医学论文发表-

内皮塞马福林 3fb 调节 Vegf 通路介质血管生成发芽

· Charlene Watterston,

· Rami Halabi,

· Sarah McFarlane,

· Sarah J. Childs

· Published: August 23, 2021

抽象

容器生长将各种外在信号与内在信号级联集成，以协调细胞迁移和发芽形态。血管内皮生长因子 （VEGF） 的亲血管效应在发芽过程中受到严格控制，以生成高效图案的血管网络。我们识别VEGF信号和分泌的配体塞马福林3fb（Sema3fb）之间的相声，这是哺乳动物Sema3F的两个斑马鱼寄生体之一。sema3fb基因由内皮细胞在主动发芽血管中表达。sema3fb 的损失导致异常宽和发育迟缓的隔行血管动脉芽。虽然芽在正确的发育时间启动，但迁移速度会降低。这些芽有持续的纤维素和异常间隔的核建议对行动素组装的调控不力。sema3fb突变体同时表现出较高的表达亲血管生成（VEGF 受体 2 （vegfr2）和增量状 4 （dll4）和抗血管生成 （可溶性VEGF 受体 1 （svegfr1）/可溶性 Fms 相关受体泰罗辛激酶 1 （sflt1）通路组件。我们显示迁移血管母细胞中磷-ERK染色增加，与增强的 Vegf 活性一致。减少Sema3fb突变体中的 Vegfr2 激酶活性可以挽救血管生成发芽。我们的数据表明，Sema3fb 通过调节 VEGF 信号通路，在促进内皮发芽方面发挥着关键作用，它充当调节内在生长因子信号的自动提示。

作者摘要

为了向组织提供必需的氧气和营养物质，血管发育由正"去"和负"停止"生长信号以及方向线索精心策划，以形成图案。信号素蛋白以"信号"铁路信号系统命名，该系统引导列车沿着适当的轨道行驶。我们的工作突出了塞马福林3fb蛋白在为发育中的血管提供促进生长信号方面的作用。血红素3fb是由血管的前体在迁移时产生的，并且作用于血管的前体，这个过程称为自体素控制。我们发现，失去血红素3fb导致血管生长停滞，表明它通常作为一个积极的信号。它通过调节 VEGF 生长因子信号通路来操作，而该通路反过来又控制着迁移过程。我们建议Semaphorin3b微调容器的生长，从而确保一个正确的模式网络的发展。

引文：沃特斯顿 C， 哈拉比 R， 麦克法兰 S， 儿童 SJ （2021） 内皮塞马福林 3fb 调节 Vegf 通路介质血管发芽.PLoS基因 17 （8）： e1009769.https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009769

编辑：塞西莉亚·莫恩斯，弗雷德·哈钦森癌症研究中心，美国

接收：2021年2月1日：已接受：2021年8月10日：已发布：2021年8月23日

版权所有：?2021年沃特斯顿等人。这是根据《知识共享归因许可证》条款分发的开放访问文章，该条款允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源被记入贷记。

数据可用性：所有相关数据均在手稿及其支持信息文件中。

资金：CW由卡尔加里眼科大学高博士生（https://iac01.ucalgary.ca/FGSA/Public/SpecificAward.aspx?AwardID=5956）资助，RH由T.陈芳研究生院（https://iac01.ucalgary.ca/FGSA/Public/SpecificAward.aspx?AwardID=60410）和艾伯塔省创新健康解决方案学生（https://albertainnovates.ca/programs/graduate-studentships-in-health-innovation/）资助。营运资金由CIHR项目拨款（https://cihr-irsc.gc.ca：PJT-168938）向SJC、光明焦点基金会（https://support.brightfocus.org）和CIHR项目赠款资助（https://cihr-irsc.gc.ca：PJT-153062） 到 SM.资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备手稿方面没有作用。

竞争利益：作者宣称不存在相互竞争的利益。医学论文发表-

介绍

发芽血管生成是一个过程，通过它，新的容器分支和成长从现有的船只，建立组织和器官的灌注。发芽血管生成如何在内在和外在水平上协调是血管生物学中最重要的问题之一。血管生长高度依赖于血管内皮生长因子 （VEGF） 信号，该信号作为促进血管生成的主要调节器，并且经常在疾病中调节不良[1]4]。组织内的 VEGF 梯度负责通过内皮表达的酪氨酸激酶 VEGF 受体 2 （VEGFR2）[5]7]发出发芽过程信号的初始触发和指导，激活下游信号，包括 MAPK-ERK 通路的信号。必须仔细调节对VEGF的细胞反应，以确保船舶的陈规定型模式。

在芽形成过程中，血管母体采用两种不同的细胞状态（称为尖端和茎），对内部和外部刺激作出反应，以促进和引导血管生长[5、8、9]。提示细胞利用纤维电图扫描环境，寻找动态控制增殖和迁移的诱人和令人厌恶的线索[10，11]。相比之下，尾随茎细胞的纤维素有限，处于静止，有助于形成血管流明和咽部[5，12]。提示和跟踪身份通过类似三角洲的 4 （Dll4）-Notch 横向抑制通路和 VEGF 信号反馈回路进行竞争确定。Dll4 表达是诱导在尖端细胞中 VEGF 信号的下游 [13]。Dll4阳性细胞激活茎细胞中的凹口受体[14]16] 以降低调节 VEGF 受体表达，并限制跟踪细胞对环境 VEGF 的反应[17]19]。

脊椎动物特异性分泌的3类塞马福林（Sema3s），包括Sema3a、Sema3c和Sema3f，通常充当抑制血管生长的令人厌恶的引导线索。Sema3 对血管生成的控制在多个物种中进化地保存[20]23] 。这些启发性线索的确切作用可能因配体和/或受体的物种和组织表达而异。PlexinD1 是一种内皮特异性受体，保存在斑马鱼和小鼠中，并集成来自多个 Sema3 配体的信号。在胚胎血管生长过程中，斑马鱼Sema3a在每个烟道上以从牛皮到星体的梯度表示。从Sema3a向其受体PlexinD1发出的寄生虫信号在内皮作用，在空间上限制分层间血管[22]。在鼠标 Sema3E 中，通过普莱辛D1[20，24]引导分间血管生长。相比之下，鱼Sema3e表现出内皮表达，并作为一种自体的亲血管生成因子，在分期血管生长期间对抗PlexinD1[25]。PlexinD1还通过增加可溶性诱饵Vegf受体（sVegfr2/sFlt1）[26]的表达来限制对VEGF的反应。sFlt1 通过隔离 Vegf 配体来对抗 Vegfr2 信号， 从而在 Sema - plexin 和 Vegf 信号之间提供链接。

Sema3F 由培养的人类和小鼠内皮细胞[27]30] 和 scRNASeq 数据库中的内皮细胞[31，32]高度表达。SEMA3F通常通过神经皮蛋白受体（NRP）发出信号，以调节细胞培养模型中的迁移[30，33]。外源性人类SEMA3F抑制肿瘤进展和血管化[21]。然而，SEMA3F在根据上下文调节船舶生长方面具有多功能的作用：它的作用是作为亲血管生成或抗血管生成线索。例如，外源性应用Sema3F限制了小鼠视网膜血管的反常生长[34]，我们最近在斑马鱼视网膜[35]中表现出类似的Sema3fa抗血管生成功能。同时，Sema3F在小鼠胎盘发育过程中是亲血管生成的[29，36]。对于内皮细胞如何接收相同的信号，以及协调不同的下游分子通路来驱动血管生成生长，人们仍然了解有限。上下文依赖和组织特定表达可以进一步影响细胞行为，例如在小鼠大脑 Sema3E/PlexinD1 信号开关从有吸引力到令人厌恶，具体取决于 NRP 共同受体表达[37]。

在这里，我们研究斑马鱼Sema3f在调节血管生成生长中的作用。我们发现sema3fb在背主动脉的内皮细胞内表达，对于促进躯干中的芽迁移是必要的。我们表明，sema3fb调节VEGF受体vegfr2的表达，以促进血管细胞迁移，以及调节基因的表达调解反馈的Vegf信号，如sflt1和dll4。这些数据共同揭示了一个新的自体犯罪作用，从内皮细胞分泌配体在调节血管生成发芽的VEGF通路活性。

结果

sema3fb通过发展血管来表示

为了研究Sema3F在血管血管生成中的作用，我们使用斑马鱼。斑马鱼基因组包含人类SEMA3F的复制正交 - sema3fa和sema3fb [38]。斑马鱼中主要主干船的陈规定型图案开始于受精后约20小时（hpf），当血管母体（内皮前体）集体从背主动脉（DA）迁移，并横向在两对软木虫之间发芽，形成间歇动脉（ISA）。然后，ISA 以圆周方式迁移并连接，形成 30 至 32 hpf[39]之间的正点纵向容器 （DLAV）。我们使用全坐骑原位杂交（ISH），分析了sema3fa和sema3fb的表达，并在发育胚胎的躯干中发现了非重叠的表达模式。sema3fb在背主动脉中表示为 26 hpf，在 ISA 中表示为 28/30 hpf（图1A和S1），类似于sema3e 的内皮表达模式[25]。相比之下，它的同源sema3fa不在主干内皮，并横向表达在烟灰（S1图）。这些表达模式与已公布的斑马鱼单细胞测序数据一致，这些数据显示斑马鱼胚胎发育中的sema3fb（但不是 sema3fa）的表达。 Sema3f在穆林和人类中的内皮表达，以及斑马鱼血管中的sema3fb的内皮表达，支持Sema3f在内皮细胞中的保存作用。医学论文发表-

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图1。内皮表达 sema3fb 促进内皮细胞发芽。

A） ISH 在 30hpf 下对 sema3fb 表达的横向视图。插入显示主动脉 （DA） 和分界动脉 （ISA） 中的表达。B） 斑马鱼血管的示意图表示，功率为 30 hpf。插图：ISA 从 DA 发芽，并连接形成多萨尔纵向麻醉容器 （DLAV） 30 hpf。C-E） 30 hpf （C） 野生类型兄弟姐妹 （sib） 的躯干血管 （黑色） 的横向共聚焦图像（sib），（D） 异质（het） sema3fbca305/+和 （E） 同源 （霍姆） sema3fbca305突变 体。注意到 DLAV（蓝色星号）和截断的 ISA 芽（黄色箭头）中的间隙。缩写： DA （多萨尔主动脉） 和 PCV （后红衣主教静脉） 。前，左;多萨尔， 起来秤吧，100μm。F） ISA 芽长度在 30 hpf 在野生类型 （WT） sibs （平均长度 106± 10 μm）， het sema3fbca305/+（92±19μm）和霍姆斯马3fbca305（91±18μm），***p<0.0001。G） 以 30 hpf 连接到形成 DLAV 的 ISA 芽的百分比。Wt sib （平均 83% 连接）， 赫特 sema3fbca305/+（50% 连接） 和 hom sema3fbca305（42% 连接），****p<0.0001。H） 在水平肌肽（HM;破折号红线）水平下对ISA发芽的横截面直径进行量化。WT sib （平均直径 6.9 ± 2 μm）， 赫特 sema3fbca305/+（8.5±2.7 μm） 和 hom sema3fbca305（9.2±2.9 μm），*p<0.0016 和 ***p = 0.0002。F-G） N = 3;Wt sib = 11 个胚胎 （n = 86 个 Isas）， 赫特 · 塞马 3fbca305/+? 22 个胚胎 （n = 163 ISA） 和霍姆斯马 3fbca305? 9 个胚胎 （n = 75 个 ISA），双向 ANOVA Tukey 的多个比较测试。错误栏 = ±SD。

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Sema3fb 损失导致血管缺陷

为了研究Sema3fb在调节完整动物血管生长中的内生作用，我们使用了sema3fbca305CRISPR 突变体与 19 碱基对删除在 Exon1 中，预计会产生过早截断的蛋白质（长度为 32 氨基酸），删除大部分 Sema 域，这是细胞内信号所需的[41，42]。为了可视化实时血管发育，我们跨越了 sema3fbca305功能突变体损失到Tg（kdrl：mcherry）ci5转基因鱼，荧光标记内皮细胞，并产生野生类型，异质性，和突变的兄弟姐妹。我们分析了血管生成发芽在30hpf时，ISA芽第一次连接形成DLAV （图1B），并观察到血管生成缺陷在两个sema3fbca305/+异质物 （图1D） 和sema3fbca305与野生类型兄弟姐妹 （图1C）相比， 同源突变体 （图1E） 。具体来说，我们注意到ISA芽的平均长度显著减少，从野生型的106μm减少到异质卵母和同源突变胚胎的91μm和92μm（图1F）。其次，在DLAV连接的ISA比例从野生类型的80%下降到异质的50%，同源突变体（图1G）的40%。最后，异质体的腹芽直径从野生型的7微米增加到异质的8.5微米和同源的9微米（图1H）。这些数据表明，Sema3fb 通常促进血管迁移，导致失落时发育迟缓的更宽的芽。

我们观察到，失去一个sema3fb的突变等位基因会导致发育中躯干中高度渗透的血管缺陷，其规模与基因的同源性损失相似。如果sema3fb功能丧失是单向充足的，则可能导致这种情况。为了通过一种独立的方法诱导功能丧失，我们注射了1克经验证的形态胶质抗感性寡核苷酸（形态，MO）对sema3fb [43]的1细胞阶段胚胎。sema3fb变形剂具有与sema3fb相同的表型ca305突变体在 30 hpf， 没有额外的缺陷在形态注入sema3fbca305突变体表明 sema3fb 突变体是功能等位基因的丧失（S1 图）。值得注意的是，Vegf通路的成员，包括Vegf和Dll4基因，也观察到单体功能充足，这两个基因对血管生成都至关重要。

由于sema3fb参数sema3fa不是用树干血管（S1 图） 表示的，我们没想到sema3fa的损失会影响 ISA 的生长。事实上，塞马3法ca304突变体显示正常的发芽和连接（S1图）。似乎也没有遗传补偿的sema3fa，作为sema3faca304注射sema3fb变形的突变体在sema3fb上没有显示其他缺陷ca305突变体或变形剂（S1图）。这些结果表明，在这个发育阶段，只有两种斑马鱼Sema3f矫形学，sema3fb，调节树干中的血管生成发芽。

尽管塞马福林参与轴素和血管细胞导引在其他系统中，我们发现在sema3fb异质体或同源突变体之间的发芽方向没有显著变化，如芽的位置观察到的，指的是分离烟蜜的肌相交界处的层压素染色（S2图）。与其他血管生成突变体一样，Sema3fb突变血管最终会恢复，很可能通过未知基因和通路进行补偿，在48马力夫（S3图）的血管图案上没有明显的差异。

我们没想到血流会助成sema3fb突变ISA表型，因为形成原发性ISA的细胞在20-30 hpf之间的迁移独立于血流[45，46]。然而，作为sema3fbca305突变体有心脏功能缺陷[41]我们接下来测试血流是否对表型有影响。我们注射了 1ng 的常用翻译阻断形态对心脏肌肽 2a （tnnt2amo：[47]）在野生类型和sema3fb突变体在一细胞阶段，以限制心脏收缩和血液流动。在tnnt2 MO 注射的野生类型中，ISA 生长不受先前报告的血流量损失的影响。同样，与未注射的突变体（S2 图）相比，tnnt2a MO 注射的 sema3fb突变体的血管生长或连接数量没有显著差异。这些数据表明，30马力的sema3fb突变体的血管缺陷不是血流变化的结果。我们注意到，未注入的sema3fbca305鱼显示DA直径（S2图）的减少，这种效果也见于tnnt2a变形剂。这表明轴向血管直径对早期心脏输出敏感，而发芽血管生成则不敏感。因此，我们的数据表明，Sema3fb通常促进ISA从主动脉发芽，在空间引导中没有明显的作用。

sema3fb 的丢失会破坏 ISA 迁移和内皮核形态

sema3fb的发育迟缓形态ca3030 hpf 的 ISA 容器表明，EC 发芽启动和/或迁移可能会有延迟。为了检查这些是否受到 Sema3fb 损失的影响， 我们越过了 sema3fbca305 Tg （kdrl：mcherry）鱼到Tg （fli1a：nEGFP）线， 它标记内皮核 （图 2A）.使用延时共聚焦成像，我们跟踪了ISA血管在野生类型和sema3fb之间的拉长ca305胚胎从25-29马力夫（图2A和2B）。我们发现在芽启动没有显著差异从 25.0/25.5 hpf 在野生类型或sema3fbca305突变的 ISA，均平均长度为 54 μm。然而，随着豆芽开始拉长，突变体的平均ISA迁移距离开始落后于野生类型距离26。5 hpf 和容器在随后的所有时间点分析中都较短，野生类型和突变体之间的长度平均为 5°9 μm（图 2B和S1 表）。ISA 血管爆炸迁移速度从 25+26 hpf 平均 0.21 μm/min（S4 图）， 并在 26×27 hpf 之间减慢到 0.15 μm/min （图 2 2C） 之前增加到 0.19 μm/min 27×28 hpf （图 2D）， 并在 28+29 hpf （图 2E）之间以 0.16 μm/min 的速度继续。相比之下，sem3fb的平均迁移速率ca305与野生类型（图 2C、2D 和S4）相比，船舶从 25×28 hpf 显著减少到平均 0.12×0.13 μm/分钟。 我们还测量了铅血管细胞（尖端细胞）距离DA每小时一次，作为EC运动性的测量，同样发现野生类型和突变血管之间的距离在25-26马力夫（S4图）之间没有差异。有一个显著的差异27hpf，与野生类型的平均距离为55μm在27马力夫（图2F）到70μm在28马力夫（图2G），而突变体只达到47μm和55μm分别。到29 hpf突变体平均迁移69μm从DA，而野生型血管母细胞迁移显著进一步，达到85μm（图2H）。这些数据共同表明，芽启动是正常的，但血管细胞运动被显著延迟与失去sema3fb。除了发育迟缓的形态，我们观察到sema3fb的丧失导致更宽的船只（图1H）。先前对斑马鱼的研究已经将ISA宽度的增加与EC增殖的变化联系起来[48]50]。为了确定细胞数量的变化是否可以解释血管直径的变化，我们测定了Tg（kdrl：mCherry）中的ISA芽形成：（fli1a：nEGFP）线 （图 2I）。ISA 的生长遵循一系列由血管母细胞尖端细胞从主动脉迁移而发起的定型血管细胞运动，然后是第二个尾随跟踪细胞。一旦领先的血管细胞到达水平肌瘤，它通常分裂和单个女儿细胞移动做多面体形成DLAV[25，51，52]。这个过程导致平均每个ISA芽（图2B）3-4内皮细胞核。塞马3fbca305突变体和异种动物每只血管的内皮细胞数量与野生动物相似（图2J）。sema3fb形态物每艘船的内皮核数也与野生型（S4图）相同，这表明sema3fb的丧失并不影响内皮细胞数。医学论文发表-

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图2。sema3fb 的丢失会中断 ISA 迁移。

A） 来自 25+29 hpf 双转基因 Tg （kdrl：mcherry;fli1a：nEGFP） 内皮细胞 （品红色） 和核 （白色） 的横向共聚焦延时图像。水平肌膜（绿色破折号线）和 DLAV（蓝色破折号线）的位置可突出 ISA 随着时间推移而增长。秤杆，50μm。B） 平均 ISA 芽长度，间隔 30 分钟，从 25/29 hpf： WT vs sema3fbca30525.0 马力，p = 0.474;25.5 hpf p = 0.262;26.0 hpf p = 0.081;26.5 hpf *p = 0.023;27.0 hpf p* = 0.020;27.5 hpf **p = 0.030;在 28.0 hpf **p = 0.008;在 28.5 hpf **p = 0.007;在 29.0 hpf *p = 0.024。C-E） ISA 迁移速度的量化（μm/min）。C） 在 26×27 hpf WT = 0.15 μm/min 和sema3fbca305= 0.12 μm/min，p = 0.157。D） 在 27×28 hpf WT = 0.19 μm/min 和sema3fbca305= 0.13 μm/min，*p = 0.020。E） 在 28×29 hpf： WT = 0.16 μm/min 和sema3fbca305= 0.19 μm/min， p = 0.461.B-E） N = 2;WT = 7 个胚胎 （n = 33 ISA） 和sema3fbca305? 7 个胚胎 （n = 35 个 ISA），未修复的 t 测试与韦尔奇的校正。F-H） 以 1 小时间隔从 DA 领先血管细胞距离。F） 在 27 hpf 平均距离 DA： WT = 55.12±14.06 μm 和sema3fbca305= 47.18±5.75 μm， *p = 0.030.G） 在 28 hpf 平均距离 DA： WT = 71.57±15.47 μm 和sema3fbca305= 55.47±9.65 μm， ***p = 0.0008.H） 在 29 hpf 平均距离 DA： WT = 85.19±18.03 μm 和sema3fbca305= 68.36±16.64 μm， **p = 0.008.F -H） N = 1： Wt = 4 胚胎 （20 ISA） 和sema3fbca305? 3 个胚胎 （15 个 ISA），未修复的 t 测试与韦尔奇的校正。I） 30hpf 双转基因 Tg （kdrl： mcherry;fli1a：nEGFP） 内皮细胞 （ECs、 品红色） 和核 （白色） 的横向共聚焦图像。注意到EC核团块（蓝色箭头/箭头）。秤吧，100μm。插图：示意图显示测量 EC 核之间距离的方法，并突出显示 ISA 中的 EC 核团。J） 每个 ISA 的 EC 核（血管细胞）数量为 30 hpf。Wt （平均 3 核 / ISA）， 异质 （het） sema3fbca305/+（3 核/ISA） 和同源 （霍姆） sema3fbca305（3 核/ISA）。K） 以 30 hpf 的速度量化每个 ISA 的内皮间核间距。Wt （平均 28 ± 13 μm）， 赫特sema3fbca305/+（23±13μm）和霍姆斯马3fbca305（22±14 μm），***p = 0.0002 和***p<0.0001。L） 以 30 hpf 的速度量化每个 ISA 的平均区域 EC fli1a：nEGFP 正核 （血管细胞） 。WT （平均 49±18 μm2）， 赫特· 塞马 3fbca305/+（平均 60±24 μm2）， 和霍姆塞马 3fbca305（平均 56±23 μm2*p = 0.0069 和 ****p<0.0001。I-L） N = 3;Wt = 14 个胚胎 （n = 138 个 Isas）， 赫特· 塞马 3fbca305/+? 19 个胚胎 （n = 190 个 ISA）， 和 homsema3fbca305? 11 个胚胎 （n = 110 ISA），。双向 ANOVA Tukey 的多个比较测试错误栏 = ±SD。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009769.g002

然而，对内皮核之间的距离的分析表明，sema3fb突变体（图2I和2K）的内皮细胞核之间的间距显著缩小。间距缩小使核团的外观。水平肌素下方的夹板位置与 ISA 的宽度增加（图 1H）相关。我们还发现，内皮核在突变体中比野生类型对照组大得多，平均为49μm2野生类型到 60 μm2异质和同源突变体 （图 2L）。核大小的增加也观察到在sema3fb变形剂（S4图）。综合起来，这些数据表明sema3fb突变芽具有正确的细胞数量，可以沿着正确的路径迁移，但不会迁移到野生类型的芽。到30hpf时，停滞的生长会破坏ISA拉长，导致细胞畸形和核形态。

sema3fb突变体显示持久性纤维

由于 Sema3F 信号控制作用于动态，我们推断血管母细胞迁移缺陷也可能伴随着纤维电图活性的变化。当 ISA 开始以 28 hpf 连接时，通过称为气肿的流程，富含纤维素的投影决心允许稳定的船舶连接形成专利 DLAV。在sema3fb 中ca305突变体，一小部分ISA可以达到和连接形成DLAV由30马力夫（图1G）。为了确定Sema3fb的损失是否会影响船舶连接过程，我们注射了野生类型和sema3fbca305具有内皮特异性 F - actin 记者的突变体， Tol2（fli1埃普Lifeact-EGFP），其中丝状作用素（F-actin），细胞骨骼的主要成分，被标记为GFP，以可视化迁移内皮细胞上的纤维电图（图3A和S5）。我们选择了 GFP 阳性 ISA 芽，这些芽已达到 DLAV 水平，并在水平肌膜上方但 DLAV（S5 图） 下方进行测定，以捕获每个 ISA 上段的纤维电图投影。一旦ISV从大约28马力夫连接起来，这些纤维电图应该会迅速消失。在阶段匹配的胚胎中，从28-30马力的马赛尔标记芽的延时共聚焦成像显示，野生型芽在首次到达DLAV时有纤维素，但随着细胞的发光，随着细胞的发光，一旦与相邻的血管连接，纤维数逐渐减少（图3B和S5）。在28hpf，野生类型和sema3fb突变体有相同数量的菲洛波迪亚每ISA（平均9菲洛波迪亚）。到29hpf，野生类型芽平均有5个纤维，而sema3fb突变体有7个。到30hpf时，野生类型中平均仍有4个纤维，而sema3fb突变体保持与较早时间点（图3B和3C）相当的数字。这些数据表明，在到达DLAV的少数sema3fb突变体的芽中，细胞不能在适当的时候限制纤维素的形成。

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图3。sema3fb 突变体在经点 ISA 中显示异常和持久的纤维电图。

A） 躯干血管的横向图像与马赛克内皮表达的转基因 fli1ep： Lifeact-EGFP 突出显示作用素 （绿色） 和内皮细胞质使用 Tg （kdrl：mcherry; 白色） 在 ISA 在 30 hpf.标记了 DLAV 间隙（蓝色星号）和截断的 ISA 芽（黄色箭头）。插图显示单个 ISA 的放大视图，其 Lifeact-EGFP 表达已达到 30hpf 的 DLAV 水平。秤吧，100μm。B） 代表从 28/30 hpf 的延时成像中拍摄的静止图像。在跨越ISA的内皮细胞中，用马赛克Lifeact-EGFP（绿色）放大的舞台匹配胚胎的静止图像，在野生类型和sema3fb中达到DLAV水平28马力夫ca305胚胎。内皮细胞质以红色 Tg（kdrl：mCherry）显示。白色箭头表示在连接 DLAV 下方盒装区域内的 ISA 芽时存在纤维素。C） 从指示基因型胚胎的 28 30 hpf 中量化 ISA 上 Lifeact-EGFP 阳性纤维素的数量。N = 3： Wt （14 EGFP 阳性 ISA/ 30 ISA 总计， 6 个胚胎， 平均值 4 菲洛波迪亚/ISA） 和同源 sema3fbca305（18 EGFP阳性ISA/35s ISA总计，7个胚胎，平均7个菲洛波迪亚/ISA）。未修复的 t 测试与韦尔奇的更正， * p = 0.03 和 ***p = 0.0002 。错误栏 = ±SD。医学论文发表-

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009769.g003

在sema3fb突变体中更改 VEGF 信号

为了研究控制sema3fb下游迁移的分子机制，我们通过Taqman RT-qPCR测定了FACS分类Tg（kdrl：mCherry）野生型和sema3fb突变内皮细胞中的基因表达。我们分析了一组调节血管生成发芽的关键内皮细胞标记（图4A和S6）的表达。对FACs分类的内皮细胞的分析显示，与对照组相比，vegfr2/kdrl增加了4.3倍，sema3fb突变内皮细胞的dll4增加了2.3倍。对照转基因Tg（kdrl：mCherry）的荧光强度，也显示活体sema3fb的麦切里荧光显著增加ca305突变体（S6 图） 。我们发现在2 或锯齿状 1a或蔬菜 2配体素食表达 （图 4A）方面没有显著差异。令人惊讶的是，我们还发现诱饵受体可溶性蔬菜1/可溶性flt1（sflt1）在突变体中的表达与对照组（图4B）相比显著增加近3倍。作为一个独立的实验，我们用定量荧光ISH（FISH）（图4B和4C）确认了突变体中受调节的蔬菜2和sflt1表达。接下来，我们检测了磷-ERK（pERK）的表达，这是VEGF在血管发芽中发出信号的下游效应器。虽然野生类型和突变体（图4D和4E）之间具有正pERK信号的ISA数量没有差异，但我们发现，突变ISV血管母细胞（图4D和4F）中PERK阳性EC核的荧光强度显著增加，这支持了ECs（图4D和4E）中Vegfr2通路活性的增加。这些数据表明，Sema3fb的丧失导致内皮细胞中VEGF-通路促进（vegfr2/dll4）和VEGF抑制（sflt1）基因的上位调节，这可能导致血管母细胞迁移中断。

图4。sema3fb突变体增加了 VEGF 受体的表达和活动。

A） 野生类型和sema3fb中的关键内皮标记的 RT-qPCR 分析ca305FACS 分离 Tg （kdrl：mcherry） 正内皮细胞在 26hpf （插入） 。N = 2， 双向 ANOVA Tukey 的多个比较测试， *p = 0.0184， **p = 0.0021， 和 ***p <0.0001 （请参阅S3 表了解折叠更改详细信息）。B） 荧光HCR原位30马力夫全安装野生类型和胚胎sema3fbca305胚胎。代表图像显示 DA 和 ISA（破折号白色轮廓）中的vegfr2（白色）和 sflt1 （红色） mRNA 成绩单的刺破重叠表达。C） 在 ISA 和 DA、野生类型 （WT、 n = 3 胚胎、 15 ISA） 和sema3fb中原位像素密度的 HCR 量化ca305（n = 3 个胚胎， 15 个 ISA）， 未修复的学生的 t 测试与韦尔奇的校正 Wt vs. sema3fbca305： vegfr2 *p = 0.047 和sflt1 * p = 0.036 。D） WT 和sema3fb中磷酸盐 （pERK） 的全安装免疫染色ca305胚胎固定在30马力。代表图像显示Tg （kdrl：mcherry）正 ISA （紫色） 和 perk 正 Ecs （绿色） 。插图：pERK 正 ISA 使用kdrl进行跟踪：mcherry表达式（虚张声势的白线）和破折号椭圆形轮廓突出显示每个 ISA 内带有 pERK 污渍的单个 EC。E） pERK 正 ISA 数量为 30hpf。F） 胚胎中平均 pERK 荧光强度的量化，为 30 hpf。D - e） N = 3， Wt （n = 21 个胚胎， 平均 5 perk 阳性 Isas）， 和霍姆齐古斯sema3fbca305（n = 19 个胚胎， 平均 5 pERK 阳性 ISA） 。双向 ANOVA Tukey 的多个比较测试， *p = 0.012。G） Vegfr2抑制时间过程的原理图，胚胎在20马力时用0.1%DMSO或Vegfr2抑制剂进行治疗，并在30hpf的活成像治疗中去除。H） 使用 DMSO 控制处理的 30 hpf 胚胎或 0.2 μM SU5416 的躯干血管（黑色）代表共聚焦图像。标记了 DLAV 间隙（蓝色星号）和截断的 ISA（黄色箭头）。秤吧，100μm。I） 经过处理的胚胎中 ISA 芽的长度为 30 hpf： WT = DMSO （n = 25 ISA，平均值 104±9 μm），WT = 0.2 μm SU5416 （n = 25 ISA，平均值 92±17 μm），sema3fbca305? DMSO （n = 30 ISA，平均值 85±17 μm）和sema3fbca305? 0.2μm SU5416 （n = 30 ISA，平均值 98±11 μm） **p = 0.0039 和 ***p <0.0001。J） 在 DLAV 中以 30 hpf 处理的胚胎中连接的 ISA 芽的百分比。WT = DMSO （n = 25 ISA-DLAV， 5 胚胎， 平均 88±11%）， WT = 0.2μm SU5416 （n = 25 ISA-DLAV， 平均 32±11%）， sema3fbca305? DMSO （n = 30 ISA-DLAV， 平均值 46±16%）， 和sema3fbca305+0.2 μm SU5416 （n = 30 ISA-DLAV，平均 73±10%），**p = 0.0084，***p = 0.0002 和 ****p<0.0001。I-J N = 2;WT+DMSO = 5 个胚胎，WT = 0.2 μM SU5416 = 5 个胚胎，sema3fbca305? DMSO = 6 个胚胎，sema3fbca305? 0.2 μm SU5416 = 6 个胚胎。双向 ANOVA 图基的多个比较测试。错误条 = ±SD。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009769.g004

为了测试sema3fb突变体的血管缺陷是否是Vegfr2活性增加的结果，我们从200/30 hpf（图4G）用0.5μM SU5416（一种选择性Vegfr2抑制剂）治疗了野生类型和sema3fb突变胚胎。据报道，抑制剂治疗的野生类型胚胎发育迟缓芽（未经治疗的野生类型为104μm，治疗野生类型胚胎为50μm），但sema3fb突变体不受影响，芽长没有显著变化（治疗和未治疗突变体的平均长度为82μm;S6 图） 。这表明，与野生类型胚胎相比，sema3fb突变体中蔬菜fr2表达的增加使他们对药理蔬菜fr2抑制的敏感度降低。然而，我们推断，这种抑制剂剂量严重扰乱VEGF信号和血管生长，并可能掩盖更微妙的变化，在芽动力学。因此，我们降低了SU4516浓度到次优剂量，其他人已经使用（低剂量：0.2μM SU5416）诱导最小的血管缺陷（图4H）[53]。不出所料，在野生型胚胎中，低剂量治疗可使芽长从104μm轻微缩短至92μm，ISA与DLAV（图4I和4J）连接的数量减少60%。然而，在sema3fb突变体中，次优 Vegf 抑制显著地挽救了sema3fb突变缺陷。经过治疗的 sema3fb突变体中的 ISA 长度从未经治疗的突变体中的平均 85 μm 增加到 98 μm，将其恢复到与野生类型无法区分的 ISA 长度（图 4I）。DLAV的连接也显著增加，从未经治疗的突变体的46%增加到治疗后的胚胎的73%，这与未经治疗的野生类型相当，并且显著增加，超出了治疗的野生类型。（图4J）。我们还应用了第二个VEGF抑制剂，DMH4在低剂量部分阻止ISA生长[54，55]。与SU4516治疗类似，野生型血管在使用DMH4治疗后长度有所缩短。有趣的是，虽然使用 15 μM 或 25 μM DMH4 的治疗也减少了sema3fb突变体的血管长度，但 ISA 仍能够分别在每种剂量（S6 图）中比经过处理的野生类型血管平均发芽 23 μm 或 35 μm。因此，Vegfr2 活动略有减少可以恢复sema3fb内皮迁移。我们的数据显示，sema3fb突变体中蔬菜fr2表达的增加对芽迁移有功能影响。

讨论

在胚胎发育和平衡期间，必须严格管制Vegf活动[18，5659]。这种控制是精致的，斑马鱼模型已经发现了许多调节层的Vegfr2通路活性在内皮细胞[14，48，60]。在这里，我们发现 sema3fb 为 VEGF 信号提供了额外的控制层。斑马鱼sema3fb mRNA 通过发展树干血管母细胞来表示。Sema3fb 的丢失会阻碍船舶迁移并破坏 ISA 形态，导致原子核被团块化并变大，从而导致 ISA 越来越宽、更短。表达分析显示，vegfr2和dll4的调节和突变内皮细胞的pERK染色强度显著增加。我们还观察到突变内皮中抑制分子svegfr1/sflt1的上调节，这表明sema3fb信号通常也会抑制sflt1表达。综合起来，我们从一个完整的动物模型的结果表明，Sema3fb的行为以自动犯罪的方式来调节Vegf介导的血管生成（模型;图5）。医学论文发表-

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图5。发芽容器中的sema3fb作用模型。

Sema3fb 在血管生成芽形成过程中由内皮细胞表示，并通过自体素机制抑制 Vegfr2 表达，并通过控制 Dll4 表达和凹口信号来维持内皮细胞动力学，以及调节 pERK。sema3fb 的损失增加了 Vegfr2、pERK、Dll4 和 sFlt1 表达。这导致异常细胞形态与更广泛的芽，持久的纤维素和更大的核。核大小的变化和发芽中断表明，Sema3b可能扮演一个角色，以限制Vegf介导的下游pERK信号诱导。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009769.g005

在培养的内皮细胞中，SEMA3F的抗血管效应主要通过SEMA3F与NRP2的竞争结合进行介导，以对抗VEGF诱发的增殖和迁移，如培养的人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）[61，62]和猪主动脉内皮细胞[63]中观察到的。SEMA3F-NRP通路通常也反对在肿瘤模型中的VEGF活性，其中SEMA3F的损失导致总血管过度生长[29，63]。然而，在我们完整的斑马鱼sema3fb功能模型的丧失，我们惊讶地发现，尽管蔬菜fr2基因的调高和Vegfr2活性增加，减少船只生长。我们发现，抑制VEGF信号被拯救的内皮迁移，表明Vegf信号的调高有助于观察到表型。有趣的是，sema3fb突变体发育迟缓的芽形态也反映了为抑制分子sflt1 [58]的功能增益而报告的表型。普莱辛-塞马福林信号是复杂的，在细胞中存在多个共同表达的配体和受体，可以调解添加剂或对立效应。斑马鱼中Sema3f的普列辛受体尚不得而知，但在细胞培养中，Sema3F与普莱辛A家族受体结合。PlexinD1 是小鼠中其他 Sema3 （Sema3A， Sema3E） 的主要内皮细胞受体，丢失时具有旺盛的血管生成发芽表型。鱼sema3fb突变表型似乎与普莱辛德 1功能丧失相反[22，52]。此外，sema3fb和plexind1都调节诱饵受体sflt1 的表达，但在相反的方向上，表明其信号在共同的下游路径上具有相反作用，以微调血管生成。

据报道，VEGF活性的增加，既自相矛盾地增加了通过Dll4的亲血管生成信号，也增加了抗血管生成分子的表达，如细胞培养模型中的sFlt1[53]。如果过度的 VEGFR-2 刺激报告会增加 HUVEC 中的 sFLT1 表达，以限制不当的船舶生长[64，65]。如果这种反馈调节也在斑马鱼中发挥作用，那么减少sema3fb突变体中的过度 Vegfr2 活性将有望降低 sFlt1 水平，从而允许发芽发生。从我们的表达分析结果中可以明显看出，停滞的容器表型是来自 Vegf 信号（上调的vegfr2和 pERK）的增加还是抑制的 Vegf 信号（增加sflt1）。虽然我们证明减少Vegf信号可以挽救血管细胞迁移缺陷，但我们缺乏测试sFlt1蛋白质水平的工具，除了我们可以在这里测量的mRNA水平之外，sFlt1的蛋白质水平可能有独特的调节。sFlt1蛋白可能有助于我们观察到的表型，而我们无法在体内评估。例如，配体（Sema3f）、受体（Nrp和Plexin）和共受体（Nrp2，注意这也是发芽的内皮细胞中的Vegfr2共受体）的相对丰度可能会影响内在信号响应。增加的 sflt1 mRNA 可能导致 Vegfr2 上行下游的 sFlt1 蛋白质表达增加，类似于 HUVEC 细胞[64]中观察到的。然而，增加的mRNA可能不会导致蛋白质的增加，蛋白质亚细胞本地化也可能在信号中发挥作用。例如，Vegf 直接控制 PlexinD1 的表达，以空间限制视网膜粘膜模型中对 Sema3e 的内皮尖端细胞响应[24]。此外，在细胞培养模型中，细胞前缘的SEMA3F表达可能影响HUVECs的方向尖端细胞迁移[61，66]。

信号素传统上对控制容器图案起指导作用。有趣的是，Sema3fb 的丢失不会影响早期血管生成期间的空间制导。这要么表明Sema3f信号通过不同的受体发出信号，要么是斑马鱼中PlexinD1的几个配体之一，其他配体传达空间指导信息。事实上，Sema3A 和 Sema3F 在 HUVECs[36]中的协同作用表明，配体的组合更有效地对抗 VEGF 介质迁移，因此多个 Sema3s 可以控制斑马鱼树干中芽的生长和轨迹[67]。对小鼠和斑马鱼的研究表明，对VEGFR2的抑制会导致内皮细胞拉长和血管连接所需的行动肌霉素收缩性调节不良[68，69]，类似于我们在sema3fb突变体中观察到的表型。SFLT1 对 VEGF 的封存进一步降低了细胞反应，以限制内皮细胞大小和作用重新排列[70]72]。

在培养细胞中，外源性SEMA3F通过破坏mTOR-RHOA/GTPase轴[30]来控制F-actin/应力纤维的形成、细胞大小和拉长。虽然斑马鱼的发芽是可有可无的，但将F-actin组装成纤维素会影响内皮细胞进入相连的血管床的速度、迁移方向和厌食症[73，74]。我们观察到，纤维多发性持续在sema3fb突变体（即异常稳定）。因此，sema3fb 的丢失可能会阻碍破坏纤维素和血管麻醉的途径，可能因潜在的行为素组装缺陷而受阻。这符合Semas在调节细胞大小和细胞骨骼崩溃方面的经典定义[11，75]。我们的数据适用于 Sema3fb 在 ISA 芽的初始形成和早期拉长中的作用。在以后的开发中，RhoA 依赖机制[76]控制动脉流明直径并针对 Vegf 生物可用性和 SFlt 本地化的变化进行改造。因此，Sema3fb在调节结构容器适应方面可能具有额外的作用：然而，我们无法确定Sema3fb突变体的血管形态的后期变化，因为它们在这个阶段恢复。

在这里，我们展示了一个自动犯罪的作用，为Sema3f调节Vegf功能在体内。我们的数据共同表明，Sema3fb 的作用是限制正 （Vegfr2） 和负 （sFlt1） 信号，允许内皮细胞采用适当的信号水平下游 Vegfr2 （图5）。我们的数据突出了停止信号的微妙平衡，这些信号可以切换船舶生长所需的内皮迁移活动。这项工作共同提供了对如何利用上下文依赖的Sema3F调制Vegf的内皮反应来治疗血管疾病的见解。

材料和方法

道德声明

所有动物程序均得到卡尔加里大学动物护理委员会（AC17-0189）的批准。麻醉和安乐死使用MS-222（三甲苯）在100毫克/升。 原始数据的基础，所有图表在手稿中可以找到S1数据。

斑马鱼菌株和维护

野生型图普费尔长鳍（TL）斑马鱼或转基因Tg（-6）。5kdrl：米切里）ci5， Tg （fli1a：negfp）y7 [50]，塞马3faca304 [35]， 和s ema3fbca305 [43] 用于实验。胚胎在10分钟内采集，在E3胚胎介质（E3）中28.5°C孵育，并在受精后数小时（hpf）内进行。内源性色素沉着被抑制从24马力夫添加0.003% 1苯基-2硫化物（PTU，西格玛奥尔德里希，圣路易斯，MO）到E3。为了基因型，组织在失明成像后从单个30马力夫胚胎中采集。基因组DNA在50微升50mM NaOH中提取，煮沸10分钟，缓冲1/10体积100mM Tris-HCl pH 7.4， 如[77]中描述的， 并由 Pcr 放大 （如[43]描述） 使用以下引物： sema3fb向前 （5'- ATTCCCACAAATAACATC-3'） 和sema3fb反向 （5'-GTACTCTGTATGATCCGC-3'）。

莫福利诺和飞：生命注射

莫弗利诺斯 （MO） 对塞马 3fb开始科登 （塞马 3fb）ATG;Atg 强调） 5 '-猫阿加特克卡加加卡格特格 - 3' 和反对tnnt2a开始科顿 （tnnt2a）ATG， ATG 强调） 5'- CATGTCTCTCTGACCCACA-3' 是从基因工具有限责任公司（科瓦利斯，或，美国）获得的。莫福利诺斯被注射到一到四细胞阶段胚胎在推荐剂量指南在1ng/胚胎[78，79]。对于 Lifeact 的内皮特定表达，使用 Fli1 构建的 Tol2 构造埃普推动生命行动 - EGFP 表达的推广者， fli1埃普Lifeact-EGFP [73]，被注射到单细胞阶段胚胎在20 ng/μl质粒与25 ng/μl Tol2转位酶RNA。医学论文发表-

FAC 排序、RNA 隔离和 RT-qPCR

对于FACS分析，24 hpf Tg（kdrl：mCherry）野生类型或突变胚胎根据[80]受到单细胞分离。简言之，胚胎用无钙环液洗过一次，轻轻搅动5次，然后加入分离溶液，在28.5°C的水浴中孵育，摇晃和周期性三伏20~30分钟。反应停止，离心，并重新悬浮在杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐水（GE医疗保健生命科学，洛根，犹他州，美国），离心和重新悬浮溶液。单细胞悬架采用 75 μm 过滤，然后是 35 μm 滤镜。细胞被分类与BDFACSARIA III（BD生物科学，圣何塞，美国）和收集。来自 24hpf 整个胚胎或 FACS 分拣细胞的总RNA使用 miRNeasy 迷你套件 （Qiagen） 进行分离。每个样本中总RNA的500 ng使用超级Script III第一链合成超级混合（18080×400）反向转录成cDNA;英维他根）。cDNA在5ng/10ul的最后反应被用于TaqMan快速高级大师混合（热费舍尔科学，马萨诸塞州，美国）。使用 QuantStudio6 实时系统（热费舍尔科学）对反应进行了测定。斑马鱼特定的塔克曼测定（热费舍尔科学，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）使用： 蔬菜 （猫 # 4448892， 克隆 ID： Dr03072613_m1）， kdrl （vegfr2） （4448892， Dr03432904_m1），dll4 （4448892，Dr03428646_m1）， 2 （4448892， Dr03436779_m1）， jag1a （4448892， Dr03093490_m1）， sflt1 （4331448， ADP47YD4） 和正常化到β行动 （4448489， Dr03432610_m1）.[Ct 方法用于计算三重测量中目标基因的正常化相对表达水平。除非另有说明，否则独立重复实验三次。

药物治疗

对于 Vegfr2 抑制，DMSO 中的 200 μM SU5416（西格玛#S8442）库存溶液（西格玛#D8418）或 DMSO 中的 100 μM DMH4（西格玛#8696）库存溶液被稀释为鱼水中的工作浓度。对于 SU5416 最终浓度 0.2 μM SU5416 和 0.5 μM 在 0.1% DMSO 中使用[53，56，81]中描述。对于 DMH4 15 μM 和 25 μM 在 0.1% DMSO 中使用[54，55]中描述。胚胎治疗从20至30马力，以目标ISA和DLAV血管生成。Wt 和同质的sema3fbca305在接受SU5416或DMH4和控制（0.1%DMSO）治疗之前，突变胚胎被手动解压，使用两种基因型的常见解决方案。

就地杂交和免疫染色

所有胚胎均固定在PBS中4%的副甲醛中，0.1%的Tween-20在4°C过夜，100%甲醇在+20°C。

对于色度原位杂交 （ISH） Digoxigenin （DIG） 标记的反感性RNA探头使用 SP6 或 T7 RNA 聚合酶（瑞士巴塞尔罗氏）合成。迪戈西根宁RNA探针产生于质粒模板（sema3fa-pCR4，线性与PmeI）（sema3fbpCR4，线性与诺蒂）。按[82]描述的全蒙和原位杂交部分进行了一些小的修改：杂交缓冲器梯度变化的步骤：2 x SSC：和 0.2 x SSC：PBST 在 70°C 和 0.2 x SSC 在 37°C 下执行。 NBT/BCIP 的使用比率分别为 2.5/3.5μl/ml。染色胚胎被转移到微中心管中，固定在4%的副甲醛（PFA）中，并在成像前用1 x PBST清洗。对于树干的横向部分，跟随整个山ISH胚胎嵌入在JB4介质（波利科学，沃灵顿，宾夕法尼亚州）。简言之，胚胎在4°C的4%PFA中固定过夜，在PBS中清洗，在100%的ETOH中脱水。脱水后，胚胎被浸泡在渗透溶液（2-羟基甲基丙烯酸酯/过氧化苯甲酰），直到它们沉入管底，然后转移并放置在充满嵌入溶液（渗透到N-Dimethylaniline）的模具中，允许在一夜之间硬化，并使用Leca微原子在7μm处切除。

对于原位杂交的杂交链反应 （HCR），从分子仪器（加利福尼亚州洛杉矶）获得可溶性 Flt1（针对基因的独特区域）和 VEGFR2 的定制探针。原位染色反应是制造商推荐的。

对于抗体染色，胚胎在50：50丙酮/甲醇中渗透20分钟，在室温下补充水分，然后在PBST10%的正常羊血清中阻塞1%的三聚氰化物，在原发抗体4°C下孵育至少48小时。拉米宁免疫染色（1：400，西格玛-奥尔德里希，密苏里州，美国），米切里（1：200，发展研究杂交银行， 美国爱荷华市）和磷化物（pERK）（1：500，细胞信号43701：Danvers，MA，美国）被检测出与鼠标抗mCherry抗体，（1：500，克朗泰克，山景，加利福尼亚州，美国），并检测出与亚历克萨夫卢尔555或488二级抗体（1：500：在 RT 中，以 5% NSS/PBST/0.1% 三顿为 1 小时。

图像采集和测量

对于整个山成像，胚胎在0.004%的Tricaine（西格玛）中被固定，在玻璃底盘（马特克，阿什兰，MA）上安装在0.8%的低熔化糖。在蔡司 LSM 700 倒置显微镜上收集了共聚焦图像。在 Zen Blue 2012 软件中收集和处理了相距 1+3 μm 的切片，并作为最大强度投影（z 堆栈，每个胚胎/图像共 10×15 片）进行呈现，并使用 FIJI/ImageJ[83]进行分析。

对于延时，z 堆栈每 10 到 30 分钟获得 5 小时，从 25 hpf 29 hpf 起。ZEN Blue 2012 软件用于提取时间点，图像处理/测量使用斐济 （ImageJ） 执行。

除非另有规定，否则对每个胚胎至少8个ISA进行了ISA测量。ISA 长度测量是使用分段线工具沿着容器从主动脉边缘到喷口的前沿进行。要计算所连接的百分比，每个 ISA 连接到其相邻的芽被计算并表示为 ISA 计数总数的百分比。对于 ISA 芽直径，在水平肌肽边界测量了 5 个芽。对于 DA 和 PCV 测量，沿 DA 和 PCV 进行了 5 次测量，直接位于蛋黄扩展上方的 ISA 下方。对于内皮细胞核间距，从每个细胞核的中间到下一个核进行了 2 次测量。为了测量荧光 kdrl：mCherry 强度，使用公式计算总荧光 （TF= 综合密度 +（选定单元 X 平均背景读数的区域）。通过追踪蛋黄延伸上方的 5 台 ISV 来对测量区域进行封闭。

对于血管细胞迁移和 ISA 速度计算，分析来自从 25 hpf 29hpf 以 30 分钟间隔获得的图像。随着时间的推移，每个胚胎（如上文所述）在每个提取的时间点测量了5个ISA。对于 ISA 迁移速度，以 1 小时间隔比较 ISA 长度的变化， 25 （T1） = 26 （T2） hpf， 26 （T2） - 27 （T3） hpf， 27 （T3） + 28 （T4） hpf， 和 28 （T4） + 29 （T5） hpf， 旅行距离是使用公式距离 + 结束长度 （μm） + 开始长度 （μm） 计算的。（例如，距离从 25+26 hpf = T2 长度 = T1 长度）。每个间隔的 ISA 迁移速度是使用公式速度 +距离 （μm） /时间 （最小） （参见S1和S2表） 计算的，对于铅血管母细胞迁移，从 DA 的 fli1a：nEGFP 正核距离以 1 小时间隔从 2+5 29 hpf 测量。

统计学

所有用于量化的数据集（定性评分或绝对测量）都被盲目分析。结果表示为 SD ±平均值。所有统计分析均使用棱镜 7 软件（图形垫）执行。所有统计测试都使用了未修复的非参数测试，或者使用韦尔奇校正的学生 T 测试来比较两个样本，或者使用 Kruskal-Wallis 测试进行双向 ANOVA，用于多个样本之间的比较。

支持信息

sema3f expression and sema3fa mutant phenotype.

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S1 图。sema3f 表达和 sema3fa突变表型。

A） 从 26-30hpf 中对全坐式 ISH 的横向视图显示腹腔横向声质中的sema3fa表达和主动脉 （DA） 和分界动脉 （ISA） 中的sema3fb表达。HM：水平肌肽。B） 在 28hpf 的树干横向部分表达sema3fa和sema3fb。sema3fa以腹腔和横向声质 （箭头） 表示，而 sema3fb 在 DA（箭头）、神经管 （nt）、诺乔德 （nc） 中强烈表达。C） 30hpf 控制野生类型 （WT） 的躯干血管 （黑色） 的横向共聚焦图像， 同源sema3faca304和sema3fbca305突变胚胎有和没有注射 1ng sema3fb阿格莫.秤吧，100μm。n/N = 有血管缺陷的胚胎数量/胚胎总数。D） WT 中 ISA 芽的长度，sema3fb阿格莫变形剂和sema3fb ca305击倒胚胎与sema3fb阿格莫在30马力：N = 1， Wt = 2 胚胎 （10 ISA， 平均 105± 7 μm）， sema3fb阿格莫? 5 个胚胎 （25 个 ISA，平均值 78± 20 μm），和sema3fbca305 + 塞马3fb阿格莫5 个胚胎（25 个 ISA，平均 87± 15μm），***p<0.0001。E） WT 和sema3fa中 ISA 芽的长度ca304突变和sema3fb ca304胚胎与sema3fb阿格莫在30马力：N = 2， 6 胚胎每组： Wt （30 ISA， 平均 109± 7 μm）， sema3faca304（28 ISA，平均值 106±9 μm）和sema3faca304 + 塞马3fb阿格莫（30 ISA，平均91±17μm），***p<0.0001。单向 ANOVA 图基的多个比较测试。错误栏 = ±SD。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009769.s001

（蒂夫）

S2 图。Sema3fb血管缺陷的损失与血液流动无关。

A） 30hpf 下层压染色胚胎的圆对角图像。Tg （kdrl： mcherry） 内皮 （红色） 和层压素 （绿色） 。胚胎来自异质性sema3fbca305/+内克罗斯。B） ISA 芽的长度定量为 30hpf， N = 1： 野生类型 （WT） （40 ISA， 4 胚胎， 平均 102± 1 μm2）， sema3fbca305/+（120 ISA，12个胚胎，平均值90±8μm2）， 和sema3fbca305（150 个 ISA，15 个胚胎，平均值 90± 14 μm2).C） 血流停止tnnt2ATG-MO 注射野生类型兄弟姐妹 （WT） 和sema3fb中躯干内皮 （黑色） 的共聚焦横向图像ca305突变 体。标记了 DLAV 间隙（蓝色星号）和截断的 ISA 芽（黄色箭头）。秤吧，100μm。D） ISA 芽的长度为 30 hpf， N = 3： WT （80 ISA， 8 胚胎， 平均长度 106±3 μm）， WT = tnnt2a阿格莫（100 ISA，10个胚胎，平均98±8.4μm），sema3fb） ca305（80 ISA，8个胚胎，平均86±17μm），和sema3fbca305 + tnnt2a阿格莫（100 个 ISA，10 个胚胎，平均 85± 22 μm）。E） 在 Dlav 上连接的 ISA 百分比为 30 hpf， N = 3： Wt （平均 82±9% 连接）， Wt = tnnt2a阿格莫（平均 86±7% 连接）， sema3fbca305（80 ISA，8个胚胎，平均54±15%连接），和sema3fbca305 + tnnt2a阿格莫（平均 54±16% 连接）。F） 在 30 hpf 胚胎中对 DA 宽度的量化， N = 3： WT （8 个胚胎， 每个胚胎 5 次测量 / n = 40 次总计， 平均宽度 18± 3 μm）， WT = tnnt2aATG-MO （10 个胚胎， 每个胚胎/n 50 个测量值， 平均 9± 1 μm），sema3fbca305（8 个胚胎，每个胚胎/n = 40 个总数 5 个测量值，平均 11± 3 μm）和sema3fbca305 + tnnt2a阿格莫（10个胚胎，每个胚胎5个测量/n = 50个总数，平均10±1μm）。G） 30 hpf 胚胎中 PCV 宽度的量化， N = 3： WT （n = 40， 平均宽度 22±3 μm）， Wt = tnnt2a阿格莫（n = 50， 平均 19±4 μm）， sema3fbca305（n = 40， 平均 20± 3 μm）， 和sema3fbca305 + tnnt2a阿格莫（n = 50，平均 19±4 μm）。双向 ANOVA Tukey 的多重比较测试，*** 表示 p = <0.001。错误栏 = ±SD。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009769.s002

（蒂夫）

S3 图。Sema6b 突变体恢复 48 hpf 。

A） 代表 48 hpf 控制野生类型 （WT） 的躯干血管 （黑色） 的横向共聚焦图像， 异质sema3fbca305/+和同源sema3fbca305突变胚胎，在血管形态或段性血管（Se）连接方面没有明显差异。秤吧，100μm。SIV = 亚肠道静脉 （丛）， DA = 多萨尔主动脉， PCV = 后考达尔静脉， CA = 考达尔动脉， CV = 考达尔静脉。N = 2， n： Wt = 5，塞马3faca305/+= 5， 和sema3fbca305? 7.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009769.s003

（蒂夫）

S4 图。sema3fb形态内皮核表型。

A） 25.5+28.5 hpf 双转基因 Tg （kdrl：mCherry;fli1a：nEGFP） 内皮细胞 （品红色） 和核 （白色） 的延时图像。水平肌肽（绿色虚线）被注意到，以突出ISA增长随着时间的推移。秤杆，50μm。B） 在 25/26 hpf 间隔内，野生类型和突变胚胎的速度没有显著差异，请参阅S2 表了解详细信息。C） 铅血管母细胞平均距离 DA 在 25 hpf： WT = 44.47±8.36 μm 和sema3fbca305= 43.14±6.84 μm， p = 0.609.D） 铅血管母细胞在 26 hpf 平均距离 DA： WT = 55.12±14.06 μm 和sema3fbca305= 47.18±5.75 μm， p = 0.572.C-D） N = 1： WT = 4 胚胎 （20 ISA） 和sema3fbca305? 3 个胚胎 （15 个 ISA），未修复的 t 测试与韦尔奇的校正。E） 双转基因Tg（kdrl：mCherry;fli1a：nEGFP）内皮（红色）和内皮细胞核（绿色）的横向共聚焦图像。注意到 DLAV 间隙（蓝色星号）和截断的 ISA 芽（白色箭头）。胚胎来自异质性sema3fbca305/+内克罗斯。秤吧，100μm。G） 在 30 hpf 胚胎中，N = 2： WT（6 个胚胎，平均值 3 个核/ISA）和sema3fbMO（7 个胚胎，平均值 3 个核/ISA）中每个 ISA 的内皮细胞核数量的量化。未修复的 t 测试与韦尔奇的更正， p = 0.17 。G） 在 30 hpf 胚胎中，N = 3： WT（60 个 ISA，6 个胚胎，平均值 42±16 μm）中每个 ISA 的平均内皮细胞核面积的量化2）， 和sema3fbMO （70 ISA， 7 胚胎， 平均 61±19 μm2).未修复的 t 测试与韦尔奇的更正， ***p<0.0001。错误栏 = ±SD

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009769.s004

（蒂夫）

S5 图。sema3fb突变体显示异常和持久的纤维。

A） 代表仍然图像的单细胞表达的fli1ep： 生命act-EGFP（绿色）在ISA内皮细胞从28-30hpf野生类型和sema3fbca305胚胎延时成像。虚线白线表示水平肌肌，在白色框中突出显示纤维电图计数的选定区域。B） 从所指示基因型的胚胎中，以 28hpf 对 ISA 上的 Lifeact-EGFP 阳性纤维素进行量化。未修复的 t 测试，p = 0.3566。C） 从指示基因型的胚胎中，以 29hpf 对 ISA 上的 Lifeact-EGFP 阳性纤维素数量进行量化。未修用 t 测试，p = 0.0029。D） 从指示基因型的胚胎中，以 30hpf 的速度量化 ISA 上的生命特性 -EGFP 阳性纤维素数量。N = 3 用于每个量化： Wt （14 ISA， 6 个胚胎， 平均值 3 菲洛波迪亚 / ISA） 和同源 sema3fbca305（18个ISA，7个胚胎，平均8个菲洛波迪亚/ISA）。未修复的 t 测试， p = 0.0002。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009769.s005

（蒂夫）

S6 图。VEGFR抑制剂与sema3fb突变体发芽之间的相互作用。

A） 调节血管生成发芽的信号通路模型，突出控制尖端和跟踪细胞身份的关键基因。B） 野生类型和sema3fb中 Tg （kdrl： mcherry） 转基因表达水平的量化ca305ISA 在 30hpf。N = 3： 野生类型 （n = 13 个胚胎， 平均 6500 a.u.） 和sema3fbca305（n = 14 个胚胎，平均为 8400 a.u.）。带韦尔奇校正的 T 测试， *p = 0.0186， a. u. = 任意强度单位。C）.B） 荧光HCR原位为蔬菜2和sflt1RNA成绩单在全安装野生类型和胚胎sema3fbca305胚胎固定在30马力。D） WT 和sema3fb中磷酸盐 （pERK） 的全安装免疫染色ca305胚胎固定在30马力。E） 用 0.5 μM SU5416 从 20hpf-30hpf 处理的胚胎中躯干血管 Tg （kdrl：mCherry） （白色） 的横向共聚焦图像。DLAV 间隙（蓝色星号）和 ISA 截断芽（指示水平肌肽水平处的黄色冲线）。秤吧，100μm。F） 用 0.5 μM SU5416 处理的 30 hpf 胚胎中 ISA 发芽长度的量化， N = 1： WT + DMSO （25 ISA， 5 胚胎， 平均值 107±8 μm）， WT = 0.5μM SU5416 （25 ISA， 5 胚胎， 平均值 50±14 μm）， sema3fbca305? DMSO （30 ISA， 6 胚胎， 平均值 82±17 μm）， 和sema3fbca305+0.5μM SU5416 （30 ISA， 6 胚胎， 平均值 82±19 μm）.。G） 在 DLAV 中连接在 30 hpf 胚胎中的 ISA 芽百分比，用 0.5 μM SU5416 处理， N = 1： WT + DMSO （25 ISA-DLAV， 5 胚胎， 平均 78% 的 ISA-DLAV/胚胎）， WT = 0.5 μM SU5416 （25 ISA-DLAV， 5 胚胎， 平均值 78%）， sema3fbca305? DMSO （30 ISA-DLAV， 6 个胚胎， 平均值 51%）， 和sema3fbca305? 0.5 μM SU5416 （30 ISA-DLAV， 6 胚胎， 平均值 82±19%）。错误条 = ±SD. H） 用低剂量的 DMH4 μM SU5416 从 20hpf-30hpf 处理的胚胎中躯干血管 Tg （kdrl：mCherry） （白色） 的横向共聚焦图像。ISA 截断芽（指示水平肌肽水平处的黄色冲线）。秤杆，50μm。I） 用 15 μM DMH4 处理的 30 hpf 胚胎中 ISA 芽的长度量化，J） 用 25 μM DMH4 处理的 30 hpf 胚胎中 ISA 芽的长度量化。I-J） N = 1;WT+ DMSO n = 3， 15 ISA， 平均 （ave.） 102±9 μm;WT+ μM DMH4 n = 2， 10 ISA， ave. 17±17 μm;WT+ 25 μM DMH4 n = 3， 15 ISA， ave. 7±8 μm.塞马3fbca305? Dmso = 3， 15 Isa， ave. 87± 18 μm， sema3fbca305? 15 μM DMH4 n = 2， 10 ISA， ave. 40±16 μm;塞马3fbca305? 25 μm DMH4 n = 3，15 ISA，32±13 μm。单向 ANOVA Tukey 的多次比较测试， * 表示 + p = 0.012， ****p = <0.0001。错误栏 = ±SD。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009769.s006

（蒂夫）医学论文发表-

S1 表。不同时间间隔的 ISA 长度。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009769.s007

（多克克斯）

S2 表。血管喷发迁移距离和速度。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009769.s008

（多克克斯）

S3 表。定量 PCR 表示折叠更改数据。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009769.s009

（多克克斯）

S1 数据。手稿中所有图表背后的原始数据。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009769.s010

（XLSX）

确认

我们感谢李坤方为我们提供了飞来飞去：GFP结构。我们感谢卡尔加里大学FACS核心在细胞分拣方面给予的帮助。我们感谢苏希特·阿胡贾、贾斯珀·格雷森-旺和杰-瑞恩·柳对手稿的评论，以及嘉莉·赫尔对Sema3fb的评论阿格莫变形金刚注射。

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00044. 44.拉蒙特雷， 吴 C - y， Ryu J - r， 武 W， 达瓦里 P， 索伯林雷， 等等。LIM-荷马多曼转录因子Islet2a促进血管细胞迁移。开发生物 2016;414： 181+192.下午：27126199

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00045. 45.王L，张P，魏Y，高Y，患者R，刘F.血流依赖klf2a-NO信号级联是稳定斑马鱼胚胎造血干细胞编程所必需的。血。2011;118: 4102–4110.下午：21849483

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00046. 46.卡尔蒂克 S， 朱基奇 T， 金 Jd， 祖伯 B， 马卡尼亚 A， 奥德里奥佐拉 A， 等等。斑马鱼脉动静脉丛发育过程中发芽和受感染性血管生成的协同相互作用。科学代表 2018;8： 1+15.下午：29311619

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00047. 47.塞纳特 · 阿杰， 胡克 A， 温斯坦 · 姆， 沃克 C， 菲什曼 M， 斯泰尼尔 · 迪尔。心脏肌肽 T 在肉瘤组装和心脏收缩中至关重要。纳特·吉纳特2002;31: 106–110.下午：11967535

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00049. 49.林C-Y、李H-C、傅C-Y、丁Y-Y-Y、陈J-S、李M-H等人针对不同的基因，在斑马鱼胚胎的血管生成过程中具有对立作用。纳特公社2013;4.下午：24264597

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00050. 50.罗马 Bl， 帕姆 Vn， 劳森 Nd， 库利克 M， 儿童 S， 莱克文 Ac， 等等。acvrl1 的中断会增加斑马鱼颅骨血管中的内皮细胞数。发展。2002;129: 3009–3019.可用： http://dev.biologists.org/content/129/12/3009.abstract下午： 12050147

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00051. 51.劳森 Nd， 温斯坦 Bm 。使用转基因斑马鱼对胚胎血管发育进行体内成像。开发生物 2002;248： 307+318.下午：12167406

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00057. 57.威廉姆斯CK，李JL，穆尔加M，哈里斯AL，托萨托G.诺奇配体三角洲样4的向上调节抑制VEGF诱导的内皮细胞功能。血。2006;107: 931–939.下午：16219802

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00060. 60.西克曼 · 阿夫， 劳森 · 恩德一流的信号限制了血管生成细胞在发展斑马鱼动脉中的行为。自然界。2007;445: 781–784.下午：17259972

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00068. 68.格劳佩拉 M， 吉列尔梅特 - 吉伯特 J， 福卡斯 Lc， Phng Lk， 凯恩 Rj， 萨尔佩卡尔 A 等。血管生成有选择地要求 PI3K 的 p110? 等形来控制内皮细胞迁移。自然界。2008;453: 662–666.下午：18449193

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00069. 69.安古洛- 乌拉特 A、卡萨多 P 、卡斯蒂略 · 斯德、科比亚尔卡 P 、科蒂尼 Mp 、菲盖雷多 · 阿姆等人。血管模式过程中的内皮细胞重新排列需要PI3激酶介质抑制作用肌酸收缩。纳特公社2018;9: 1–16.下午：29317637

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00071. 71.筑地-田村K，小川M.抑制PI3K-Akt和mTORC1信号通路促进血管内皮细胞的拉长。J 细胞科学 2016;129： 1165 LP+ 1178.下午：26826185

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00074. 74.Wakayama Y， 福原 S， 安藤 K， 松田 M， Mochizuki N. Cdc42 通过斑马鱼内皮纤维素的 Fmnl 驱动组装来调解 Bmp - 诱导发芽血管生成。开发单元格。2015;32: 109–122.下午：25584797

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00075. 75.特雷普斯 L， 勒盖尔特 A， 加瓦尔德 J. 塞马福林在上皮和内皮结的调节中新兴角色。组织障碍。2013;1： e23272.下午：24665374