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《医学论文发表-MTL5从细胞质中核转移需要它与LIN9的直接相互作用》

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《医学论文发表-MTL5从细胞质中核转移需要它与LIN9的直接相互作用》期刊在线投稿系统

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《医学论文发表-MTL5从细胞质中核转移需要它与LIN9的直接相互作用》期刊简介

医学论文发表-MTL5从细胞质中核转移需要它与LIN9的直接相互作用，对男性的肌病和生育能力至关重要

· 张星霞，

· 李明，

· 蒋晓华，

· 马慧，

· 范瑞星，

· 杨丽，

· 余昌平，

· 徐建泽，

· 兰贾汗

· 姜汉伟

· 石庆

· 发布时间： 2021年8月13日

MTL5从细胞质中核转移需要它与LIN9的直接相互作用，对男性的肌病和生育能力至关重要

· 张星霞，

· 李明，

· 蒋晓华，

· 马慧，

· 范瑞星，

· 杨丽，

· 余昌平，

· 徐建泽，

· 兰贾汗

· 姜汉伟

· 石庆华

· 发布时间： 2021年8月13日

· https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753

· 品

· 作者

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· 数字

这是一个未经纠正的证据。

数字

抽象

梅病对于游戏和性繁殖的产生至关重要，但调节美化进展的因素和基本机制在很大程度上仍不得而知。在这里，我们表明MTL5在酶-乳酸酯过渡期间转移到精子细胞核中，并确保肌病在乳酸酯阶段之外进展。MTL5 显示与 MuvB 核心复杂组件的强相互作用，这是一种著名的调节间质进展的转录复合体，MTL5 的酶-帕奇泰恩过渡通过 MTL5 C-终端 443/475 残留物与组件 LIN9 的直接相互作用进行介导。男性山 5c-穆/c-mu表达截断MTL5（p.Ser445Arg fs*3）的老鼠缺乏与LIN9的相互作用，并被拘留在细胞质中，显示男性不育和精子致病性逮捕在帕奇泰恩阶段，与Mtl5淘汰小鼠相同，表明与LIN9的相互作用对于MTL5在梅病期间的核转移和功能至关重要。我们的数据表明，MTL5在酶-乳酸酯过渡过程中转移到细胞核中，以启动其功能，同时在乳酸精细胞中加入MuvB核心复合物，这突出了调节男性梅氏症进展的新机制。医学论文发表-

作者摘要

梅病对精子生成和男性生育能力至关重要。然而，调节梅病进展的因素在很大程度上仍不得而知。我们报告了睾酮特异性蛋白质MTL5通过与LIN9的直接相互作用，在酶-乳酸酶过渡时转移到精子细胞核中，LIN9是MuvB核心复合物的重要组成部分，以促进在乳酸酶阶段之外的美化进展。我们还表明，MTL5 拉下 MYBL1 和精子细胞中的所有 MuvB 核心复合物（LIN54 除外）。鉴于 MuvB 核心复合物作为细胞周期调节器在间质细胞中的已知作用，我们建议 MTL5 与 MuvB 核心复合体一起促进美学进展，以确保男性生育能力。我们的结果表明，MuvB复合物在男性梅病中的一个新功能，也揭示了控制乳基阶段梅蒂克进展的主调节蛋白。MTL5 是细胞循环进展的新型生殖细胞特异性调节器，通过细胞变异在细胞变异的特定阶段发挥作用。医学论文发表-

引文：张X、李M、姜X、马H、范S、李Y等人（2021）MTL5从细胞质中核转移需要与LIN9直接相互作用，对男性的肌病和生育能力至关重要。PLoS基因 17 （8）： e1009753.https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753

编辑：魏燕，美国内华达大学医学院

接收：2021年3月16日：已接受：2021年7月29日：已发布：2021 年 8 月 13 日

数据可用性：所有相关数据均在手稿及其支持信息文件中。

资金：这项工作得到了中国国家自然科学基金委员会（31890780）、31630050（QS）、32061143006（QS）和82071709（XJ）的支持：http://www.nsfc.gov.cn/），中国国家重点研究发展计划（2018YFC1003400（HJ）、2016YFC1000600（QS）和2018YFC1004700（XJ）：http://www.most.gov.cn/）中国科学院战略重点研究计划（XDB19000000（QS）：http://www.cas.cn/），中央高校基础研究基金（2070002006年）：http://www.moe.gov.cn/）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备手稿方面没有作用。

竞争利益：作者宣称不存在相互竞争的利益。

介绍

不孕不育影响全球约15%的育龄夫妇，它正逐渐成为一个严重的医疗问题，也是一个重大的社会问题[1+4]。虽然人工辅助生殖技术可以使越来越多的不孕夫妇生育自己的孩子，但因美蒂性功能障碍而不孕不育的男性由于缺乏游戏特性而无法从这些技术中受益[5，6]。因此，关于对美化进展至关重要的基因的研究有助于提高我们对控制美化的机制的基本理解[7，8]。

梅蒂奇益发I，其中包含一系列梅氏病特异性事件，包括美的重组和突触，相当于体细胞细胞周期的G2阶段[9]14]。它需要更长的时间（持续约13天在小鼠）比间质细胞，以确保这些美学事件的有序进展。根据染色体的配置和结构[15]，美的G2相（益生菌I）分为一系列子阶段，包括瘦素、酶精、帕奇泰恩、二聚苯和二苯甲苯。其进展受到不同检查站的严格管制，这些检查站监测梅奥蒂奇事件的适当发生，当梅蒂奇特错误发生时，这些检查点会导致梅蒂奇特逮捕（通常是在帕奇泰内阶段）。这表明存在一个细胞循环调节器，在美学检查点的监管下促进或阻止美化进展。

MuvB核心复合物由LIN9、LIN54、LIN37、LIN52和RBBP4组成，是一种著名的细胞循环调节器，通过将不同的关键转录因子结合并引导到细胞周期基因的促进者[16，17]中，在子宫切粒体细胞周期的不同阶段发挥关键作用。在G0和G1早期阶段，MuvB核心与E2F4/5、DP1/2和p130/p107相互作用，形成抑制基因表达的DREM复合体（二元化伙伴（DP）、RB样、E2F和MuvB）。然后，这些共同因素从 MuvB 核心综合体中释放出来，以便在 S 阶段和早期 G2 阶段将 B-MYB 招募到 MuvB 核心综合体（MMB 复合物），促进 G2/M 过渡。这个复合体在G2后期进一步招募FOXM1来激活G2/M基因[16，17]。然而，目前还不清楚这种复杂的功能是否以及如何在美益生菌I阶段。

MTL5（金属洛西奥宁样5，也称为特斯明）是一种睾丸特异性金属洛西奥宁样蛋白质，含有串联的赛斯坦富产区域（CRC域，DNA结合域），它与LIN54[18]共享序列相似性。小鼠Mtl5基因位于19号染色体上，它有两个成绩单等形体，具有更长和更常见的脚本，编码475氨基酸（aa）蛋白质，具体表现在小鼠睾测试[19]中。作为特异性金属洛蒂奥宁，Mtl5 mRNA 表达在产后 8 天（dpp）首次检测到，这与肌病的启动[20]一致。尽管mRNA的早期表达，同源Mtl5删除在小鼠不导致任何明显的缺陷，在瘦素和苯丙烯阶段，但导致男性不育，由于精子致病性逮捕在帕奇泰恩/二苯阶段[21]。

有趣的是，松浦晃一等人对小鼠睾酮中MTL5定位的免疫细胞化学分析表明，在精子生成过程中，它穿梭于精子细胞的细胞质和细胞核之间[22]。Sutou等人发现，MTL5主要位于I-IX期精子细胞的细胞质中，对应于早期和中期的乳腺细胞，但随后在晚期的乳腺细胞或二叶虫阶段转移到精子细胞核中，这些细胞群存在于X-XII丘脑阶段[19]。综合起来，这些报告表明，MTL5的核转移与其功能之间可能存在关系。

为了揭示MTL5从细胞质转移到细胞核的机制和生物学意义，我们首先研究了MTL5在小鼠睾片中的定位，发现MTL5在酶-帕奇泰恩过渡周围转移到细胞核。然后，我们表明MTL5与除精子细胞中的LIN54外的所有MuvB核心复杂组件相互作用，并通过培养细胞中的LIN9直接传输到细胞核中。我们还表明，MTL5的核迁移是由LIN9进行的，LIN9是MuvB核心综合体的子组，在DREAM综合体[23，24]中是众所周知的，通过它与MTL5的C-终端443-475aa区域的直接相互作用。MTL5 的截断突变（p.Ser445Arg fs*3），生成Mtl5c-穆/c-mu小鼠线，消除了它与LIN9的相互作用，从而导致细胞质保留MTL5在乳腺精子细胞。雄性小鼠同源性在帕奇泰恩和阿祖斯珀米亚表现出精子生成，与Mtl5淘汰（Mtl5）小鼠的表型完全相同，表明MTL5在基质-乳酸酯过渡期间由LIN9输送到细胞核中，以促进在乳酸酯阶段外的美化进展。-/-

结果

MTL5 在酶-帕奇泰恩过渡期间从细胞质转移到精子细胞核

先前对小鼠的研究报告说，MTL5以特定精子细胞类型的方式定位到细胞质或细胞核[19]，但MTL5在精子生成过程中从细胞质转移到精子细胞核的阶段尚未完全解决。为了确定MTL5从细胞质转移到细胞核的确切阶段，我们详细分析了MTL5在小鼠精子生成过程中的表达和定位模式。MTL5蛋白是专门在小鼠睾片（S1A图）中表达的，在小鼠睾片（S1B图）中首次在10分多钟时检测到，对应于第一波精子生成中的瘦素和酶精。与这一发现一致，对分离的精子原细胞的RT-PCR显示，Mtl5表达最初在瘦素和酶精细胞中检测到，然后在乳酸盐和二甘肽精子细胞中急剧增加，最后在精子中消失（S1C图）。

MTL5 的本地化是由 MTL5 和 +H2AX 在睾丸部分或涂抹睾丸细胞（图 1A 和 1B）上共同染色决定的。MTL5信号首先在瘦素和酶卵石精子细胞质中观察到，这些细胞体显示出分散的+H2AX信号，并在乳酸和二甘肽精子细胞核中变得更强，而在预生细胞和Sertoli细胞（图1A和1B）中未检测到MTL5信号。为了检测MTL5在帕奇泰尼/二聚苯甲基精子细胞中的动态核定位，根据PNA染色（图1C）的形态，对10周前野生型小鼠的睾丸部分进行了MTL5和PNA的免疫染色。在第二阶段观察到早期乳酸精子细胞的细胞质和细胞核的MTL5的定位，然后从III期到第八期（图1C）逐渐积聚在乳酸/二苯精子细胞的核中。在第八阶段（图1C）后，从管状细胞中几乎未观察到MTL5的细胞质定位。然后，我们染色H1t，这是在中段后在生殖细胞中表达，以进一步检测MTL5核定位的精子细胞传播的动态（图1D）。MTL5信号首先从早期乳酸精细胞的细胞核中观察到，并在中晚期乳酸细胞核和二叶烯精子细胞（图1D）中变得更强。医学论文发表-

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图1。MTL5 在美益生菌 I 的精子细胞中的动态定位。

（A）在10周大的野生小鼠睾丸部分免疫MTL5（红色）和+H2AX（绿色）。核被霍赫斯特 33342 （蓝色）所抵消。放大视图（底部）由白框（顶部）表示。白色箭头表示帕奇泰尼或二甘油精子细胞。蓝色箭头表示瘦素或酶精细胞。秤杆，50μm。（B）在10周大的野生小鼠的涂片睾丸细胞中，为MTL5（红色）和+H2AX（绿色）进行免疫。核被霍赫斯特 33342 （蓝色）所抵消。白色箭头表示帕奇泰尼或二甘油精子细胞。绿色点缀椭圆形表示甲苯精子细胞。秤杆，10μm。（C） 10周大野生小鼠睾丸部分的MTL5（绿色）和PNA（红色）免疫。核被霍赫斯特 33342 （蓝色）所抵消。放大的视图由白色框表示。秤杆，50μm。（D）在传播10周大的野生小鼠精子细胞中的SYCP3（红色）、H1t（灰色）和MTL5（绿色）免疫。秤杆，10μm。（E）使用细胞质和核蛋白提取物从8、10、12、15、20和产后25天（dpp）小鼠睾测试中进行西侧污点分析。GAPDH和SYCP3分别作为细胞质和核控制。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.g001

为了进一步确认MTL5的迁移，我们把精子细胞的细胞质和细胞核从8个 dpp 分离到25个 dpp 小鼠，并由西方斑点（图1E）确定MTL5的水平。与免疫荧光定位一致，在8个 dpp 睾片的细胞质或核裂解物中未检测到 MTL5，但随后在 10 个 dpp 睾片的细胞质裂解物中检测到，然后在 12 个 dpp 睾片（图 1E）中的精子细胞核中首次检测到 MTL5。随着精子源波的进展，MTL5蛋白水平逐渐增加，在细胞质和核裂解的精子细胞从15个 dpp （图 1E）。

这些结果表明，MTL5表达仅限于瘦素和酶卵石阶段精子细胞质，然后在酶-帕奇泰恩过渡后开始转移到生殖细胞核中。

MTL5 由 MuvB 核心复合组件 LIN9 运送到原子核中

根据蛋白质结构分析，MTL5没有明确的核定位序列（NLS），强烈暗示其他蛋白质会调解或有助于其进入核。为了识别有助于MTL5核转移的蛋白质，我们因此在帕奇泰尼和二甘醇精子细胞中用抗MTL5的抗体进行免疫沉淀，使用STA-PUT方法[25]从10周前的野生型小鼠睾试中富集了二聚苯乙烯精子细胞，随后进行了质谱分析（IP-MS）（图2A和2B）。总共确定了27种假定候选MTL5相互作用蛋白，其中至少含有3种独特的肽（S1表）。有趣的是，除了MTL5和MYBL1，MuvB核心综合体的5个组件中，包括RBBP4、LIN9、LIN52和LIN37，有4个出现在按覆盖范围（%）（图 2C）排列的候选人名单中名列前茅。值得注意的是，MYBL1是MYBL2的同源性，已被实验证明与体细胞中的MuvB核心复合物相互作用[26]28，16]。为了确认MTL5与MuvB核心复合物的相互作用，我们在与MufB核心复合物（包括LIN9、LIN37、LIN52、RBBP4和LIN54）以及MYBL1共同表达MTL5后，在 HEK293T 细胞的解剖中执行了共免疫沉淀（共IP）。不出所料，共同IP结果显示，MTL5与MYBL1和所有MuvB核心复杂组件（图2D）相互作用，除了LIN54，这是特别低表达在睾酮（S2图）。

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图2。MTL5 与 MuvB 核心复合体的大部分组件相互作用。

（A）用MTL5抗体（从221aa到475 aa）沉淀的样品的银渍，在SDS-PAGE之后，从10周大的野生型小鼠的乳酸和二苯甲酸精细胞中沉淀。兔子IgG作为负控制。红星标记IgG和MTL5抗体组之间的不同带。蓝色箭头表示未指定的波段。M 表示蛋白质标记。（B） IP-MS 识别与 MTL5 相互作用的蛋白质，然后对三个蛋白质组进行减法分析，并具有两个生物重复。在野生类型组中至少含有三种独特肽的蛋白质，但在IgG和淘汰（KO）组中均不存在，被认为是候选MTL5交互蛋白。括号中的数字表示蛋白质的数量。（C）按覆盖率（%）排序的顶级候选人排名，从高到低。显示前 6 名候选人。（D）在与MYC标签磁珠共同免疫沉淀后，在 HEK293T 细胞中对 MTL5（与 MYC 标签融合）与每个 MuvB 核心复杂组件或 MYBL1（与 GFP 标签融合）之间的相互作用进行西式斑点检测。pEGFP-N1 作为负控制。IP，免疫沉淀。IB，免疫印迹。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.g002

为了确定 MuvB 核心复合物的哪个组件与 MTL5 直接相互作用，我们使用酵母双混合（Y2H）筛选，检查了 MTL5（猎物，转化为 Y187 酵母形体株）和 LIN9、LIN37、LIN52、RBBP4 或 MYBL1（诱饵，转化为 AH109 酵母形体菌株）之间的相互作用。只有经过改造的AH109和Y187酵母形体细胞与MTL5和LIN9或MTL5和RBBP4可以在所有选择性介质板（S3图）上生长，这表明MTL5与LIN9和RBBP4直接相互作用。

基于上述发现，我们建议通过与 LIN9 或/和 RBBP4 结合来调解 MTL5 从细胞质的核转移。因此，我们分别检查了与质粒编码MYC-Mtl5和质粒编码GFP-Lin9或GFP-Rbbp4的HMT5在 HEK293T 细胞中的本地化（用于对照组） GFP-林37，GFP-林52，或GFP-Mybl1编码质粒也分别与MYC-Mtl5结构共同感染）。MTL5 在 HEK293T 细胞的细胞质中弥漫定位，当单独与MYC-Mtl5或 pEGFP-N1 向量（图 3A 和 3B）发生转染时。不出所料，MTL5 的细胞质定位也观察到与 MTL5 同表达的 MTL5 与 LIN37、LIN52 或 MYBL1 的细胞中，因为在 Y2H 筛查（图 3C/3E）中未检测到 MTL5 与它们的直接相互作用。此外，RBBP4，一个先前确定的MTL5的直接相互作用伙伴，只显示细胞质定位，未能将MTL5传输到细胞核（图3F）。相反，与另一种MTL5相互作用的蛋白质LIN9共同表达，导致MTL5在KEK293T细胞（图3G）中从细胞质到细胞核的戏剧性再分配，表明LIN9可能是MTL5核转移的关键因素。

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图3。MTL5由LIN9输送到培养的 HEK293T 细胞的核中。

HEK293T细胞暂时被质粒编码（A）MYC-Mtl5、（B）MYC-Mtl5和pEGFP-N1短暂地瞬时感染，（C） MYC-Mtl5 和 GFP-林37，（D） MYC-Mtl5 和 GFP-林52，（E） MYC-Mtl5 和 GFP-Mybl1 ，（F） MYC-mtl5 和 GFP-Rbbp4 ，或（G） MYC-Mtl5 和 GFP-林9。 蛋白质的本地化通过对MTL5（红色）和GFP（绿色）抗体的抗体进行免疫染色来观察，并通过尼康共聚焦激光扫描显微镜系统成像来观察。惠特箭头表示 MTL5 和 LIN9 的共同本地化。计算MTL5的核（N）或细胞质（C）定位的细胞，括号中的"n"表示被分析的共转染细胞的数量。数据以平均± SEM 的形式呈现，这些数据来自三个独立的实验。P 值通过t 测试进行分析。p<0.001。秤杆，10μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.g003

LIN9 通过与培养体细胞中 MTL5 的 C 端 443-475 氨基酸的直接相互作用将 MTL5 输送到核中医学论文发表-

为了确定 MTL5 的哪些区域负责与 LIN9 的直接交互，以及随后导入到核中，我们使用 MTL5 的截断变体进行了 Y2H 筛查检测，以确定哪些区域与 LIN9 存在直接交互。MTL5 由 475 aa 组成，包含 C 区 263 aa 至 370 aa 的 CRC 域，以及 C 终点站的两个预测的氦域（从 420 aa 到 439 aa，从 444 aa 到 468 aa）。因此，我们克隆了包含 CRC 域的 MTL5-N（150 aa）、MTL5-M （251×370 aa）和包含预测的单数域的 MTL5-C （371×475 aa）的片段，进入 pGADT7 表达载体，分别产生 AD-MTL5-N （1/150 aa）、AD-MTL5-M （251×370 aa）和 AD-MTL5-C （371×475 aa）（S4A 图）。这些载体被转化为Y187酵母形成形菌株，然后与BD-LIN9杂交，后者被转化为AH109酵母形质菌株。只有通过AD-MTL5-C和BD-LIN9转化的Y187和AH109酵母形体细胞才能在双降压介质板（图4A）上生长，这表明MTL5和LIN9之间直接相互作用的区域位于MTL5 C-终端371-475 aa中。我们还克隆了LIN9（S4B图）的片段到pGBKT7表达载体，使用 AD-MTL5-C 进行了 Y2H 筛查检测，发现 LIN9 的 C 终点站（341=559 aa）区域与 MTL5-C （371=475 aa）的 C 终点站（图 4B）有直接相互作用。

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图4。LIN9 直接与 MTL5 C 端残渣 443-475 相互作用，用于将 MTL5 传输到原子核。

（A） Y2H 用于分别评估截断的 MTL5（MTL5-N、MTL5-M 和 MTL5-C）与全长 LIN9 的相互作用。MTL5-N 包含残留物 1+250 aa;MTL5-M 包含残留物 251+370 aa;MTL5-C 表示包含 371-475 aa。（B） Y2H 评估截断的 LIN9（LIN9-N、LIN9-M 和 LIN9-C）与 AD-MTL5-C （371/475 aa）之间的相互作用。LIN9-N 含有残留物 1+150 aa;LIN9-M 包含残留物 151+340 aa;LIN9-C 包含残留物 341-559 aa。（C） AD-MTL5-C1 （371/418 aa）、AD-MTL5-C2 （419/442 aa）和 AD-MTL 的相互作用 5-C3 （443/475 aa）与 BD-LIN9-C （341/559 aa）或 BD 空（控制）分别由 Y2H 评估。（A-C）中的相互作用通过双（SD-Leu/Trp，-LW）、三重（SD-His/Leu/Trp，5 mM 3-AT，-LWH）或四滴介质板（SD-Ade/His/Leu/Trp，-LWHA）的四滴介质板（SD-Ade/His/Leu/Trp，-LWHA）的生长进行测试。（D） HEK293T 细胞与编码MYC-Mtl5 -+C3的质粒短暂共通（已删除 C-终端 443 475 aa 残留物）和 GFP-LIN9。LIN9 和突变 MTL5 的本地化是通过分别对 GFP（绿色）和 MTL5 （红色）的抗体进行免疫染色检测的。HEK293T细胞的核（蓝色）与霍奇斯特33342进行了反染。计算MTL5核（N）或细胞质（C）定位的细胞，括号中的"n"表示所分析的（共）受感染细胞的数量。白色箭头表示 HEK293T 细胞中截断的 MTL5 和 LIN9 的本地化。数据以三个独立复制的± SEM 表示。P 值通过学生t测试检测到。p<0.001。秤杆，10μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.g004

更精确地映射与 LIN9 相互作用的 MTL5 区域，我们进一步克隆了MTL5 C-终端371-475 aa的三个片段到pGADT7表达载体中，生成AD-MTL5-C1（371-41） 8 aa），AD-MTL5-C2 （419/442 aa）和MTL5-C3 （443-475 aa）（S4A 图）。只有经过改造的Y187和AH109酵母形体细胞与AD-MTL5-C3和BD-LIN9-C生长在所有选择性介质板（图4C），这表明C-终端443×475aa的MTL5，其中包含第二个预测的六边形域从444aa到468aa，是其与LIN9直接相互作用的关键。

鉴于MTL5的C-终端443-475 aa是其与LIN9直接相互作用所必需的，我们假设这种直接相互作用对于MTL5从细胞质的核转移可能至关重要。为了测试这一点，我们生成了一个MYC-Mtl5-éC3矢量，该矢量编码了缺少C终端443+475 aa（S4C图）的截断MTL5，然后用GFP标记的鼠标LIN9（GFP-Lin9）向量将其转移到 HEK293T 细胞中。结果表明，LIN9未能将MTL5-+C3输送到转染细胞（图4D）的核中，但能够将截断的MTL5在其他地区删除到核（S5图）。这些结果进一步表明，MTL5 的 C 端 443/475 aa 对于从细胞质转移到细胞核至关重要，由与 LIN9 的直接相互作用进行介导。

将MTL5转移到精子细胞核中需要MTL5 C终点站，对于精子进展和精子生产至关重要

鉴于LIN9将MTL5转移到体细胞核中的功能，我们假设LIN9对于MTL5在精子细胞中的核转移至关重要。为了测试这一点，我们首先检查了LIN9是否在乳腺精子细胞中显示出核定位。LIN9的定位是在10周前的老鼠睾光中通过免疫荧光染色检测到的，我们发现在Sertoli细胞、精子和帕奇泰尼/二苯精子细胞的核中观察到LIN9信号，而在瘦素/硫酸精细胞（S6A图）中没有观察到明显的LIN9信号。此外，LIN9蛋白首次在12个 dpp 左右的精子细胞中检测到，这与 MTL5 发生核转移时在乳酸盐精子细胞中的外观一致（S6B 图）。

为了进一步测试MTL5和LIN9之间的相互作用是否对MTL5在精子细胞中的核转移也至关重要，我们生成了MTL5 C终端截断小鼠（Mtl5）c-穆/c-mu），它产生了截断的蛋白质p.Ser445Arg fs*3。据预测，这种突变会使MTL5的C终端443-475 aa内的第二个潜在氦域消融，从而废除了LIN9相互作用（图5A和5B）。同时，我们获得了MTL5淘汰小鼠（Mtl5）（S7图）。事实上，我们检测到在Mtl5中出现了预期尺寸的截断MTL5-/-c-穆/c-mu使用抗MTL5 N终端抗体（表位1 220 aa）（图5C）的西方污点测试。截断的MTL5（p.Ser445Arg fs*3）废除了它与LIN9在 HEK293T细胞中的相互作用（图5D）。MTL5 和 LIN9 之间的干扰交互在 14 dpp Mtl5中也得到了确认c-穆/c-mu小鼠睾测试（图 5E）。不出所料，我们在Mtl5的乳酸精细胞核中没有看到任何MTL5信号c-穆/c-mu使用免疫荧光染色（图5F）检查的睾片。与免疫荧光结果一致，在Mtl5的核提取物中未检测到MTL5蛋白c-穆/c-mu小鼠（图5G）。综合起来，这些结果进一步表明，MTL5的C-终端445-475 aa负责MTL5在精子细胞中的核转移，并突出了LIN9-MTL5在MTL5核运输中在精子生成过程中的重要作用。医学论文发表-

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图5。C-终点站删除了MTL5（Ser445Arg fs*3）的展品，它废除了与LIN9的相互作用，未能在MTL5中转移到精子细胞核中c-穆/c-mu小鼠。

（A）图（上图）和核苷酸序列（底部）鼠标Mtl5蝗虫从合奏数据库（ENSMUST0000025840.15）与突出编码外显子（绿色）和TAG（浅绿色）过早停止科顿的修改成绩单（底部）。帕姆，原空间器相邻主题。sgRNA，单导RNA。C木-CF 和 C木-CR 代表Mtl5突变小鼠的基因型引物。（B）突变鼠标应变，从 Exon 9 中的第 1335 位置删除 76 个基点至 1410（Mtl5）c-穆/c-mu）被桑格测序确认。Mtl5 制作的截断 MTL5 （p.Ser445Arg fs*3）中删除站点的位置c-穆/c-mu由箭头指示。（C） Mtl5、Mtl5 测试中MTL5水平的西方斑点分析+/+c-穆/c-mu，和Mtl5老鼠。SYCP3 作为负载控制，以指示细胞群的可比组成。（D）在 HEK293T 细胞中截断的 MTL5 （p.Ser445Arg fs*3）和 LIN9 在共感染后与 MYC 磁性珠子共同免疫沉淀的西方污点分析。MYC-Mtl5- c-mu 编码截断的MTL5（p.Ser445Arg fs*3）。pEGFP-N1 充当负控制。IP，免疫沉淀。IB，免疫印迹。（E）西方污点分析截断的MTL5（p.Ser445Arg fs*3）和LIN9在14 dpp Mtl5和Mtl5之间的相互作用-/-+/+c-穆/c-mu小鼠在与MTL5-N抗体共同免疫沉淀后进行睾测试。IP，免疫沉淀。IB，免疫印迹。红色箭头表示预期频段。（F） MTL5（红色）和+H2AX（绿色）在4周大的Mtl5和Mtl5睾丸部分的免疫+/+c-穆/c-mu小鼠。核被霍赫斯特 33342 （蓝色）所抵消。白色箭头表示具有完整性体的乳腺精子细胞。秤杆，50μm。（G）使用4周前Mtl5和Mtl5的细胞质和核蛋白提取物对MTL5和截断MTL5（p.Ser445Arg fs*3）进行西式污点分析+/+c-穆/c-mu鼠标睾测试。GAPDH和SYCP3分别作为细胞质和核控制。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.g005

为了确定MTL5的核转移是否需要其体内功能，我们检查了Mtl5的精子发生和肌病c-穆/c-mu小鼠，并与那些在Mtl5和Mtl5小鼠（图6）。山 5+/+-/-c-穆/c-mu小鼠的睾睾睾比Mtl5的幼鼠小，睾/体重比显著降低到2.16，这与Mtl5小鼠（图6A和6B）相当。H & E 染色显示在Mtl5的初级精子细胞阶段精子致病性逮捕+/+-/-c-穆/c-mu小鼠，这是无法区分的Mtl5小鼠（图6D）。与这些发现一致的是，在Mtl5的阴道表皮中未观察到精子-/-c-穆/c-mu小鼠，与在Mtl5小鼠考达表皮（图6C和6D）中看到的一样。这一观察也与所报道的Mtl5淘汰小鼠[21]中的观点一致。此外，所有生殖细胞都是SYCP3阳性，在Mtl5中均未观察到可检测的PNA阳性细胞-/-c-穆/c-mu和Mtl5半生管，进一步确认在Mtl5的原发性精子细胞阶段的精子发生被捕-/-c-穆/c-mu小鼠（S8图）。

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图 6.Mtl5 C 端删除导致在Mtl5的帕奇泰内阶段的精子生成逮捕c-穆/c-mu小鼠。

（A）睾膜形态、（B）睾膜/体重比率和（C） 10 周大的Mtl5、Mtl5和Mtl5的表皮精子计数+/+-/-c-穆/c-mu小鼠。（D） 10周大小鼠睾丸和表皮部分的H&E染色。秤杆，50μm。（E） 10 周大的 Mtl5、Mtl5 和Mtl5的表面传播精子细胞中的 SYCP3 （绿色）和SYCP1 （红色）免疫+/+-/-c-穆/c-mu小鼠。秤杆，10μm。（F）在美益形蛋白酶I的子阶段精子细胞的百分比。括号中的数字表示计数的精子细胞数量。数据以平均± SEM 的形式呈现，来自至少四只小鼠。单向 ANOVA 分析 P 值。*p<0.05;****p<0.0001;NS， p>0.05.

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进一步确定在Mtl5中逮捕梅西斯的确切阶段c-穆/c-mu小鼠，我们执行免疫染色SYCP3和SYCP1，同源染色体之间的突触制造者，在精子细胞传播检查在Mtl5，Mtl5的美益生菌进展+/+c-穆/c-mu，和Mtl5老鼠。结果表明，在所检查的921个肌质蛋白酶I细胞中，有207个二聚苯甲酸盐精子细胞在Mtl5睾酮中观察到，而在两个Mtl5中均未发现二聚苯细胞-/-+/+c-穆/c-mu或Mtl5睾酮后得分767和976前列腺I精子细胞，分别（图6E和6F）。与对照组相比，Mtl5中瘦素和酶精细胞的比例显著增加-/-c-穆/c-mu和Mtl5睾检由于缺乏二苯精子细胞，而乳酸盐精子细胞的比例没有显著变化，表明在Mtl5的乳酸盐精子细胞的损失-/-c-穆/c-mu和Mtl5小鼠（图6E和6F）。与此一致，TUNEL检测显示Mtl5睾片中凋细胞精子细胞的数量显著增加-/-c-穆/c-mu和Mtl5小鼠（S9图）。-/-

鉴于Mtl5不同子阶段的精子细胞比例相似c-穆/c-mu和Mtl5小鼠，我们进一步确定MTL5的C终端突变是否导致精子生成停止在同一阶段与Mtl5小鼠。首先，我们比较了睾丸组织形态部分在10，12，15，20和25天后产后（dpp）从控制，Mtl5-/--/-c-穆/c-mu，和Mtl5小鼠，并观察到核形态异常的生殖细胞从Mtl5-/-c-穆/c-mu和Mtl5小鼠自15个 dpp，这是可区分的对照小鼠，表明精子生成逮捕12至15个 dpp（在晚帕奇泰内之前）在两个Mtl5-/-c-穆/c-mu和Mtl5小鼠（S10图）。为了进一步确认在晚期帕奇泰内阶段之前的精子生成逮捕，我们在Mtl5， Mtl5上染色了H1t-/-+/+c-穆/c-mu，和Mtl5精子细胞传播（S11 图）。我们在Mtl5中没有发现具有较厚的横向元素末端或强H1t信号（晚期帕奇泰恩特性）的乳酸盐精子细胞-/-c-穆/c-mu和Mtl5小鼠，表明类似的精子生成逮捕之前，晚帕奇泰内在两个突变小鼠（S11图）。-/-医学论文发表-

检查在Mtl5中是否影响了同源重组c-穆/c-mu和Mtl5小鼠，我们数了在酶和早期乳酸盐精子细胞中，有200多块DSB标记RPA2（S12A和S12B图）和DMC1（S12C和S12D图）。在Mtl5中没有观察到RPA2或DMC1 foci数量的明显差异-/-c-穆/c-mu与野生型对照组（S12图）相比，苯甲苯和早期乳酸盐精子细胞。我们还染色了SYCP1和SYCP3，以检测Mtl5，Mtl5中乳酸盐精子细胞的突触+/+c-穆/c-mu，和Mtl5老鼠。我们发现，在大约60%的乳酸盐精子细胞中没有观察到突触缺陷，即使在残存的乳酸盐精子细胞中，突触缺陷也只涉及突变体中的一两个体细胞对（S13图）。因此，它表明，只有轻微的突触缺陷在我们的突变小鼠和这种突触缺陷不太可能是帕奇泰恩逮捕的主要原因。-/-

综合起来，这些结果表明，通过与LIN9的直接相互作用，在精子细胞中对MTL5的核转移至关重要，在精子生成、精子产生过程中，因此对男性生育能力至关重要（图7）。

图7。MTL5在调节男性梅病方面预测的简短工作模型。

C 到 N 表示从细胞质（C）到细胞核（N）的转移 MTL5。

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讨论

在本研究中，我们描述了MTL5在不同肌子阶段精子细胞中的动态定位，并强调了MTL5核转移在精子发生过程中的酶-帕奇泰恩过渡中的重要性。我们表明，MTL5蛋白积聚在瘦素和酶精细胞的细胞质中，然后开始在酶-乳酸酯过渡周围转移到精子细胞核中。进一步的实验表明，由其C终点站调解的MTL5与MUVB核心复合物的组成部分LIN9直接相互作用，通过它从细胞质中输送到精子细胞核。MTL5 突变体（删除 MTL5 的 C 端 445/475 aa）和淘汰小鼠的生殖表型表明，MTL5 在精子细胞中的核转移是 MTL5 发挥作用所必需的，由于 MTL5 C 终端 445-475 aa 的删除阻止了其核转移，并导致在精子生成期间在乳腺肿阶段出现梅氏病，与Mtl5小鼠观察到的表型完全相同。-/-

精子生成是一种复杂的发育进展，需要一系列蛋白质在细胞质和生殖细胞核之间穿梭[29]。例如，在乳酸精细胞核（G2阶段）中观察到环素D2，在拉长精子的细胞质中检测到环素D3[30，31]，而在体细胞中，D型环素通常积聚在G1阶段的细胞核中，然后在S相（32，33）开始时迅速出口到细胞质中降解，从而提出了一种调节功能蛋白核和细胞质过渡的特定机制。然而，如何实现这一机制以促进精子生成仍不得而知。在这里，我们确定了MTL5在精子细胞中的定位，并揭示MTL5开始转移到酶-帕奇泰恩过渡周围的细胞核。因此，MTL5在不同阶段精子细胞中的具体细胞质和细胞核分布为我们提供了一个新的模型，以了解精子生成过程中蛋白质细胞质-细胞核转移的机制和功能。

蛋白质转移到细胞核是一个基本过程，对细胞的基本功能至关重要。虽然许多蛋白质通过保存的核定位序列（NLS）[34，35]进入核，但在 MTL5 序列中没有观察到规范的 NLS。我们证明，MTL5细胞质-细胞核转移是由LIN9实现的，LIN9是一种核和染色质相关蛋白质[36]，通过它们的直接相互作用。防止MTL5和LIN9之间的相互作用导致MTL5的细胞质保留，从而导致精子在乳酸阶段的精子生成停止，就像在MTL5小鼠中观察到的一样。有趣的是，在野生型睾丸（S6A图）的瘦素和酶卵石精子细胞中未观察到LIN9蛋白，在12p（S6B图）左右的精子细胞中首次检测到LIN9蛋白，这与MTL5的细胞核转移一致，进一步确认 LIN9 在将 MTL5 运送到酶- 帕奇泰恩过渡周围的精子细胞核中的重要作用。因此，MTL5通过LIN9将MTL5输送到精子细胞核中，对于精子生成过程中超过乳酸阶段的肌病进展是必要的。-/-

据报道，Mtl5淘汰小鼠在乳腺阶段出现精子生成，晚期的精子细胞约18.8%和二聚苯丙烯阶段[21]。然而，我们没有发现晚期帕奇泰恩或二甘油精子细胞在Mtl5c-穆/c-mu或Mtl5小鼠。这种不一致可能是由于用于区分不同美学子阶段的标准[9，37，38] 。奥吉等人。定义晚期乳腺素和二苯精子细胞的基础上，形成一个完整的性体，这也可以观察到早期或中期的乳腺细胞[39]41]。然而，基于精子细胞传播染色突触复合物（SC）横向元素蛋白（SYCP3）和中央元素蛋白（SYCP1）以及H1t染色信号，我们没有发现任何细胞与强大的H1t信号和较厚的末端的横向元素或脱氧核动力源，晚期帕奇泰尼或二甘醇精子细胞的特征[37]，在Mtl5-/-c-穆/c-mu或Mtl5小鼠，表明在这些小鼠的晚期帕奇特内阶段之前，精子发生发生。-/-

同源重组和突触缺陷是帕奇泰内阶段梅蒂奇逮捕的两个主要原因。然而，我们检测到在Mtl5，Mtl5之间的RPA2和DMC1 foci的数量没有明显的差异+/+c-穆/c-mu和Mtl5精子细胞在zygotene和早期帕奇泰内阶段，表明在Mtl5突变体的美学逮捕不是同源重组缺陷的结果。虽然我们确实观察到Mtl5的轻度突触缺乏-/-c-穆/c-mu和Mtl5精子细胞，合成的严重程度预计不会导致美血性乳腺素逮捕[42，43]。-/-

我们已经证明，MTL5 与 MYBL1 和除小鼠睾酮和培养的人类体细胞 LIN54 以外的所有 MuvB 核心复杂组件相互作用。这种与MuvB核心综合体的互动在阿拉伯塔利亚纳[44]中得到了证明。最近已经表明，TCX5，一种特斯明/TSO1样的CXC领域含体蛋白质，是TCX5/6包含多子团复合体的组成部分，也被称为DREM复合物（含有E2F/DP-p130/p107和MuvB核心复合物的复合物）[44，16，17]。众所周知，MuvB核心复合物在细胞周期的不同阶段发挥着重要作用，通过结合和引导不同的关键转录因子到细胞周期基因的促进者[26，45，28，16，17]。在子宫内膜异位症期间，MuvB 核心复合物将 E2F/DP-p130/p107 结合，形成 DREAM 复合物，以抑制 G0 和 G1 早期阶段的细胞周期依赖基因表达，同时，它招募B-MYB（MYBL2）蛋白质在S和早期G2阶段形成Myb-MuvB（MMB）复合物，并招募FOXM1到G2/M基因的促进者激活其表达[46，26，28，17]。在美化中，删除MYBL1（A-MYB，B-MYB的参数），这是高度表达后，美学进入，也导致精子致病性逮捕之前，晚帕奇泰内阶段[47]，类似的美学逮捕阶段在MTL5缺乏小鼠，表明Myb-MuvB复合物在促进美血进展通过中期帕奇泰恩阶段的重要作用。鉴于MYBL1与睾酮中的MuvB核心复杂组件一起被MTL5拉下，我们的发现表明，MTL5对于精子生成过程中超过中丘脑阶段的梅氏病进展至关重要，其缺陷导致在乳酸杆菌的精子生成，从而导致阿祖斯珀米亚的精子生成。因此，MTL5很可能在其核转移后，通过与MuvB核心复合物的LIN9结合进行介质，与Myb-MuvB复合物一起发挥作用，在精子生成过程中促进梅氏病进展超过中段（图7）。

众所周知，环素和环素依赖激酶（CDK）是细胞周期的明确定义调节器。在梅病中，环素/CDK复合物已知具有独特的特征和要求[48，49，11，50×54，13] 。其中一些（如Ccnb1，Ccnd2和Ccnb2）只影响雌性小鼠的美血细胞周期。此外，删除Cyclin A1，这是高度表达在睾司，导致男性美学逮捕在中二苯[48，55];Cyclin E1 缺陷睾肠在形态上与野生型睾鱼一样正常，Cyclin E2 缺失导致精子成熟性逮捕[50]，而 Cyclin E1 和 E2 的双重突变导致在具有严重突触缺陷的类似乳胶的阶段出现美化逮捕[50];CDK2 对于将端粒附着在核包络上至关重要，其缺陷导致同源配对的缺陷，原因是花束形成失败[51]。鉴于Mtl5突变所导致的独特表型，我们认为MTL5通过影响以前未知的因素来调节美化进展。

MTL5 可以拉下 MuvB 核心复合体的所有组件，但 LIN54 除外，该参数为 MTL5[18，56]，在鼠标睾酮（S3 图）中以低水平表示。据报道，在体细胞中，LIN54是指导MuvB核心复合物结合细胞周期基因同源区（CHR）的关键因素，该区域是细胞周期调节基因的促进区域（18]）的一个调控元素，通过其DNA结合域（CRC域），该域与MTL5[18，57，56]共享序列相似性。因此，我们相信MTL5取代了MUVB核心复合物中LIN54的功能，然后将MuvB核心复合物引导到帕奇泰恩精子细胞中必需基因的促进者。综合起来，我们的结果表明，MTL5被LIN9转移到细胞核中，以促进乳酸阶段以外的美化进展。MTL5的功能很可能通过取代LIN54来形成一个梅氏杆菌特异性MavB核心复合物来促进梅氏细胞周期的进展。因此，我们的研究不仅确定MTL5是细胞周期进展的一种新型和生殖细胞特异性调节剂，在细胞周期进展的特定阶段发挥作用，以确保男性生育能力，而且还揭示了进一步的研究，以找到直接促进美化进展的主要调控蛋白（图7）。

材料和方法

道德声明

所有对小鼠的实验都遵循中国科技大学机构动物保护委员会的指导方针，批准编号为USTCACUC1301021。

小鼠

CRISPR/Cas9基因组编辑用于生成Mtl5敲除和突变小鼠，如前所述[58，59]。sgRNA和Cas9 mRNA被微注射到C57BL/6J小鼠的酶，然后被转移到伪怀孕的ICR雌性。基因组DNA是从创始人小鼠的脚趾活检中提取的，用于桑格测序，而异质的创始小鼠被培育出来产生同源小鼠。创始人雌性小鼠在外星 2 中删除 19 个基点，在Mtl5的外森 9 中删除 76 个基点（ENSMUST0000025840.15）被选中产生同源Mtl5敲除（Mtl5）和突变（Mtl5）-/-c-穆/c-mu）小鼠，分别。所有的老鼠都用适当的食物滋养， ddh2O 并保持在 12 小时的光佩里奥德（灯在 08：00°20：00）。本研究中使用的基因仿生和 sgRNA 的引数列在S2 表中。

血氧林和欧辛（H&E）染色和免疫造血术

这些小鼠被子宫颈错位安乐死，睾酮和表皮被分离，并立即固定在布恩的H&E染色溶液或4%的准甲醛（PFA）免疫造血术在4°C。对于免疫造血术，睾丸和表皮部分在4°C时用原发性抗体在一夜之间孵育，然后用二级抗体在37°C安装时用含有霍奇斯特33342（病毒原，H21492）的Vectashield（矢量实验室，H-1000）探测1小时。为了减少实验间的变异，同时处理了野生型、敲除和突变小鼠的睾测试。幻灯片被可视化，所有图像都是使用尼康Eclipse 80i显微镜拍摄的，该显微镜配有数码相机（尼康DS-Ri1用于H&E染色或Hamamatsu C4742-80用于免疫造血）。一些图像也使用尼康C2加共聚焦激光扫描显微镜系统拍摄。医学论文发表-

RNA 隔离和 RT-PCR

根据各自制造商的协议，使用 Trizol 试剂（TaKaRa， 9109）和 PrimeScript RT 套件（TaKaRa， RR047A）执行 RNA 提取和 cDNA 合成总量。RT-PCR 使用 EasyTaq DNA 聚合酶（TransGen 生物技术，AP111）在以下条件下执行：94°C 3 分钟，然后是 25°30 周期 30 秒在 94°C，60°C 为 30s，72°C 为 30s。我们实验室以前研究的 cDNA 模板（S1B 图）被用于 RT-PCR，如前所述[25]。用于 RT-PCR 的引数列在S2 表中。

精子细胞扩散和免疫荧光染色

精子细胞扩散准备和免疫荧光染色执行，因为我们以前描述[25，60，61]。Vectashield（矢量实验室，H-1000）用于密封幻灯片，使用连接到CCD相机的BX61显微镜（奥林巴斯）拍摄到美色细胞的图像，并使用图像-Pro Plus软件（媒体网络）进行分析。用于美学分析的抗体列在S3表中。

共免疫沉淀（共IP）和质谱

帕奇泰尼和二甘肽精子细胞使用STA-PUT方法[25]丰富，然后在冷 RIPA 缓冲器（Beyotime， P0013C）中裂解，配以苯甲基磺胺（热费舍尔，36978）和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏，04693116001）。解剖物通过 8% 脉冲对 8°10 周期（3s 开/关）进行声波处理，并在 4°C 下以 15，000 xg 离心，时间为 15 分钟。超高分子被分成两个阿利奎特，每个阿利奎特孵育与预先清除的蛋白质A/G阿加罗斯珠（圣克鲁斯，sc-2003）和2微克抗MTL5 C终端抗体（从残留物221×475的表位）或兔子IgG非特异性抗体（ABclonal，AC005）。在4°C的隔夜孵育后，在RIPA缓冲器中清洗了3次，在10mM Tris缓冲器中清洗了两次，然后免疫复合物与叶片缓冲器（0.2 M Glysine，0.15%NP-40，pH 2.3）在室温下分离出珠子。上海国家蛋白质科学中心质谱分析，对银染色样品进行验证后，对样品进行鉴定。MTL5蛋白质的候选相互作用列在S1表中。

调谐分析

细胞凋亡检测在睾丸部分通过终端脱氧核苷酸转移酶dUTP尼克端标签（TUNEL）检测根据制造商的规格（罗氏，11684795910，巴塞尔，瑞士）。这些图像是使用尼康 ECLPSE 80i 显微镜（尼康）拍摄的，该显微镜配备了 CCD 摄像机（Hamamatsu），并使用 NIS 元素显微镜成像软件（尼康）进行分析。

细胞质和核蛋白提取

细胞质和核蛋白的提取是按照制造商的规格（Beyotime，P0027）进行的。GAPDH 和 SYCP3 分别用作细胞质和细胞核的负载控制。

西方污点

西方污点进行了我们之前描述的[25]和乐队可视化和检查与化疗（GE 医疗保健，图像量LAS 4000）.本研究中使用的抗体列在S3表中。

质粒

典型的鼠标Mtl5（ENSMUST00000025840.15）全长编码序列从小鼠睾酮cDNAs反向转录，克隆成MYC标记的表达载体，由CMV宣传媒介控制，形成MYC-Mtl5。鼠标林9，林37，林52，Rbpp4，Mybl1和Lin54全长编码序列也从鼠标测试cDNAs反向转录，并克隆成 pEGFP-N1 表达载体，按照制造商的协议，通过克隆快车 II 单步克隆套件（Vazyme，C113）形成 GFP-Lin9、GFP-Lin37、GFP-Rbbp4、GFP-Mybl1 和GFP-Lin54。 MTL5-N （1+250 aa）、MTL5-M （251+370 aa）、MTL5-C1 （371+418 aa）、MTL5-C2 （419 aa） \442 aa）和 MTL5-C3 （443+475 aa）从 MTL5 中删除，用于构建MYC-Mtl5-\N、MYC-Mtl5 -?M， MYC-Mtl5-+C1， MYC-Mtl5-+C2，和MYC-Mtl5 -+C3，分别。此外，鼠标典型的Mtl5全长编码序列被融合到GAL4激活域（AD）矢量pGADT7或GAL4 BD/诱饵载体pGBKT7，形成AD-MTL5或BD-MTL5来检测自动激活。鼠标林9，林37，林52，Rbbp4和Mybl1全长编码序列被克隆成GAL4 BD/诱饵载体pGBKT7，形成BD-LIN9，BD-LIN37，BD-LIN52，BD-RBBP4和BD-MYBL1。 N （1250 aa）， M （251/370 aa）， C （371/475 aa）， C1 （371/418 aa）， C2 （419 MTL5 的 442 aa）和 C3 （443/475 aa）碎片被克隆成 pGADT7 矢量，用于构建质粒 AD-MTL5-N、AD-MTL5-M， AD-MTL5-C， AD-MTL5-C1，分别为 AD-MTL5-C2 和 AD-MTL5-C3。LIN9 的截断片段 N （1=150）、M （151/340）和 C （341=559）被克隆成 pGBKT7 矢量，用于构建 BD-LIN9-N、BD-LIN9-M 和 BD-LIN9-C。所有用于质粒结构的引物都列在S2 表中。

培养细胞中的转染、免疫荧光和共IP

HEK293T 电池（ATCC， CRL-3216）在高葡萄糖杜尔贝科的改良鹰的介质（DMEM）中培养，辅以 10% FBS （GIBCO， 15140122）与 100 U/ml 青霉素和 100 微克/毫升链霉素（GIBCO， 16000044）和保持在 5% CO2，环境 O2在37°C。细胞在解冻后至少经过两次，并以70%-80%的细胞密度转染。根据制造商的协议，转染使用脂化胺 3000（病毒素）进行。

Twenty-four hours of after transfection, cells were fixed in 4% paraformaldehyde followed by immunofluorescence. The primary antibodies were incubated at 4°C overnight and followed with secondary antibodies for 1 hr at 37°C. Finally, the cells were mounted with Vectashield. Pictures were captured using a Nikon C2 Plus Confocal Laser Scanning Microscope. The antibodies used for cell immunofluorescence are listed in S3 Table.

对于 CoIP，这些细胞在转染后 36 小时采集，并在冷前 NP-40 缓冲区（Beyotime， P0013F）中裂解，配以苯甲基磺胺（热费舍尔，36978）和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏，04693116001）。然后，Lysate 进行了离心机，1/10 卷超高分子用作输入样品。其余超高纳特与Myc-Tag（9B11）鼠标mAb（磁珠结合）（细胞信号技术，#5698）一起孵育。在4°C的夜间旋转孵育后，磁珠被冲入NP-40缓冲器，由磁架收集。蛋白质从珠子中取出，在100°C的热块上用样品缓冲10分钟。

酵母双混合

用猎物（AD）和诱饵（BD）菌株转化的酵母细胞在 2xYPDA 介质（2% 酵母提取物）中杂交， 4% 肽、4% D-葡萄糖和 0.006% 腺苷硫酸盐）在 30°C 过夜，然后杂交菌株离心，在 100 ul ddH 中重新使用2O，并稀释到不同的比率（10）0, 10+1, 10+2和 10+3）在以双（SD-Leu/Trp， -LW），三重（SD-他/卢/Trp 与 5 mM 3-AT， -LWH）或四辍学中板（SD-Ade/他/Leu/Trp， -LWHA）在 30°C 35 天传播之前。空 pGBKT7 和 pGADT7 用于测试自激活。用于酵母质粒结构的底漆列在S2 表中。

统计分析

使用单向 ANOVA 对野生类型、敲除或突变小鼠进行了睾膜/体重比、精子细胞比例、TUNEL 阳性管状和细胞分析、RPA2 和 DMC1 卵石分析、H1t 染色分析和突触缺陷分析。通过学生 t 测试分析具有不同 MTL5定位的共转染细胞的百分比。研究结果以SEM±表示，统计意义设定为P<0.05。

支持信息

The expression of MTL5 in mouse tissues and male germ cells.

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S1 图。MTL5在小鼠组织和雄性生殖细胞中的表达。

（A） 10周大雄性小鼠不同组织中MTL5蛋白的西方斑点分析。（B） 8、10、12、15、20和25 dpp 鼠睾测试中MTL5蛋白质的西性斑点分析（高暴露表明8个 dpp 中没有带）。β-阿克廷作为装载控制。（C）纯化小鼠精子细胞中Mtl5 mRNA（ENSMUST0000025840.15）的RT-PCR分析。SC、Sertoli细胞;PL、前瘦素精子细胞;pLZ、青春期瘦素和二甘肽精子细胞;pPD、青春期乳酸盐和二甘肽精子细胞;aPD、成人乳酸盐和二甘肽精子细胞;Rs，圆形精子。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s001

（蒂夫）

**S2 图。林54在不同小鼠组织中的表达。**

RT-PCR分析Mtl5和Lin54在10周大小鼠不同组织中的表情。Actb作为内部参考。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s002

（蒂夫）

S3 图。MTL5 直接与 LIN9 和 RBBP4 交互。

AD-MTL5 与 BD-LIN9、BD-LIN37、BD-LIN52、BD-RBBP4 的相互作用， BD-MYBL1，或空控制（pGBKT7）由Y2H系统评估，在双（SD-Leu/Trp，-LW），三重（SD-希/卢/Trp与5mM 3-AT，-LWH）或四（SD-阿德/他/柳/Trp，-LWHA）辍学介质板与不同的稀释。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s003

（蒂夫）

S4 图。为 Y2H 和 HEK293T 细胞转染检测而构建的质粒。

（A）全长和截断的MTL5被克隆到GAL4激活域（AD）矢量pGADT7生成AD-MTL5， AD-MTL5-N （1/250 aa）、AD-MTL5-M （251-370 aa）、AD-MTL5-C （371/475 aa）、AD-MT L5-C1 （371/418 aa）、AD-MTL5-C2 （419-442 aa）或 AD-MTL5-C3 （443/475 aa）。（B）全长和截断的LIN9被克隆成GAL4 BD/诱饵载体pGBKT7，生成BD-LIN9、BD-LIN9-N（1+150 aa）、BD-LIN9-M（151+340 aa）或BD-LIN9-C（341+559 aa）。（C） MTL5-N （1+250 aa）、MTL5-M （251+370 aa）、MTL5-C1 （371+418 aa）、MTL5-C2 （419 aa） \442 aa）或 MTL5-C3 （443+475 aa）从MYC-Mtl5中删除，以生成 MYC-Mtl5 -\N、MYC-Mtl5 -\M， MYC-Mtl5-+C1， MYC-Mtl5-+C2，或 MYC-Mtl5- +C3，分别。灰色框表示充满赛斯泰因的域（CRC）。绿色和红色框表示包含瑞航-MODEL 预测的单数域的区域。德尔，删除; aa，氨基酸。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s004

（蒂夫）

S5 图。培养细胞中截断的MTL5蛋白的本地化。

HEK293T 细胞暂时被质粒编码（A） Myc-mtl5 -\N 短暂地瞬时感染，（B）仅 Myc-mtl5-ü M，（C） Myc -mtl5-+C1 和（D） Myc -mtl5- +C2 单独，或与 Gfp -Lin9质粒一起。MTL5 和 LIN9 蛋白质通过免疫染色物对 MTL5 （红色）和 GFP （绿色）进行检测，并通过共聚焦激光扫描显微镜分析蛋白质本地化。核（蓝色）与霍奇斯特33342相反。括号中的"n"表示分析的共转染细胞数量。数据以平均± SEM 的形式呈现，用于三个独立实验。*p<0.01;***p<0.001;***p<0.0001。P 值由学生的 t 测试决定。秤杆，10μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s005

（蒂夫）

S6 图。鼠标测试中 LIN9 的本地化和表达。

（A）从10周大的野生小鼠身上对LIN9（红色）和+H2AX（绿色）睾丸部分进行免疫。核被霍赫斯特 33342 （蓝色）所抵消。红色箭头表示 Sertoli 细胞。绿色箭头表示精子。白色箭头表示瘦素或酶卵石精子细胞;黄色箭头表示帕奇泰尼或二甘油精子细胞。秤杆，50μm。（B）西方斑点分析8个 dpp、10 dpp、12 dpp、14 dpp、20 dpp 和成人（10 周大）小鼠睾酮的四倍体生殖细胞（原精子细胞）中的 LIN9 蛋白质。4C DNA含量代表由荧光激活细胞分拣（FACS）富集的四倍体精子细胞。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s006

（蒂夫）

**S7 图。Mtl5 淘汰（Mtl5）小鼠的一代。*-/-***

（A）图（上）和核苷酸序列（底部）的鼠标Mtl5蝗虫取自合奏数据库（ENSMUST0000025840.15）与外显子（绿色盒）和TGA（红色）过早停止科顿的修改成绩单。CF 和 CR 代表Mtl5淘汰鼠标的基因型引物。帕姆，原空间器相邻主题。sgRNA，单导RNA。PCR （B）和桑格测序（C）确认了从外森 2 位置 498 到 516 开始的 19 bp 删除鼠标应变。（D）对具有相应基因型的10周大小鼠睾片中的MTL5表达的西方斑点分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s007

（蒂夫）

**S8 图。山 5c-穆/c-mu老鼠不能产生精子和精子。**

从10周大的Mtl5，Mtl5的PNA（红色）和SYCP3（绿色）睾丸部分的免疫+/+c-穆/c-mu，和Mtl5老鼠。核被霍赫斯特 33342 （灰色）所抵消。白色虚点框中的细胞被放大到一边。秤杆，50μm。-/-

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s008

（蒂夫）

**S9 图。Mtl5中增大的凋亡c-穆/c-mu和*Mtl5鼠标睾测试。-/-***

（A） Tunel 对Mtl5的检测， Mtl5+/+c-穆/c-mu和Mtl5鼠标睾丸部分。红色，TUNEL 正细胞。秤杆，50μm。（B-C）在Mtl5，Mtl5中，具有TUNEL阳性细胞的管状细胞百分比和每个管子的TUNEL阳性细胞数量-/-+/+c-穆/c-mu，和Mtl5睾测试。括号中的数字表示已计数的管子数量。数据以平均值± SEM 表示。P 值由单向 ANOVA 分析。p<0.0001：NS， p>0.05.-/-

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s009

（蒂夫）

S10 图。产后控制中的精子生成， Mtl5c-穆/c-mu和***Mtl5老鼠。-/-***

H-E 从控制睾丸部分染色， Mtl5c-穆/c-mu和Mtl5小鼠在指示的年龄。红箭表示精子细胞。黄色箭头表示元相精子细胞。蓝色箭头表示圆形精子。黑箭表示具有高度浓缩色质（凋亡细胞）的精子细胞。秤杆，50μm。-/-

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s010

（蒂夫）

S11 图。在***Mtl5的晚期帕奇泰内阶段之前，精子生成被捕c-穆/c-mu和Mtl5老鼠。-/-***

（A）从10周大的Mtl5，Mtl5的乳腺精子细胞上对SYCP3（红色）、H1t（绿色）和+H2AX（蓝色）进行免疫+/+c-穆/c-mu和Mtl5老鼠。N，H1t 阴性;P， H1t 阳性。（B） 10周大Mtl5，Mtl5中H1t阴性乳酸盐精子细胞的百分比-/-+/+c-穆/c-mu和Mtl5老鼠。括号中的数字表示计数的细胞数。数据以平均值± SEM 表示。P 值由单向 ANOVA 分析。p<0.0001：NS， p>0.05.秤杆，10μm。-/-

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s011

（蒂夫）

**S12 图。美学重组在Mtl5中未受影响c-穆/c-mu和*Mtl5老鼠。-/-***

在10周大的Mtl5，Mtl5中对RPA2（A、B）和DMC1（C，D）进行免疫和量化+/+c-穆/c-mu和Mtl5酶精苯和早期乳酸盐精子细胞。数据以平均值± SEM 表示。P 值由单向 ANOVA 分析。NS， p>0.05.秤杆，10μm。-/-

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s012

（蒂夫）

**S13 图。Mtl5中的轻度突触缺陷c-穆/c-mu和*Mtl5帕奇泰恩精子细胞。-/-***

（A） MTL5中 SCYP1 （红色）和 SYCP3 （绿色）的免疫+/+c-穆/c-mu和Mtl5帕奇泰恩精子细胞。白色点缀椭圆形表示自体对的合成。秤杆，10μm。（B）具有有缺陷的自体突触双价体的细胞百分比。括号内分析的细胞数量。-/-

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s013

（蒂夫）

S1 表。27种候选蛋白质（独特的肽>2）与质谱学鉴定的MTL5相互作用。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s014

（多克克斯）

S2 表。本研究中使用的引数。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s015

（多克克斯）

S3 表。本研究中使用的抗体。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009753.s016

（多克克斯）

确认

我们感谢上海国家蛋白质科学设施（NFPS）的质谱系统检测IP-MS。

引用

00001. 1.阿加瓦尔 A，穆贡德 A，哈马达 A，查特先生。全球男性不孕不育的独特观点。雷普罗德生物内分泌醇。2015;13:37.下午：25928197

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医学论文发表-MTL5从细胞质中核转移需要它与LIN9的直接相互作用，对男性的肌病和生育能力至关重要

MTL5从细胞质中核转移需要它与LIN9的直接相互作用，对男性的肌病和生育能力至关重要

这是一个未经纠正的证据。

数字

抽象

作者摘要

介绍

结果

MTL5 在酶-帕奇泰恩过渡期间从细胞质转移到精子细胞核

MTL5 由 MuvB 核心复合组件 LIN9 运送到原子核中

LIN9 通过与培养体细胞中 MTL5 的 C 端 443-475 氨基酸的直接相互作用将 MTL5 输送到核中医学论文发表-

将MTL5转移到精子细胞核中需要MTL5 C终点站，对于精子进展和精子生产至关重要

讨论

材料和方法

道德声明

小 鼠

血氧林和欧辛 （H&E） 染色和免疫造血术

RNA 隔离和 RT-PCR

精子细胞扩散和免疫荧光染色

共免疫沉淀（共IP）和质谱

调谐分析

细胞质和核蛋白提取

西方污点

质 粒

培养细胞中的转染、免疫荧光和共IP

酵母双混合

统计分析

支持信息

S1 图。MTL5在小鼠组织和雄性生殖细胞中的表达。

S2 图。林54在不同小鼠组织中的表达。

S3 图。MTL5 直接与 LIN9 和 RBBP4 交互。

S4 图。为 Y2H 和 HEK293T 细胞转染检测而构建的质粒。

S5 图。培养细胞中截断的MTL5蛋白的本地化。

S6 图。鼠标测试中 LIN9 的本地化和表达。

S7 图。Mtl5 淘汰（Mtl5） 小鼠的一代。-/-

S8 图。山 5c-穆/c-mu老鼠不能产生精子和精子。

S9 图。Mtl5中增大的凋亡c-穆/c-mu和Mtl5鼠标睾测试。-/-

S10 图。产后控制中的精子生成， Mtl5c-穆/c-mu和Mtl5老鼠。-/-

S11 图。在Mtl5的晚期帕奇泰内阶段之前， 精子生成被捕c-穆/c-mu和Mtl5老鼠。-/-

S12 图。美学重组在Mtl5中未受影响c-穆/c-mu和Mtl5老鼠。-/-

S13 图。Mtl5中的轻度突触缺陷c-穆/c-mu和Mtl5帕奇泰恩精子细胞。-/-

S1 表。27种候选蛋白质（独特的肽>2）与质谱学鉴定的MTL5相互作用。

S2 表。本研究中使用的引数。

S3 表。本研究中使用的抗体。

确认

引用

小鼠

血氧林和欧辛（H&E）染色和免疫造血术

质粒

**S2 图。林54在不同小鼠组织中的表达。**

**S7 图。Mtl5 淘汰（Mtl5）小鼠的一代。*-/-***

**S8 图。山 5c-穆/c-mu老鼠不能产生精子和精子。**

**S9 图。Mtl5中增大的凋亡c-穆/c-mu和*Mtl5鼠标睾测试。-/-***

S10 图。产后控制中的精子生成， Mtl5c-穆/c-mu和***Mtl5老鼠。-/-***

S11 图。在***Mtl5的晚期帕奇泰内阶段之前，精子生成被捕c-穆/c-mu和Mtl5老鼠。-/-***

**S12 图。美学重组在Mtl5中未受影响c-穆/c-mu和*Mtl5老鼠。-/-***

**S13 图。Mtl5中的轻度突触缺陷c-穆/c-mu和*Mtl5帕奇泰恩精子细胞。-/-***