《医学论文发表-一种新的级联允许梅塔希齐姆·罗伯茨在昆虫感染期间区分皮质层和血凝素微环境》期刊简介
医学论文发表-一种新的级联允许梅塔希齐姆·罗伯茨在昆虫感染期间区分皮质层和血凝素微环境
· 张兴，
· 孟亚民
· 黄一舟
· 张丹，
· 方卫国发布时间： 2021年8月4日
抽象
致病真菌在感染期间对动态微环境有精确反应，但基础机制尚不清楚。昆虫致病真菌梅塔希齐姆罗伯西是一种具有代表性的真菌，研究真菌致病性的广泛主题，因为它类似于一些主要的植物和哺乳动物致病真菌在其发病机能。在这里，我们报道了一个新的级联，规范M的反应。在其发病过程中，罗伯西到2个不同的微环境。在昆虫切片上，转录因子COH2激活了地层渗透基因的表达。在血甲中，蛋白质COH1的表达是由于高石脱乙酰酶HDAC1和高石3乙酰转移酶HAT1所赋予的表观遗传抑制的减少。COH1 与 COH2 相互作用，以降低 COH2 的稳定性，这种向下调节的基质层渗透基因和向上调节的基因用于造衣。我们的工作显著地促进了对昆虫真菌致病性的洞察。
引文：张X、孟 Y、黄Y、张D、方W（2021）一部新颖的级联，使梅塔希齐姆·罗伯茨在昆虫感染过程中能够区分皮质层和血凝素微环境。PLoS 生物 19 （8）： e3001360.https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001360
学术编辑：索芬·卡蒙，塞恩斯伯里实验室，英国
收到：2020年8月16日：接受：2021年7月9日：已发布：2021年8月4日
版权 所有：?2021张等人这是一个开放访问文章，根据《知识共享归属许可证》的条款分发，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到记分。
数据可用性：所有相关数据均在文件及其支持信息文件中。本研究获得的所有RNA-Seq数据的GenBank加入编号为PRJNA637940。
资金：这项工作由中国国家自然科学基金委员会（http://www.nsfc.gov.cn/）资助，资助人数为31672078和31872021。W.F收到了这两笔赠款。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或编写手稿方面没有作用。
竞争利益：作者宣称不存在相互竞争的利益。
缩写：ChIP-qPCR，色度免疫沉淀定量PCR：ChIP-Seq，色素免疫沉淀测序：共IP，共免疫沉淀：DID，更暗的界面域;EMSA，电泳移动移位检测：核定位，核本地化信号：ORF，打开阅读框;PDA，土豆脱糖醋;qPCR，定量PCR：qRT-PCR，定量反转录PCR;RNA-塞克，RNA测序;SDY， 萨博劳德克斯特罗斯汤补充 1% 酵母提取物;WT，野生类型
介绍
昆虫、植物和哺乳动物的真菌病原体通常在宿主感染期间遇到动态微环境，但它们对微环境的反应和适应机制尚不清楚[1]。昆虫病原和内皮真菌梅塔希齐姆·罗伯茨被用作研究昆虫真菌发病机理的模型[2]。当锥体粘附在易感昆虫宿主的皮质层并产生分化成称为阿普索里亚的感染结构的细菌管时，就会发生感染。阿普西里亚产生感染钉，通过机械压力和皮质层降解酶的组合穿透皮质层。一旦到达昆虫血凝素，真菌就会经历从催眠到酵母状细胞（即爆破孢子）的二态化，昆虫被真菌生长和毒素的结合杀死。最后，生长在血凝体中的真菌从死昆虫中重新出现。在这个发病机理进展中，M.罗伯茨遇到两种不同的微环境：昆虫皮质层和昆虫色体。昆虫切片是防止真菌感染的第一道屏障，也是M.突破这一屏障的罗伯茨与一些植物致病真菌相似，如麦格纳波特奥里扎伊和金合院[3，4]，它们都形成压抑感染结构。 在M之间的压榨剂发育中，蛋白质激酶A和疏水剂等致病因素在功能上得到保护。奥里扎和M.罗伯茨[5，6]。M的发病机原体。罗伯茨在许多方面也类似于哺乳动物致病真菌，例如逃避昆虫和哺乳动物之间一直保存的宿主与生俱来的免疫系统的能力[7]。因此，M.罗伯西可以作为一种代表性的真菌来研究真菌致病性的广泛主题。此外，在农业害虫和疾病媒介生物控制方案[8]中，甲基硫化物物种正在被开发为环境友好型替代品或化学杀虫剂的补充剂。因此，为了优化肌瘤的开发和改善，需要详细的昆虫真菌致病性的机械学知识。医学论文发表-
对地层渗透机制进行了广泛的研究，许多可降解的基因和控制地层渗透的重要调节器被报道[9]。最近，也发现了一些因素在血凝胶殖民化中起着重要作用，包括负责获取宿主固醇的固醇的固醇载体，以保持快速增殖连字符体细胞膜的完整性[10]。胶原蛋白MCL1和有毒的二级代谢物，如去特性素，有助于避免宿主与生俱来的免疫系统[11，12]。铁代谢的侧磷也是造和铝殖民化的一个重要因素[13]。我们最近的工作中的RNA测序（RNA-Seq）分析表明，在从昆虫皮质层到造衣机的微环境过渡过程中，许多基因都关闭，包括可降解的皮质酶[9]。其中一些角质层降解酶，如Pr1蛋白酶和金属蛋白酶Mep1先生和Mep2先生，是重要的毒性因素[14，15]，它们的表达需要在血甲中受到低管制，否则它们会激活昆虫免疫力[16]。尽管真菌功能基因对昆虫的感染有着广泛的特征，但M反应背后的详细调控机制。不同微环境的罗伯茨还有待探索。
在这项研究中，我们发现了一个新的监管级联，控制M的反应。罗伯茨到其发病机理的2微环境。在昆虫基质层上，转录因子COH2（甲壳体2的结肠化）激活了参与基质层渗透的基因的表达。一旦真菌进入赫莫科埃尔，就会表达调节蛋白COH1（甲壳体1的结肠化），从而物理接触转录因子COH2，降低其稳定性，从而抑制用于基质层渗透的基因表达，并增加对甲壳体殖民化基因的调节。我们进一步发现，血甲中COH1的表达是高石脱乙酰酶HDAC1和高石乙酰转移酶HAT1所赋予的表观遗传抑制减少的结果。
结果
调节蛋白COH1的鉴定
在我们之前的RNA-Seq分析[9]中，我们发现一种基因（MAA_08820，被指定为Coh1，因为它涉及到十二甲的殖民化）在造衣过程中得到了高度表达。在这项研究中，从最后一个星体中收集的血淋巴梅洛内拉幼虫（用于本研究的所有检测）被用抗凝血剂治疗，结果含有血细胞的血淋巴（以下简称血淋巴）的真菌生长被用作血凝胶殖民化的近似体，以下简称替代血糖殖民化。通过在G的内层上孵育真菌来实现对乳胶的渗透。梅洛内拉幼虫。除非另有说明，否则本研究中使用的昆虫削片来自G。梅洛内拉幼虫。通过在液体介质Sabouraud葡萄糖汤中种植真菌，辅以1%酵母提取物（SDY）或马铃薯葡萄糖（PDA）板，实现了预防性生长。根殖民化是指M的生长。罗伯茨在阿拉伯多普西萨利亚纳的根。当定量反转录 PCR （qRT-PCR） 分析使用来自皮质层渗透的 RNA 样本进行时， 防沙生长和根殖民化，Cq值（样本反应曲线与阈值线相交的PCR周期数）约为38个周期，在蔗糖凝胶（图1A）上未检测到PCR产品，表明Coh1的转录水平极低或无法检测。然而，qRT-PCR分析和随后在蔗糖凝胶上检测的PCR产品证实，Coh1成绩单是在代孕造和甲壳体殖民化（图1A）期间表达的。Coh1的PCR产品也检测到由活G准备的RNA。梅洛内拉幼虫感染M.罗伯茨，表明这种基因是在昆虫的真正色体中表达的。当使用用骨髓木乃伊木乃伊的昆虫尸体中的RNA时，未检测到 PCR 产品，表明Coh1在坏死阶段（图 1A）中未表示。
图1。Coh1基因的表达和调节。
（A） A 加罗斯凝胶电泳的定量反转录PCR（qRT-PCR）产品Coh1。1： 萨博罗德克斯特罗斯汤的预防性生长，辅以1%酵母提取物（SDY）介质;2：地层穿透：3：植物根系殖民化：4：含溶细胞的溶胶淋巴生长：5：活昆虫感染M。罗伯茨：6： 昆虫尸体木乃伊与M.罗伯西骨髓：M：DNA梯子。图像代表3个独立实验。上面板：基因Coh1：下面板：参考基因Gpd编码甘油醛3磷酸盐脱氢酶。（B） 中尉50（杀死50%的昆虫所占用的时间）当昆虫被局部地在皮质层上应用锥体接种时，其值。ΔCoh1#1，ΔCoh1#2，和ΔCoh1#3是删除突变体的 3 个独立隔离ΔCoh1。WT，野生类型。生物分析重复了3次，每次重复40只昆虫。数据表示为平均± SE. 具有不同字母的值显著不同（n = 3， P < 0.05， Tukey 的单向 ANOVA 测试）。（C） 在生长过程中，在WT菌株中Coh1的qRT-PCR产品的Agarose凝胶电泳和在预防性生长过程中删除高石脱乙酰酶基因Hdac1（Δ Hdac1）和高石乙酰转移酶基因Hat1（Δ Hat1）的突变体。注意：在WT菌株中未看到qRT-PCR产品。（D） qRT-PCR 分析替代造衣机殖民化 （Hemo 淋巴） 和皮质层渗透 （卡蒂克） 相对于防沙生长 （SDY） 期间 WT 菌株中Hdac1和 Hat1 的表达。（E） GFP信号在真菌细胞上的基质层（乳酸）和在真正的血甲（血凝胶）的G.梅洛内拉幼虫。gfp基因的菌株是由Hat1（上面板）或Hdac1（下面板）的发起人驱动的。F，真菌细胞;H，赫莫特比例杆：10 μm。图像代表3个独立实验。平均灰色值 （MGV） 显示真菌催眠中的 GFP 荧光强度。（F） qRT-PCR 分析 WT 菌株中的Coh1表达和替代甲壳体殖民化期间ΔHat1和hdac1 Δ突变体。本研究中的所有 qRT-PCR 实验均重复了 3 次。对于此图中的 qRT-PCR 分析，这些值表示治疗中基因表达的折叠变化，而其各自控制中的表达方式设置为 1。此图中显示的所有图形背后的数据可以在S1 数据中找到。医学论文发表-
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Coh1是一种单拷贝基因，具有 525 bp 开放读取框架 （ORF），该基因编码含有 174 个氨基酸残留物的蛋白质。COH1含有Ecl1域（PFAM12855），该域也鉴定在盐酸酵母糖精和香糖精的ECL1蛋白中：这些蛋白质被认为是调节器，尽管它们的功能没有特征[17]。然而，BLASTp分析使用COH1的全长蛋白质序列作为查询，没有发现显著的相似性（>?5）M之间。罗伯茨COH1和酵母ECL1蛋白。COH1中没有预测到假定信号肽或核本地化信号 （NLS）。在M的染色体中。科赫1号与相邻基因相距遥远，其ORF距离上游基因（MAA_10633）111，146个基点，距离下游基因（MAA_08821）7，498个基点。
COH1 参与真正的海焦殖民化
为了调查Coh1的生物功能，我们构建了一个删除突变体（Δ Coh1），该突变体将整个ORF（S1A和S1B无花果）删除。本研究中使用的基因和真菌菌株列在表1中。南方污点分析表明，在3个随机选择的分离物中，只有1个除草剂耐药基因Bar（真菌转化选择标记基因）（Δ Coh1#1，Δ Coh1#2和Δ Coh1#3）（S1C图），表明插入外来DNA只导致通过同源重组删除Coh1，并且没有异位整合发生。ΔCoh1的 3 个独立隔离体接受了以下表型分析，在所有分析中未观察到这些隔离体之间的差异（见下文）。在PDA板块上，Δ Coh1与菌落生长、殖民地形态和结膜产量（S2A–S2C图）中的野生型（WT）菌株并无不同。
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表1。这项研究中使用的质粒、融合蛋白和真菌菌株。
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M.的致病性。罗伯茨，显示的时间为50%的昆虫死亡（LT50），在G中进行了检测。梅洛内拉幼虫。接种方法是通过在昆虫角质层上使用锥形，或者直接将锥形注射到体细胞中（从而绕过角质层）进行。通过主题应用程序，LT50变异ΔCoh1的 3 个分离值比 WT 菌株 （图 1B）高约 2 倍。通过直接注射，Δ Coh1的3个分离物也有较高的LT50值比WT应变（S2D无花果）。直接注射后3分和4分，注射Δ Coh13分离物的昆虫的氢化物比WT菌株（S2E图）含有的连字符体少得多（P<0.05）。定量PCR（qPCR）分析进一步表明，受Δ Coh1感染的垂死昆虫的真菌负担明显低于感染WT菌株的昆虫（P<0.05）（S2F和S2G图）。在通常感应环境中（即塑料培养皿的疏水表面），在氮营养物质水平低的情况下，WT菌株和突变 Δ的Coh1（S2H图）之间没有发现压榨层的差异。突变体ΔCoh1穿透昆虫皮质层的能力与 WT 菌株（S2I 图） 没有区别。
然后，我们研究了COH1与宿主免疫防御的真菌相互作用。感染WT菌株减少了G的酚类酶活性。梅洛内拉幼虫，但没有发现突变的Δ Coh1和WT菌株（S2J图）之间的显著差异。qRT-PCR分析表明，感染WT菌株会调节昆虫中抗菌素胆霉素和防御素的表达，但受突变体Δ Coh1感染的昆虫与WT菌株（S2K无图）之间没有显著差异。
我们还通过异位地将其基因组克隆整合到Δ Coh1（S1D图）的基因组中，构建了Coh1删除突变体的补充菌株C-Δ Coh1。 随机挑选了五个变压器进行以下分析。在所有分析中，5 个变压器之间没有发现任何差异，并且仅显示 1 个变压器的数据。补充菌株C-Δ Coh1在皮质层渗透和LT方面与WT菌株并无不同50通过局部应用和注射（S3D–S3F无花果）接种值。虽然PDA板块上C-Δ Coh1菌株的菌落生长与WT菌株（S3A图）并无不同，但其结膜产量显著降低（S3B图）。 菌株C -ΔCoh1的菌落在 PDA 板（S3C 图） 中心接种了锥体悬架后，开始自动自联 14 d 。与WT菌株相比，Coh1在PDA板（S1E图）的防沙生长过程中，在补充菌株C-Δ Coh1中表达。 因此，删除突变体Δ Coh1没有成功地补充其基因组克隆在菌株C-Δ Coh1，这表明Coh1的原生染色体位置是必不可少的转录调节。为了调查WT菌株和C-Δ Coh1在PDA板上的防盐生长差异是否源于C-Δ Coh1中Coh1的表达，我们构建了Coh1-过度表达菌株Coh1 欧通过将 COH1 的编码序列（由构成促进者Ptef从奥雷奥巴西迪姆拉乌兰[18]驱动）转换为 WT 菌株（S1F 无花果）。与C -ΔCoh1一样 ， Coh1欧在PDA板（S3B和S3C图）上14 d培养后，其结肠自动解体，显示出锥形产量下降。应变Coh1欧在皮质层渗透和LT方面与WT菌株和C-Δ Coh1没有显著差异50通过局部应用或注射（S3D–S3F无花果）接种的值。
由高石脱乙酰酶和高石乙酰转移酶对Coh1的调节
为了识别调节Coh1表达的机制，我们比较了WT菌株中Coh1的表达水平与被删除的调节基因[2，9，19]突变中的表达水平。因为不可能从G收集足够的血淋巴。梅洛内拉幼虫筛选大量的突变体，我们寻找的调节器，抑制Coh1在中等SDY的预防性生长过程中的表达，其中Coh1没有表达（图1A）。我们发现，Coh1表现在11个表观遗传突变体中，删除了高石乙酰转移酶、去乙酰酶和甲基转移酶，表明这些表观遗传调节器在盐化生长期间（图1C和S4A）对Coh1表达呈负控制。与盐酸盐生长期间相比，在代孕血糖殖民化（图1D和S4B）期间，只有高石H3去乙酰酶基因（MAA_02098，指定为Hdac1）和高石H3乙酰转移酶基因（MAA_02282，指定为Hat1）受到显著降低管制。在H1和Hdac1的表达水平上没有发现皮质层渗透和预防性生长（图1D）之间的显著差异。我们进一步比较了Hdac1和Hat1在基质层渗透期间的表达水平与在真正的十进制（即M感染的昆虫的造衣体）殖民化期间的表达水平。罗伯茨）。由于我们无法从真正的血甲中获得足够的真菌生物量，无法为 qRT-PCR 分析准备足够的 RNA， 我们通过追踪2个菌株（WT-PHdac1-GFP和WT-PHat1-GFP）中的GFP（绿色荧光蛋白）信号来分析Hdac1和Hat1的表达方式，其中gfp基因是由Hdac1或WT菌株（S1J图）中的Hat1发起人驱动的。与代孕血凝血殖民化从 qRT-PCR 分析中获得的结果一致，在两种菌株中，皮质层真菌细胞中的 GFP 荧光强度都强于真正的血凝胶 （图 1E）。医学论文发表-
在先前的研究中，我们构建了一个删除突变的帽子1，Δ帽子1，其补充应变C-ΔHat1 [19]。在这项研究中，我们产生了Hdac1删除突变体，Δ Hdac1，其补充应变C-Δ Hdac1（S1G和S1H图）。 在代孕造衣殖民期间，Coh1的表达水平在突变 Δ的Hat1中增加了 27.6 倍，在突变ΔHdac1 （图 1F） 中增加了 15.2倍。因此，我们假设，在造衣过程中，Hat1和Hdac1的表达减少，抑制了他们对Coh1的负面调控，导致Coh1的表达。为了测试此贴定，我们首先尝试通过对 Histone H3 中 7 个赖氨酸残留物的乙酰化水平进行免疫体分析来识别 HAT1 和 HDAC1 的目标位点。与WT菌株相比，在突变ΔHat1中，裂解4（H3K4）的高石H3的乙酰化水平显著降低，而在删除突变体中，lysine 56（H3K56）的高石H3的乙酰化水平 Δ在Hdac1和ΔHat1（图2A）中增加。
图 2.HDAC1 和 HAT1 通过调节其发起区域的高石 H3 乙酰化来控制Coh1表达。
（A） 野生型（WT）菌株中希斯通H3蛋白中7个赖氨酸残留物的乙酰化水平的免疫细胞分析，突变体Δ Hdac1和ΔHat1。本研究中显示的所有西方污点图像都是至少3个独立实验的代表。（B） 突变Δ Hdac1的Coh1促进剂H3K56的乙酰化水平，其补充菌株C-Δ Hdac1，Hdac1-过度表达菌株Hdac1 欧， 和 Wt 菌株在萨博劳德克斯特罗斯汤的预防性生长期间补充 1% 酵母提取物 （SDY） 和代孕的赫莫科尔殖民 （Hemolymph）.（C） 突变ΔHat1的Coh1促进剂中高石 H3、H3K56 和 H3K4 的乙酰化水平及其补充菌株C-ΔHat1相对于在预防性生长期间的 WT 菌株。（D） qRT-PCR分析Hdac1表达在WT菌株，突变Δ Hat1，及其补充菌株C-ΔHat1在防沙生长和代孕造和造反殖民。（E） 突变ΔHat1 Hdac1促进剂中高石 H3 和 H3K4 的乙酰化水平及其补充菌株C-ΔHat1相对于防盐生长期间的 WT 菌株。（F） 在替代造衣机殖民化期间，WT菌株Hdac1促进剂中高石H3和H3K4的乙酰化水平相对于预防性生长。对于此图中的色素免疫沉淀定量 PCR （ChIP-qPCR） 分析，这些值表示高石 H3、H3K4 或 H3K56 乙酰化水平与相应控制级别（设置为 1）的折叠变化。所有 ChIP-qPCR 实验至少重复了 3 次。此图中显示的所有图形背后的数据可以在S1 数据中找到。
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然后，我们调查了Hat1和Hdac1是否在Coh1发起器中调节了 Histone H3 的乙酰化。利用色度免疫沉淀定量PCR（CHIP-qPCR）分析，我们发现代孕造和甲醇殖民化期间WT菌株中Coh1促进剂中的高石H3的乙酰化水平比防盐生长期间高13.8倍。更具体地说，在代孕造毒剂殖民化期间，Coh1促进剂中H3K56的乙酰化水平比盐酸盐生长期间高3.5倍，但发现盐水生长与代孕造毒剂殖民化之间没有显著差异。在防沙剂生长过程中，删除突变Δ Hdac1的Coh1促进剂H3K56的乙酰化水平比WT菌株高3.3倍，但WT菌株、补充菌株C-Δ Hdac1和Hdac1-过度表达菌株Hdac1之间没有显著差异欧 (图 2B）。Hdac1的过度表达， 由来自 A的组成发起人Ptef驱动 。拉乌兰斯[18]，被 qrt - pcr（S1i 图） 确认。在代孕造毒期间，WT菌株中Coh1的促进者H3K56的丙酸化程度是Hdac1菌株的5倍欧，但WT菌株、删除突变体Δ Hdac1和菌株C-Δ Hdac1（图2B）之间没有发现任何差异。
如上所述，HAT1 是一种高石乙酰转移酶。出人意料的是，WT菌株中Coh1促进剂中高石H3、H3K4和H3K56的乙酰化水平均低于突变ΔHat1：然而，WT菌株和C-Δ Hat1（图2C）之间没有发现显著差异。 很可能HAT1不会在Coh1的发起人中直接乙酰酸酯高石H3，而是可以调节其他成分，这反过来又会改变Coh1促进者的高石H3乙酰化水平。由于HDAC1的目标是H3K56，而HAT1对H3K56（图2A）的全球乙酰化水平进行了负面监管，我们调查了HAT1是否通过控制H3在其发起人的乙酰化来调节Hdac1表达。qRT-PCR分析表明，在生长和代孕造和替代造衣机殖民（图2D）期间，WT菌株中Hdac1的表达水平明显高于突变ΔHat1，这表明HAT1对Hdac1转录有积极监管。ChIP-qPCR 分析进一步表明，突变ΔHat1 Hdac1促进剂中的高石 H3 和 H3K4 的乙酰化水平均低于 WT 菌株 （图 2E）。在WT菌株中，Hdac1促进剂在预防性生长过程中的乙酰化水平明显高于代孕造和造毒（图2F）。为了进一步确认 HAT1 规范了 Hdac1的表达，而 Hdac1 又控制了Coh1表达式，我们构建了Hat1-Hdac1 Δ应变欧与Hdac1过度表达在突变的Δ帽子 1 （S1i 图） 。qRT-PCR分析表明，代孕造和甲骨文殖民期间，ΔHat1中的Coh1表达水平比ΔHat1-Hdac1的表达水平高3.3倍欧 (S4C 无花果）。
COH1 与转录因子 COH2 进行物理交互
作为一种假定调节蛋白，COH1可以与其他蛋白质相互作用，以控制甲壳细胞殖民化。使用WT-COH1-HA的拉下检测，表达WT菌株（S5B图）中的融合蛋白COH1：HA（一种带有HA[血凝素]标签的COH1蛋白质），我们未能识别出与COH1相互作用的蛋白质。除非另有说明，否则编码融合蛋白的所有基因都由来自A的组成促进者Ptef驱动。拉乌兰在这项研究中。先前的研究表明，基因表达的改变可以改变其相互作用成分[20-23]的表达模式，因此我们使用RNA-Seq来分析Coh1-过度表达菌株Coh1之间的差异表达基因（DEGs）欧和WT应变，以确定与COH1相互作用的候选人。Coh1中有1，893个DEG，其中1，227个基因被向上调节，666个基因被调节欧应变。作为一种调节蛋白，COH1更有可能与其他调节器相互作用，以控制基因表达。与WT菌株相比，在Coh1菌株中对5个转录因子进行了向上调节欧.酵母2混合测定显示，COH1与1转录因子（MAA_07838）（图3A）相互作用，该因子被指定为COH2，因为它也调节血糖的殖民化（见下文）。Coh2具有 849-bp ORF，可编码含有 282 个氨基酸残留物的蛋白质，推断分子重量为 30.9 kDa。COH2 是具有 DNA 结合域 （COH2-DBD） 的 bZIP 转录因子：Ser-30 到 Thr-50）、NLS（Ser-16 到 Asp-39）和更暗的接口域 （DID） （His-53 到 Leu-88）。
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图 3.COH1 与转录因子 COH2 进行物理交互，以降低 COH2 稳定性。
（A） 酵母2混合分析证实了COH1与COH2的物理相互作用。左面板：殖民地生长在SD/?ade/?他/?卢/?Trp + X-α加仑+ Aba。右面板：COH1缺乏自动激活活动。具有 pGBKT7-COH1 的 Y2HGold 细胞不能在 SD/?Ade/?他/?Trp + X-α加仑中生长。BD、绑定域：NC，负控制（含有质粒pGADT7-T和pGBKT7-林的酵母细胞）;PC，正控制（含有质粒pGADT7-T和pGBKT7-53的酵母细胞）。（B） COH1 与 COH2 物理相互作用的致免疫预测确认。核聚变蛋白COH1：HA和COH2：Myc（分子重量=44.6 kDa）同时在COH1-HA/COH2-Myc菌株中表达。控制是表达蛋白质COH2：：Myc的菌株WT-COH2-Myc。免疫预测是用抗HA抗体进行的。通过免疫细胞（IB）分析，用抗HA或抗Myc抗体检测蛋白质。更暗的 COH2：：Myc 由红色箭头表示。M，DNA梯子（C） COH2的微分积累：：在WT-COH2-FLAG菌株的2个分离物中加入FLAG蛋白，在菌株Coh1中分离出5个分离物欧-科赫2旗。抗β-图布林抗体检测到的β-图布林蛋白证实了蛋白质的均等负荷。数字表示 COH2 的带强度：：与β -图布林相比，FLAG。#1隔离株WT-COH2-FLAG的值被设置为1。（D） COH2的组织免疫化学污渍：G的真菌细胞中的G.梅洛内拉幼虫。顶部面板：应变WT-COH2-FLAG：中间面板：Δ科1-COH2-弗拉格：底部面板：Coh1欧-科赫2旗。比例栏表示 10μm。图像代表3个独立实验。F，真菌细胞;FITC，氟西辛异氰酸酯;H，黄细胞：MGV，平均灰色值。（E） 确认二氧化碳的降解：通过蛋白质组体途径确认FLAG蛋白。生长在萨博罗德克斯特罗斯汤中，辅以1%酵母提取物（SDY）介质的菌精，用26S蛋白酶抑制剂MG132进行处理。（F） COH2的无处不在水平：：FLAG蛋白由于与COH1的相互作用而增加。COH2：：FLAG蛋白从MG132处理的骨髓中用抗FLAG抗体拉下来，并带有抗异素（乌比）抗体（左）和抗FLAG抗体（右）。IP，免疫沉淀。医学论文发表-
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我们进一步使用菌株（COH1-HA/COH2-Myc）进行共免疫沉淀（CO-IP）检测，构成表达COH1：HA和COH2：：Myc（一种带有COH2标记为Myc的蛋白质），并确认COH1在体内与COH2（图3B）进行物理相互作用。在共同IP检测中，带有抗Myc抗体的西方污点分析始终表明，检测到的蛋白质质量比蛋白质COH2的预测分子量（44.6 kDa）大2倍：Myc（图3B），表明COH2形成同质体。为了证实这一点，进一步使用菌株（COH2-FLAG/COH2-Myc）进行联合IP检测，构成表达COH2：：FLAG（一种与GAG融合为COH2的蛋白质）和COH2：Myc表明，这2种融合蛋白在体内形成了一个较暗的蛋白质（S6A无花果）。COH2 中的 DID 包含 7 个白化病残留物，这些残留物可能负责此转录因子的变暗。为了测试这一点，我们构建了一个菌株（COH2）Δ确实-迈克）表达蛋白质COH2ΔDID* 在D的白细胞残留物的Myc替代了聚变蛋白COH2中的丙氨酸：：Myc.西方污点分析表明，融合蛋白COH2ΔDID* Myc 没有形成变暗器（S6B 无花果）。
然后，我们检测了使用共同 IP 检测实际接触 COH1 的 COH2 区域。COH2分为N-终点段（Met-1至Thr-100）和C-终点节（Ser-101至Arg-282）。N-终点节包含预测的DNA结合域COH2-DBD、DID和NLS。对于共同IP检测，我们构建了2个菌株：COH1-HA/COH2-N-Myc，表达HA标记的COH1和与Myc融合的COH2（COH2-N）N终点的融合蛋白， 和COH1-HA/COH2-C-Myc，表示HA标记的COH1和COH2 C-终点站（COH2-C）与Myc.共同IP检测融合，表明COH1可以物理上与COH2的N终点站相互作用，但没有与C-总站（S6C和S6D无花果）。与蛋白质COH2：Myc一样，COH2-N：：Myc也形成了二氧化金（S6C图）。
蛋白质COH2：：FLAG被用作本研究中使用的COH2融合蛋白的代表（见下文），以检测与标签融合的COH2蛋白是否保留了其WT活性。为此，我们构建了一个 COH2：：FLAG 表达盒，其编码序列由Coh2发起器驱动，然后转换为变异ΔCoh2（见下文），以产生Coh2-PCoh2-COH2-FLAGΔ应变。WT菌株、coh2-PCoh2-COH2-FLAGΔ和辅料菌株C-Δ Coh2之间没有发现生长和致病性的差异，表明COH2：：FLAG蛋白作为COH2（S7A和S7B无花果）发挥作用。然而，这种方法不能用来调查本研究中使用的COH1融合蛋白是否保留了其WT活性，因为Coh1的原生染色体位置对其促进剂活性（S1D和S1E图）至关重要。然而，Coh1- 过度表达应变Coh1欧在菌落生长和致病性方面与构成表达融合蛋白COH1??Myc（S3C图）的菌株并无不同，间接表明COH1和COH1??Myc具有相同的功能。
COH1 和 COH2 相互作用降低了 COH2 稳定性
然后调查了COH1和COH2对转录因子COH2活动的实际相互作用的影响。我们首先对相互作用对 COH2 稳定性的影响进行了分析。为此，将融合蛋白COH2的蛋白质水平与Coh1菌株进行比较欧-COH2-FLAG（COH2：：在Coh1中表示的FLAG-过度表达应变Coh1欧).菌株的五个隔离物 Coh1欧-选择COH2-FLAG和2个分离株WT-COH2-FLAG，因为它们具有相同的转录水平的融合基因编码蛋白质COH2：：FLAG（S8A无花果）。在SDY介质中，COH1在应变中表示欧-COH2-FLAG，但不是在WT-COH2-FLAG，2分离菌株WT-COH2-FLAG都积累了更高的蛋白质COH2水平：：FLAG比所有5个分离菌株Coh1欧-COH2-标志（图3C）。我们进一步分析COH1是否减少了M感染昆虫的真体体中的COH2：FLAG蛋白的含量。罗伯茨。用抗 FLAG 抗体从真正的血凝体中收集的真菌细胞进行组织免疫化学染色， COH2：：FLAG蛋白被发现在Coh1-COH2-FLAG Δ菌株中比在真正的血甲中表达的菌株WT-COH2-FLAG（Coh1表示）更丰富，而后者的COH2：：FLAG蛋白比Coh1-过度表达菌株Coh1欧-COH2-标志（图3D）。为了调查COH2：：由COH1表达引起的AGFL蛋白的减少是否是由于蛋白质组的降解，WT-COH2-FLAG和Coh1的菌株欧-COH2-FLAG生长在SDY介质中，辅以MG132，这是26S蛋白酶体的特定抑制剂。如图3E所示，MG132治疗提高了Coh2的蛋白质水平：：在Coh1菌株中的FLAG欧-COH2-FLAG，但不是在WT-COH2-FLAG的应变中，表明COH1和COH2之间的相互作用诱导了蛋白质组的COH2：FLAG蛋白的降解。我们进一步发现，COH2的无处不在水平：：在菌株Coh1中的AGFL蛋白欧-COH2-FLAG高于WT-COH2-FLAG，表明无处不在的蛋白酶通路是导致COH2退化（图3F）的原因。
然后，我们测试了 COH1 对 COH2 二元化的影响。为此，我们构建了一个应变（Coh1）欧-COH2-弗拉格/科赫2-迈克）与融合蛋白 COH2：： FLAG 和 COH2：：Myc 表示在菌株Coh1欧 (S5 无花果）。如在菌株COH2-FLAG/COH2-Myc，与融合蛋白COH2：：FLAG和COH2：：Myc表示在WT菌株（S5无花果），COH2变暗在菌株Coh1欧-COH2-FLAG/COH2-Myc（S8B无花果），表明COH1不会影响COH2变暗。
我们还检测了COH1对COH2进入核的影响。为此，我们试图构建一种表达聚变蛋白COH2的菌株：：在菌株Coh1中GFP欧，但这一尝试没有成功，因为蛋白质COH2：GFP总是被分离成2种蛋白质：COH2和GFP。然而，我们成功地在WT菌株和Coh1菌株中表达了一种融合蛋白COH2-N：GFP（GFP与含有NLS、COH2-DBD和DED的COH2 N终点站融合在一起）欧生产WT-COH2-N-GFP和Coh1欧-COH2-N-GFP （S5C 无花果），分别。在这2个菌株中，在SDY介质的盐水生长期间和真正的血凝胶殖民期间，GFP荧光强度在细胞核（S8C图）中最强。然而，使用同时表示COH1：HA和COH2-N：GFP的COH1-HA/COH2-N-GFP菌株，共同IP分析表明，这2种融合蛋白不能物理上相互接触（S8D无花果）。此外，蛋白质COH2-N：：GFP没有进行二氧化糖（S5C无图）。因此，COH2-N：：GFP不适合分析COH1对COH2进入核的影响。
COH2 与致病性有关
为了研究Coh2的生物功能，我们首先对其表达模式进行了分析。qRT-PCR分析表明，Coh2在防沙生长、皮质层渗透和替代造衣机殖民化（S9A图）期间是构成表达的。对于WT-PCoh2-GFP菌株，在WT菌株中Coh2促进剂驱动的gfp中，昆虫皮质层真菌细胞中的GFP荧光信号与受感染昆虫的真血糖（S9B图）一样强烈，表明Coh2在皮质层渗透和真正的血甲殖民化过程中是构成表达的。
然后，我们构建了一个Coh2删除突变体（Δ Coh2）及其补充菌株C-Δ Coh2（S1G和S1H图）。在PDA板块上，在Δ Coh2、C-Δ Coh2和WT菌株（S9C和S9D无图）之间没有明显的菌落生长、菌落表型或结肠产量差异。与昆虫皮质层锥体的局部应用， LT50ΔCoh2 （17.4 ± 0.59 d） 的价值比 WT 菌株 （8.7 ± 0.05 d） （P < 2 倍 0.05），但没有发现WT菌株和补充菌株C-ΔCoh2（8.6±0.07 d）之间的显著差异（P>0.05）。直接注射，LT50ΔCoh2值 （4.5 ± 0.24 d） 略高于 WT 菌株 （3.6 ± 0.09 d）（P < 0 。05），再次应变C-ΔCoh2（3.7±0.13 d）与WT菌株没有显著差异（P>0.05）。在塑料培养皿的疏水表面，在突变的Coh2 Δ延迟了压压形成，而WT菌株和C-Δ Coh2（S9E图）之间没有显著差异。与WT菌株相比，突变体Δ coh2穿透肌层的能力降低，WT菌株与C-Δ Coh2（S9F无花果）之间没有发现任何差异。
为了研究Coh1如何与Coh2相互作用来调节致病性，我们构建了双基因删除突变体Δ Coh1：：Δ Coh2（S1G图）。WT-COH2-FLAG和ΔCoh1-COH2-FLAG是分别在 WT 菌株和变种ΔCoh1中过度表达Coh2的菌株。与主题应用程序， LT50变异Δ Coh1：：ΔCoh2的价值与Δ Coh1和Δ Coh2值没有显著差异，但明显高于WT-COH2-FLAG和Δ Coh1-COH2-FLAG菌株的价值。与WT菌株相比，WT-COH2-FLAG和Δ Coh1-COH2-FLAG菌株的毒性也显著降低（S9G图）。直接注射，LT50Coh1：：ΔCoh2的应 Δ变值与ΔCoh1、ΔCoh2、WT-COH2-FLAG和Δ Coh1-COH2-FLAG （S9H 无花果） 没有显著差异。通过这两种接种方法，发现受Δ科1、Δ科2、Δ科1：Δ科2、WT-COH2-FLAG和Δ Coh1-COH2-FLAG感染的昆虫之间的真菌负担没有显著差异，这些昆虫的真菌负担明显低于感染WT菌株（S2F和S2G图）的昆虫。与受WT菌株感染的昆虫相比，由突变 Δ体coh2感染的昆虫的苯诺洛西酶活性增加了2.3倍（P<0.05）。在受WT菌株感染的昆虫、Δ科1号、C-Δ科2号、WT-COH2-FLAG和Δ科1-COH2-FLAG（S2J图）之间，没有发现表诺西酶活性的重大差异。在受WT菌株感染的昆虫和Δ Coh1、Δ Coh2、WT-COH2-FLAG和Δ Coh1-COH2-FLAG（S2K无图）的突变体之间，在抗菌素胆小素和防御素的表达水平上没有显著差异。医学论文发表-
确定由二氧化碳约束的DNA图案
为了研究转录因子COH2如何用调节蛋白COH1调节致病基因，我们首先使用ChIP-Seq分析与菌株WT-COH2-FLAG来识别由COH2直接调节的基因。在查普-塞克分析中， 峰值呼叫者 MACS（基于 ChIP-Seq 的模型分析）共识别出 562 个受 COH2（S10A 图） 约束的峰值，其中 66.4% 包含一致 7 核苷酸主题 （TGA[C/G]T[C]C/A]]）与多个可能的核苷酸位于位置 4， 6， 和7（图4A和S10B）。此主题被指定为COH2-BM（COH2绑定主题）。与 COH2 形成更暗的一致，主题COH2-BM包含一个柱形序列：TGA 和 TCA 在第四位间隔 1 个核苷酸。然后，电泳移动移位检测 （EMSA） 用于确认 COH2 与基因MAA_04430促进者中主题COH2-BM （TGAGTCT） 的结合，该基因是 ChIP-Seq 分析确定的促进者中具有主题 COH2-BM的基因的代表。我们未能表达大肠杆菌中COH2的全部蛋白质，但含有预测DNA结合域（指定为COH2-DBD）的部分（Met-1至Thr-100）被成功表达，然后为EMSA（S10C和S10D无花果）纯化重组蛋白。凝胶移位检测显示，DNA探头含有与重组COH2-DBD蛋白（图4B）结合的图案COH2-BM（生物素标签）。特定的竞争对手（无标签的DNA探针）几乎完全废除了DNA波段转移（图4B）。为了分析在主题COH2-BM中每个位置对 COH2-DBD 结合的重要性，通过用其他 3 个替换共识基座构建了未标记的COH2-BM突变体，这些突变体随后被用作生物素标记的 DNA 探针与重组蛋白 COH2-DBD 结合的竞争对手。与 ChIP-Seq 分析获得的数据一致，只有 G 到 A 突变位于 7 位置的探头几乎完全废除了标记 DNA 探头的带移，而具有 C 到 A 的探头在位置 6 和空间核苷酸（位置 4）的所有 3 个突变探头也显著改变了波段移位（S10E 和 S10F 图）。其他位置的突变也影响了波段移位，但程度低于上述突变探针（S10F 图）。
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图4。确定由COH1和COH2调节的造烟基因。
（A） 色度素免疫沉淀测序 （ChIP-Seq） 分析确定了受转录因子 COH2 约束的 DNA 图案COH2-BM。（B） 电泳移动移位检测 （EMSA） 确认生物素标记图案COH2-BM （生物探针） 与重组蛋白 COH2-DBD （COH2 DNA 结合域） 的体外结合。在增加特定竞争对手（冷探针：未标记图案COH2-BM）之前，标记的 DNA 波段在 50-100、150、200 或 300 倍的超额中发生了转变，证明了这种结合活动。经测试的DNA图案COH2-BM来自基因MAA_04430的促进者，ChIP-Seq分析证明该基因具有COH2-BM的图案。（C） 色度素免疫沉淀定量PCR（CHIP-qPCR）分析证实，体内的COH2与菌株WT-COH2-FLAG中MAA_04430促进剂中的COH2-BM主题结合，表达融合蛋白COH2：：FLAG。WT-FLAG：仅表示标签标志的应变。（D） ChIP-qPCR 确认 COH2 与 4 个脱毒素生物合成基因（DtxS1、 DtxS2 、 DtxS3和DtxS4）的促进者具有体内约束力。 （E） ChIP-qPCR分析表明，在代孕血凝血殖民化过程中，删除Coh1基因增加了COH2与4个脱毒素生物合成基因的促进者的结合。Δ Coh1-COH2-FLAG：一种表达蛋白质COH2的菌株：：在变种的coh1 Δ中，它具有一种表达蛋白质的菌株。（F） ChIP-qPCR 分析证实，在防盐生长期间，COH1 减少了 COH2 与 4 个脱硫素生物合成基因的促进者的体内结合。科赫1欧-COH2-FLAG：一种表达蛋白质COH2的菌株：：FLAG和过度表达Coh1基因。此图中显示的所有图形背后的数据可以在S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001360.g004
为了验证 ChIP-Seq 和 EMSA 结果，我们用引因进行了定量 ChIP-qPCR，旨在覆盖基因MAA_04430促进者的图案COH2-BM。免疫预科后，qPCR分析显示，含有WT-COH2-FLAG菌株中含有图案COH2-BM的DNA片段的拷贝数比仅表示FLAG标签（图4C）的菌株高29.4倍。
COH1 和 COH2 相互作用抑制了二氧化碳介导对甲壳体殖民化基因的抑制
由于COH1仅在造衣过程中表达，因此我们调查了COH1和COH2如何相互作用来调节这一感染阶段。为此，RNA-Seq 分析首先用于比较在代孕造和造和过程中 WT 菌株的转录组和ΔCoh1和ΔCoh2的突变体。与WT菌株相比，68个基因被向上调节，207个基因在突变 Δ的Coh2（S11A图）中受到调节。与WT菌株相比，在突变 Δ的Coh1（S11A图）中，有52个基因受到低管制，97个基因被向上调节。RNA-Seq 分析表明，Coh1和Coh2均未对Hat1表达进行监管，随后的 qRT-PCR 分析进一步证实，WT 菌株与Noh1和 Δ ΔCoh2的突变体之间的Hat1表达水平没有显著差异，而 Coh1过度表达应变Coh1之间也未发生显著差异欧和Coh2 -过度表达应变Wt - Coh2 - FLAG （S11c 无花果） 。值得注意的是，在ΔCoh1中受到低监管但在ΔCoh2 （S11B 图） 中受到监管的 15 个基因中，有 10 个基因参与了血凝胶殖民化，包括脱毒生物合成通路中的 4 个基因、侧孔铁运输器 （MAA_10457） 和乳糖 （MAA_00990）。为了调查这15个基因是否由COH2直接调控，我们在其发起人中搜索了COH2-BM的图案，这些主题被确定为ORF启动站点上游的大约2kbDNA片段，或者确定为15个基因的ORF和各自相邻基因的ORF之间的区域（如果短于2kb）。在15个基因的促进者中发现了COH2-BM的图案。
我们以4个脱毒生物合成基因（DtxS1、DtxS2、DtxS3和DtxS4）为代表，研究了COH1和COH2调控血糖殖民化所涉及的基因的机制。 qRT-PCR进一步证实，在代孕血凝胶殖民化期间，与WT菌株相比，这4个脱毒素生物合成基因在突变的Coh1 Δ受到低管制，在突变的 Δ coh2（S11D Fig）中受到向上调节。以DtxS3基因为代表，我们测定了Coh1和Coh2对M感染昆虫真实血糖中脱毒生物合成基因表达的影响。罗伯茨。为此，由DtxS3发起人PDtxS3驱动的带有gfp的表达式盒被转换成WT菌株，突变体Δ Coh1和Δ Coh2产生菌株WT-PDtxS3-GFP，Δ科1-PDtxS3-GFP，以及Δ科2-PDtxS3-GFP（S1J无花果）。从真正的血凝胶中采集的Δ Coh2-PDtxS3-GFP细胞的GFP荧光强度似乎比WT-PDtxS3-GFP强，后者又比Δ Coh1-PDtxS3-GFP（S11E图）强。医学论文发表-
ChIP-qPCR 分析显示，在 DtxS1、DtxS2、DtxS3和DtxS4的增量中，WT-COH2-FLAG的 COH2 占用率分别比压力 WT-FLAG（无花果 4D）高 102.8 倍、29.3 倍、62 倍和 13.9 倍。 根据上述 qRT-PCR 和 ChIP-qPCR 数据，我们假设 COH2 是脱毒生物合成基因的抑制器，当真菌进入昆虫血凝素时，COH1 减轻了这种抑制作用。为了测试这一点，我们检测了COH1的存在对COH2与4个基因的促进者结合的影响。为此，我们构建了一个菌株（ΔCoh1-COH2-FLAG）与融合蛋白 COH2：：FLAG 表示在突变ΔCoh1 （S5A 无花果）.在代孕造衣机殖民化过程中，Dtxs1、Dtxs2、Dtxs3和Dtxs4在菌株中富集的蛋白质COH2：：FLAG，其菌株Δ Coh1-COH2-FLAG均高于WT-COH2-FLAG（图4E）。相反，与WT-COH2-FLAG的应变相比，Dtxs1、Dtxs2、Dtxs3和Dtxs4的增量在压力Coh1中分别减少了5.3倍、3.4倍、5.3倍和5.3倍欧-COH2-标志（图4F）。
COH2诱导地层降解基因的表达
如上所述，除了调节甲壳体结肠以及调节剂COH1外，COH2还控制了基质层的渗透。为了研究COH2如何调节皮质层渗透，我们使用RNA-Seq比较了变异Δ Coh2的转录体和WT菌株在蝗虫后翼生长时。与WT菌株相比，549个基因在Δ Coh2（S11A图）中受到低管制，236个基因被向上调节。COH2结合图案COH2-BM在549个低监管基因中的368个基因中发现，在236个上规基因中发现171个。在这项研究中，G.梅洛内拉幼虫作为致病性分析的宿主。因此，通过对5个有代表性的基因的qRT-PCR分析，验证了用蝗虫后腿在G型基质层上获得的结果。梅洛内拉幼虫，他们的表达没有发现蝗虫后翼和G之间的差异。梅洛内拉乳酸（S11G 无花果） 。
值得注意的是，在删除突变体Δ coh2中，44个可降解的基因被降低调节，包括30个蛋白酶、3个甲壳素酶、2个脂酶和9个细胞色素P450酶（S11F图）。在30个蛋白酶基因中，有27个在其促进者中有主题COH2-BM。COH2-BM主题也发现在3个奇蒂纳酶基因，1个唇膏基因和7个细胞色素P450基因的促进者。两个蛋白酶基因（MAA_10199和MAA_10350）和1个千叶酸酶基因（MAA_10456）被用作代表，以确认COH2直接调节了上述的皮质层降解基因。在G的渗透期间。与WT菌株（图5A）相比，麦丽氏菌、qRT-PCR证实，这3个基因在突变的Coh2 Δ受到调节。由于在皮质层渗透期间不可能获得足够的生物量来获得足够的DNA来进行ChIP-qPCR分析，即生长M。在昆虫皮质层上，用G的皮质层在皮质层介质中生长真菌，从而准备了近似的皮质层渗透。梅洛内拉幼虫作为唯一的碳和氮源（以下简称基质层介质）。当真菌生长在皮质层介质中时，ChIP-qPCR分析表明，在WT-COH2-FLAG菌株中，COH2：：FLAG蛋白与这3个基因的促进者（图5B）结合。
COH1抑制在甲壳体殖民化过程中的基质层降解基因表达
一旦真菌进入昆虫血凝胶，皮质降解基因的表达就会受到抑制，否则它们会导致昆虫的过度活性免疫，从而降低昆虫尸体中的真菌可重复性[9，24]。因此，我们调查了当真菌进入造衣体时，COH1是否对基质层降解基因进行COH2介导诱导。2蛋白酶MAA_10199和MAA_10350和奇蒂纳塞MAA_10456再次被用作在皮质层渗透过程中由COH2调节的皮质层降解基因的代表。与基质层渗透率相比，3个可降解基质基因的表达水平在代孕造和甲酸结肠（图5C）期间均显著降低。与这3个基因的表达模式一致，ChIP-qPCR分析表明，在皮质层介质生长过程中，COH2与其促进区域的体内结合明显大于代孕造和甲基殖民化（图5D）。在代孕造和甲酸结肠期间，突变ΔCoh1中这 3 个皮质降解基因的表达水平高于 WT 菌株 （图 5E），在ΔCoh1中，COH2 与其促进者的体内结合也大于 WT 菌株 （图 5F）。
利用蛋白酶基因MAA_10199作为上述3个皮质降解基因的代表，通过追踪WT-菌株中的GFP信号，验证了通过代孕血糖殖民获得的表达结果PMAA_10199-GFP和Δ Coh1-PMAA_10199-GFP，它们分别通过将由MAA_10199促进者驱动的gfp基因转化为WT菌株和突变的Δ Coh1（S1J图）而构建。在切片上的WT-PMAA_10199-GFP细胞的GFP荧光强度强于真正的血凝胶（图5G）。在真正的血凝胶中，GFP 荧光强度在Coh1-PMAA_10199-GFP Δ应变中强于WT-PMAA_10199-GFP （图 5G）。
讨论
真菌是昆虫最常见的病原体，已知约有1，000种导致节肢动物疾病[25]。在昆虫真菌发病过程中，真菌经历了从皮质层到造衣机的微环境过渡。在这项研究中，在模型内致病真菌M.罗伯茨，我们发现了一个新的监管级联，控制真菌对2微环境的反应。在此级联中，转录因子 COH2 与调节蛋白 COH1 相互作用，并充当打开或关闭与甲壳虫的近层渗透或殖民化有关的基因的开关。在皮质层渗透过程中，COH2通过直接结合其促进区域来激活编码皮质层降解蛋白酶、甲壳素酶和脂酶的基因表达。除了由COH2直接调节的基质层降解基因外，RNA-Seq分析还表明，其他基质层降解基因由COH2间接调节。M. robertsii有一个复杂的皮质层降解酶系统，含有许多蛋白酶、甲壳素、脂酶和其他酶，其中一些酶的皮质层降解可以诱导额外的皮质层降解酶的表达[26]。因此，由COH2直接调节的地层降解基因的活动可以诱导参与地层渗透的其他基因的表达。
相反，转录因子COH2抑制了血甲菌化基因的表达，包括脱毒生物合成和铁获取的基因表达。 罗伯茨穿透了皮质层，到达了赫莫科尔。然而，Ecl1 领域含有调节蛋白 COH1 表示在色体和物理接触 COH2 中。这种相互作用抑制COH2介导的对基因的压制，以殖民化的十二甲基。此外，COH1和COH2之间的相互作用抑制了COH2介导的去接基质降解基因，以确保这些基因不会在昆虫的色素中表达。精确调节这些可遗传基因非常重要，如果在血甲中表达，它们会导致昆虫宿主[24]的过度活性免疫力。COH1如何抑制二氧化碳在溶质中的活性的基础机制是，它们的相互作用使COH2容易受到26S蛋白体通路的蛋白质降解的影响。虽然COH2抑制了血甲细胞殖民化基因的表达，但删除了Coh2基因，即完全去除COH2蛋白，轻微但显著地损害了真菌殖民昆虫血甲的能力。这种差异的一个可能解释是，26S蛋白酶通路在造衣过程中不会完全降解COH2蛋白，剩余的蛋白质可能具有其他非特异功能，以促进甲壳体殖民化。此外，RNA-Seq分析表明，许多基因同时受到COH1和COH2的调控，但COH1和COH2控制着一组不同的其他基因，这表明COH1除了与COH2相互作用之外，还可以具有其他功能。这可以解释为什么在科1号Δ、Δ科2号和Δ Coh1Δ号的突变体之间没有发现毒性差异，以及突变体为什么ΔCoh2不同于Coh2表达菌株ΔCoh1、ΔCoh1 -COH2-FLAG和WT-COH2-FLAG对宿主现象酶活动的影响。在以前的几项研究中，Ecl1蛋白被描述在盐水酵母S中。塞雷维西亚和施。庞贝，他们被认为是参与时间寿命事件[27]，抗应力[28]和性发展[29]的调节器，但他们的分子功能仍然不清楚。我们描述了Ecl1蛋白COH1在致病真菌M中的功能。罗伯茨。通过表观遗传调节抑制Coh1对预防性生长很重要，因为Coh1过度表达菌株表现出异常的结肠表型，并降低了结肠产量。然而，COH1在造衣过程中表示，并通过与转录因子COH2的相互作用，在这个感染阶段发挥重要作用。医学论文发表-
在血甲殖民化过程中，Coh1的表达通过分别针对 H3K56 和 H3K4 的 histone H3 乙酰转移酶 HAT1 所赋予的表观遗传抑制的回归激活。HDAC1对表观遗传抑制的回归得到了两行证据的证实。首先，在WT菌株中，代孕造毒剂殖民期间Hdac1的表达水平明显低于盐水生长期间。在代孕造毒剂殖民化过程中，Coh1促进剂中H3K56的乙酰化水平高于预防性生长期间。此外，在预防性生长过程中，删除Hdac1基因导致Coh1促进剂中H3K56的乙酰化水平增加，从而激活Coh1表达。其次，在代孕血凝结期间，删除Hdac1基因对Coh1促进器H3K56的乙酰化水平没有显著影响，但用组成促进器有力地提升Hdac1表达，降低了Coh1促进器H3K56的乙酰化水平，从而降低了Coh1的表达水平。删除Hdac1的原因在代孕血甲酸酯殖民化期间未导致Coh1促进器中 H3K56 的乙酰化水平显著增加，原因可能是Hdac1表达减少到非常低的水平，因此 HDAC1 对Coh1促进器中 H3K56 的乙酰化水平的影响微乎其微。
当M.罗伯西从皮质层到达昆虫甲骨文，Hat1的表达水平降低。这导致H3K4在Hdac1促进器中的乙酰化水平降低，从而减少该基因的表达。除了通过控制HDAC1来调节Coh1发起人的H3K56乙酰化水平外，删除Hat1还提升了Coh1发起人的 H3K4 乙酰化水平，表明 HAT1 对Coh1的调节中涉及其他未知成分。在止甲中减少 Hat1表达不是由于Coh1或Coh2的反馈调节，而是由其他非特异性因素造成的。在从皮质层到造衣机的微环境过渡过程中，M.罗伯茨在宿主防御、营养、渗透和氧气供应方面面临着巨大的环境变化。由监管级联控制的转录重新编程的触发因素可能是多因素的，仍有待解决。
最后，我们发现了一个调控级联，精确控制不同组基因的M的反应。在昆虫发病过程中，罗伯西到2个独特的微环境（皮质层和色体）。此级联包含 4 个组件：高石 3 乙酰转移酶 HAT1、高石 3 去乙酰酶 HDAC1、转录因子 COH2 及其相互作用的蛋白质 COH1。在昆虫基质层上，COH2会打开关键基因，以进行基质层渗透。一旦真菌到达血凝胶，2表观遗传调节器HAT1和HDAC1的表达减少，这增加了在Coh1促进剂的希斯通H3的乙酰化水平，从而激活其表达。COH1 物理接触 COH2 以降低 COH2 稳定性，从而关闭用于基质层渗透的基因，并打开用于造衣机殖民化的关键基因。我们的工作显著地推进了对昆虫真菌发病机性的洞察。M中描述的4个调控基因的同源基因。罗伯西被广泛发现在其他真菌，包括昆虫致病真菌，如博韦里亚巴西亚纳和人类致病真菌，如塔拉罗米塞斯马内菲。因此，许多其他致病真菌中可能存在类似的监管级联。
方法
基因删除
M.罗伯茨·ARSEF2575 来自美国农业部恩托莫病原真菌文化农业研究服务收藏。大肠杆菌DH5?用于构建质粒。M的转换。罗伯茨由农用细菌AGL1[30]调解。
基因缺失和基因缺失突变体的补充是按先前描述的[30]进行的。基因缺失的质粒是使用 pPK2-Bar-GFP 或 pPK2-Sur-GFP 构建的，作为主质粒[30]。为了构建一个质粒来补充基因删除突变体，该基因的基因组克隆——包含促进区域、ORF和终止区域——被PCR放大并插入质粒ppK2-Sur-GFP[30]。高保真度塔克DNA聚合酶（KOD加新：日本大阪的丰田博（Toyobo）用于PCR反应，所有PCR产品都通过DNA测序得到确认。本研究中使用的基因缺失质粒和其他引物的构造引物在S1表中提出。
过度表达Coh1 或 Hdac1的应变构造
Coh1和Hdac1的编码序列由 PCR 克隆，并分别插入质粒 pPK2-Bar-Ptef[2]组成促进器Ptef的下游，以分别产生质粒 pPK2-Bar-Ptef-Coh1 和 pPK2-Bar-Ptef-Hdac1。由此产生的质粒然后转化为WT菌株，以产生菌株Coh1欧和高清1欧.qRT-PCR证实了这2个基因的过度表达。
苯诺菌酶活性和抗菌表达的检测
以检测真菌感染对苯诺菌酶活性和G中抗菌编码基因表达的影响。梅洛内拉幼虫， 5 μL 的锥体悬架 （1 × 107锥体/mL）被注射到每个幼虫。12小时后，3只幼虫的淋巴被收集到4°C的PBS（磷酸盐缓冲盐水）缓冲器中，蛋白质浓度使用BCA蛋白测定剂盒（中国大连美伦）确定。溶胶（总蛋白质的5微克）悬浮在CaCl中2溶液 （5 mM） 实现 20 μl 的最终体积，然后与 80 μL L-DOPA（L-3，4-二羟基苯丙胺）溶液（20 mM，pH 6.6）混合。在黑暗中以26°C的30分钟孵化后，测量了492纳米的吸收。溶酶中的酚类酶活性表现为每微克蛋白质的吸收。L-DOPA 解决方案用作空白[31，32]。控制是从未接种疫苗的昆虫那里收集的淋巴。这个实验重复了3次。
qRT-PCR对抗菌编码基因的表达水平进行了分析，用从受感染的G的脂肪体中准备的RNA进行。梅洛内拉幼虫。G.梅洛内拉18S rRNA基因（根银行加入编号：AF286298）被用作内部标准。医学论文发表-
昆虫真菌负担分析
绝对的qPCR分析用于检测感染M的昆虫的真菌负担。通过量化真菌基因组DNA。18s rDNA 内部转录间隔器 （ITS） 序列用于 qPCR 分析，以估计真菌负担。构建一个用于绝对qPCR分析的标准曲线，即M的基因组DNA。罗伯茨是从生长在SDY介质中的菌精中提取的，并作为qPCR的模板进行串行稀释。为了从受感染的昆虫中提取DNA，5只幼虫在表面用次氯酸钠溶液（1%）进行消毒，并汇集进行DNA提取。真菌负担表现为每1克受感染幼虫的真菌基因组DNA量。
共同IP分析
除了主质粒 pPK2 - 苏尔 - 普特夫 - 弗拉格， ppk2 - 苏尔 - 普特夫 - 哈， pPK2-Bar-Ptef-FLAG 和 pPK2-Bar-Ptef-HA 用于生产与 FLAG 或 HA[33]融合的蛋白质，在这项研究中，我们还通过在质粒 pPK2-Bar-Ptef-Ptef 中插入与 13 次重复的 Myc 肽对应的编码序列构建了主质粒 pPK2-Bar-Ptef-Myc[2]。所有的融合基因都由来自A的组成促进者Ptef驱动。拉乌兰[18]。
为了检测COH1与COH2的体内物理相互作用，构建了COH1-HA/COH2-Myc同时表达融合蛋白COH1：HA和COH2：Myc。COH1（排除停止编码）的编码序列由PCR克隆，并插入质粒ppK2-Sur-Ptef-HA中HA标签编码序列的上游，以产生质粒ppK2-苏尔-普特夫-COH1-HA，然后转化为WT菌株，产生一种称为COH1-HA的菌株。COH2（排除停止，除外）的编码序列也被 PCR 放大，并插入质粒 pPK2-Bar-Ptef-Myc 中 Myc 标签编码序列的上游，生成质粒 pPK2-Bar-Ptef-COH2-Myc。然后，这种质粒转化为COH1-HA应变，以产生COH1-HA/COH2-Myc的菌株，用于共同IP分析。同样，为了确定实际接触COH1的COH2部分，该蛋白质被分为两个部分：含有DNA结合域COH2-DBD和NLS的N-终点站（Met-1至Thr-100），以及C-终点站（Ser-101至Arg-282）。N-终点站和C终点站的编码序列由PCR克隆，并插入质粒ppK2-Bar-Ptef-Myc中Myc标签编码序列的上游。然后，产生的质粒转化为Coh1-HA菌株，以产生COH1-HA/COH2-N-Myc和COH1-HA/COH2-C-Myc的菌株，用于共同IP分析。
为了检测COH2是否形成同质体，构建了COH2-FLAG/COH2-Myc菌株。为此，质粒ppK2-酒吧-Ptef-COH2-Myc被转化为WT菌株，产生一种称为COH2-Myc的菌株。COH2（排除停止胶子）的编码序列被 PCR 放大，并插入 pPK2-Sur-Ptef-FLAG 中 FLAG 标签编码序列的上游，生成质粒 pPK2-苏尔-普特夫-COH2-FLAG。然后，这种质粒转化为COH2-Myc菌株，以产生COH2-FLAG/COH2-Myc的菌株，用于共同IP分析。为了检测 COH1 对 COH2 变暗的影响， COH1的编码序列被克隆并插入质粒ppK2-NTC-GFP-Ptef[26]的发起器Ptef的下游，以产生质粒ppK2-NTC-GFP-Ptef-COH1，然后转化为COH2-FLAG/COH2-Myc菌株，以产生Coh1菌株欧-二氧化碳2-弗拉格/科赫2-米克。
共同IP分析按先前描述[33]执行。蛋白质浓度是使用BCA蛋白测定剂盒（中国大连美伦）确定的。老鼠抗Myc和抗HA抗体是从ABclonal（中国武汉）购买的，兔子抗FLAG抗体是从西格玛-奥尔德里希（美国圣路易斯）购买的。Dynabeads 蛋白 G 珠是从英维特罗根 （卡尔斯巴德， 加利福尼亚州， 美国） 购买的。医学论文发表-
使用标准的西方污点分析进行联合IP后，确认真菌菌株中融合蛋白的表达，并分析目标蛋白质的存在。真菌蛋白总量如前所述[33]提取。所有共 IP 检测都重复了至少 3 次。
奇普 - 塞克和奇普 - qpcr 分析
表达融合蛋白COH2的菌株WT-COH2-FLAG：FLAG用于ChIP-Seq识别转录因子COH2所绑定的DNA图案。科尼迪亚 （108）接种100mL的SDY介质，在26°C孵育36小时，220转/小时摇晃。然后收集并接受由武汉伊金书生物技术公司（中国武汉）进行的ChIP-Seq分析。用于免疫沉淀的抗体是抗FLAG（中国杭州华比奥），使用光照希塞克2000测序系统对CIP浓缩DNA进行测序。经过初步的质量控制，去除测序适配器和低质量的基础，干净的读数被映射到M的基因组。罗伯茨使用软件BWA（版本0.7.15-r1140）。峰值呼叫者 MACS（版本 2.1.1.20160309;q值< 0.05） 用于本地化 COH2[34]的潜在绑定站点。
ChIP-qPCR 按照先前描述[33]执行，并进行了一些修改。交叉连接的菌精在液氮中磨成细粉末，然后在裂解缓冲器中再吸附。离心后，色质DNA使用M220（科瓦里斯，沃本，美国，美国）与PIP 75 W，值因子10，周期/爆裂200计数，时间1，500s剪切。免疫预测使用抗体（抗 FLAG [西格玛-奥尔德里希，圣路易斯， MO， 美国]， 抗 H3Ac， 抗 H3K4Ac， 或反 H3K56Ac [主动莫蒂夫， 卡尔斯巴德， CA， 美国]） 与迪纳比德蛋白 G 珠 （英维他命， 卡尔斯巴德， CA， 美国）一起执行。ChIP 浓缩的 DNA 被用作使用雷鸟 SYBR qPCR 混合无 ROX（日本大阪都洋博）进行 qPCR 分析的模板。通过将免疫沉淀的DNA除以输入DNA来计算相对富足值。所有 CHIP-qPCR 分析均重复了 3 次。
为了在代孕血甲殖民期间准备骨髓，血淋巴（250μL）是从最后一个星G收集的。梅洛内拉幼虫，并混合同等量的抗凝血溶液（60米三聚氰胺柠檬酸，52米柠檬酸，120m NaCl，200m葡萄糖，20m EDTA），其中10μL的锥形悬架（1×107锥体/mL）接种。在26°C的潜伏36小时后，轻轻摇晃，培养处理与冻结（?80°C）和解冻（26°C）的循环，然后进行离心。颗粒在无菌水中再接再补，再用离心收集。这种用水清洗被重复7次，以去除昆虫的淋巴，然后收集菌精用于ChIP-qPCR分析。为了获得足够的生物量，以获得足够的DNA，用于在皮质层渗透期间进行ChIP-qPCR分析，真菌菌菌在基质层中与G的皮质层一起生长。梅洛内拉幼虫（1%，V/W）作为唯一的碳和氮源。准备G.梅洛内拉乳酸甲骨文是按先前描述[26]进行的。为此，在上面描述的SDY介质中生长的菌精通过过滤收集，然后用无菌水洗3次。然后，在角质层介质中，在26°C下生长1小时，然后收集用于 ChIP-qPCR 分析。
埃姆萨斯
EMSA 是按先前描述[33]进行的，以分析 COH2 DNA 结合域 （COH2-DBD） 与含有COH2-BM 的DNA 探针的结合。DNA探针是基因MAA_04430促进器的一部分，ChIP-Seq分析证明该基因受COH2的约束。以E表示 COH2-DBD（Met-1 到 Thr-100） 。大肠杆菌，其编码序列被PCR克隆，并插入到质粒pET28a（英维他根）的EcoRI/HindIII站点。由此产生的质粒被转移到E.大肠杆菌BL-21菌株，和重组蛋白的表达是由异丙基β-D-1-硫基丙酮苷在18°C 16小时，如制造商的说明（诺威根，麦迪逊，威斯康星州，美国）。重组后的COH2-DBD蛋白随后与HiPur Ni-NTA树脂（美国瑟莫费舍尔科学、沃尔瑟姆、马伊）和凝胶过滤色谱学一起纯化为均质，具有HiLoad 16/600和26/600 Superdex 75准备等级（GE医疗保健生物科学，瑞典乌普萨拉）。
为了准备标有生物素的DNA探针，它的一条链条被贴上了生物素标签（中国杭州的辛克生物技术），根据制造商的指示，该探针与互补链相退，形成双链DNA。DNA探针的两条未标记链经过商业合成和脱氧核糖核酸，形成未标记的DNA片段。变异的DNA探针的准备与WT DNA探针完全一样，其图案为COH2-BM，其他3个探针中各有1个核苷酸。变异DNA探针的细节显示在S10E图中。
EMSA 是使用光移化疗 EMSA 套件（热费舍尔科学）进行的。在竞赛检测中，增加了300倍的无标签DNA探针。医学论文发表-
RNA-塞克和qRT-PCR分析
总RNA是提取与三氯环生试剂（瑟莫费舍尔科学）。在防沙生长和替代造衣殖民期间，为 ChIP-qPCR 分析准备了上述的菌精，然后进行 RNA 提取。为了在皮质层渗透期间准备骨髓，在放置在水体板上的蝗虫后翼上应用了锥体悬架。在26°C的30小时孵化后，后翼和真菌生物量受到RNA提取。
RNA-Seq分析由个人基因技术（中国南京）进行。配对端测序在光照2000测序平台上进行。干净的读数被映射到M。罗伯茨基因组使用软件希萨特2（https://daehwankimlab.github.io/hisat2/）。使用 FPKM（每百万个片段每千基碎片碎片）方法用于基因表达定量的读数，该读数与参考序列唯一对齐。使用经调整的P值 0.05（本杰明–霍奇伯格方法）使用 DESeq 软件执行差分表达分析。对于从生长在溶胶中的菌细胞中收集的RNA，从昆虫RNA中产生的读数被过滤，其余读数被映射到M。罗伯西基因组，用于后续分析。
对于 qRT-PCR，与 Revertra 王牌 qPCR RT 主混合（日本大阪东京都）的补充 DRNA （cDNAs） 合成了总RNA。qRT-PCR 分析使用雷鸟 SYBR qPCR 混合无 ROX（日本大阪都洋博）进行。Gpd和tef的基因被用作内部标准，如先前描述的[35]。基因的相对表达水平使用2确定?ΔΔCt方法[36]。所有 qRT-PCR 实验均重复 3 次。
测定高石 H3 中的乙酰化水平
为了分析高石H3的乙酰化水平，100微克的总蛋白质被电泳在12%的SDS-PAGE凝胶上，然后转移到PVDF膜（Bio-Rad，大力神，加利福尼亚州，美国）。抗乙酰基基H3（西格玛-奥尔德里希）检测出高石H3的全球乙酰化水平。针对希斯通 H3（H3K4、H3K9、H3K14、H3K18、H3K23、H3K27 和 H3K56） 不同 lysine 站点乙酰化水平的抗体均从活动莫蒂夫（加利福尼亚州卡尔斯巴德，美国）购买，并稀释 1：2，000 用于西方污点分析。希斯通H3蛋白被检测为抗H3（默克米利波雷;1：1，000稀释）。所有斑点均由化学发光检测系统（清晰西ECL、Bio-Rad）成像，所有波段的信号强度均使用图像J软件（https://imagej.nih.gov/ij）进行量化。实验重复了3次。
酵母 2 混合和自动激活检测
酵母2混合检测是按照制造商的指示（日本克朗泰克）进行的。对COH1和5转录因子之间的相互作用进行了检测。PCR 克隆了 5 个转录因子（MAA_08013、MAA_06777、MAA_07566、MAA_06937 和MAA_07838）的编码序列，并插入质粒 pGADT7 中。COH1 的编码序列也由 PCR 克隆并插入质粒 pGBKT7 以生成质粒 pGBKT7-COH1。所有基于 pGADT7 的质粒都转化为 Y187 细胞，而 pGBKT7-COH1 则转化为 Y2HGold 细胞。酵母制造商酵母转化系统2（日本东京Takara生物）用于制备酵母能力细胞。交配后，产生的菌株生长在中性SD/?Ade/?His/?Leu/?Trp与X-α-gal和AbA（奥雷奥巴西丁A：高拉生物）。COH1的自动激活是通过在中型SD/?Ade/?His/?Trp上用X-α-gal接种含有质粒pGBKT7-COH1的菌株来测试的。酵母2混合和自动激活检测重复3次。
抑制无处不在的蛋白酶通路的活动
科尼迪亚 （108总共）接种到100 mL的SDY介质，并在26°C生长30小时，然后添加26S蛋白酶抑制剂MG132（200μM）。经过4小时的孵育，通过过滤收集的细胞为蛋白质制备。为了检测蛋白质COH2的无处不在水平：：FLAG，用小鼠抗FLAG（中国华比奥）进行免疫预测，如前所述[30]。兔子抗超曲素抗体是从阿布克隆（中国武汉）购买的。
组织营养化学染色
对融合蛋白COH2的组织营养化学染色分析??FLAG是如前所述[2]进行的。主要抗体为抗 FLAG（中国华比奥），氟西甲青酸酯 （FITC） – 组合山羊抗鼠标 IgG（中国华比奥：稀释 1：200）用于二次贴标。医学论文发表-
通过跟踪GFP信号分析基因表达
为了通过追踪GFP信号来研究受感染昆虫真实血凝体中基因的表达，我们构建了由该基因发起人驱动的GFP编码序列的菌株。圆锥体 （105这种真菌株的10μL的0.01%特里顿X-100溶液中的锥体被注射到G中。梅洛内拉幼虫。36小时后，采集血凝胶中的真菌细胞，用于GFP信号观察和量化。为了分析在皮质层渗透过程中基因的表达，在G上接种了200μL的锥形悬浮剂。在36小时的孵化后，观察并量化了梅洛内拉皮质层和GFP信号。
使用 ImageJ 软件（https://imagej.nih.gov/ij）对上述图像中催眠的荧光强度进行量化。为此，以 Tiff 格式保存图像，然后将其位深度更改为 8 位，然后使用 50 像素的"滚球直径"[37]减去一般背景。然后选择图像中的催眠，然后计算区域、平均灰色值 （MGV） 和 MGV 对选定区域的标准偏差。所选催眠的荧光强度显示为MGV。
致病性检测
G.梅洛内拉幼虫（瑞清诱饵公司，中国上海）用于检测M的致病性。罗伯茨。接种是通过在昆虫角质层上局部应用锥形或将锥形注射到昆虫的溶质[10]中进行的。所有生物分析都重复了3次，每次重复40只昆虫。对培养皿（康宁、康宁、纽约、美国）疏水表面的压压形成进行测定，如前所述[2]。
穿透昆虫皮质层的能力被检测出如先前描述[33]。简言之，2μL 的圆锥体悬架（1 × 107锥体/mL）被涂在放置在PDA板上的完整基质层的中心。在26°C的48小时孵育后，角质层被移除，PDA板被进一步孵育，使真菌的生长，如果有的话，已经突破了角质层，并达到PDA介质。真菌穿透昆虫皮质层的能力越强，真菌到达PDA介质越多，即去除皮质层和孵化后出现在PDA板上的菌落越大。
要检测真菌在昆虫溶胶中产生爆炸孢子的能力，5μL 的锥体悬架（1 × 10）5锥形/mL被注射到G的血糖中。梅洛内拉幼虫。然后，注射后3和4分，每次治疗10只幼虫用1%漂白剂进行表面消毒，并像之前描述的那样单独出血[10]。来自每个幼虫的血淋巴（50μL）与抗凝血溶液的50μL混合，并扩散到选择性介质[10]。在26°C的4d孵育后，确定了殖民地形成单元（CFU）。所有检测都重复了至少3次。
支持信息
Figure 1Figure 2Figure 4Figure 5S1 FigS2 FigS3 FigS4 FigS7 FigS8 FigS9 FigS11A-1 FigS11A-2 FigS11A-3-FigS11B FigS11 Fig
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S1 无花果。确认删除基因Coh1，Hdac1，或Coh2，并过度表达Hdac1和Coh1。
（A） 基于同源重组的基因缺失示意图图。下面板是删除质粒的地图，其在真菌基因组中的相对位置显示在上面板中。（B） 确认使用 PCR 在具有除草剂 PPT 电阻且没有 GFP 信号的变压器中使用 PCR 的Coh1删除突变体 （ΔCoh1）的构造。ΔCoh1#1， ΔCoh1 #2， 和ΔCoh1#3代表删除突变体的 3 个独立隔离，WT 是野生型菌株。上面板：PCR 与入门栏和确认引号 CF2 一起进行（所有引号的相对位置显示在 [A]中）。PCR 产品只能从删除突变体中获取。下面板：使用引言 CF1 和 CF2 进行 PCR。PCR 产品只能在 WT 菌株中获得。（C） 南方污点分析证实，选择标记基因Bar没有异位地集成在（B）中显示的Coh1删除突变体的3个分离物中，这表明选择标记基因的插入只删除了Coh1基因。基因组DNA（15微克）与巴姆希和斯迈一起消化。Bar基因的PCR产品是二基因基因（DIG）-标记并用作DNA探针。（D） 确认将Coh1基因的基因组克隆插入删除突变体Δ Coh1的基因组中，由PCR使用引物ORF-5和ORF-3进行补充。C1、C2、C3、C4 和 C5 代表 5 个随机选择的变换器。（E） 在 （D） 显示的 5 个随机选择变量器 （C1、C2、C3、C4 和 C5） 中对Coh1表达进行反向转录 PCR （RT-PCR） 分析，表明由于Coh1的原生染色体位置对于其转录调节的重要性，因此无法构建ΔCoh1的补充菌株。RNA 是从生长在 PDA 板上的菌株中收集的，其中Coh1没有在 WT 菌株中表示。上面板：Coh1基因。注意：在WT菌株和删除突变体Δ coh1中未看到 PCR 产品。下面板：参考基因Gpd编码甘油醛3磷酸盐脱氢酶。（F） RT-PCR 确认Coh1 -过度表达应变Coh1欧在预防性生长期间。科赫1欧#1， Coh1欧#2和科赫1欧#3是 3 个独立的菌株隔离体 Coh1欧.隔离科1欧#3用于其他菌株的制造。（G） PCR 确认hdac1（左）和 Δ ΔCoh2（中）和双删除突变体ΔCoh1：：ΔCoh2（右）构建删除突变体。为了构建变异Δ Coh1：：Δ Coh2，Coh1基因在突变的coh2 Δ被删除。对于每个基因，上下面板的图谱与 （B） 中的图谱相同。D1、D2和D3代表3个独立的删除突变体。（H） PCR 确认删除突变体与分别的基因组克隆ΔHdac1和ΔCoh2的互补性。C1 和 C2 代表 2 个独立的补充菌株。（一） qrt - pcr 确认Hdac1 -过度表达应变Hdac1 的建设欧或ΔHat1-高清1欧在代孕期间，他S1 数据中找到。医学论文发表-
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001360.s002
（蒂夫）
S2 无花果。Coh1参与造衣体殖民化，但不参与皮质层渗透、盐水生长和结膜化。
（A） PDA板上的菌落直径。Δ Coh1#1，Δ Coh1#2，和Δ Coh1#3是3个独立的分离突变Δ Coh1。注意：在接种后的每个时间点，所有测试菌株（n = 3，P > 0.05，Tukey 的单向 ANOVA 测试）之间没有发现菌落直径的显著差异。 （B） PDA板块的结对收益率。锥形产量的量化重复了 3 次，每次重复重复 3 次。数据表示为平均± SE。在菌株（n = 9，P > 0.05，单向 ANOVA）之间没有发现显著的结对产量差异。 （C） （A） （A） 中描述的 4 个菌株的 PDA 板上的殖民地表型（上面板）和锥形（下面板）。接种疫苗后观察到5分（鳞片表示10微米），接种后18分拍摄殖民地照片（鳞片表示10毫米）。图像至少代表3个独立实验。（D） 中尉50（杀死50%的昆虫所占用的时间）当昆虫通过向溶殖器中注射锥体进行接种时，其值。数据表示为平均± SE. 具有不同字母的值显著不同（n = 3， P < 0.05， Tukey 的单向 ANOVA 测试）。（E） 将锥体注射到溶胶后，在第 2 天、第 3 天和第 4 天对昆虫氢化体中的连字符体进行量化。CFU，殖民地形成单位。在每天之内，具有不同字母的值明显不同（n = 3，P < 0.05，Tukey 的单向 ANOVA 测试）。（F 和 G）对感染M的活昆虫真菌负担的绝对qPCR分析。通过（F） 局部应用或 （G） 直接注射的罗伯茨菌株。具有不同字母的值显著不同（n = 5，P < 0.05，图基的单向 ANOVA 测试）。 （H） 疏水塑料表面的压榨发育。在所有时间点中，WT 菌株和突变ΔCoh1的 3 个独立隔离体（n = 3，P > 0.05，Tukey 的单向 ANOVA 测试）之间均未发现显著的压压形成差异。 实验重复了3次。数据表示为平均± SE。内装是接种后16小时形成的压榨剂的代表。（一） G 的皮质层渗透的检测。梅洛内拉幼虫。康尼迪亚 （2μl 的圆锥体悬架 [1 × 107在角质层上涂上锥状/mL]，它被放置在PDA板上，在26°C下孵育48小时，以允许渗透。角质层被去除，然后在26°C孵育板，使真菌生长。比例栏表示 1 厘米。真菌群落的出现表明了地层渗透的成功。PDA板上的真菌群的大小表示穿透皮质层的能力。图像代表3个独立实验。（J） 从G.梅洛内拉幼虫感染不同的M。罗伯西应变。控制：未接种疫苗的昆虫。具有不同字母的值显著不同（P < 0.05，图基的单向 ANOVA 测试）。（K） qRT-PCR分析编码抗菌胆素和防御素的基因在G中的表达水平。梅洛内拉幼虫。控制：未接种疫苗的昆虫。具有不同字母的值显著不同（P < 0.05，图基的单向 ANOVA 测试）。此图中显示的所有图形背后的数据可以在S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001360.s003
（蒂夫）
S3 无花果。Coh1的预防性生长和致病性 - 过度表达菌株Coh1欧和补充应变C-Δ科1的Δ科1。
（A） PDA 板块的殖民地增长。科赫1欧#1和科赫1欧#2是 2 个独立的菌株隔离体 Coh1欧.在每个时间点（n = 9，P > 0.05，单向 ANOVA）没有发现菌株之间的显著差异。 （B） PDA 板块的结节收益率。具有不同字母的值显著不同（n = 9，P < 0.05，图基的单向 ANOVA 测试）。 （C） 在PDA板上结肠（上面板;比例杆：10μm）和菌落形态（下面板;比例杆：1厘米）。（D 和 E）中尉50值通过（D）主题应用程序或（E）直接注入。测试菌株（P > 0.05，图基的单向 ANOVA 测试）之间没有发现显著差异。（F） 乳酸层渗透。比例栏代表 1 厘米。图像代表3个独立实验。此图中显示的所有图形背后的数据可以在S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001360.s004
（蒂夫）
S4 无花果。9 表观遗传突变体中的Coh1表达。
（A） WT菌株中Coh1表达的反向转录PCR（RT-PCR）分析2个高石乙酰转移酶基因（Hat2 [MAA_04679]和Hat3MAA_04734]），5个高石去乙酰酶基因（Hdac2 [MAA_02065]， Hdac3 [MAA_04246]， Hdac4 [MAA_04846]， Hdac5 [MAA_05326]和Hdac6 [MAA_05985]），和 2 个 histone 甲基转移酶基因（Hmt1 [MAA_00272]和Hmt2 [MAA_09293]）在预防性生长期间。注意：在WT菌株中未看到RT-PCR产品。上面板：Coh1基因：下面板：参考基因Gpd。M，DNA梯子图像代表3个独立实验。（B） qRT-PCR 分析替代血细胞殖民化 （血淋巴） 和皮质层穿透 （乳酸） 相对于防盐生长 （SDY） 期间 （A） 中描述的 9 个表观遗传基因的表达。（C） qRT-PCR 分析在 Hat1 和 Δ ΔHat1-Hdac1的菌株中的Coh1表达式欧在代孕期间，他S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001360.s005
（蒂夫）
S5 无花果。西方对不同菌株中融合蛋白表达的污点分析。
（A） 融合蛋白COH2的表达：在WT菌株中，在菌株Coh1中产生WT-COH2-FLAG菌株欧生成Coh1欧-COH2-FLAG，并在变异的Δ科1形成Δ科1-COH2-FLAG。应变WT-FLAG是通过将 WT 菌株与质粒 pPK2-Bar-Ptef-FLAG 转换为 FLAG 标签的表达而获得的。注：由于变暗，与融合蛋白COH2相对应的波段：：FLAG比其预测的分子量大约2倍。由于规模较小，未看到与 FLAG 标签相对应的波段。（B） 融合蛋白COH1：在WT菌株中表达：HA产生WT-COH1-HA菌株。WT-HA的应变是 WT 菌株，用于表达 HA 标签而与质粒 pPK2-苏尔-普特夫-HA 一起转化。（C） 与 WT 菌株中的 GFP 蛋白标记的 COH2 的 N-总站（Met-1 至 Thr-100）的融合蛋白COH2-N：GFP 的表达，以产生 WT-COH2-N-GFP和Coh1菌株中的菌株欧生产科赫1欧-COH2-N-格夫普科赫1欧-COH2-N-GFP#1， Coh1欧-COH2-N-GFP#2和科1欧-COH2-N-GFP#3是3个独立的菌株隔离体欧-COH2-N-格夫普（D） 融合蛋白COH2的表达：：菌株WT-COH2-FLAG中的Myc产生菌株COH2-FLAG/COH2-Myc。应变WT-COH2-FLAG/Myc是用质粒 pPK2-Bar-Ptef-Myc 转换的应变，用于表达 Myc 标签。（E） 蛋白质的表达与标签Myc融合到变异的COH2（COH2）ΔDID，在 WT 菌株中将较暗界面域中的 7 个柳辛残留物与丙氨酸）替换，以产生菌株WT-COH2Δ确实-我.应变WT-Myc是WT菌株转换与质粒ppK2-酒吧-Ptef-Myc表达Myc标签。（F） 融合蛋白COH1：HA的表达与COH2的N-终点的蛋白质融合到WT菌株中的Myc标签，产生COH1-HA/COH2-N-Myc菌株。应变COH1-HA/Myc是通过将质粒ppK2-酒吧-Ptef-Myc转换为菌株WT-COH1-HA获得的。（G） 融合蛋白COH1：HA与COH2 C终因（Ser-100至Arg-282）的表达与WT菌株中的Myc标签融合，产生COH1-HA/COH2-C-Myc菌株。COH1-HA/Myc中的应变在 （F） 中描述。WT-Myc中的应变在 （E） 中描述。使用的抗体显示在每个面板的底部。并非裁剪所有图像。所有西方污点分析的图像代表了每个条件的 3 个独立实验。医学论文发表-
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001360.s006
（蒂夫）
（A） 共同IP确认COH2二分钱机的形成。融合蛋白COH2：FLAG（分子重量=33 kDa）和COH2：Myc（分子重量=44.6 kDa）同时在COH2-FLAG/COH2-Myc菌株中表达。控制菌株COH2-Myc表示蛋白质COH2：：Myc.免疫预测是用抗FLAG抗体进行的。通过抗Myc或抗FLAG抗体的免疫细胞分析检测出蛋白质。上面板：箭头表示COH2的二毛钱：：FLAG：下面板：箭头表示COH2的更暗：：Myc和COH2：：FLAG。（B） 较暗界面域 （DID） 中的白化病残留物是 COH2 变暗的关键。WT-COH2-Myc：一种表达蛋白质COH2的菌株：：Myc：WT-COH2Δ确实-Myc：一种表达Myc标记蛋白COH2的菌株ΔDID，一个突变的COH2与7个白化病残留物在D做替代丙氨酸。注意：蛋白质COH2：：Myc形成一个较暗的（上面板），而COH2ΔDID* Myc 不（下面板）。（C） 共同 IP 分析显示，COH2 （COH2-N：：：Myc） 的 Myc 标记 N 终点站与 HA 标记的 COH1 （COH1：：HA） 进行物理交互。（D） 共同 IP 分析显示，COH2 的 Myc 标记 C 终点站（COH2-C：：Myc） 不与 HA 标记的 COH1（COH1：：HA）相互作用。免疫预测是用抗HA抗体进行的。通过抗HA或抗Myc抗体的免疫细胞分析检测出蛋白质。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001360.s007
（蒂夫）
S7 无花果。融合蛋白COH2：FLAG具有与COH2相同的功能。
（A） WT、ΔCoh2-PCoh2-COH2-FLAG和C-ΔCoh2菌株的殖民地直径。注意：每天3个菌株之间没有显著差异（n = 9，P>0.05，图基的单向ANOVA测试）。 （B） 中尉50通过主题应用程序的值。测试菌株（n = 3，P > 0.05，图基的单向 ANOVA 测试）之间没有发现显著差异。 此图中显示的所有图形背后的数据可以在S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001360.s008
（蒂夫）
S8 无花果。COH1 和 COH2 相互作用对 COH2 稳定性、COH2 变暗和真菌进入核的影响。
（A） qRT-PCR 分析编码融合蛋白 COH2 的基因表达：：将菌株WT-COH2-FLAG的 2 个分离物中的 FLAG 和菌株Coh1的 5 个分离物中欧-科赫2旗。（B） 共同IP分析表明，COH2蛋白在Coh1中变暗-过度表达菌株Coh1欧.使用了三种菌株：（1）WT-COH2-Myc，构成表达融合蛋白COH2：：Myc：（2）WT-COH2-FLAG/COH2-Myc，构成表达融合蛋白COH2：：FLAG和COH2：：Myc：和（3）科赫1欧-COH2-FLAG/COH2-Myc，它构成表达COH1蛋白和融合蛋白COH2：FLAG（分子重量=33kDa）和COH2：：Myc（分子重量=44.6 kDa）。菌株生长在营养丰富的中等SDY中，其中COH1在菌株WT-COH2-FLAG/COH2-Myc中没有表示。免疫预测是用抗FLAG抗体进行的。通过抗Myc或抗FLAG抗体的免疫细胞分析检测出蛋白质。注意： 融合蛋白 COH2：： FLAG 和 COH2：：Myc 在菌株中变暗Coh1欧-COH2-FLAG/COH2-Myc和WT-COH2-FLAG/COH2-Myc，以及融合蛋白COH2：：Myc在WT-COH2-Myc菌株中形成了一个较暗的变暗器。（C） 在SDY介质（左面板）和真正的血凝胶殖民化（右面板）的防血生长过程中，COH2的GFP标记N-终点进入核。使用了两种菌株：（1） WT-COH2-N-GFP，融合蛋白 COH2-N：：GFP （GFP 与 WT 菌株中表达的 COH2 N 终点站） 和 （2） Coh1欧-COH2-N-GFP，构成表达COH1蛋白和COH2-N：：GFP。菌株的三个独立隔离体 Coh1欧-COH2-N-GFP随机选择用于此检测。在每个面板中：左，明亮的场显微镜：DAPI（4+，6-二胺-2-苯丙烯）染色的中荧光显微镜;右，荧光显微镜用于GFP观察。C， 圆锥体：N，核。注意：在所有测试菌株中，GFP荧光强度在原子核中最强。（D） 共同IP分析表明，GFP标记的二氧化碳（COH2-N：：GFP）的N-终点站无法实际接触HA标记的COH1（COH1：：HA）。免疫预测是用抗HA抗体进行的。通过抗HA或抗GFP抗体的免疫细胞分析检测出蛋白质。此图中显示的所有图形背后的数据可以在S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001360.s009
（蒂夫）
S9 无花果。Coh2涉及昆虫感染，但不涉及预防性生长。
（A） qRT-PCR 在代孕造和体殖民化（溶胶）、皮质层穿透（乳酸）和防盐生长 （SDY） 期间对Coh2表达的分析。（B） GFP信号在菌株的真菌细胞与gfp驱动的Coh2促进剂在基质层（乳酸）和真正的血凝胶（血凝胶）的G.梅洛内拉幼虫。F，真菌细胞比例杆：10 μm。图像代表3个独立实验。（C） WT菌株PDA板上的殖民地直径，突变Δ Coh2，及其补充菌株C-ΔCoh2。接种是通过应用5μL的锥体悬浮（1×10）进行的7在PDA板的中心锥体/mL。注意：在每天内，观察到3个菌株之间的菌落直径没有显著差异。（D） 结对收益。注意：这3个菌株之间没有显著差异。内装是PDA板接种后第18天拍摄的殖民地照片（比例杆代表10毫米）。（E） 疏水塑料表面的压榨发育。在每个时间点，具有不同字母的值都明显不同（n = 3，P < 0.05，Tukey 的单向 ANOVA 测试）。（F） 乳酸层渗透。这个实验在S2I图中描述。比例栏代表 1 厘米。图像代表3个独立实验。（G 和 H）中尉50值通过（G）主题应用程序或（H）注入。数据表示为平均± SE. 具有不同字母的值显著不同（P < 0.05， Tukey 的单向 ANOVA 测试）。此图中显示的所有图形背后的数据可以在S1 数据中找到。医学论文发表-
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001360.s010
（蒂夫）
（A） ChIP-Seq 分析揭示的基因组中所有 COH2 峰值位置的分布。（B） HOMER（图案优化）软件丰富的前 3 个绑定主题。（C） SDS-PAGE分析E中重组COH2-DBD（COH2的DNA结合域）蛋白的表达和纯化。大肠杆菌。M，蛋白质梯（瑟莫费舍尔科学）。车道1：从E.大肠杆菌细胞与空质粒pET-28a（控制）。车道2：从E.大肠杆菌细胞表示二氧化碳2-DBD。车道 3：2 号车道中显示的粗提取物的超自然物。车道 4： 蛋白质从 3 号车道上显示的超自然分子中纯化， 带有 Hispur Ni - nta 树脂。（D） 使用抗 He 标签抗体进行西式污点分析，以确认重组剂 COH2-DBD 的表达。M，蛋白质梯子1 巷和 2 号车道分别是 （C） 中 1 号和 4 号车道上显示的蛋白质。（E） 含有主题COH2-BM（以红色显示）的 DNA 探头的序列，其两侧是基因MAA_04430促进器中的序列（黑色）。DNA探针的名称显示在左侧，其序列显示在右侧。野生类型：含有野生型图案COH2-BM的DNA探针：1A：在主题COH2-BM中处于 1 位置的核苷酸从野生类型 （T） 更改为核苷酸 A。命名系统也用于此图中显示的所有其他变异 DNA 探针。（F） EMSA 分析脱氧核糖核酸探针与重组 COH2-DBD 蛋白质的结合。在增加特定竞争对手（冷探针：未标记的野生型DNA探针）之前，DNA（生物探针：生物素标记的野生型DNA探针）带移（无标记的野生型DNA探针）的结合活性得到了证明。主题COH2-BM中的每种核苷酸与重组 COH2-DBD 蛋白结合的重要性，表现在添加未标记变异探针 （Mut.Cold-probe） 作为竞争对手的 DNA （生物探针） 带转移的影响上，其超额值为 300 倍。未标记的变异DNA探针的名称显示在车道的顶部。这些图像代表了3个独立的实验。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001360.s011
（蒂夫）
S11 无花果。在造衣或基质层渗透期间，对COH1和COH2调节的基因进行分析。
（A） 通过RNA-Seq分析，在代孕造和造衣（Hemolymph）或皮质穿透（乳酸）期间，WT菌株与Δ Coh1和ΔCoh2的突变体之间所分析的不同表达基因的摘要。与WT菌株相比，向上（红色）和向下（绿色）表示突变体中向上调节和向下调节的基因。（B） Venn图显示由COH1进行正调节的基因分布，并在代孕造和甲基化过程中受到COH2的负调节。（C） qRT-PCR 分析在 WT 菌株中代孕的 Hemocoel 殖民化过程中的Hat1表达，突变体ΔCoh1和ΔCoh2，Coh1 -过度表达应变Coh1欧， 和Coh2 -过度表达应变Wt - coh2 - FLAG。（D） qRT-PCR分析在WT菌株的代孕血糖殖民化过程中表达的4个脱毒素生物合成基因（DtxS1、DtxS2、DtxS3和DtxS4）和突变体，Δ Coh1和Δ Coh2。（E） 从受WT-PDtxS3-GFP菌株感染的昆虫真正的血细胞中收集的真菌细胞中的GFP信号，Δ科1-PDtxS3-GFP，以及Δ科2-PDtxS3-GFP。在3个菌株中，gfp基因是由DtxS3促进者驱动的。F，真菌细胞;H，黄细胞：MGV，平均灰色值。比例栏表示 10μm。（F） RNA-Seq 分析在皮质层渗透期间通过 COH2 调节的辣椒酶、蛋白酶、脂酶和 P450 基因。WT菌株中基因的表达水平设置为1：这些值表示变异的Δ coh2中微分基因表达的日志2转换折叠变化。这3个单独的实验分别由数字1、2和3表示。（G） qRT-PCR 分析在突变ΔCoh2和 WT 菌株的基质层渗透过程中表达的基质降解基因。为了量化自由氨基酸、肽和皮质层降解酶的活动，真菌菌株在用G的皮质层介质中生长。梅洛内拉乳酸醇是唯一的碳和氮源。（H） 文化超自然分子的细胞外蛋白酶活动总量。（我和J）（I） 无氨基酸和 （J） 肽在培养超纳特中的浓度。控制是昆虫的基质层，没有接种真菌。（K） 文化超自然者的奇蒂纳塞活动。所有检测都重复了3次。具有不同字母的值显著不同（P < 0.05）。C-Δ科2：Δ科2的补充应变。此图中显示的所有图形背后的数据可以在S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001360.s012
（蒂夫）
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001360.s013
（PDF）
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001360.s014
（文档）
确认
我们感谢浙江大学生态研究所的陈俊博士帮助从M中检索发起人序列。罗伯西基因组。
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