，MgcRacGAP（免疫性面板）的招聘则得到了保留（底部面板）。请注意 Bi-2536-治疗卵母细胞中增强的 MgcRacGAP 信号，这可能是由于绑定 ECT2 的释放而导致的表位脱盖。在23个卵母细胞（eGFP-ECT2N）和15个卵母细胞（MgcRacGAP）中，从3个独立实验中不断观察到B中显示的荧光模式。（C） 框图，显示自旋角度的最大变化β，如顶部图和方法定义，在控制和Bi-2536+治疗卵母细胞。对从9个独立实验中收集的70个控制卵母细胞和从6个独立实验中收集的35个双-2536卵母细胞进行了C测量。C 中的框图和统计数据参数如图 2所述。P-值在C是通过双面曼恩-惠特尼测试获得的。此数字背后的数据可以在S1 数据中找到。秤杆 = 10μm。PLK1，马球状激酶1：ROCK1，罗相关蛋白激酶1。
（蒂夫）
S4 图。分析二涉及2个不同调节的皮质行为肌素亚聚合物。
（ A ）固定 F - actin （法洛丁染色）、 eGFP - AHPH （ RhoA 传感器）和 DNA （至 Pro - 3 ）控制成像和拉伦库林 A - 治疗的 II 卵母细胞。白色箭头显示面向中央主轴的 F-actin 和激活的 RhoA 补丁。请注意，尽管在拉伦库林A治疗时缺乏F-actin积累，但RhoA活化的持续性。在A中显示的荧光模式在至少3个独立实验中收集的至少8个卵母细胞中持续观察。（B） 皮质荧光强度配置文件，回顾在A中观察到的F-actin和eGFP-AHPH极化模式。 （C） 固定F-actin（纤维素染色剂）、肌素-II（pMLC2免疫染色）和DNA（至Pro-3）控制成像、Bi-2536-治疗（PLK1抑制剂）和Y-27632治疗/ROCK1抑制剂）第二卵母细胞。白色箭头显示面向中央主轴的 F-actin 和肌素-II 贴片。（D） 皮质荧光强度图，回顾C. 注意到PLK1和ROCK1抑制后中央主轴面行动肌素贴片的消失， 回顾F-actin和肌素-II极化模式。（E） 固定F-actin（法洛丁染色）和肌素-II（pMLC2免疫染色）控制成像或Y-27632-治疗元相II卵母细胞。（ F ）修复肌素 - II （ pMLC2 免疫染色）控制成像或 Y - 27632 - 治疗的 II 卵母细胞。图像显示多个共焦平面的最大强度 z 投影。请注意，在C-F中显示的C-F.荧光模式中，在PLK1和ROCK1抑制下的F-actin帽和肌素-II环的持久性在至少3个独立实验中收集的至少18个卵母细胞中一致观察到。此数字背后的数据可以在S1 数据中找到。秤杆 = 10μm。F-行动素，作用性长丝;PLK1，马球状激酶1：pMLC2，磷化肌素光链2：ROCK1，罗相关蛋白激酶1。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s004
（蒂夫）
S5 图。Cdc42 通过 F-actin 极化促进皮质吸引力。
（A） 固定F-actin（法洛丁染色）、肌素-II（pMLC2免疫染色）和DNA（至Pro-3）元相II-被捕卵母细胞成像，表达兰氏菌和Cdc42 GTPase（分别为兰特24N和Cdc42T17N）的主导阴性形式。（B） 平均±SD皮质F-actin（法洛丁染色）和肌素-II（pMLC2免疫染色）荧光强度，作为皮层与DNA簇距离的函数。荧光强度正常化为每个轮廓的均值。对从2个独立实验中收集的10个对照组、11个RanT24N和15个Cdc42T17N元相II卵母细胞进行了测量。（C） 显示控制（浅灰色）和 Cdc42T17N 卵母细胞（蓝色曲线）的流速 SD（如 S1 图所述）±一段时间内的平均变化图。（D） 显示在 10 到 50 分钟分析窗口内记录的最大流量速度（10% 最高值的平均值）分布的框图（参见 C 和方法）。（E） 图表显示与控制中的卵母细胞中心和DNA簇中点（浅灰色）和Cdc42T17N卵母细胞（蓝色曲线）距离的平均变化，±SD。虚线表示在 10 到 50 分钟的分析窗口内执行的线性拟合。（F） 显示从 E 中描述的线性拟合中提取的斜坡分布的框图。斜坡被解释为向卵母细胞中心移动的主轴速度（参见方法）。（G） 向卵母细胞中心方向散射主轴速度图与最大流速。分别对32个对照和29个Cdc42T17N卵母细胞进行了C-G测量，分别来自8个和3个独立实验。D 和 F 中的框图参数如图2所述。D 和 F 中的p 值（对照控件）是使用双面曼恩-惠特尼测试获得的。G 中的 p 值是使用单向 ANOVA 来测试最大流速对主轴向中心移动速度的影响。此数字背后的数据可以在S1 数据中找到。秤杆 = 10μm。F-行动素，作用性长丝;PIV，粒子图像速度：pMLC2，磷化肌素光链2：sPB ，小极地体。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s005
（蒂夫）
S6 图。对称性断裂的简化分析模型。
（A） 高斯分布的初始偏差与不稳定配置。红色实线显示分析分布。（B） 分配产生的对称断裂时间，需要与不稳定配置达到任意距离。红色实线显示分析分布。（C） 对称断裂时间与初始偏移。红色实线显示分析表达。此数字背后的数据可以在S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s006
（蒂夫）
S1 数据。主要和补充数字背后的数字数据。
图1D， 1E， 1G， 1H， 2D， 2F， 2G， 3B ， >3D， 4B ， 4C， 5B， 5C， 6C， 6D， 7B， 7D， 7E， 7F， 7G，和S1D， S1F， S3C， S4B， S4D， S5B， S5C， S5D， S6A， S6B和S6C图以单独的Excel表，组合成一个单一的Excel文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s007
（XLSX）
S1 电影。第二阶段主轴旋转（亮场）。
接受主轴旋转的激活卵母细胞的实时成像。卵母细胞被注射了H2B-mCherryDNA标记。图像每 1 分钟获取一次，目标为 63×，代表单个共焦 Z 平面。秤杆 = 10μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s008
（AVI）
S2 电影。第二阶段主轴旋转 （MT）。
接受主轴旋转的激活卵母细胞的实时成像。卵母细胞被注射了H2B-mCherryDNA标记和eGFP-MAP4MT标记的组合。图像每2分钟获取一次，目标为20×，最大投影量为20个共聚焦Z平面。秤杆 = 10μm。山， 微管
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s009
（AVI）
S3 电影。元相 II 和相 II 卵母细胞 （PIV） 中的细胞质流模式。
实时成像比较元相 II 中的细胞质流和第二阶段卵母细胞。请注意第二阶段的流量反转。卵母细胞被注射了H2B-mCherryDNA标记。图像每2分钟获得一次，目标为20×（元相II）或63×（第二阶段），代表单个共聚焦Z平面。PIV 矢量场颜色代码表示跟踪粒子的速度。右上箭头显示 0.3-μm.min-1 向量的大小和颜色。秤杆 = 10μm。PIV，粒子图像速度。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s010
（AVI）
S4 电影。细胞质流模式在第二阶段卵母细胞（PIV，高时间分辨率）。
实时成像显示细胞质流在激活的卵母细胞中。卵母细胞被注射了H2B-mCherryDNA标记。图像每 1 分钟获取一次，目标为 63×，代表单个共焦 Z 平面。PIV 矢量场颜色代码表示跟踪粒子的速度。右上箭头显示 0.35-μm.min-1 向量的大小和颜色。秤杆 = 10μm。PIV，粒子图像速度。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s011
（AVI）
S5 电影。自动 3D 分割和跟踪程序。
自动3D分割和跟踪程序，以监测DNA簇在卵母细胞中的位置。顶部面板显示来自 3 个偏差方向卵母细胞的跟踪 DNA 簇，而底部面板显示相同卵母细胞体积的 3D 重建。图像每2分钟获取一次，目标为20×，最大投影量为20个共聚焦Z平面。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s012
（AVI）
2 个激活卵母细胞的实时成像显示其旋转启动时间的明显差异。卵母细胞被注射了H2B-mCherryDNA标记。图像每2分钟获取一次，目标为20×，最大投影量为20个共聚焦Z平面。秤杆 = 10μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s013
（AVI）
S7 电影。中央主轴/RhoA 通路抑制 （Bi-2536）.。
控制和Bi-2536-治疗（PLK1抑制剂）活性卵母细胞的实时成像。卵母细胞被注射了H2B-mCherryDNA标记。在 Bi-2536+治疗的卵母细胞中，大约三分之一（n = 10/35 约 29%） 的主轴围绕细胞外围旋转（见右卵母细胞），而其他主轴（n = 25/35 约 71%） 只是与皮层平行（见中卵母细胞）。图像每2分钟获得一次，目标为20×，最大投影为20个共聚焦Z平面（H2B-mCherry）或单个共聚焦Z平面（亮场）。秤杆 = 10μm。PLK1，马球状激酶1。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s014
（AVI）
S8 电影。分析阶段二期间的皮质F-actin重组。
接受主轴旋转的激活卵母细胞的实时成像。卵母细胞被注射了H2B-mCherryDNA标记和eGFP-UtrCHF-actin标记的组合。图像每2分钟获取一次，目标为20×，最大投影量为20个共聚焦Z平面。秤杆 = 10μm。F - actin， 行动性长丝。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s015
（AVI）
S9 电影。诺科达佐尔诱导的DNA簇分离揭示了皮质吸引力。
用低剂量的诺科达佐尔治疗的活性卵母细胞的实时成像。这种治疗偶尔会导致DNA簇脱离主轴，并揭示DNA簇从极化皮层接受有吸引力的力量。手动跟踪的细胞质颗粒（见白圆）和 PIV 测量显示，朝向偏振皮层的元相状流在分析第二阶段期间持续存在。卵母细胞被注射了H2B-mCherryDNA标记和eGFP-MAP4微管标记的组合。图像每 2 分钟获取一次，目标为 20×，最大投影为 20 个共焦 Z 平面（H2B-mCherry + eGFP-MAP4）或单个共焦 Z 平面（亮场）。PIV 矢量场颜色代码表示跟踪粒子的速度。右上箭头显示 0.4-μm.min-1 向量的大小和颜色。秤杆 = 10μm。PIV，粒子图像速度。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s016
（AVI）
S10 电影。皮质电极化抑制（Cdc42T17N）。
单独注射 H2B-mCherry DNA 标记（控制、左面板）或与 Cdc42T17N 组合的激活卵母细胞的实时成像。在 Cdc42T17N 注射的卵母细胞中，大约三分之一（n = 8/27 约 30%） 的主轴转移到细胞中心（见右卵母细胞），而其他主轴（n = 19/27 约 70%） 挤压了 PB2，但尺寸小于对照组（见中卵母细胞）。另请注意，作为控制，Cdc42T17 卵母细胞会经历反细胞质流。图像每2分钟获得一次，目标为20×，最大投影为20个共聚焦Z平面（H2B-mCherry）或单个共聚焦Z平面（亮场）。秤杆 = 10μm。PB2，第二极地体。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s017
（AVI）
S11 电影。皮质电剂和细胞动力学侵入抑制（Cdc42T17N = Y-27632）。
单独注射 H2B-mCherry DNA 标记（控制、左面板）或与 Cdc42T17N 组合的激活卵母细胞的实时成像。培养基辅以ROCK1抑制剂Y-27632，以防止细胞动力学的侵入。请注意，细胞质流的回归和主轴迁移都防止了这种抑制状态。图像每2分钟获得一次，目标为20×，最大投影为20个共聚焦Z平面（H2B-mCherry）或单个共聚焦Z平面（亮场）。秤杆 = 10μm。ROCK1，罗相关蛋白激酶1。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s018
（AVI）
S12 电影。对抗力产生对称性断裂和主轴旋转。
典型模拟的延时序列（左）或没有（中、右）高斯噪音添加到DNA簇位置。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001376.s019
（AVI）
确认
我们感谢ARCHE-生物科技动物设施和MIC-生物科技显微镜设施的工作人员提供技术援助和专家建议。
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