医学论文发表-与Dynamo一起对病毒状颗粒进行高效亚形图平均值的分步指南
· 斯特凡诺·斯卡拉穆扎
· 丹尼尔·卡斯塔尼奥-迪埃
· 发布时间： 2021年8月26日
抽象
亚形图平均 （STA） 是电子断层扫描中一种强大的图像处理技术，用于确定大分子复合物在原生环境中的 3D 结构。它是一种快速增长的技术，在结构生物学中越来越重要。STA 的计算方面非常复杂，取决于大量的变量。我们注意到缺乏关于STA处理的详细指南。此外，该领域的现有出版物往往缺乏一份足够实用的文件，无法以合理的努力复制成果，这是科学界成长所必需的。因此，我们提供了一个完整、详细和完全可重复的处理协议，涵盖了 STA 中粒子采摘和粒子对齐的所有方面。基于命令线的工作流程完全基于 STA 流行的Dynamo软件。在此工作流程中，我们还演示了如何简化加工管道的大部分并实现自动化以增加吞吐量。此协议面向所有级别的用户。它可以用于培训目的，也可以通过修改和扩展给定的管道，利用Dynamo的灵活性来设计用户特定的项目。该协议通过电子显微镜公共图像存档 （EMPIAR） 数据库条目 10164 从未成熟的 HIV-1 病毒状粒子 （VLPs） 中成功验证，这些粒子描述了电子断层扫描中经常出现的几何形状。
引文：斯卡拉穆扎S，卡斯塔尼奥-迪兹D（2021）分步指南，以有效的亚形图平均病毒状粒子与Dynamo。PLoS 生物 19 （8）： e3001318.https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318
学术编辑：格兰特·詹森，美国加州理工学院
接收：2021年3月1日：已接受：2021年6月9日：已发布：2021 年 8 月 26 日
版权所有：2021年?斯卡拉穆扎，卡斯塔尼奥-迪兹。这是根据《知识共享归因许可证》条款分发的开放访问文章，该条款允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源被记入贷记。
数据可用性：协议中使用的所有中间文件和处理脚本均可从 EMPIAR 数据库 （EMPIAR-10702） 获得。
资金：这项研究得到了人类前沿科学计划（HFSP）授予RGP0017/2020和瑞士国家科学基金会（SNF）赠款205321 179041的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备手稿方面没有作用。
竞争利益：作者宣称不存在相互竞争的利益。
缩写：CC，交叉关联;CTF，对比转移功能：电子显微镜公共图像档案：FSC，富里尔壳相关性;GMM，高斯混合物模型;GPU，图形处理单元;GUI，图形用户界面：PDB，蛋白质数据库;RAM，随机访问内存;RMS，根均值方形;SIRT，同时迭次重建技术;STA，亚形图平均值;VLP，病毒状粒子;WBP，加权背投影
介绍
细胞细胞器和生物大分子，如蛋白质及其复合物，在几乎所有的生命科学中都起着根本作用。在结构生物学中，研究这些粒子的分子结构，以获得有关其形态和功能的信息。电子断层扫描是一种成熟且快速演变的技术，除了确定感兴趣的粒子的 3D 结构外，还允许对粒子进行原位成像，从而得出有关其细胞上下文、几何形状和与其环境相互作用的结论。
电子断层扫描中一种强大的图像分析技术是亚形图平均值 （STA），其中独立提取图中相同利益粒子的副本，然后对齐并平均到常见参考，以增加底层结构的信号和细节。STA 在结构生物学方面取得了许多突破，方法开发正在进行中[1]5]。STA 的一大挑战是该技术的高度复杂性，这种技术是由生物结构中通常复杂的几何形状造成的，这些几何形状往往显示项目之间存在巨大差异。这使得在图光片中定位粒子（粒子采摘）等任务特别困难。
存在用于 STA 的各种软件。其中流行的是Dynamo [6，7]，汤姆[8]，AV3[9]，PyTOM[10，11]，EM - Clarity[12]，雷利翁[13]，EMAN2[14]，皮特[15，16]， M[17]，和 MLTOMO[18]。有关如何使用这些软件包的指南和教程可以在相应的网站上找到。对于Dynamo和 RELION，有已发布的处理协议，涵盖处理管道的特定部分[13，19]。
由于缺乏关于这些方法的深入信息，STA 中的出版结构往往难以复制，因为提供这些信息通常超出了此类出版物的范围。迄今为止，只有少数协议和教程深入到 STA 处理的实际方面[13，19]。我们在教学 STA 方面的经验表明，虽然用户通常对理论有很好的把握，但他们经常会与那些很少可用的实际细节作斗争。我们希望满足这些信息的需要，因此创建了这个协议，旨在提供一个完整，详细，完全可重复的分步指南粒子采摘和粒子对齐在Dynamo。基于脚本的方法显示了Dynamo工具如何与 MATLAB 脚本相结合，以创建简单、多功能和即用的解决方案。显示的管道也可以作为用户特定项目的基础，因为它可以扩展或适应其他几何形状，例如脂质管或其他类型的表面。我们还演示了如何简化和自动化处理管道的部件，以提高生产率。该协议面向所有级别的用户，可用于培训或作为设置用户特定项目的指南。
STA的Dynamo软件，主要写在MATLAB（数学作品（www.mathworks.com），被选为这份报告，因为它的受欢迎程度和多功能性。独立处理 STA 处理中所有步骤的功能可以单独调用并与传统的 MATLAB 脚本相结合，使软件非常灵活，并允许设置具有高度自动化的可定制处理管道。这种多功能性对于 STA 至关重要，因为它允许根据分析样品通常独特的几何形状来设计和调整图像处理策略。
在此协议中，我们使用 [21] 中使用的 5 张图作为未成熟的 HIV-1 病毒状颗粒 （VLPs）[20]使用 ID 10164（相关蛋白质数据库 （PDB） 条目 5l93）处理电子显微镜公共图像存档（EMPIAR）数据集。我们选择此数据集是因为它已用于其他各种 STA 项目的基准测试[12]。更重要的是，这个特定数据集中的样本几何由球体表面的粒子组成，这是电子断层扫描中经常看到的几何形状。因此，同样的协议可以很容易地适应任何类似的样本，例如，在脂质囊泡中重组的膜蛋白或任何其他类型的球形病毒。
该协议的重点是在Dynamo粒子采摘和粒子对齐。然而，对处理前和处理后的步骤进行了简要解释，以确保完全可重复性。为了减少用户的变量数量，我们使用简单的 2D 对比度传输功能 （CTF） 校正图来限制这些步骤中对第三方软件的依赖。我们执行预处理和后处理的方式是许多正确处理方法之一，用户可以自由地使用他们喜欢的软件进行这些步骤。协议可归纳为以下 3 个部分：
1. 预处理：此部分包括漂移校正、剂量加权、CTF 校正、倾斜系列对齐和图光重建。
2. STA：此协议文件的核心是基于命令线的工作流程（分为 4 个处理脚本）。它写在 MATLAB 中，包括发电机函数。它涵盖了从粒子采摘到金标准精炼的所有步骤，并且专为最小用户干预而设计。
3. 后处理：此部分涵盖分辨率估计、锐化和过滤。
材料和设备
硬件要求
需要以下具有建议的最小规格的硬件组件：
· 计算机或工作站;
· 足够的磁盘存储（>3 TB）和随机存取存储器（RAM，>64 GB）;
· 访问多个图形处理单元 （GPU） 进行子切除图对齐。我们建议至少 2 种最先进的 GPU（例如 NVIDIA GeForce RTX 2080 Ti），但建议至少 6 个，因为子卷对齐是处理中计算最密集的步骤;和
· 访问多核计算环境，用于平均子图（>12 处理内核）。
软件要求
操作系统
· 利诺 （推荐） 或 macos 。Windows 未进行测试，可能需要额外的步骤以确保兼容性。
预处理
· 运动焦 2[22]用于漂移校正;
· CTFFIND4[23]用于脱焦估计;和
· IMOD[24]用于倾斜系列对齐和图光重建。
亚形图平均值
· MATLAB （数学作品） 版本 R2019a 或较新版本。对于不熟悉 MATLAB 或类似编码语言的用户，我们强烈建议学习其一些基本知识。理想情况下，用户应该熟悉阵列、循环和功能等术语。
· 用于 STA 的Dynamo软件（版本 1.1.520 或较新版本）。Dynamo的独立版本独立于 MATLAB 工作。但是，对于此协议，我们建议使用 MATLAB 版本。下载链接、大量文档和指南可以在线找到（www.dynamo-em.org）。
· 奇梅拉 UCSF[25]用于亚形图注释。
后处理
· 分辨率估计和锐化的 3[26];和
· Bsoft[27]用于本地分辨率估计 （功能集团） 。
数据
从EMPIAR条目10164（下载这里：www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/entry/10164），根据表1使用的5倾斜系列的框架。
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表1。数据。
处理中使用的 EMPIAR-10164 数据集的 5 张图的图示名称和剂量率。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318.t001
这些帧记录在FEI泰坦克里奥斯传输电子显微镜（球体畸变：2.7毫米）操作在300keV配备了加坦K2直接电子探测器使用剂量对称倾斜方案[28]。校准的 4K 像素尺寸为 1.35 安格斯特罗姆。有关数据获取的更多详细信息，请在相应出版物的辅助信息[20]中找到。
程序
预处理
使用 MotionCor2 完成帧的漂移校正和傅立叶宾宁[29]到 3710×3838 像素。使用的参数列在表2中。此步骤可以使用Dynamo包装dpcomp. 运动记录. 包装完成。Dynamo工具dpktut. hiv. 预处理可用于从单个显微图创建mrc堆栈。
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表2。预处理参数。
运动焦和 CTFFIND4 中使用的参数。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318.t002
在每个倾斜度上使用 CTFFIND4 进行脱焦估计。对于脱焦估计，我们只考虑与倾斜显微图从 0° 倾斜投影对应的显微图区域。这种角度依赖的裁剪会导致更可靠的脱焦估计。CTFFIND4 中使用的参数列在表 2中。此步骤可以使用包装dpcomp.ctffind.包装完成。医学论文发表-
剂量加权是在对每个倾斜进行脱焦估计后完成的，使用在 Unblur[30]中引入的算法的 MATLAB 实现，并使用与每个倾斜的最后一帧对应的累积剂量（减少 20% 以更加保守）。此步骤可以使用Dynamo包装 dpktilt. 过滤器. 曝光完成。或者，也可以使用 IMOD 中实施的剂量加权选项。
倾斜系列对齐和图图重建在 IMOD 中完成。黄金纤维的种子模型首先自动生成，然后手动完成，以便获得每个倾斜系列约8至16个珠子轨道。自动跟踪图，手动修复间隙。精细对齐是通过估计只有1个旋转和保持所有其他参数固定完成的。根据我们的在线指南（http://www.dynamo-em.org/w/index.php/Considerations_for_tilt_series_alignment_in_IMOD），残余物最小化。应优化残余，直到实现低于 2 像素的根平均方形 （RMS）。跳过了 IMOD 中的脱焦估计，而是使用 CTFFIND4 的结果。CTFFIND4 输出文件可以转换为 IMOD 兼容的脱焦文件使用工具dpcomp.ctffind.forImod.CTF 校正使用相位翻转完成。在进行图光定位时，请确保图光检查的厚度足以包含整个样本。此外，x 轴倾斜和角度偏移应保持在零。这确保了图谱的 Z 轴与电子束方向重合，从而便于对卷（例如缺失楔子的几何形状）进行解释。最后，使用加权背投影 （WBP） 为每个倾斜系列生成 1 个全尺寸的图。任何必要的装箱将在以后直接在子卷本身的对齐过程中进行。
最后的图示应以Dynamo文件命名大会（www.dynamo-em.org/w/index.php/Practical_Suggestions_for_Tomographic_Reconstruction）命名。在这里，我们预计在处理结束时进行以下 5 次图光检查：
b001ts001. rec
b001ts003. rec
b001ts043. rec
b001ts045. rec
b001ts054. rec
对于想要跳过预处理的用户，这些图光检查可以在 EMPIAR （EMPIAR-10702） 上找到。
为处理脚本准备数据结构
在运行处理脚本之前，需要设置一致的数据结构。最好遵循下一段所述的Dynamo公约。
首先，以下3个目录应在主要项目目录内创建：
· 目录： 包含与Dynamo 目录相关的文件， 包括文件和vll文件：
· 颗粒：包含在处理过程中将创建的各种粒子文件夹：和
· 项目：包含处理脚本本身、所有对齐项目以及处理过程中生成的单个文件（例如掩码）。
接下来，需要创建并存储包含托数路径（绝对或相对）的卷列表或vll文件档（它将用于同时将所有图光加载到Dynamo 目录中）。创建一个名为"图"的文本文件，内容如下：
/path_to_tomogram/b001ts001.rec
/path_to_tomogram/b001ts003.rec
/path_to_tomogram/b001ts043.rec
/path_to_tomogram/b001ts045.rec
/path_to_tomogram/b001ts054.rec
然后，还需要创建包含与肿瘤图及其体积 ID 相通的路径（绝对或相对）的文档文件，并存储在目录文件夹中。此文件将用于从图中提取子卷。创建一个名为"图"的文本文件.doc内容如下：
1 /path_to_tomogram/b001ts001.rec
2 /path_to_tomogram/b001ts003.rec
3 /path_to_tomogram/b001ts043.rec
4 /path_to_tomogram/b001ts045.rec
5 /path_to_tomogram/b001ts054.rec
处理脚本（设置.m、超大.m、定位.m和精炼.m）需要保存到文件夹项目中。脚本可以在支持信息S1 附录中找到，或者它们可以直接从 Dynamo（每个新版本都维护和更新它们）中检索到，使用命令dpktut.hiv.设置、dpktut.hiv.oversample、dpktut.hiv.定位和dpktut.hiv.精炼。
最后，发电机目录必须建立首先打开MATLAB，然后加载Dynamo。导航到目录文件夹后，目录管理器可以加载命令dcm。如何使用目录的详细信息可在我们的在线指南（www.dynamo-em.org/w/index.php/Dcm_GUI）中找到。应创建并命名新的目录c001。然后，可以通过加载以前创建的文件进行图光检查来导入这些图。之后，通过首先选择所有卷，然后单击从菜单创建装箱版本（使用因子 2），需要将图谱放入垃圾箱。此装箱卷仅用于Dynamo内部目的，而不用于实际处理。
处理脚本的描述
4 个处理脚本构成了此协议的核心。它们包括从粒子拾取到生成结构的 2 个金标准半地图的所有处理步骤。他们完全写在马特拉布和迪纳莫。脚本是全自动的，并按顺序运行，要么在 MATLAB 命令行中键入其文件名（无扩展），然后按输入键，要么在 MATLAB 编辑器中打开它们并单击按钮运行。用户交互最小化，并且仅要求在执行脚本以进行图示和子切除图注释之间进行。
脚本的结构共分为9个主要处理步骤，进一步分为所谓的块（见图1中的流程图）。在本报告中，每个步骤的功能在专用部分进行解释。每个部分在开头包含相应步骤的一般描述，然后详细解释每个方块。有关单个命令的详细信息，请直接在脚本本身的代码中进行进一步评论。有关已使用命令的更多信息，也可使用 MATLAB 功能的命令帮助或Dynamo功能的助手找到。
· 
图1。处理脚本的流程图。
从相应的处理脚本中概述所有步骤和块。除了在执行单个脚本之间需要的脚本和子图注释（用手符号标记）之外，所有步骤都是自动的。突出了两个主要加工类别（颗粒采摘和金本位制精炼）。CC，交叉关联;VLP，病毒状粒子。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318.g001
脚本的设计方式允许在每一步后暂停并恢复处理。每次 MATLAB 重新启动时，必须运行一次加载全球输入的设置.m。
脚本旨在设置和运行在目录项目本地对齐项目。要在另一个位置（例如集群上）运行对齐项目，用户应使用dvtar命令而不是dvrun，并遵循相应的在线指南来传输对齐项目（www.dynamo-em.org/w/index.php/Tarring_projects）。
在开始处理的第一步之前，应验证所有处理脚本是否位于文件夹项目中。为了能够运行脚本，MATLAB 中的当前文件夹也应是项目文件夹。
S1 表提供了大致处理时间的概览。S2 表中提供了处理过程中使用的所有中间文件的概述。列出的文件（包括图示）也可在 EMPIAR （EMPIAR-10702） 上找到，可用于跳过单个处理步骤。提供复制所有显示数字的数据和代码。
第 1 步：设置输入
描述。
此步骤定义了整个脚本中将使用的输入。这包括文件名、目录路径和处理参数。
块 A： 输入。
可能需要适应用户环境的用户特定输入。通往Dynamo 目录、文档和粒子文件夹的路径可以相对于脚本位置或绝对位置输入。该数据集优化了与几何相关的参数，除非使用另一种类型的数据集，否则不应进行调整。这些参数值背后的推理在第一次使用的方块中解释。计算相关输入需要匹配用户的硬件设置。
块 B：解析输入并生成文件名。
此块包含从以前的输入中自动生成或源自的文件名。这些不需要调整。
第 2 步：VLP 六角形格子的过度采样
描述。
在此步骤中，VLP 的表面被过度采样，并提取了第一组子卷。过度采样的目的是提取足够的重叠子卷，使形成VLP的六角形晶格的每个单位细胞（即形成VLP的辣椒蛋白p24的每18个微小组合）都有机会出现在至少1个子卷中。在此过程中，还对子卷施加了 VLP 表面正常初始方向。医学论文发表-
块 A： 定义偶极子模型。
要生成 VLP（分段）的表面参数化，只需手动定义其中心和半径。这是使用迪纳莫的偶极子模型完成的。为此，通过目录以dtmslice打开图光（请务必打开以前已装箱的版本）。然后打开偶极子模型集，每个可见的 VLP 仅标有 2 次点击：一次在中心，一次在其表面。按入可保存集中的当前偶极子并激活下一个偶极子。此注释此时不需要非常准确，因为以下对齐项目旨在应对在此步骤中引入的不准确之处（可容忍高达 40 像素的不准确）。此外，有缺陷的 VLP 应注释，因为坏/垃圾颗粒将在以后的专用步骤中排除。每张图应标注约 8 到 9 个 VLP。有关创建偶极子设置模型的更多详细信息，请见在线指南（www.dynamo-em.org/w/index.php/Walkthrough_for_lattices_on_vesicles）。
块 B：过程偶极子模型。
每个偶极子通过运行所谓的模型工作流进行处理，从而在表面上创建一个固定的坐标格（每张图约 800 到 1，000 个）（见图 2A）。这些坐标或作物点将是提取（或裁剪）子卷的中心。超采样是通过将作物点之间的间距（或分离）设置为 120 像素来实现的，这比裁剪子卷（256 像素）的侧长（或盒子大小）略小一半。此侧长足够大，足以容纳格子的多个单元单元。稍后将确定单个单元单元的坐标。对于每个托儿所，子卷被提取并存储在名为pa_ts???的托图特定目录中_s256，问号被影像号码代替。一个简单的平均线没有对齐应该已经揭示了表面的曲率（见图2B）。
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图2。VLP 和平均值的过度采样。
（A）用Dynamo命令 dtplot 可视化的图示ts001 （z 视图） 的作物点。作物点位于球体表面的常规间距上。（B）裁剪颗粒的平均值（在 x 视图中投影）。VLP 表面的曲率是可见的。准确复制此数字的数据和命令可在 EMPIAR （EMPIAR-10702） 上找到。电子显微镜公共图像档案：VLP，病毒状粒子。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318.g002
第 3 步：创建初始参考
描述。
生成用于以后项目的初始参考。这是通过对齐粒子从图示b001ts001.rec和重新调整结果的平均值的中心。
方块 A：对齐项目供参考。
首先，对齐项目的模板通过用随机的阿齐穆特角度平均从图示b001ts001.rec中生成。这种随机化对于防止缺失楔子造成的系统性错误是必要的。然后，使用Dynamo命令设置对齐项目。这是传统上通过dcp图形用户界面 （GUI） 手动完成的，但在此处，目标是最大限度地减少用户干预。对齐项目是根据命令dcp.new创建的，并通过传递数据文件夹、表和模板的输入。之后，定义项目参数。该项目由 2 轮（或参数集）组成，每个轮次有 3 次迭代。角搜索范围和允许的移位最初相当大，因为这是首次对粒子进行对齐。在第二轮中，搜索范围缩小。为了加快处理速度，通过定义其侧长（参数暗淡），子卷会在飞行中装箱。在第一轮中，他们被扔进垃圾箱两次，在第二轮，一次。没有强加对称性来避免任何初始偏见。低通滤镜设置为 23 个 Fourier 像素（对应 15 + 基于 256 像素的侧长和 1.35 + 的像素大小）。如果首选更强的低通滤镜，则可以在开始时添加额外的一轮。在这里，我们从 15 + 开始，已经减少了此协议的处理时间。脚本中给出了所有对齐参数的描述。运行项目后，通过倒置对比度和强低通滤镜保存生成平均值的附加副本。此副本稍后将用于奇梅拉 USCF 的可视化目的。
方块 B：定义粒子中心。
以前保存的平均文件名result_pr_ts001_0_INVERTED.em在奇梅拉 USCF 中打开。使用体积跟踪工具，最中心单元的中心标记为图 3中所示。然后，通过保存带有文件名reference_centerNaNm的当前标记进行存储。
下载：
图3。奇梅拉 UCSF 中定义的单元细胞中心。
单位单元单元（黄点）的中心首先将平均值倒置旋转，然后使用体积跟踪工具标记 CA-N 终端域的尖端。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318.g003
块 C：中心粒子和重新平均值。
对齐项目产生的平均值进行调整，使以前标记的单元单元的中心与子卷的中心匹配。首先使用先前定义的中心坐标转换表中所有粒子的坐标，然后重新平均所有子圆。实现此目标。生成的平均值将是下一个对齐项目的开始参考。
第 4 步：第一对齐项目
描述。
在此步骤中，每个图中的所有子卷都与以前创建的参考图单独对齐。由此产生的图光平均值将构成粒子拾取的基础，其中将确定单个晶格单位的坐标。
块 A：第一对齐项目。
使用所有图光片的循环，每个图光检查的粒子与以前创建的参考对齐。子卷的轴再次随机化，以尽量减少潜在的缺失楔形器件。对齐参数与以前的参考项目相同，从现在起在 C6 对称性上施加的唯一区别是。由此产生的坐标（见图4）预计将从其初始位置（比较图2）移动，并已适应VLP的形状，这是不是严格的球形。
下载：
图4。第一次对齐的结果。
左图显示了使用第一个对齐的生成表可视化的图示ts001 （z 视图） 的坐标。坐标从初始位置（比较图2）移动，并适应VLP的形状。裁剪的子卷足够大，足以覆盖坐标之间的所有空位。这在右侧的图中可视化，其中每个坐标都放置直径与子圆的侧长（256 像素）相匹配的磁盘，并成功覆盖 VLP 的整个表面（使用Dynamo命令 dpktbl.plots.disk.disk 可视化）。准确复制此数字的数据和命令可在 EMPIAR （EMPIAR-10702） 上找到。电子显微镜公共图像档案：VLP，病毒状粒子。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318.g004
第 5 步：确定候选粒子
描述。
粒子采摘的目的是确定六角形晶格（或辣椒蛋白p24的每18个微米组合）的每个单元细胞的坐标。在此步骤中，粒子拾取的第一部分完成，其中确定所有候选坐标（下一步将排除假坐标）。使用以前对齐项目的结果，将使用 2 步子装箱程序确定候选坐标（在子拳击中，特定结构特征的坐标首先以平均值定义） 。由于平均值由多个具有单个方向的子卷组成，因此这些坐标可以翻译（或映射）到每个子卷上，最后也可以转换为图。使用此方法，仅在平均值中可见的特征位置可以在完整图中注释。另请参阅在线指南：www.dynamo-em.org/w/index.php/Advanced_starters_guide#Subboxing）。原则上，一个子盒步骤就足够了，即每个图光平均值中的所有单元细胞都被标记并映射回相应的图。但是，必须单独为每个托儿检查进行此工作。为了避免额外的劳动，引入了额外的分箱步骤，其中所有图格平均值首先对齐，形成"平均值"。在这个"平均值"中可见的所有单位细胞只标记一次，然后在第一步中映射回图格图平均值。在第二步中，它们从平均值映射到图上，从而导致一组新的坐标。这个过程在第5图中得到了说明。使用这些新坐标，提取并对齐新的子卷。
下载：
图5。粒子拾取的 2 步子盒的插图。
在对齐了图谱平均值和计算了"平均值"之后，所有单位单元的坐标（黄点）在"平均数"中手动标记。然后，坐标首先映射到图谱平均值上，最后映射到相应的成像图上，从而形成一个坐标网格，与预期的六角形几何完全覆盖 VLP 表面。在图示的"平均值"的右侧，显示了本协议生成的实际"平均平均值"上单元单元单元的所有标记中心。坐标在奇梅拉UCSF中使用体积跟踪器工具标记。通过此过程，只需手动标记 1 张单密度图，即可确定所有单元单元的候选坐标，以实现完整数据集。VLP，病毒状粒子。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318.g005
块 A：创建"平均值"。医学论文发表-
"平均值"是通过设置和运行一个小对齐项目并将图光平均值视为输入数据创建的。相应的数据文件夹是通过将图光平均值复制到其中，并在粒子文件名的 Dynamo约定后重命名它们（www.dynamo-em.org/w/index.php/Data_folder）创建的。在这里，每个粒子标记号对应于图数。创建最小的Dynamo表，初始模板由数据文件夹的简单平均值形成。对齐参数的设置方式与前一个参数相同。对齐项目运行迅速，因为它只包含 5 个粒子。由此产生的"平均值"是低通过滤，其对比度被转用于奇梅拉 USCF 的可视化。
块 B：定义所有单元单元的坐标。
文件名result_pr_a_INVERTED.em的"平均值"在奇梅拉 USCF 中打开。使用体积跟踪器工具，所有晶格单元单元单元的中心都按照图 5中所示手动标记。然后，使用文件名particle_centersNaNm保存当前标记集。
块 C：地图坐标返回到平均值。
在此处执行子盒的第一步，其中单击坐标映射回每个平均值。首先，将对齐项目和点击坐标的生成表读入工作空间并准备处理。然后，使用Dynamo命令dynamo_subboxing_table，执行实际子盒执行，从而为每个图格平均值生成一个临时本地表。此本地表包含相对于图光平均值的起源表示的单位单元坐标。最后，坐标从本地表中提取，并读入将用于子盒的第二步的单元格阵列。
D 块：地图坐标回图。
子盒的第二步在这里执行，其中坐标从平均图绘制到图。首先，对于每个图谱，以前计算的坐标和第一个对齐项目的表都加载并用于子盒的dynamo_subboxing_table功能。然后，对于每个坐标，生成一个包含相对于每个子圆原点的转换坐标的表。所有坐标的表被合并，从而产生一个最终表，其中包含了托图中所有格子单元的候选位置。由于以前的过度采样，我们预计许多坐标会重叠。使用Dynamo功能dpktbl.排除将用户指定半径内的坐标降低到单个坐标的"排除"，可以更正该表以达到此效果。在下一步中，将删除附带描述缺陷或不存在粒子的坐标。最后的坐标在图6中可视化。应定义每个图的大约 5，000 到 9，000 个坐标。我们使用这些提取一套新的子圆，侧长为192像素，慷慨地适合六角形晶格的全单元单元。这些子卷的原始平均值（没有对齐）将包含一些子文件，因为子框子卷的 z 轴方向是从之前选择它们的平均值中继承下来的。由于VLP表面的曲率，这种新的 z 轴并不总是与 VLP 表面的正常矢量重合。此效果将在第二个对齐项目中消失。
· 下载：
图 6.粒子拾取产生的坐标。
使用Dynamo命令 dtplot 显示一个 VLP 从图示ts001表面的粒子坐标来演示粒子拾取的结果。未成熟的HIV-1 CA-SP1固有的六角格结构清晰可见。与完美球体稍有偏差也值得注意。准确复制此数字的数据和命令可在 EMPIAR （EMPIAR-10702） 上找到。电子显微镜公共图像档案。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318.g006
方块 F：第二个对齐项目。
新的粒子在每个图光检查的第二个对齐项目中对齐。由于粒子位置现在更准确，角搜索空间和移位限制比第一个对齐项目减少。子卷仍然被装箱在飞行中，因为在这一点上，高分辨率还没有兴趣。结果将用于以下分类步骤。
第 6 步：交叉关联分类
描述。
这是粒子拾取的第二步，其中包含有缺陷粒子的子卷（或根本没有）会自动从数据集中删除。使用交叉相关 （CC） 阈值单独为每个托图单独完成此工作。
块 A： CC 阈值。
每个对齐子卷和最终平均值之间的 CC 存储在最后生成的表中。CC 分数的直方图显示 2 个人口。CC 分数较低的人口被认为是需要排除在处理之外的"坏"类。它主要含有质量特别差的颗粒（例如，由缺陷引起的）或只包含噪音的子颗粒。为了自动排除过程，高斯混合物模型 （GMM） 安装到 CC 分数分配中。GMM 通常用于分类，此处使用的具体 GMM 描述了 2 个高斯分布的组合。使用 MATLAB 功能拟合器，GMM 可安装到 CC 分数分布中。然后，通过在 2 高斯山峰之间采取最低值和添加经验定义的 0.01 常数来定义阈值。图7A显示了一个图的阈值确定示例，结果粒子排除在图7B中可视化。描述相同粒子的坐标再次固定，并计算每个图谱的新平均值。
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图7。通过 CC 分类排除粒子。
（A） GMM 适合从图Xs001中粒子的 CC 分数分布和粒子排除的自动定义阈值。（B）从图示ts001中排除的某些 VLP 的粒子坐标（红色）示例。不包括不符合预期晶格几何的粒子。使用Dynamo命令 dt 图可视化。准确复制此数字的数据和命令可在 EMPIAR （EMPIAR-10702） 上找到。CC，交叉关联;电子显微镜公共图像档案：GMM，高斯混合物模型;VLP，病毒状粒子。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318.g007
块 B：调整粒子的高度。
在下一步中，所有图解的所有子卷将合并为一个单一数据集。由于到目前为止，它们已被独立处理，其单位细胞的中心可能因图而异。因此，需要确保不同图谱的单元单元在子卷内共享相同的z高度（由于强制的 C6 对称性，轴方向和x/y移位已经保持一致）。这是通过将图光检查的平均值对齐到合成参考中，然后将生成的转化参数（这里只需z方向的一个向转移）应用到相应表中的所有粒子上来完成的。
块 C：重新裁剪。
粒子拾取完成，使用上一张表的坐标，所有子圆最后一次重新提取（使用前一侧长度为 192 像素）。预计每张图中约有2，000至5，000个颗粒。此数据集现在由子卷组成，这些子卷都包含一个中心单元单元。颗粒的质量及其初始方向足以作为以下金本位制调整的基础。图 8显示了所有图格平均值的汇编。注意托福西的不同切除引起的结构差异。
图8。每图图亚形图平均结果。
所有图中所有子切除图平均值的概述（低通过滤和切入中心）。由不同 D 的图光检查引起的结构差异是可见的（子脚本是指表 1中所述的图示编号）。D， 德福西
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318.g008
第 7 步：黄金标准对齐
描述。
现在，所有粒子都已采摘完毕，就可以开始金本位制的改进，即首先将所有图光的子卷组合在一起，然后拆分为 2 个大小相同的数据集，在 2 个不同的对齐项目中独立处理。
块 A： 合并图谱并生成偶数/奇数数据集。医学论文发表-
首先，所有图光检查的表格都合并在一起。然后，使用Dynamo的星形文件功能，通过创建包含所有子卷的绝对路径的单个星形文件，将 5 个到形图数据集进行组合。此星文件稍后将用作对齐项目的数据输入。由于星文件还包含粒子标记号，组合表可以以传统方式使用。此方法是首选，因为它不需要从其原始位置复制或移动任何子卷。组合表被分成一个包含偶数粒子标签的数据集，另一个包含奇数标签（每个粒子约 8，500 个粒子）。最终生成每个半数据集的平均值，作为以下对齐项目的参考。
B 块：设置偶数/奇数项目。
2 个半数据集使用以前创建的启动参考在 2 个独立对齐项目中处理。共设置 3 轮，每个迭代 3 次。每轮后都会减少参数搜索空间。低通滤镜增加到 32 像素（8.1 é），最后两轮在全尺寸颗粒上运行。
第 8 步：改进
描述。
通过再次修剪数据集并运行与调整参数的最终对齐项目来改进以前的结果。
块 A： CC 滤镜再次（规范化和每张图）。
要去除低质量颗粒，数据集会再次通过 CC 阈值减少。对于每个半数据集，每个托普的阈值分别完成，因为图谱的不同脱焦值会影响总体 CC 分数（全球 CC 阈值可能排除特定脱焦值的太多粒子，从而减少 CTF 零的覆盖范围）。将 CC 分数低于平均值以下 1 个标准偏差的子卷删除。在计算阈值之前，CC 分数会因纬度角度而正常化，因为由于缺少楔形效应，VLP 赤道上的粒子通常比两极上的粒子具有更高的 CC 分数。正常化是通过将通用傅立物系列的前 2 个术语安装到数据中，通过功能dpksta.过滤器.byCC完成的。使用减少的表，计算新的平均值，作为最后一个对齐项目的参考。
B 块：改进偶数/奇数项目。
在创建对齐项目之前，定义了大致遵循 VLP 曲率的对齐面罩。然后，使用与上一个项目上一轮相同的参数设置 2 个对齐项目，但使用略带增加的低通滤镜（38 个 4 个像素对应于 6.8+），并使用新的对齐面罩。
第 9 步：准备半地图
描述。
金标准处理产生的 2 个平均值（半地图）保存用于后期处理。
方块 A：准备半地图。
偶数半地图与奇数半地图对齐，生成的转换参数用于转换与偶数半地图对应的表。然后，该表用于重新平均均匀粒子。此重新平均是为了避免半地图对齐导致的边缘工件。2 个半地图现在可用于金标准傅立物外壳相关性 （FSC） 计算。通过重新计算完整数据集的所有粒子，还可以计算最终地图，该地图还将用于锐化。在这里，重新平均是必要的，以确保正确的傅立叶补偿的最后地图（www.dynamo-em.org/w/index.php/Fourier_compensation_during_averaging）。
后处理
分辨率估计是通过计算 2 半地图之间的掩蔽校正 FSC 曲线并使用 0.143 的截止标准在 RELION 中完成的。最终创建的半地图已在 RELION 公约中命名，因此可以直接加载到软件中。FSC 计算使用紧软面膜。此面膜由高斯过滤和迭倍二进制最终平均值创建，直到整个中央单元单元单元包含在面膜内，并且面膜的高斯脱落不会与结构重叠。我们的分辨率估计值为 4.5 + （参见S1A 图中的 FSC 曲线）。此分辨率与使用相同的数据集和2DCTF 校正 （图 9）估计的分辨率相同 。
·
图9。经过后处理的电子密度图。
（A） CA-SP1 单体显示为突出显示的 CA-N 终端域（橙色）和 CA-C 端域（绿色）。为了轻松比较结构，将显示与[21]中显示的类似视图。（B）相应 PDB 条目 5l93 的刚性拟合显示地图的质量。PDB，蛋白质数据库。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318.g009
本地分辨率是使用 Bsoft 软件包中的集团功能进行估计的。23 像素的盒子大小可用于 FSC 截止标准 0.5 和 C6 对称性。局部分辨率估计的结果显示在S1B 图中。
最终密度图使用 -270 的 B 因子与 RELION 命令relion_image_handler生成，与 Guinier 地块估计值（在我们的情况下为 +240）相比，该值略强。低通过过滤器设置为估计分辨率 4.5 é。最后，使用 IMOD 的命令剪辑翻转调整地图的手。最终密度图的细节，包括分子结构的拟合显示在S1图。最终平均值的正交部分显示在S1C图中。
结论
本协议文件的目标是为 STA 处理提供实用且易于重复的指南，以帮助社区中新的和有经验的用户。我们通过建立和记录 STA 中粒子采摘和粒子对齐的处理管道来实现此。该管道基于Dynamo软件包，并结合 MATLAB 功能。该程序应用于未成熟的艾滋病毒-1 VLPs（EMPIAR-10164）的数据集，代表电子断层扫描中经常出现的几何形状。我们通过成功复制使用相同数据集生成的[21]结果验证了我们的管道。
通过合并和自动化关键处理任务，并通过消除冗余步骤，我们进一步简化和自动化了管道的大部分。唯一的用户交互是图和子图中功能的手动注释。这些相互作用是专门为尽量减少手动工作而设计的：每个 VLP 只需要标记 2 点，中心需要注释一次，子盒需要注释一次。所有其他步骤（包括按 CC 阈值分类）都是自动化的。通过引入粒子拾取的 2 步子盒，我们为强力粒子坐标确定提供了替代方法。我们还证明，从处理开始使用全尺寸 WBP X光检查就足以满足此类数据的需求，并且不需要使用预装的 X光检查或采用替代重建方法的托普。但是，对于困难的数据集，例如几何形状较复杂的图谱、较小的粒子或较低的信号与噪声比率，我们仍然建议从高对比度重建方法开始，例如，同时迭次重建技术 （SIRT） 或类似的算法。然而，使用装箱的影像是多余的，因为Dynamo允许在子圆的排列过程中将子圆在飞行中装箱。
我们通过本报告和代码本身的广泛评论详细记录了 STA 管道。我们还提供了多个指向其他在线指南、文档和材料的链接。处理脚本也集成在Dynamo中，在那里将维护和更新这些脚本。欢迎用户提交反馈或改进建议。此外，我们还记录了处理前和处理后的所有相关步骤和参数，使用户能够复制结果。医学论文发表-
我们希望所提供的材料将作为用户特定项目、基准工作或教学和培训目的的基础。我们进一步鼓励社区发布许多 STA 处理协议和方法，以支持该领域的快速增长。
支持信息
每个处理步骤的计算时间。
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处理步骤
无花果份额
S1 表。每个处理步骤的计算时间。
每个处理步骤的近似计算时间（壁时间）摘要。使用 16=28 CPU、32/64 GB RAM 和 6 个现代 GPU（由于计算集群可用资源的变化而导致 CPU 和 RAM 的变化）的配置确定时间。对于手动干预（比较图1），我们预计用户每次图示大约需要10分钟来定义偶极子模型，5分钟来定义粒子中心，15分钟来定义所有单元单元的坐标。中央处理单元CPU;GPU，图形处理单元;拉姆，随机访问内存。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318.s001
（PDF）
在每个处理步骤中使用或生成的所有中间文件的摘要。2 问号"？？" 代表 01、03、43、45 和 54 的影像数字（如表 1所述）。一个问号"？" 代表目录图数字（1、2、3、4 和 5）。所有列出的文件都可以在线获得，预计对于单个粒子本身（这些可以直接生成与命令dtcrop使用提供的作物表和图作为输入）。对于对齐项目数据，仅提供结果。在创建与处理脚本命令的对齐项目（无需实际运行项目）后，可以简单地将相应项目的目录结果复制到新生成的项目文件夹中以跳过处理。对于目录，只提供几何模型。它们可以在用户生成后复制到目录文件夹中，以便跳过令图注释（在复制模型后按目录管理器中的同步模型）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318.s002
（PDF）
S1 图。分辨率估计值和最终平均值。
（A）面罩校正的 FSC 曲线显示全球分辨率估计为 0.143 截止点的 4.5 angstrom。（B）显示整个地图分辨率变化的本地分辨率估计（截止 0.5）。（C）最终平均值的矫形切片。黄线显示切片的位置。准确复制此数字的数据和命令可在 EMPIAR （EMPIAR-10702） 上找到。电子显微镜公共图像档案：FSC ，傅立物壳相关性。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318.s003
（蒂夫）
处理脚本设置.m，超.m，定位.m，并细化.m。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001318.s004
（PDF）
确认
我们感谢拉斐尔·科雷和卡洛斯·费尔南德斯·罗德里格斯测试并复制了协议。我们还感谢阿利斯特·伯特、达斯汀·莫拉多、约书亚·赫钦斯、劳伦-安·梅斯卡斯和保拉·纳瓦罗的讨论。
引用
00001. 1.弗兰克J.电子断层扫描：用传输电子显微镜进行三维成像。斯普林格科学与商业媒体;2013.
00002. 2.万 W， 布里格斯 · 贾格冷冻电子断层扫描和亚形图平均。甲醇酶。2016;579:329–367.
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· 谷歌学者
00003. 3.卡斯塔尼奥-迪埃斯D，扎内蒂G。以平均分形图进行原位结构确定。柯尔·奥平结构生物 2019;58：68+75.下午：31233977
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· 普布梅德/NCBI
· 谷歌学者
00004. 4.达内夫R，亚那吉萨瓦H，KikkawaM.冷冻电子显微镜方法：当前方面和未来方向。趋势 生物化学 科学.2019;44 （10）：837+48.下午：31078399
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· 普布梅德/NCBI
· 谷歌学者
00005. 5.舒尔 · Fkm走向高分辨率原位结构生物学与低温电子断层扫描和亚形图平均。柯尔·奥平结构生物 2019;58：1+9.下午：31005754
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· 谷歌学者
00006. 6.卡斯塔尼奥-迪兹 D、库德里亚舍夫 M、阿尔海特 M、斯塔尔伯格 H. Dynamo：一种灵活、用户友好的发展工具，用于高性能计算环境中低温-EM 数据的亚形图平均值。J 结构生物 2012;178 （2）：139+51.下午：22245546
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· 谷歌学者
00007. 7.卡斯塔尼奥-迪埃兹D，库德里亚舍夫M，斯塔尔伯格H.Dynamo目录：几何工具和数据管理，用于在低温电子图平均分形图中粒子采摘。J 结构生物 2017;197 （2）：135+44.下午：27288866
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· 谷歌学者
00008. 8.尼克尔S，福尔斯特F，利纳鲁迪斯A，德尔网W，贝克F，赫格尔R，和TOM软件工具箱：电子断层扫描的获取和分析。J 结构生物 2005;149 （3）：227+34.下午：15721576
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· 谷歌学者
00009. 9.Fürster F， 勋章 O， 祖伯曼 N， 鲍迈斯特 W， 法斯 D. 逆转录病毒包络蛋白复合结构现场研究低温电子断层扫描.普罗克·纳特尔·阿卡德·西·美国 2005;102（13）：4729+34。下午：15774580
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· 普布梅德/NCBI
· 谷歌学者
00010. 10.陈 Y， 费弗 S， 赫拉贝 T， 舒勒 Jm， 弗斯特 F. 快速和准确的无参考对齐子图。J 结构生物 2013;182 （3）：235+45.下午：23523719
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· 普布梅德/NCBI
· 谷歌学者
00011. 11.赫拉贝 T. 本地化。pytom： 一种用于低温电子断层扫描的现代网络服务器。核酸 Res. 2015;43 （W1）：W231+6.下午：25934806
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· 普布梅德/NCBI
· 谷歌学者
00012. 12.希姆斯 BA， 张 P. emlarity： 高分辨率低温电子断层扫描和亚形图平均软件。纳特方法。2018;15(11):955–61.下午：30349041
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· 谷歌学者
00013. 13.巴拉特 · 谭， 舍雷斯 · 什瓦使用 RELION 中的平均亚形图从电子低温断层扫描数据中解决大分子结构问题。纳特 · 普罗托克2016;11(11):2054–65.下午：27685097
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· 谷歌学者
00014. 14.陈 M ， 贝尔 Jm ， 石 X ， 孙 Sy ，王 Z ，吕德克 SJ 。低温 ET 和亚形图平均值的完整数据处理工作流程。纳特方法。2019;p. 1-8.下午：30573832
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00015. 15.尼卡斯特罗 D， 施瓦茨 C， 皮尔森 J， 高黛特 R， 波特 Me， 麦金托什 Jr 。低温电子断层扫描揭示的轴心的分子结构。科学。2006;313(5789):944–8.下午：16917055
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00016. 16.豪曼 Jm， 亨格 A， 马斯特罗纳德 Dn. 使用楔形遮蔽差异的低温电子断层扫描的聚类和方差图。J 结构生物 2011;175 （3）：28+99.下午：21616153
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00017. 17.特古诺夫 D， 薛 L， 迪尼曼 C， 克拉默 P， 马哈米德 J. 多粒子低温 - EM 精炼与 M 可视化核糖体抗生素复合物在 3.7 + 细胞内。生物Rxiv.2020.
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00018. 18.斯托尔肯 M， 贝克 F， 哈勒 T， 赫格尔 R， 古特什一世， 卡拉佐 Jm， 等等。基于电子断层扫描数据的最大可能性分类。J 结构生物 2011;173 （1）：77+85.下午：20719249医学论文发表-
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00019. 19.纳瓦罗PP，斯塔尔伯格H，卡斯塔尼奥-戴兹D.协议的亚形图平均膜蛋白在Dynamo软件包。前莫尔比奥西。2018;5:82.下午：30234127
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00020. 20.舒尔 · Fkm 、 奥伯 M 、 哈根 · Wjh 、万 W 、雅科比 · 阿杰、柯克帕特里克 · Jm 等人。HIV-1帽-SP1的原子模型揭示了调节组装和成熟的结构。科学。2016;353(6298):506–8.下午：27417497
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00021. 21.图罗埃夫 B， 舒尔 Fkm， 万 W， 布里格斯贾格。使用 NovaCTF 对低温电子断层扫描进行高效的 3D-CTF 校正可将亚形图平均分辨率提高到 3.4 + J 结构生物 2017;199 （3）：187+95。下午：28743638
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00022. 22.郑 SQ ， 帕洛夫恰克 E ， 阿玛奇 JP ， 韦尔巴卡， 程 Y ， 阿加德 DA 。运动Cor2：改善低温电子显微镜的光束诱导运动的异位校正。纳特方法。2017;14(4):331–2.下午：28250466
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00023. 23.罗豪 A， 格里戈里夫 N. CTFFIND4： 从电子显微图快速和准确的脱焦估计。J 结构生物 2015;192 （2）：216+221.下午：26278980
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00024. 24.马斯特罗纳德 Dn， 举行 Sr. 自动倾斜系列对齐和断层扫描重建在 Imod 。J 结构生物 2017;197 （2）：102+13.下午：27444392
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00025. 25.佩特森EF，戈达德TD，黄CC，沙发GS，格林布拉特DM，孟EC等人UCSF奇梅拉罗的可视化系统进行探索性研究和分析。J 计算化学. 2004;25 （13）：160+5 12.下午：15264254
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00026. 26.齐瓦诺夫 J， 纳卡内 T， 福斯伯格博， 基马纽斯 D， 哈根 Wjh， 林达尔 E， 等等。在 RELION-3 中自动高分辨率低温 EM 结构测定的新工具。生活。2018：7：e42166.下午：30412051
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00027. 27.海曼 JB， 贝尔纳普 DM. Bsoft： 电子显微镜的图像处理和分子建模。J 结构生物 2007;157 （1）：3+18.下午：17011211
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00028. 28.费尔南德斯 Jj， 李 S， 阿加德达。基于对齐残值插值的低温断层扫描中的样本运动。J 结构生物 2019;205 （3）：1+6.下午：30690142
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00029. 29.彭切克 PA， 方 J， 李 X， 程 Y， 乐尔克 J， 斯帕恩 CM. CTF 参数快速估计与错误评估。超微镜检查。2014;140:9–19.下午：24562077
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00030. 30.格兰特 T， 格里戈里夫 N. 使用 2.6 + 轮状病毒 VP6 的重建测量单粒子低温 -EM 的最佳暴露。生活。2015：4：e06980.下午：26023829
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