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《医学论文发表-由 MyoD-Dll1 轴连接的凹口信号和肌生成的反馈调节》

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《医学论文发表-由 MyoD-Dll1 轴连接的凹口信号和肌生成的反馈调节》期刊在线投稿系统

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《医学论文发表-由 MyoD-Dll1 轴连接的凹口信号和肌生成的反馈调节》期刊简介

医学论文发表-由 MyoD-Dll1 轴连接的凹口信号和肌生成的反馈调节

· 张海峰，

· 尚仁杰，

· 毕鹏鹏

· 发布时间： 2021年8月9日

、

抽象

肌肉前体细胞称为肌细胞，对肌肉发育和再生至关重要。冠状信号是一种古老的细胞间通信机制，在控制肌质的肌原程序方面起着突出的作用。目前，肌原线索是否以及如何反馈以细化这些细胞中的 Notch 活动在很大程度上还不得而知。在这里，通过小鼠和人类基因增益/功能丧失研究，我们报告说，MyoD直接打开诺奇-利甘德基因Dll1的表达，激活诺奇通路，以防止在相邻的肌细胞中发生可预示的分化，同时自主抑制诺奇，以促进Dll1表达细胞中的致密程序。机械学方面，我们通过描述新颖的E-box缺陷小鼠模型的肌生成，以及通过CRISPR介导干扰在人体细胞中形成的MyoD-Dl1°Inch轴背后的cis-监管DNA图案进行了研究。这些结果揭示了调解对位和肌生成的相互控制的关键转录机制。

作者摘要

骨骼肌组织在发育和再生过程中的形成是通过控制肌肉特异性转录因子（包括 MyoD 基因）的表达水平来精心策划的。先前的研究已经确定了诺奇信号的关键功能，这是一种进化保存的细胞通信途径，在阻断MyoD和功能性肌肉细胞的生成方面。因此，在肌原体形成之初，需要降低诺奇通路的活性，以促进肌部表达，从而诱导肌肉结构基因的表达。在这里，我们确定了一个关键的调控机制，MyoD直接诱导Dll1基因的转录，编码一个经典的一流配体。有趣的是，Dll1可以抑制诺奇细胞自主促进肌肉细胞分化，同时激活邻近细胞中的凹点，以阻止其肌原分化。MyoD-D01-缺口基因控制轴的发现填补了我们对肌原体分子调控的理解知识空白。

引文：张H，尚R，毕P（2021）通过MyoD-Dll1轴连接的凹口信号和肌生成的反馈调节。PLoS基因17（8）：e1009729。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009729

编辑：安东尼·菲鲁利，美国印第安纳波利斯普渡大学

接收：2021年3月16日：已接受：2021年7月20日：已发布：2021 年 8 月 9 日

数据可用性：所有相关数据均在手稿及其支持信息文件中。

资金：这项工作得到了从佐治亚大学到P.B启动基金的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备手稿方面没有作用。

竞争利益：作者宣称不存在相互竞争的利益。医学论文发表-

介绍

骨骼肌约占成人体重的40%。肌生成涉及一系列事件，从主转录调节器（包括 Pax7 和肌肉调节因子（MRF）对肌肉谱系的规范开始，然后是建立肌肉结构和功能的大量基因的表达[1]6]。在成人组织中，肌肉干细胞通常保持静止状态，但可以通过损伤迅速激活，然后干细胞进入细胞周期，生成一组前体，这些前体要么分化以修复肌纤维，要么自我更新以补充干细胞库[7，8]。肌肉干细胞这些不同状态的精确控制是适当的组织平衡的关键[9]11]。

冠状信号是一种古老的细胞间通信机制，它决定了元子中各种组织类型的细胞命运[12]15]。此路径的改变突出了疾病和癌症的范围[16]20] 。将 Notch 信号导入时，将 Notch 受体与位于相邻细胞上的配体（14， 21）结合启动。凹口配体是DSL（德尔塔/塞拉特/LAG-2）家族蛋白的成员，包括哺乳动物中的德尔塔类（Dll1、Dll3、Dll4）和锯齿状（Jag1，Jag2）。带状配体的内分泌产生机械拉力，驱动诺奇受体的构象变化[22]。这有利于诺奇受体的后续蛋白解裂，并产生诺奇细胞内域（NICD）[23]。作为转录激活器，NICD 然后转移到细胞核，在那里它与 Rbpj 结合，并招募一个转录复合体来激活下游目标的表达，包括 Hairy/增强器的分裂（Hes）和与 YRPW 主题（嘿）家族基因相关的 Hes [24]。尽管设计简单，但 Notch 信号的生物功能高度依赖上下文[12， 25]。这在一定程度上是由于在各种生物过程中信号的多功能配体利用[25， 26]。

在骨骼肌中，诺奇被公认为肌原分化的有力抑制剂[27]31]。基因研究还揭示了这种信号通路在增强肌肉干细胞静止状态方面的关键范例[30， 32]35] 。值得注意的是，在小鼠中删除 Rbpj 或 Notch-ligand Dll1 会导致肌肉祖细胞耗尽，并伴有严重的肌肉萎缩和肌肉再生失败[30， 36]38] 。另一方面，肌细胞中诺奇的构成激活足以诱导细胞分化，重新表达干细胞标记[39]。一流的信号对于建立一个控制肌肉干细胞功能的专门微环境或利基也至关重要[40]42]。在接近干细胞时，来自微血管的内皮细胞可以提供激活诺奇并维持肌肉干细胞静止状态的诺奇-利甘Dll4 [43]。同样，区分肌肉细胞也可以通过提供Dll1[44， 45]来传达自我更新的信号。虽然Dll1和Dll4似乎对小鼠的骨骼肌肉细胞具有类似的功能，但这些配体在调节肌生成方面对立的功能在小鸡阴郁中被识别出来[46]。

目前，核心肌原计划是否以及如何反馈以抑制诺奇活动在很大程度上仍不得而知;以及这种互惠调节如何决定肌细胞的分化动力学。在这里，通过人类和小鼠细胞的基因增益/功能丧失研究，我们解开了MyoD在控制Dll1表达和诺奇活性方面的关键作用。引人注目的是，在鼠标或人类肌细胞中删除 MyoD 废除了 Dll1 表达，而在成纤维细胞中，MyoD 的强制表达强烈诱导了 Dll1 转录。利用一条新颖的突变鼠标线，我们还探索了 MyoD 控制 Dll1 表达的cis监管元素。利用异种细胞混合实验，我们报告了Dll1在诺奇转导上的阴性抑制和转激活作用，从而可以在肌细胞的亚群中建立不同的致密程序。这些结果为老鼠和人类的肌原体的进化保存控制机制提供了见解。

结果

在人和鼠标肌生成过程中，强烈感应凹口配体 Dll1 表达

根据生物背景[26，47]，衣着不均或不同功能。为了了解哪些诺奇配体可以参与人类致密计划，我们进行了基因表达分析，这些肌细胞来自健康捐赠者，如前所述[48，49]。值得注意的是，这些细胞显示出强大的致肌和致菌潜力（图1A）。在三天的诱导后不久，可以观察到包含数百个核的巨大肌素+合成（图1A），并伴有肌原蛋白（MyoG）和肌素表达（图1B）的提示诱导。因此，这些人类肌质可以作为解剖人类肌原体遗传机制的理想模型。医学论文发表-

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图1。小鼠和人类细胞中通过致肌线索对Dll1表达的强力诱导。

(A）人类肌瘤在文化中表现出高致肌和致菌潜力。GFP 给细胞贴上了标签，以便在分化的早期阶段可视化同步。秤吧，100μm。（B）肌素（MF20 抗体）和肌生成素（MyoG）在人类肌质的不同分化阶段的西式印迹结果。（C）人类肌细胞分化过程中的诺奇配体基因的 qPCR 结果。生长培养条件下每个基因的Ct值（时间 0）为Dll1 （25.6）、Dll3 （26.8）、Dll4 （32.4）和Jag1 （28.6）。未检测到Jag2表示式。（D， E）在小鼠肌细胞分化（D， GSE20846）和肌肉再生（E， GSE97764）期间，诺奇利甘基因和凹槽靶海尔的 RNA 测序结果。CTX（心毒素）样本来自受伤后的第3天。FC ，表情折变。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009729.g001

在所有五个一流的配体中，DLL1的表达是人类肌细胞分化后36小时（图1C）的最高诱导和峰值。其表达随后被调低（图1C）。相比之下，JAG1的表达被诱导到肌细胞分化的后期阶段。同时，我们还通过查询先前研究产生的RNA-seq数据集[50，51]，检查了小鼠体外肌原分化和体内肌肉再生过程中的诺奇配体基因的表达模式。与人类数据类似，Dll1和Jag1的表达在小鼠肌质（图1D）的分化后迅速引起，尽管只有Dll1在肌肉再生过程中显示出显著增加（图1E）。在这些致肌条件下，规范性冠状目标基因海尔的表达也得到了显著的调节（图1D和1E）。这些结果表明，Dll1在控制各种哺乳动物物种的肌原体方面可能起到进化保护的作用。

DLL1 转活抑制人类肌细胞分化的凹点信号

根据选择模型，Dll1 激活 Notch 要么促进鸡的肌生成[46]或抑制小鼠的肌生成[37， 44]。为了探讨Dll1在凹口信号和人类肌生成规则中的作用，我们建立了独特的细胞混合和基因表达检测（图2A）。首先，我们在小鼠成纤维细胞中过度表达Dll1，这些成纤维细胞后来与人类肌瘤共同培养。从混合培养中收集RNA，并用于测量与人类序列特定引数的诺奇靶基因表达。这使我们能够测量人类肌瘤中的诺奇活性，而不用强迫它们与成纤维细胞分离。鉴于 Notch 激活严格要求相邻细胞之间的物理接触，此实验设计避免了从基因表达分析之前必须首先分离细胞的场景中对 Notch 信号的潜在干扰。

图2。Dll1 转活抑制人类肌原分化的凹点。

(A）异种细胞混合测定和点信号通路的原理图。（B） DNA电泳结果验证了人类qPCR引物的特异性。（C）人类HEY1和HEYL使用 B. 细胞测试的引数的 qPCR 结果在混合后 24 小时内进行分化。EV：空控制载体。指示的细胞类型的存在或不存在分别通过正负符号表示。n = 3.（D）在单独或混合培养条件下的老鼠成纤维细胞和人类肌瘤的荧光图像。人类肌质被红色荧光蛋白樱桃标记：小鼠成纤维细胞（10T1+2）被控制（EV）或 Dll1 表示逆转录病毒感染。细胞分化24小时。秤杆，25μm。（E）肌细胞的量化结果，如 D. n = 3 所示。（F）肌素免疫染色人类肌细胞，分化96小时。秤吧，100μm。（G）测量肌细胞融合，如在F.n.=3。（H， I） qPCR 在将培养物与成纤维细胞混合后，对原发性小鼠肌瘤中的基因进行结果。数据是指± SEM. *P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001。ns，不重要。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009729.g002

我们选择了诺奇靶基因 HEY1 和 HEYL 来测量诺奇活性，因为它们在人类肌质中表达得非常丰富，而 qPCR 引数的物种特异性得到确认（图 2B）。通过这些实验，我们检测到HIY1和HIL表达在人类肌瘤中的戏剧性诱导，当与表达Dll1（图2C）的小鼠成纤维细胞共同培养时，表明Dll1能够在人类肌肉细胞中转活诺奇通路。

我们继续通过研究Dll1对肌原分化的影响来解剖它在人类肌体中的生物功能。人类肌瘤被预先贴上红色荧光蛋白樱桃的标签，并与小鼠Dll1+成纤维细胞混合后诱导分化。值得注意的是，这种共同培养计划强烈抑制肌原分化，通过大幅削减肌G和肌素表达（图2D-2F）来证明这一点。因此，肌细胞融合，骨骼肌生成的标志，被完全废除时，细胞与Dll1+成纤维细胞（图2F和2G）共同培养。医学论文发表-

除了抑制肌原分化之外，诺奇信号对于维持肌肉干细胞的静止和Pax7的表达也至关重要，Pax7是肌肉干细胞的忠实标记和主要调节器[52]。由于不朽的人类肌瘤不表达Pax7，我们选择了原鼠肌瘤来检查Dll1-转导的T琴在肌肉干细胞标记表达上的作用。不出所料，当这些细胞与Dll1+成纤维细胞混合时，Pax7的表达显著增加，与其他标记一样，这些标记要么完全（Calcr，Tenm4），要么由静止的肌肉干细胞（图2H和2I）表达。

Dll1 ***cis*- 抑制凹点，促进人类肌原分化**

Dll1 表达可以通过肌原刺激在肌细胞中迅速诱导。鉴于诺奇具有强大的抗致密活性，通过在 Dll1+ 肌细胞内发出信号来进行放任性凹槽激活会导致终止肌原分化。因此，我们假设 Dll1+ 肌细胞可以采用内在机制来逃避凹槽激活，以完成肌原程序。

有趣的是，Dll1在人类肌质中的强迫表达显著减少了诺奇靶基因HEY1、HEYL和 HES1的表达，分别减少了 75%、45% 和 70%（图 3A）。这一结果暗示了Dll1的抑制作用，即信号接收器细胞中的异位配体表达阻止了来自发送者的信号，这种模式以前在其他发育过程中被报道过[53]。为了证明这一点，我们再次采用异种细胞混合实验，可以区分Dll1（图3B）的阴性效应和跨效应。一贯地，在小鼠成纤维细胞中过度表达Dll1可以忠实地激活人类肌瘤中的凹口，通过诱导HEY1和HEYL表达（图 3C），伴随着 MyoD 表达（图 3D/3F）和肌细胞融合（图3E 和 3G）的大幅减少。不出所料，Dll1的这种跨作用效应被γ-秘密酶抑制剂DAPT（图3E-3G，第5组对4）废除。有趣的是，类似于DAPT，人类肌瘤（信号接收器）中Dll1的强制表达也阻止了诺奇激活，并恢复了MyoD表达、肌原分化和肌细胞融合（图3C-3G，第6组对4）。这些结果共同揭示了Dll1的抑制作用，它阻止了凹点激活，同时促进肌原分化。

图3。Dll1 cis- 抑制凹点信号，促进人类肌细胞分化。

(A） qPCR 结果的凹口目标基因在人类肌质的反应 Dll1 过度表达。细胞在生长介质中培养。（B）在人类肌细胞中对C+G.（C，D）的C+（C，D）的间质靶基因 HEY1/HEYL （C）和MyoD （D）的相对mRNA水平进行异种细胞混合测定。细胞分化24小时。n = 3.（E）小鼠成纤维细胞（10T1+2）和人类肌瘤在单独或混合培养条件下的荧光图像。人类肌质被红色荧光蛋白樱桃标记：小鼠成纤维细胞或人类肌瘤被控制（EV）或 Dll1 感染，表示逆转录病毒。细胞在感染后的第2天混合，然后肌原分化24小时（上）或96小时（底部）。秤吧，100μm。（F）肌D? 细胞的量化结果（如 E（上）。n = 3.（G）聚变指数和每人类肌管同步的核数的测量，如E（底部）。细胞分化96小时。第 1+6 组的治疗对 E+G. n = 3 组相同。数据是指± SEM. *P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009729.g003

**从人类肌细胞中删除DLL1会消除其对 Notch 信号的跨激活和cis抑制作用**

为了研究内源性DLL1在人类肌细胞中的作用，我们进行了DLL1功能丧失研究，由CRISPR/Cas9介质突变（图4A）。首先，人类肌瘤被转录为伦蒂病毒，提供Cas9的表达和一对引导RNA（gRNA），针对DLL1基因（图4B）的编码外显子4。后来，我们获得了肌细胞克隆，在CRISPR治疗（图4A）后从单细胞分离中扩展。PCR （图 4C）和测序（图4D）的基因型分析显示，在一个DLL1敲除克隆（DLL1）中，胆囊帧移位突变科).可能是由于无稽之谈导致的信使RNA衰变，DLL1在DLL1中的表达科与仅用Cas9（图4E）转导的克隆相比，肌质减少了87%。不出所料，当DLL1在人类肌质中被删除时，混合培养中从人类到小鼠细胞的Tch信号受到了损害（图4F）。小鼠肌瘤的阻尼性水平也伴随着Pax7（图4G和4H）的较低表达水平和更高的肌原分化标记的表达水平，例如MyoG和Myh3（图4I）。因此，这些结果证实了DLL1对诺奇和致肌基因表达的转化作用。

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图4。DLL1 在人类肌细胞中的功能丧失研究。

(A） CRISPR/Cas9方法的原理，从人类肌质中生成基因敲击克隆。（B）人类DLL1基因结构的示意图和外系4中的gRNA序列。（C） DLL1基因型 PCR 的 DNA 电泳结果。（D）桑格测序分析人类DLL1基因型PCR产品。在 exon 5 和 Exon 7 中分别检测到未成熟止损的 95 bp 和 19 bp 等位基因。（E）使用位于外向 3 （向前）和外向 4 （反向）中的引子测量DLL1的 qPCR 结果。DLL1共有 11 个外长。（F， G） qPCR 结果为小鼠肌细胞中的基因，与指示基因型的人类肌质共同培养。（H）从小鼠/人类肌质的混合培养中对蛋白质解质的西式印迹分析。请注意，不朽的人类肌瘤不会表达Pax7。（I） qPCR 结果为小鼠肌细胞中的基因，这些基因与指示基因型的人类肌细胞共同培养。（J）测量 Wt 或 Dll1 中 HEY1 和 HEYL 表达的 qpcr 结果科人类肌瘤后，与 Dll1 + 成纤维细胞共同培育。（K）肌素免疫染色人肌细胞。（L）肌素? 细胞的量化，如面板 K. n = 3。数据是指± SEM. *P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009729.g004

从历史上看，他们的配体对 Notch 的抑制研究一直基于过度表达策略 [53]。我们希望通过比较 WT或DLL1 来研究 DLL1 在其内源表达水平上的抑制作用科成肌细胞。为了实现这一目标，我们共同培养了人类WT或DLL1科肌瘤与 Dll1 + 成纤维细胞，作为信号发送者。事实上，在Dll1中，凹点目标基因Hey1和Heyl的表达水平科肌瘤与成纤维细胞混合后明显高于 WT 肌瘤（图 4J）。较高的凹点水平与DLL1的致肌潜力的大幅降低有关科肌质（图 4K 和 4L）。这些结果验证了DLL1对诺奇的细胞自主抑制，这对正确诱导肌原分化至关重要。

到目前为止，我们的结果表明，只有 Dll1+ 接收器和 Dll1+ 发送者单元之间的信号才有效，而 Dll1+ 发送者单元之间的信号效果较差。加强信号定向性，我们表明，通过直接表达NICD来重新概括的凹槽激活，在人类肌细胞中降低调节DLL1表达87%，同时对肌原分化和标记表达（S1图）的剧烈抑制。因此，凹口效应器NICD和配体Dll1可以相互抑制对方的丰度，从而在人类肌质中建立凹口极性。

**Dll1 的Cis抑制作用由其细胞外域进行调解**

在配体受体相互作用之后，Notch 活动可以沿着信号转导通路的多个步骤进行改进[14]。为了探索 Dll1 对诺奇施加抑制作用的阶段，我们单独或与 Dll1 一起在人类肌质中表示 Nicd 。回顾诺奇激活的影响，NICD的表达显著诱导了诺奇目标的表达，并阻止了肌D/MyoG和肌原分化（图5A和5B）的表达。值得注意的是，Dll1 的共同表达未能减轻 NICD （图 5A 和 5B）的这些影响。因此，Dll1可抑制NICD 生成上游的凹沟。

图5。Dll1 的细胞外域是用于抑制凹点的cis。

(A）单单或与 Dll1. 比例栏 100 μm 一起具有 NICD 逆转录病毒表达的人类肌细胞的免疫染色结果。（B）单体或与 Dll1 一起具有逆转录病毒表达的人类肌质的 qPCR 结果。n = 3.（C）一级信号和细胞混合实验的示意图。（D/F）肌素免疫染色（D）和 qPCR （E， F）的结果共同培养肌细胞 - 纤维细胞与全长或变异 Dll1 蛋白质的表达。EV，空矢量控制。请注意，删除细胞外域会废除 Dll1.（G）肌细胞融合的cis抑制功能，如面板 D 所示。第 1 组的治疗组 1+5 中的治疗对于面板 D+G. 数据是± SEM. *P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001。ns，不重要。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009729.g005

先前对 Notch 配体受体相互作用的结构研究表明，配体的跨和 cis效应都通过与 Notch 受体结合的细胞外域进行[53， 54]。为了验证此模型，我们使用了DLL1科肌细胞检查突变Dll1蛋白的抑制功能，其中细胞外或细胞内域被移除（图5C）。作为对实验设计的验证，我们表明成纤维细胞中Dll1的过度表达（图5D+5G，第2组对1）可以持续调节肌瘤中诺奇目标基因的表达，并阻止其肌原分化和融合：当 DLL1 中重新表示全长 Dll1 时，可以废除此类更改科肌质（图 5D/5G，组 3 对 2）.在此背景下，删除Dll1蛋白的细胞外域但非细胞内域废除了Dll1（图5D+5G，组4/5对3）的调节功能。因此，与以往在非肌肉细胞中的生化研究一致，肌质中的Dll1也通过细胞外域的作用发挥cis调节功能。医学论文发表-

肌病是Dll1表达在人和老鼠肌细胞的关键调节器

鉴于Dll1在人类肌细胞中的重要作用，我们继续剖析控制其表达的转录机制。在肌原分化期间，Dll1 的强力诱导表明，肌原调节器（例如 MyoD 和 MyoG）可以直接控制 Dll1 转录。支持这一概念，MyoD或MyoG的共同表达可以恢复Dll1表达（S1C图），以及被NICD表达（S1D 图）阻止的人类肌细胞的肌原分化。

为了直接检查监管关系，我们生成了鼠标和人类MyoD科肌质跟随CRISPR-Cas9工作流程（图6A）。对于小鼠MyoD基因，从第一个编码外例中选取了一个 gRNA 作为靶向。克隆扩张后，通过测序进行基因描述分析显示 MyoD ORF （图 6B）的中断。结果，MyoD蛋白从肌D中耗尽科免疫染色（图6C）显示的肌细胞。值得注意的是，MyoD的失活显著降低了调节Dll1表达（图6D），伴随着海1和海尔表达（图6E）的大幅减少。相比之下，Hes1的表达显示出下降的趋势，但与对照组（图6E）相比，在统计学上没有显著性。

图 6.肌病对小鼠肌细胞中的Dll1表达至关重要。

(A） CRISPR/Cas9方法的原理，从小鼠C2C12肌质中生成基因敲击克隆。（B）鼠标MyoD基因型 PCR 产品的桑格测序结果。（C）肌免疫染色证实肌病蛋白耗竭科克隆。秤杆，50μm。（D， E） Dll1 （D）和 Wt 和Myod中诺奇靶基因（E）的 qpcr 结果科成肌细胞。细胞分化48小时。n = 3.（F）肌病（上图）或肌（下）与肌素的免疫染色结果。注意Myod科肌质未能区分，这种缺陷被肌D或MyoG的逆转录病毒表达所拯救。细胞分化72小时。秤吧，100μm。（G）西方印迹结果显示 WT 或MyoD中肌肉蛋白质的表达水平科成肌细胞。细胞分化72小时。（H， I） dll1 （H）和小鼠Myod中诺奇靶基因（I）的 qpcr 结果科细胞。肌质被区分了72小时。n = 3.（J）描述人类和老鼠肌细胞混合测定原理的诺奇信号示意图。（K）凝胶电泳结果验证了鼠标 qPCR 引物的特异性。（L） qPCR 结果，使用在 K 中验证的引数测量鼠标Heyl的 mRNA 水平。在与鼠标肌质、WT 或MyoD混合之前科人类肌瘤被表达Dll1或MyoD的逆转录病毒感染。细胞分化24小时。n = 3.数据是指± SEM. *P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001。ns，不重要。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009729.g006

当诱导肌原分化时，鼠标肌病科组没有显示任何肌素? 细胞（图 6F）.一贯地，肌生成素（MyoG）、肌细胞融合因子肌瘤（Mymx）和肌制造商（Mymk）[55， 56]的表达在Myod中是检测不到的科细胞（图 6G）。为了确定这种表型是由于MyoD的确切损失，但不是罕见的CRISPR偏离目标效应（如果有的话），我们进行了救援实验。事实上，当MyoD被重新引入MyoD时，肌原分化（图6F和6G）、Dll1（图6H）和诺奇靶基因（图6I）的表达都得到了恢复科细胞。有趣的是，MyoG的强制表达也取得了类似的救援效果（图6F-6I）。

同时，我们研究了这种调节机制在人体细胞中的保护。因此，我们产生了人类肌病科肌质由 CRISPR 突变体使用一对 gRNA 验证在我们的以前的研究[49]。测序确认了CRISPR治疗细胞（S2A图）中的胆囊框架移位突变。缺乏肌D蛋白再次通过免疫染色（S2B图）得到验证。与鼠标数据类似，从人类肌细胞中删除肌D也废除了肌原分化（S2B和S2C图），并显著抑制了DLL1（S2D图）和海1（S2E图）的表达，后者在人类肌病中重新表达MyoD或MyoG蛋白后被集体正常化科细胞（S2B-S2E 图）。

为了模拟MyoD-Dll1轴对诺奇活动的调节，我们进行了异种细胞混合实验。在此分析中，WT 或MyoD科人类肌质与鼠标肌质混合（图6J）。因此，可以通过比较不同细胞混合组之间的诺奇靶基因表达来研究对MyoD中断的转化效应。我们首先验证了 qPCR 引数（图 6K）的鼠标序列特异性。值得注意的是，在与WT-人类肌质混合后，海尔的表情在小鼠肌质（图6L）中引起显著诱发。然而，当人类肌病时，这种效果被废除了科肌质用于混合实验（图6L）。当 Dll1 或 Myod 被送回人类Myod时，海尔表达的这种缺陷被拯救了科肌质（图 6L）。这些结果表明，MyoD通过对Dll1的调节，可以转活相邻肌质中的凹口信号。

Dll1 表达的差异在人类和小鼠肌质的肌细胞遗传缺失后发生变化

肌病是肌原分化期间的MyoD直接靶基因[57， 58]。值得注意的是，与Dll1类似，MyoG的表达也废除了鼠标（图6F和6G）和人类（S2C图）MyoD科细胞。有趣的是，肌病的生物学缺陷科细胞可以通过肌的强制表达来拯救，这表明 MyoD 可以通过 MyoG 控制 Dll1 表达。医学论文发表-

为了直接测试MyoG在MyoD-Dll1调控轴中的作用，我们通过小鼠（图7A）和人类肌细胞（S3A图）[49]的CRISPR突变灭活了MyoG基因。使用检测肌原体的碳基终点的抗体，通过西式印迹（图7B）和免疫染色（图7C和S3B）确认了MyoG蛋白的成功耗竭。鉴于CRISPR编辑在C2C12肌质（图7B和7C）中的高效率，我们首先在分离单克隆突变体之前，对批量CRISPR处理细胞进行了描述。值得注意的是，大多数的MyoG科C2C12肌细胞在全月肌原分化（图7D）后没有表达肌素。为了与致菌缺陷相一致，在小鼠MyoG中废除了Mymx和Mymk基因的表达科细胞（图 7B）。然而，对于Dll1表达，我们只观察到鼠标MyoG的温和但显著减少（降低 33%）科细胞（图 7E）。相比之下，海尔的表达目标基因的减少更为明显（低83%）（图7E）。验证CRISPR敲击的具体效果，肌细胞分化（图7F，上排）以及基因表达变化（图7G和7H）在MyoG的再表达后获救。更有趣的是，强迫表达 Myod 也可以拯救Myog的表型科细胞，表明MyoD可以调节无肌和致肌基因表达独立于MyoG。

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图7。从鼠标肌细胞中删除Myog后Dll1表达的响应。

(A）小鼠MyoG基因结构的示意图，以及CRISPR/Cas9在C2C12小鼠肌质中介质基因编辑后桑格测序结果的示例。（B）西方印迹结果，以显示WT和MyoG中致肌标记的表达水平科成肌细胞。星突出显示非特定频段。（C， D）小鼠WT和MyoG的免疫染色结果科分化后第 2 天（C）和第 7 天（D）的肌质。（E） Dll1和海尔在 Wt 和Myog中的 qpcr 结果科成肌细胞。细胞分化48小时。n = 3.（F）肌G和肌素的免疫结果为批量CRISPR治疗肌细胞（上）和两个孤立的KO克隆（底部）。请注意，虽然 MyoG 总是耗尽，但两个 KO 克隆体显示出致肌能力的巨大差异。细胞被诱导分化72小时。（G）西方印迹结果，以显示肌原分化标记的表达水平和批量CRISPR处理MyoG科成肌细胞。细胞分化72小时。（H， I） qPCR 结果 WT 和批量 CRISPR 治疗Myog的基因表达科肌质（H）或Myog科单敲击克隆（I）。细胞分化48小时。n = 3.数据是指± SEM. *P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001。ns，不重要。秤杆，100μm。

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与Myod的完全致肌衰竭相反科肌质，肌素?细胞被发现从散装CRISPR治疗的MyoG科肌质（图 7F）。我们假设这可能反映了 C2C12 肌质的异质性[59]在 MyoG 删除时显示各种响应，或者仅仅是由于基因敲除缺乏均匀性。因此，我们着手隔离和描述MyoG科单克隆。事实上，虽然大多数Myog科克隆显示分化（如A1克隆）的完全失败，肌素?细胞在致密诱导（如A4克隆）（图7F）后很容易在少数克隆细胞中被发现。有趣的是， Dll1 表达方式的变化与Myog的致肌潜力非常相关科克隆（图 7I）。同样，人类的肌病科与对照组（S3D图）相比，尽管存在融合缺陷（S3B和S3C图），但保留肌原位（肌素?）的肌细胞显示出DLL1相对正常的表达水平。

为了排除细胞永生对上述基因表达变化的影响，我们还重复了原发性小鼠肌质的MyoD/MyoG CRISPR实验。由于这些细胞不能用于克隆扩张和表征，我们选择直接检查Dll1基因在批量CRISPR处理细胞（S4A图）中的表达。反映高效的淘汰，我们观察到在CRISPR处理组（S4B图）的MyoD或MyoG表达的急剧减少。值得注意的是，MyoD的失活也减少了MyoG的表达，而MyoG的删除对MyoD（S4B图）的表达水平没有明显的影响，这与这些因素之间的调节关系是一致的。尽管如此，MyoD和MyoG CRISPR治疗都造成了肌原分化（S4B图）的重大缺陷，同时Dll1表达（S4C图）的显著减少。我们共同对小鼠和人类基因敲除肌质的分析表明，Dll1表达的诱导是MyoD和MyoG控制下肌肉细胞致肌计划的一个组成部分。

肌病诱导非肌肉细胞中的Dll1转录

我们的功能增益和失能实验揭示了 MyoD 在控制 Dll1 表达在人和老鼠肌细胞中的关键作用。我们继续研究这一规则背后的机械基础，并专注于两个问题。首先，转激活器 MyoD 是否足以诱导 Dll1 表达？其次，MyoD 如何转活 Dll1 表达方式？

我们通过对不表达任何致肌因子的成纤维细胞进行充分性测试来调查第一个问题。我们用肌瘤或（和） Myog 转导成纤维细胞。与我们之前的报告，MyoD足以诱导Mymx和Mymk[49]的表达，成纤维细胞的同步性产生（图8A）。引人注目的是，肌瘤细胞中 MyoD 的表达以 66 倍（图 8B 和 8C）有力地激活了 Dll1 表达。MyoG 也诱导 Dll1 表达，虽然与 Myod （图 8c）相比，水平要弱得多。同样，MyoG 的表达也受到 MyoD （图8B，右图）的强烈调节，而 Myog 并没有显著诱导 Myod 的表达（图 8B，左）。与 MyoD 的主导效应一致，MyoD 对 Dll1 表达的诱导并没有通过添加 MyoG （图 8C）显著提升。

图8。肌瘤母细胞中 Myod 对Dll1诱导的足够测试。

(A）细胞细胞溶胶染料CMFDA（绿色）的荧光图像，以突出由肌瘤或MyoG诱导的成纤维细胞同步。秤吧，100μm。（B ， C） qpcr 结果的 Myod， Myog （B），和Dll1在鼠标成纤维细胞与强迫表达肌瘤， Myog 或两者兼而有之。n = 3.（D）实验设计原理图，以测试肌D转录活性在激活成纤维细胞中的Dll1表达的足够性。（E）成纤维细胞的肌病免疫染色。TMX：塔莫西芬。CHX：环氧酰胺。秤杆，25μm。（F）治疗后成纤维细胞中Dll1表达的 qpcr 结果，请注意， Myod 的Dll1表达诱导在 CHX 治疗（5 小时）后被废除。n = 3.数据是指± SEM. *P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001。ns，不重要。

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在成纤维细胞的命运转换过程中，MyoD 诱导出一个泛肌原程序，以 MyoG 表达的向上调节（图 8B，右图）[60]63]例证。我们继续研究 MyoD 是否需要下游的其他致肌因子来诱导 Dll1 表达。为了测试这一点，我们同时抑制蛋白质翻译由环酰胺（CHX）与控制MyoD转录活动（图8D）。后来通过指挥核导入肌D-雌激素受体融合蛋白（MyoD）来实现的) [64] 治疗4-羟基莫西芬（TMX）。我们的理由是，如果 MyoD 蛋白是自给自足的激活 Dll1 表达，这种诱导不应该被 CHX 治疗否定，它阻止其他致肌因子的翻译，如 Myog：相反，如果 CHX 损害了 MyoD 的操作，则表明 MyoD 需要来自其他因素的功能来协同激活 Dll1 表达。

这个实验设计以前已经验证[49]并且通过显示 Myod 的核导入来确认的蛋白质响应TMX治疗（图8E）。值得注意的是，激活肌病的强力诱导 Dll1 转录（图 8F）。当CHX与TMX（图8F）一起管理时，这种效果被完全废除了。因此，MyoD 需要由 MyoD 诱导的其他因子来激活 Dll1 转录。这一结果与MyoD在异种胚胎生成[31]期间自给自足地诱导Dll1表达的报告形成鲜明对比。因此，哺乳动物可能已经进化了一层额外的调节机制，以微调Dll1表达在肌形成过程中。

**Dll1 促进器上的cis- 监管图案的扰动影响其在体内和*体外表达***

作为 bHLH 转录因子，MyoD 通过与电子盒子主题（CANNTG）[62]结合来激活其目标基因的表达。使用FIMO，一个主题发现工具，经验预测转录因子结合位点[65]，我们发现了三个高度保守的 MyoD 结合主题在 Dll1 基因的 intron 4 （图 9A）。值得注意的是，对 ENCODE ChIP-seq 数据集[66]的分析还发现，在 C2C12 肌爆分化（图 9B）期间，该区域的 MyoD 结合峰值。

图9。通过人类和小鼠细胞中的内在电子盒元素调节 MyoD 的Dll1表达。

(A）来自遥远相关哺乳动物物种的Dll1内在区域对 MyoD 结合图案的生物信息预测。（B）从鼠标肌质中编码肌病的 ChIP-seq 结果。绿框突出显示的鼠标序列在A.（C）示意图的实验设计和原理，以探索由dCas9调解干扰的cis监管元素。克里斯普里：克里普斯尔干扰;（D）人类 Wt 肌质的 qpcr 结果与 dcas9 和 grna 的表达表示。n = 3.（E）鼠标Dll1的测序结果Δ232CRISPR/Cas9 介质基因靶向产生的突变等位基因。（F）控制和受伤的头骨前肌的横截面的 H&E 染色结果。箭指向再生的肌毛虫与仙人掌。秤吧，200μm。（G） qPCR 结果，测量了通过控制感染或 MyoD 表达逆转录病毒感染的鼠标成纤维细胞中的Dll1表达。n = 4.（H）转录规则和 Notch 信号发送或接收细胞之间的配体受体相互作用的示意图摘要。数据是指± SEM. *P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009729.g009

然后，我们使用CRISPR互连工具来询问基因调控机制，如先前报道的[49， 67]69] 。对于这个实验，一个催化死亡的Cas9（dCas9）被引导到这些电子盒子图案，以解剖其功能背后的MyoD-Dll1监管轴（图9C）。我们假设MyoD可以结合到内源电子盒图案，在肌原分化期间诱导Dll1表达（图9C，状态a）：当被 gRNA 招募时，dCas9 对这些电子盒子图案的定位应阻止 MyoD 绑定，从而抑制 Dll1 的表达（图 9C，状态b）。根据我们的假设，在这三个电子盒子图案中，每个电子盒子图案中都招募 dCas9 的 gRNA 表达显著抑制了 Dll1 表达，在人类肌质中平均抑制了 65% （图 9D）。当这些电子盒子同时被阻塞时，没有观察到添加剂效应（图9D）。因此，MyoD至少可以通过与位于Dll1基因内在4中的进化保存的电子盒图案结合，激活人类肌质中的Dll1表达。医学论文发表-

CRISPR干扰结果促使我们在体内的肌生成过程中测试这些子调节元素的功能。使用CRISPR基因组编辑，我们生成了一个新的小鼠模型，从Dll1基因的内tron4中删除了这些E框图案。测序确认删除了以这些保存的电子盒元件（图9E和S5A）为中心的 232 bp 区域。我们把这个等位基因命名为Dll1Δ232.Dll1的细菌线传输Δ232等位基因在用WT小鼠繁殖创始人后被确认。Dll1的交叉Δ232/+老鼠产生同源突变体的预期门德利安比率（S5B图）。Dll1Δ232/Δ232突变体过于正常和肥沃，这与Dll1空突变体[37]的过早杀伤力形成鲜明对比。

鉴于Dll1表达是由肌肉损伤（图1E）强烈诱导的，我们首先测试了内电电子盒元素的缺失是否会影响Dll1的表达和肌肉再生。令人惊讶的是，与 Dll1 基因淘汰模型[70]中肌肉再生的主要缺陷相反，Dll1在当天观察到肌肉再生的正常进展。4、7 和 28 后损伤Δ232/Δ232突变小鼠（图9F和S5C和S5D）。为了更好地解释这个结果，我们检查了Dll1的表达。纤维细胞从对照和突变小鼠中分离出来，然后过度表达MyoD。有趣的是，突变成纤维细胞中的Dll1表达与对照组（图9G）相比下降了71%。这种效果与人类肌质中CRISPR干扰（低65%）（图9D）的效果相似。在查看 ChIP-seq 数据[66]时，我们没有在其他内生或交源区域观察到额外的 MyoD 结合峰值。最后，最近一项使用荧光酶测定的研究也确定这个内在区域为MyoD结合位点[70]。因此，我们推断Dll1Δ232/Δ232突变细胞可能使用了来自未知区域远端增强剂的替代电子盒图案来补偿体内的敲除或CRISPR干扰效应。

讨论

总之，我们的研究揭示了Dll1表达和肌原因子MyoD激活的关键规律。这个细胞际调节环（图9H）涉及三个主要部分，可以由肌肉前体细胞的不对称分裂[71]73] 启动，允许一个女儿细胞继承比另一个更高的 MyoD 蛋白水平。首先，MyoD高肌细胞可以迅速打开 Dll1 的表达，它在相邻的 Myod 中转活凹点低细胞。第二，激活 MyoD 中的一个档次低细胞将进一步降低MyoD和Dll1基因的转录。第三，即使存在 MyoD 中 Dll1 的任何残余表达低细胞，这些配体与肌病中的诺奇受体结合高细胞不太可能激活后者的凹口，由于从充分表达的 Dll1 的cis抑制。类似地，MyoD 之间的间档信号高细胞也会被抑制。总的来说，Notch的两极性可以建立，使女儿细胞能够适应相反的细胞命运，即分化或自我更新。具体来说，在分化细胞中迅速调高Dll1可以避免细胞自主的凹点活性。鉴于诺奇对肌生成的强烈抑制作用，这种抑制机制是完成肌原分化的先决条件。另一方面，转活的T恤通路可以防止早熟分化，促进静默状态和肌肉干细胞的自我更新，以进行长期肌肉再生（图9H）。与先前的研究[27，35]一起，这些结果使对反馈机制有了更全面的了解，即在肌生成过程中可以建立雀智极性和不同的细胞命运。

一流的活动对配体和受体的摩尔比敏感。配体对诺奇的抑制作用最初是在德罗索菲拉的发展过程中观察到的[53， 74]。反映哺乳动物系统的复杂性，受体与配体的顺位相互作用被证明在不同的生物过程中抑制或激活了"26、75、76"。尽管如此，我们的研究提供了直接的证据，Dll1可以减轻诺奇信号细胞自主，以促进肌质的肌原分化。我们对 Dll1 的结构和功能分析揭示了其细胞外域对cis抑制的关键作用。这一结果与之前对雀样配体/受体蛋白复合物的结构测定相一致[54]。配体与受体的相互作用可能要么使受体分流，并限制它与来自发送细胞[53]的配体进行转位相互作用，要么在 cis 中的配体可以稳定 Notch 受体，从而干扰受体的蛋白解处理和激活 [53]。

另一个有趣的问题，可以探索是Jag1在这个模型中的作用。在小鼠和人类肌质的肌原分化过程中，Jag1的表达也被诱导，尽管没有Dll1那么强烈。值得注意的是，先前的研究表明，Jag1是激活肌细胞中"77"中效率最低的配体。因此，与 Dll1 相比，在肌细胞分化过程中 Jag1 表达的调高对相邻细胞的凹点活性的影响可能较小。

除了基因增益和功能丧失实验外，我们还通过两种补充方法检查了控制Dll1转录的子调控元素：小鼠中的CRISPR干扰和CRISPR敲击。这些实验的结果始终揭示了内燃电子盒图案在驱动 Dll1 表达中的关键作用。因此，这些元素的干扰和敲除分别减少了 Dll1 表达的 65% 和 71%。然而，这种变化的幅度并没有在肌肉发育或再生过程中在体内引起任何明显的表型。一些可能性可以解释这个结果。首先，Dll1的下放可能触发肌肉细胞中其他一级配体的调节，以补偿Dll1的减少。其次，突变肌瘤中Dll1表达的剩余29%可能足以引起顺位抑制和转活效应，使诺奇活性和细胞命运不受影响。然而，我们生成的遗传小鼠模型可以应用，以了解这些cis- 监管站点是否可以由其他 bHLH 转录因子（例如 NeuroD[78]）在其他发育过程或疾病中使用。此外，今后有必要作出努力，全面剖析MyoD在肌原分化过程中驱动Dll1表达的未知cis监管序列。最后，还需要确定在 MyoD 下游协同诱导 Dll1 表达的神秘因素。虽然 Myog 以诱人的候选人的身份出现，但 Myod 可以有力地诱导Myog的 Dll1 表达科细胞表明，在调节这个过程时必须存在其他因素。

材料和方法

***Dll1*的生成Δ232突变小鼠**

所有动物程序都得到佐治亚大学机构动物护理和使用委员会的批准。Dll1Δ232小鼠模型是由像以前报告的那样通过卵管电位生成的[79]。简言之，交配的雌性小鼠被用于手术暴露卵管。CRISPR基因编辑鸡尾酒是新鲜组装的，含有6μM Cas9蛋白（IDT，1081058，地段#0000405530），30μM gRNA（crRNA与tracRNA，IDT，1072534，地段#0000403961）。这种鸡尾酒通过微资本注射被输送到卵石中。使用 CUY21EDIT II 电风机进行电极化，其协议如下： Pd A： 100 mA， Pd 上： 5 ms， Pd 关闭： 50 ms，三个周期，衰变 10%。肌肉损伤是由将1.2%的氯化镁（50微升）注射到头骨前肌中引起的。

鼠标基因型分析

Dll1 基因奇数 PCR 使用从脚趾剪裁中提取的基因组 DNA 与引物一起执行，向前： Agaacctcgtcgctctg 和反向： Gcgtctagacaagct 。对于桑格测序，PCR 产品首先被凝胶纯化并克隆成 pCRII 托波载体（热费舍尔科学，K460001），并使用 T7 或 SP6 引物进行排序。Dll1的细菌线传输Δ232等位基因被基因型的F1代小鼠证实。

细胞培养

人类肌质（ID： hskmc - AB1190）像以前描述的那样永垂不朽[48]。人类肌质在骨骼肌肉细胞生长介质中培养（促销细胞，C-23060）。鼠标 10T1×2 成纤维细胞（ATCC， CCL-226）和 C2C12 肌瘤（ATCC， CRL-1772）保持在 10% FBS 与 1% 青霉素/链霉素（吉布科， 15140122）在 DMEM （杜尔贝科的修改鹰的中高葡萄糖， D5796）.主要是肌质被酶消化分离后的协议[80]。人和老鼠肌细胞分化介质含有2%的马血清补充在DMEM与1%抗生素青霉素/链霉素。使用通用支原体检测套件（ATCC，30-1012K）对细胞进行支原体阴性测试。

伦蒂病毒制备和CRISPR-Cas9体外淘汰实验

用于体外基因敲除实验的伦蒂-CRISPR v2载体[81]是冯章（添加质粒 # 52961）的礼物。针对人类和小鼠 MyoD 和 MyoG 基因编码区域的指南RNA 被单独克隆到 Lenti-CRISPR v2 载体中并进行测序以验证正确的插入。提供了本研究中使用的 gRNA 序列。医学论文发表-

鼠标 Dll1 intron 4 grna1：鳄鱼

鼠标 Dll1 intron 4 grna2： Ggcttg 塔加特

小鼠肌病基因： Gtcactatccggag

老鼠 Myog 基因 grna1：阿卡卡塔卡特卡奇克

小鼠肌基因 grna2：卡卡塔克加格格奇克

人类肌病基因：CGTCGAGCAATCCAG

人类肌基因 grna1：阿卡卡格克塔克加加加

人类肌病基因 grna2： Ccacact 加加加加格奇克

人类 Dll1 基因 grna1：阿卡加加卡切特加格特

人类 Dll1 基因 grna2：特加加actactacggag

伦蒂病毒是由通过通过富基因6转染试剂（普罗梅加，#E2692）与富伦蒂-V2，psPAX2和pMD2.G质粒的透射伦蒂-X 293T细胞（克隆技术，632180）进行转染产生的。转染后48小时，收集伦蒂病毒感染人类或肌细胞肌瘤。pspax2 矢量是迪迪埃 · 特罗诺的礼物（阿迪恩质粒 # 12260）。pMD2.G 矢量是迪迪埃 · 特罗诺的礼物（阿迪格质粒 # 12259）。

逆向载体制备和表达

逆转录病毒表达载体pMXs-Puro（细胞生物实验室，#RTV-012）用于人类和小鼠肌质的基因克隆和表达。红荧光蛋白樱桃和小鼠Dll1的开放读取帧被融合克隆成pMXs-Puro载体。质粒中DNA插入物的身份得到验证。Myod - pclbabe 质粒[82] 是斯蒂芬 · 塔普斯科特（阿迪根质粒 # 20917）的礼物。肌质被标记为逆转录病毒感染，提供pMXs-樱桃表达载体。肌病表达和化学治疗按先前报告[49]进行。

差异化指数和融合指数测量

分化指数是按肌肉细胞（MF20+）内核数的百分比除以成像区域的总核数计算的。融合指数计算为肌管（≥3核）中的核数，占肌肉细胞内核总数的百分比。

RNA提取和基因表达分析

RNA是使用TRIzol试剂（热费舍尔科学）提取的。在用于反向转录之前，使用光谱光谱仪（纳米滴一，热费舍尔科学）来评估RNA质量和浓度。cDNA 通过反向转录与 M-MLV 反向转录酶（病毒原，28025013）的随机寡头合成。为了分析基因表达变化，使用 QuantStudio 3 实时 PCR 系统（热费舍尔科学）与 SYBR 绿色主混合（罗氏）和 qPCR 引物执行实时 PCR。2?Ct方法用于分析基因表达正常化后对Gapdh或18S rRNA的表达。提供了本研究中使用的引物序列。

Dll1 qpcr - f 的引物：加特克特加特加特加特克克卡

Dll1 qpcr - r 的引言：特克塔格塔格特克特克特卡

贾格 1 qpcr - f 的引物： Gtc 卡特卡加加格加特加克

贾格 1 qpcr - r 的引言： Gcg 加特加特克特加

Dll3 qpcr - f 的引物：克塔克 · 克加特克卡奇

Dll3 qpcr - r 的引言：加特卡塔克塔克加格

Dll4 qpcr - f 的引物： Gtctcccgg 塔格

Dll4 qpcr - r 的引引器：卡格特加特加格加格加格特

贾格 2 qpcr - f 的引物：特格格卡卡特克克塔

贾格 2 qpcr - r 的引引器： Gcctccacgaggagta

海 1 qpcr - f 的引物：阿阿克特格特格特克克斯科特加特

海 1 qpcr - r 的引言：卡塔加克塔克卡卡

海尔 qpcr - f 的引物：阿特加特克特格加加加加cc

海尔 qpcr - r 的引笔： Gccatctctcct

赫斯 1 qpcr - f 的引物：特特格特卡格特卡格特

赫斯 1 qpcr - f 的引物： Ggtgctaggacttacg

Myod1 qpcr - f 的引物： Cgacgg 加特加塔卡

Myod1 qpcr - r 的引言：塔塔茨格特格特格特克

Myog qpcr - f1 的引物：加卡卡格加特卡特

Myog qpcr - r1 的引言：切克克特加卡特

Myh3 qpcr - f 的引物：阿特格特克特格特格特克特克特卡

Myh3 qpcr - r 的引言：格格卡特克特克特

Gapdh qpcr - f 的引物：卡卡格特克特克特克特加

盖普德 qpcr - r 的引言：卡格特克塔卡特卡泰克

18s qpcr - f 的引物： Gtaccgttgaacccatt

18s qpcr - r 的引物： Ccatcaatgtagcg

Dll1 qpcr - f 的引物：卡加克特克特克特克塔格克塔格

Dll1 qpcr - r 的引言：阿格加特加特

嘿 1 qpcr - f 的引物： Gcaccacttg

嘿 1 qpcr - r 的引言： Gg 加卡

海尔 qpcr - f 的引物：克塔克 · 格加特加塔

海尔 · 克普克 - r 的引言：阿特克特格特克特格特加特格

赫斯 1 qpcr - f 的引物：特特格特卡格特卡格特

赫斯 1 qpcr - r 的引物： Ggtgctaggacttacg

盖普德 qpcr - f 的引物： Tctcccgactacac

盖普德 qpcr - r 的引言：阿格特加塔格克克特

18s qpcr - f 的引物：阿卡格塔加塔加

18s qpcr - r 的引物：海合会

西方印迹

蛋白质裂解剂是使用RIPA缓冲器（西格玛，R0278）补充完整的蛋白酶抑制剂（西格玛）准备的。莱西特以 16，000 x g 离心机离心 15 分钟。由此产生的超纳特与 4 倍莱姆利样品缓冲器（生物拉德， #161+0747）混合。SDS-PAGE 凝胶电泳共分离了 20 微克蛋白解质。这些蛋白质被转移到聚氯乙烯膜中，在室温下被阻塞在5%的牛奶中，并在4°C时用以下原发性抗体在5%的牛奶中稀释。加普德（圣克鲁斯生物技术， sc-32233）， α-图布林（圣克鲁斯生物技术， sc-8035），肌素（DSHB， MF20）， MyoD （圣克鲁斯生物技术， SC-304）， Myog （DSHB， F5D）.HRP结合的二级抗体：驴抗羊IgG-HRP（圣克鲁斯生物技术， sc-2473），山羊反鼠标IgG（H+L）-HRP结合（生物拉德，170+6516）和山羊反兔子IgG（H + L）-HRP结合（生物拉德，170，6515）被稀释在1：5，000。信号检测是使用西式发光剂（圣克鲁斯生物技术，sc2048）进行的。医学论文发表-

克里斯普参考间测定

伦蒂 - 萨姆 v2 是亚当 · 卡普夫的礼物（阿迪金质粒 # 92062）。在去除 VP64 表情盒后，Lenti-SAM v2 质粒用于 gRNA 克隆。下面提供了针对人类 DLL1 电子区域的控制和电子盒主题区域的 gRNA 序列。

人类 Dll1 印地龙 4 grna1： Ctgcccagcaacaatgc

人类 Dll1 印地安人 4 grna2：阿格加卡格特克特克克

人类 Dll1 intron 4 grna3：阿加格特加格特克塔格特格

免疫染色

免疫染色按先前报告[49]进行。简言之，细胞固定在4%PFA中10分钟，膜使用0.2%Triton X-100渗透。细胞在室温下被 3% 的 BSA 阻塞。在4°C下进行了一夜的原体孵化。免疫染色信号通过与荧光结合的二级抗体和Hoechst 33342孵化来检测，以可视化核。荧光图像是使用生物锥显微镜系统或奥林巴斯FV1200共聚焦激光扫描显微镜收集的。

量化和统计分析

实验至少重复了三次。所有定量结果都用学生的双尾分布进行测试分析。与P值<0.05的比较被认为是显著的。

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一流的激活通过MyoD/MyoG抑制人体细胞中的DLL1表达。

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**S1 图。一流的激活通过MyoD/MyoG抑制人体细胞中的DLL1表达。**

(A-C）qPCR 结果肌原标记（A）， DLL1 （B， C）在人类肌体与 NICD 的逆转录病毒表达.请注意，NICD 对DLL1表达的抑制作用被 MyoD 或 MyoG 表达（C）拯救。细胞分化72小时。n = 3.数据是指± SEM. **P < 0.01， ***P < 0.001。（D）分化72小时后，肌细胞和肌素免疫染色结果。请注意，通过 MyoD 或 MyoG 的共同表达可以挽救 NICD 的致密分化和融合缺陷。秤吧，100μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009729.s001

（蒂夫）

**S2 图。肌病对人类肌细胞中的DLL1表达至关重要。**

(A）人类肌D基因结构和测序结果，证实在一个孤立的MyoD中，MyoD ORF的双性帧转移科克隆类似于我们以前的报告[49]。箭头指向 1bp 插入;箭头指向 1bp 删除。（B）人类WT和肌D的肌D（上）和肌素（底部）的免疫染色结果科成肌细胞。肌病染色证实肌病中肌D蛋白的耗竭科细胞。秤吧，100μm。（C）西方印迹结果显示人类肌病中缺乏肌G和肌素表达科分化后 48 小时的肌质。（D， E）人类 Wt 和Myod的 qpcr 结果科肌质与肌病或肌的逆转录病毒表达。细胞分化48小时。n = 3.数据是指± SEM. *P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001。ns，不重要。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009729.s002

（蒂夫）

**S3 图。从人类肌细胞中删除 Myog 不会影响DLL1表达。**

(A）人类MyoG基因结构和测序结果示例，类似于我们上一份报告[49]。（B）肌G和肌素的免疫染色结果，显示MyoG蛋白的完全耗竭和相对温和的分化缺陷，为一个克隆衍生的人类肌细胞科成肌细胞。秤吧，100μm。（C）肌细胞融合的量化。（D） qPCR 结果表明，从人类肌质中删除MyoG时，DLL1表达没有受到显著影响。数据是指± SEM. **P < 0.01， ***P < 0.001。ns，不重要。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009729.s003

（蒂夫）

S4 图。删除 MyoD 或 MyoG 会影响鼠标原肌体中的 Dll1 表达。

(A）实验设计的原理图。（B）小鼠原发性肌细胞的免疫染色结果，以显示CRISPR治疗前后肌D/MyoG的表达水平。箭头指向显示细胞质染色信号的细胞，这些信号可能是非特定信号。（C） Dll1 在 CRISPR 中治疗小鼠原生肌质的 qPCR 结果。n = 3.数据是指± SEM. ***P < 0.001。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009729.s004

（蒂夫）

**S5 图。Dll1的特征Δ232 /Δ232鼠。**

(A） WT 和Dll1基因型 PCR 代表凝胶电泳结果Δ232/Δ232小鼠。（B） Dll1摘要Δ232/Δ232基因型结果。（C）实验设计原理图及治疗和组织收集的时间表。（D）控制和受伤的头骨前肌的横截面的H&E染色结果。箭指向小再生肌细胞。秤吧，200μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009729.s005

（蒂夫）

确认

我们感谢高拉夫·戈普、阿丽娜·白菊、威廉·马雷、赫克托·罗梅罗-索托、艾米莉·玛丽·希克斯和实验室里的其他受训人员提供技术援助。我们感谢 Myoline 平台为永生的人类细胞系和普渡大学的光世焕博士和来自 UTSW 的李晓春博士分享试剂。

引用

00001. 1.本辛格 Cf，王 Yx，鲁德尼基马。建立肌肉：肌生成的分子调节。冷泉哈布佩佩克维奥 2012;4 （2）.埃普布 2012/02/04.下午：22300977：酒吧中央 PMCID： PMC3281568。

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医学论文发表-由 MyoD-Dll1 轴连接的凹口信号和肌生成的反馈调节

抽象

作者摘要

介绍

结果

在人和鼠标肌生成过程中， 强烈感应凹口配体 Dll1 表达

DLL1 转活抑制人类肌细胞分化的凹点信号

Dll1 cis- 抑制凹点， 促进人类肌原分化

从人类肌细胞中删除DLL1会消除其对 Notch 信号的跨激活和cis抑制作用

Dll1 的Cis抑制作用由其细胞外域进行调解

肌病是Dll1表达在人和老鼠肌细胞的关键调节器

Dll1 表达的差异在人类和小鼠肌质的肌细胞遗传缺失后发生变化

肌病诱导非肌肉细胞中的Dll1转录

Dll1 促进器上的cis- 监管图案的扰动影响其在体内和体外表达

讨论

材料和方法

Dll1的生成Δ232突变小鼠

鼠标基因型分析

细胞培养

伦蒂病毒制备和CRISPR-Cas9体外淘汰实验

逆向载体制备和表达

差异化指数和融合指数测量

RNA提取和基因表达分析

西方印迹

克里斯普参考间测定

免疫染色

量化和统计分析

支持信息

S1 图。一流的激活通过MyoD/MyoG抑制人体细胞中的DLL1表达。

S2 图。肌病对人类肌细胞中的DLL1表达至关重要。

S3 图。从人类肌细胞中删除 Myog 不会影响DLL1表达。

S4 图。删除 MyoD 或 MyoG 会影响鼠标原肌体中的 Dll1 表达。

S5 图。Dll1的特征Δ232 /Δ232鼠。

确认

引用

在人和鼠标肌生成过程中，强烈感应凹口配体 Dll1 表达

Dll1 ***cis*- 抑制凹点，促进人类肌原分化**

**从人类肌细胞中删除DLL1会消除其对 Notch 信号的跨激活和cis抑制作用**

**Dll1 的Cis抑制作用由其细胞外域进行调解**

**Dll1 促进器上的cis- 监管图案的扰动影响其在体内和*体外表达***

***Dll1*的生成Δ232突变小鼠**

**S1 图。一流的激活通过MyoD/MyoG抑制人体细胞中的DLL1表达。**

**S2 图。肌病对人类肌细胞中的DLL1表达至关重要。**

**S3 图。从人类肌细胞中删除 Myog 不会影响DLL1表达。**

**S5 图。Dll1的特征Δ232 /Δ232鼠。**