        
            客服中心
        
        QQ：854727998
Email：lunwen133@163.com
地址：福建省厦门市思明区嘉禾路337号

                最新投稿+更多
        
                标题标题标题

                最新期刊更新+更多
        
                新教育时代-初中体育教学中如何激发学

                最新期刊更新+更多
        
                新教育时代-初中体育教学中如何激发学

您的位置：首页 > 医学 > 医学论文发表- Δ40p53等形抑制p53依赖的电子RNA转录

《医学论文发表- Δ40p53等形抑制p53依赖的电子RNA转录》

主管单位：
主办单位：
国际刊号：
国内刊号：
期刊级别：
发行周期：
收录情况：
审稿时间：
投稿邮箱：

《医学论文发表- Δ40p53等形抑制p53依赖的电子RNA转录》期刊在线投稿系统

* 投稿刊物	医学论文发表- Δ40p53等形抑制p53依赖的电子RNA转录
* 作者姓名		(只写第一作者)
* 联系电话		（请填写正确的联系电话）
通讯地址		（请填写正确的通讯地址）
* 电子邮箱		（请提供正确的电子邮箱）
* 联系qq		（请提供常用的联系qq）
上传稿件
验证码

《医学论文发表- Δ40p53等形抑制p53依赖的电子RNA转录》期刊简介

医学论文发表- Δ40p53等形抑制p53依赖的电子RNA转录，并在p53激活期间通过信号特定转录因子进行调节

· 塞西莉亚·莱万多夫斯基

· 泰勒·琼斯

· 玛格丽特·格鲁卡

· 西瓦普里娅·拉马穆尔蒂

· 罗宾·道尔

· 迪伦·塔特杰斯

· 发布时间： 2021年8月5日

抽象

自然发生的Δ40p53异形异质体与野生型p53（WTp53）结合，以调节发育、老化和应激反应。Δ40p53如何改变WTp53功能仍然令人费解，因为它们的共同表达会导致四位细胞异质性。我们用一个经过充分测试的策略绕过了这个问题，该策略表示Δ40p53：WTp53作为单个成绩单，确保2：2四位四位一体。用转录学（精确核运行测序[PRO-顺序]和RNA测序[RNA-顺序]）、代谢学和其他方法检查了来自原生TP53轨迹的表达Δ40p53：WTp53、WTp53或WTp53（作为控制）的人类MCF10A细胞系。Δ40p53：WTp53在转录中处于活动状态，虽然在正常条件下表型与WTp53相似，但未能在Nutlin诱导的p53激活后诱发生长阻滞。这发生在Δ40p53：WTp53依赖抑制增强剂RNA（eRNA）转录和随后未能诱导mRNA生物发生，尽管基因组占用率与WTp53相似。不同的刺激（5氟酸酸[5FU]）也显示了Δ40p53：WTp53特定于mRNA感应的变化;然而，其他转录因素（TFs;例如E2F2）可以推动响应，产生与WTp53类似的结果。我们的结果表明，Δ40p53缓和WTp53功能，使其他特定于刺激的TF能够做出补偿性反应。这种对WTp53活动的调节可能是Δ40p53的基本生理功能。此外，此处发现的Δ40p53：WTp53 功能差异表明，mRNA 生物生成的 eRNA 需求以及人类 p53 作为四聚氰胺进化而来支持 eRNA 转录。

引文：莱万多夫斯基CB，琼斯T，格鲁卡M，拉马穆尔蒂S，道尔RD，塔特杰斯DJ（2021）Δ40p53等形抑制p53依赖电子RNA转录，并允许在p53激活期间通过信号特定转录因子进行调节。PLoS 生物 19 （8）： e3001364.https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364

学术编辑：郭邦京，IMBA，奥地利

收到：2020年11月17日：接受：2021年7月15日：已发布：2021年8月5日

数据可用性：本文中报告的测序数据的加入编号为 GEO：GSE147703。有关如何访问纳森特流数据处理管道的信息，这里提供（https://doi.org/10.17605/OSF.IO/NDHJ2）。FACS 数据存入生物研究数据库，编号为 S-BSST672。

资金：这项工作得到了国家卫生研究院（R03 AG061466）对DJT和RDD的资助：F30 AG051335 至 CBL;T32 GM065103 到 TJ;R01 GM117370 到 DJT，GM125871 到 RDD ）。我们还感谢 NIH 对生物前沿计算核心（OD012300）和流细胞学核心设施（OD021601）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或编写手稿方面没有作用。

竞争利益：我读过该杂志的政策，本手稿的作者有以下相互竞争的兴趣：D.J.T.是DWpoint治疗公司的SAB成员。R.D.D.是阿尔佩吉奥生物科学的创始人。

缩写：5FU，5氟酸：CDK，依赖环素的激酶;ChIP-seq，色度免疫沉淀测序：低温EM，低温电子显微镜：EGF，表皮生长因子;ER，内质性视状体;电子RNA，增强剂RNA：FACS，荧光激活细胞排序;GRO-顺序，全球运行对序;GSEA，基因集富集分析：IGF-1，胰岛素样生长因子1：IPA，独创性通路分析：IRES，内部核糖体入口网站;猛禽，哺乳动物的拉帕霉素目标;PCA，主要组件分析;PI，碘化物丙酸：亲本身，精确核运行测序：RNA-seq，RNA测序;RT-qPCR，反向转录定量PCR;sgRNA，单向RNA：TF，转录因子：TFEA，转录因子富集分析;UHPLC/MS，超高性能液相色谱/质谱法;WTp53，野生型 p53

介绍

转录因子（TFs）是细胞状态和细胞生理学的主要驱动因素[1]。作为对它们生物学重要性的证明，整个成纤维细胞群在表达单个TFMyoD[2]时将形成肌管。作为TF，p53协调细胞应激反应，并在癌症、衰老和干细胞生物学[3-5]中发挥关键作用。在这些不同的生物环境中调节p53功能涉及一系列机制，其中经过充分研究的例子包括翻译后修饰[6]或蛋白质稳定性[5、7、8]的变化。不太清楚的是p53等形体[9]，它代表自然发生的截断产品，这些产品来自原生TP53轨迹的替代拼接或其mRNA的改变翻译。在已识别的p53等形体中，Δ40p53等形形式可以说是生物学上最相关的，但也仍然是最神秘的[10]之一。医学论文发表-

等形Δ40p53有许多别名，如p44、p53/p47和ΔNp53：Δ40p53缺乏只有N端39氨基酸，其中包括第一个p53激活域（AD1）。所有其他 p53 域（包括寡聚合和 DNA 绑定域）都保留下来。AD1 是一个关键的 p53 域名，在体内驱动大多数 p53 转录响应[11，12]，并且需要稳定地招募共同激活器，如调解员和 CBP/p300。AD1也被MDM2蛋白所识别，MDM2蛋白是一种E3无处不在的利加，通过蛋白质降解（7，8）对p53功能进行负调节。除 AD1 外，p53 N 终点站还包含第二个激活域 AD2。AD1 和 AD2 的丢失或每个域中关键残留物的突变（D1 中的 L22、W23;L53， W54 在 AD2）导致完全丧失 p53 TF 功能，类似于 p53 空表型[13]。值得注意的是，p53AD2 能够在 L22、W23 AD1 突变的情况下激活 p53 成绩单子集，以支持衰老和肿瘤抑制[13，14]的诱导。

在没有野生型p53（WTp53）的情况下，Δ40p53等形体在体外是转录不活跃的，尽管形成稳定的四重奏[15]。此外，p53 空背景中的Δ40p53表达不会改变 p53 空表型[16]。因此，Δ40p53要求WTp53影响p53转录反应并引起表型变化。这在小鼠研究中得到了最好的体现，在研究中，截断或自然发生的Δ40p53等形形式与WTp53一起以大约1：1的比例[16，17]表示。这些"Δ40p53+WTp53"小鼠采用加速老化表型，除了过早死亡外，还涉及正常衰老观察到的生理变化，如衰老增加、早发性骨质疏松症和记忆丧失[16、18、19]。

虽然Δ40p53作用于改变WTp53功能的分子和细胞机制尚不清楚，但它涉及WTp53的异构体的形成。当与WTp53[20， 21]一起表达时，Δ40p53等形形式形成混合Δ40p53：WTp53四重奏。生成Δ40p53可以通过交替拼接实现：然而，主要机制似乎是通过内部核糖体入口站点（IRES）[22，23]进行交替翻译。细胞Δ40p53水平已证明会随着不同类型的压力而增加[24-27]，这表明Δ40p53水平在生物体的整个生命过程中自然波动。虽然强制Δ40p53与WTp53共同表达会导致小鼠加速衰老[16]，但细胞应激和Δ40p53水平之间的直接相关性表明，慢性应激可能导致导致哺乳动物衰老的转录变化[28]。

理解Δ40p53如何影响WTp53函数的一个主要障碍是，由于四位素异质性，包括形成"污染物"WTp53四合器，共同表达（即Δ40p53+WTp53）会混淆分析。在这种情况下，Δ40p53：WTp53四重奏的活性不能与WTp53功能脱钩。WTp53 四重奏[29]的低温电子显微镜（cryo-EM）结构揭示了一种直接的方法，将Δ40p53和 WTp53 作为单个脚本连接起来，同时保留 p53 四聚酯结构（图 1A）。作为原则证明，我们在一系列生化和基于细胞的实验中测试了系绳Δ40p53：WTp53四合器（与标准WTp53四合器相比）的功能[15]。不出所料，将Δ40p53与WTp53连接起来的灵活序列（这比实现构象灵活性所需的时间要长）并不影响p53活动。例如，系绳p53四合器纯化为WTp53四合器（例如，在大小排除列上相同），以及WTp53（即WTp53：WTp53）的系绳版本模仿WTp53在H1299细胞中诱发的表型和基因表达变化[15]。事实上，WTp53 与 WTp53：WTp53 引起的全球基因表达变化（mRNA）本质上是相同的[15]。这些结果肯定了系绳策略，并作为更严格的分析的"概念证明"，在分析中，我们使用CRISPR/Cas-9生成同源的敲击细胞系，表达WTp53、Δ40p53：WTp53或WTp53：WTp53来自原生TP53轨迹。医学论文发表-

：正常生长和坚果林诱发条件下的表型比较。

（A） WTp53 四重奏的原理图[29]和以固定 2：2 的四重奏生成Δ40p53：WTp53 四重奏的策略。请注意，灵活的系绳比允许构象灵活性[15]所需的时间更长。（B）在（–）或 Nutlin-3a 治疗后 6 小时探测 p53 水平的西方污点。非编辑的 MCF10A 单元格表示 WTp53 并显示为控制。此外，每个车道上装载了20微克总蛋白质。（C）超过5个治疗周期的增长率：每个周期包括在基底（0.1%DMSO）条件下20小时的生长，分裂细胞1：10，然后再生长48小时（3个生物复制品;条=SEM）。（D）细胞周期分析（PI）：图表（插图）表示6个生物复制品的平均值（条=SEM）。箭头突出显示 WTp53 细胞中的 S 相损失，而Δ40p53：WTp53 细胞则相反。（E）按 FACS 测量 p21 蛋白质水平。加入编号为 S-BSST672 的生物研究数据库中的基础 FACS 数据。 S1数据中面板 C 和 D 的原始数据。FACS，荧光激活细胞排序;PI，碘化物丙酸：WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.g001

使用精确的核运行测序（PRO-seq），我们测量了p53激活后的快速转录响应，而RNA测序（RNA-seq）则探测了稳定状态mRNA水平的后续变化，这些转录响应与使用色度免疫沉淀测序（ChIP-seq）的p53占用率有关。结合代谢学和表型检测，我们更好地定义了Δ40p53如何改变WTp53在人体细胞中的功能。值得注意的是，这种Δ40p53等形体会缓和WTp53活动，从而允许其他TF推动刺激特定的反应。我们还发现了连接增强器RNA（eRNA）转录和mRNA生物发生Δ40p53功能的意外方面，这表明4个完整的p53激活域（即AD1 + AD2）必须占用p53结合位点才能诱导eRNA转录。

结果

基因组编辑细胞系的生成

产生了三个不同的基因组编辑（CRISPR/Cas-9）MCF10A细胞系：WTp53控制，其中WTp53被简单地插入到原生的TP53轨迹中：WTp53：WTp53 控制，以探测潜在的系绳特异性效应：和Δ40p53：WTp53 （图 1A）.在每种情况下，p53 cDNA序列都插入TP53基因exon 2的第一个转化启动位点，以确保表达将通过原生p53促进器（S1A和S1B无花果）得到控制。我们选择MCF10A细胞是因为它们内源性表达WTp53，并且来自非肿瘤乳腺组织。因此，MCF10A细胞具有稳定的基因组，不易发生突变或多倍体。编辑后的细胞根据mCherry选择进行排序，使用PCR（S1C无花果）、西印（S1D无花果）和测序（S2无花果）对单细胞克隆进行扩展和验证。

通过用小分子Nutlin-3a治疗细胞来测试基因组编辑细胞中p53表达的内源调节，这会破坏p53与MDM2[30]的相互作用。因此，Nutlin-3a 激活 p53 并增加其蛋白质水平。如图1B所示，Nutlin-3a在所有3个基因组编辑的细胞系中都增加了p53蛋白水平，确认在非编辑的MCF10A细胞中，每个细胞的调节与WTp53相似。其他验证结果显示在S3 图中。这3个MCF10A细胞系共同提供了评估生理相关条件下Δ40p53功能的手段。由于Δ40p53：WTp53 表示为单个成绩单，因此可以保证固定的 2：2 四位肌位测量，从而避免由Δ40p53 + WTp53 共同表达产生的四位素异质性。

WTp53 和Δ40p53：WTp53 细胞在正常生长条件下表型相似

在无压力条件下，细胞p53活性通常非常低。所有 3 个细胞系（WTp53、WTp53：WTp53 和Δ40p53：WTp53）均来自同一父系 MCF10A 线，因此除 TP53 轨迹外，均为同源。在正常生长条件下，WTp53、WTp53：WTp53或Δ40p53：WTp53细胞（S4A图）之间的细胞周期没有显著变化。此外，每个细胞系的增长率也相似（图1C）：虽然Δ40p53：WTp53细胞的生长略有增强，但增长在统计学上并不显著。作为肿瘤抑制剂，p53显著影响细胞代谢[5]。因此，我们比较了WTp53、WTp53：WTp53和Δ40p53：WTp53细胞的代谢。根据细胞周期和细胞生长检测，非目标代谢学实验证实，每个p53敲击细胞线具有相似（但不完全相同）的代谢物基底水平（S1表）。与细胞周期进展相关的代谢物显示在S4B无花果中。

Nutlin-3a 暴露Δ40p53：WTp53 细胞（与 WTp53）中的表型变化

接下来，我们检查了每个细胞系（WTp53、WTp53：WTp53或Δ40p53：WTp53）对 Nutlin-3a 激活 p53 的反应。值得注意的是，Nutlin-3a 是非基因氧化的，对 p53[31]非常具体;因此，与典型的生理刺激（如DNA损伤）不同，辅路不会被Nutlin-3a激活。如图1D所示，Nutlin-3a 激活的 p53 触发了 G1 的显著增加，WTp53 细胞中的 S 和 G2 相位减少。这些结果是 G1 逮捕的特征，代表典型的 p53 响应[3]。也如预期的那样，WTp53：WTp53细胞与WTp53细胞（S5A图）相似。相比之下，Nutlin 处理的Δ40p53：WTp53 细胞的细胞周期数据类似于控制处理（DMSO）细胞，G1 中仅有轻微的纳特林依赖性变化，没有达到p ≤ 0.01 （图1D）的统计信心。

驱动细胞周期阻滞的p53靶基因是CDKN1A（又名p21），p21可以通过混合Δ40p53：WTp53四胞胎诱导，如我们[15]和其他人[16]所示。我们测量了坚果林处理的WTp53与Δ40p53：WTp53细胞的p21蛋白质水平，并观察到每行（图1E）的增加：WTp53：WTp53 在S5B 无花果中）。虽然P21蛋白水平在WTp53细胞中更大，但很明显，Nutlin-3a激活了Δ40p53：WTp53四胞胎，这与Nutlin-3a治疗后增加的Δ40p53：WTp53蛋白质水平（图1B）一致。p53空 MCF10A 细胞的平行实验证实，p21 蛋白的纳特林依赖性增加为 p53 依赖（图 1E）。此外，正如预期的那样，在响应 Nutlin-3a 治疗的 p53 无细胞中未观察到细胞周期变化，p21 mRNA 水平（S5C 图）也没有变化。

另一些人则表明，细胞压力会暂时增加Δ40p53蛋白质水平（20、24-26、32），这对衰老有影响，因为随着时间的推移，长期诱导Δ40p53可能导致生理老化。为了模拟细胞应激的瞬时周期（即p53通路激活），我们让每个细胞系（WTp53、WTp53：WTp53或Δ40p53：WTp53）重复循环进行Nutlin-3a治疗（20小时），然后进行48小时恢复。如S5D图所示，WTp53：WTp53细胞与WTp53的反应与预期相似。相比之下，观察到WTp53和Δ40p53：WTp53细胞之间存在明显差异。WTp53细胞的生长受到抑制，但Δ40p53：WTp53细胞的增殖仍在继续，即使在多轮坚果素治疗（S5D图）之后也是如此。这一结果与未经治疗的 WTP53 与Δ40p53：WTp53 细胞形成对比，后者的生长速度（图 1C）没有显著差异。医学论文发表-

由于增殖细胞与受逮捕细胞的代谢需求将不同，我们还比较了WTp53的代谢体与Nutlin-3a治疗后Δ40p53：WTp53细胞（S2表）。不出所料，经过坚果林处理的WTp53细胞显示出代谢变化，反映了它们的增殖减少（S2表：WTp53：WTp53细胞的类似结果）。相比之下，在Δ40p53：WTp53细胞中明显的代谢差异与其维持增殖是一致的，甚至在坚果素刺激（S1表）之前就已观察到。例如，Δ40p53：WTp53细胞（S6图）中苯丙胺水平降低或苯丙胺代谢物水平增加，与细胞周期和增殖的维持[33]是一致的。相反，WTp53和WTp53：WTp53细胞在这些代谢物中表现出相反的趋势（相对于Δ40p53：WTp53），这与纳特林治疗时细胞周期阻滞的诱导一致。虽然这些结果可能反映了 Nutlin-3a 在Δ40p53：WTp53 细胞中完全缺乏 p53 通路激活，但根据图 1B（Δ40p53：WTp53水平依赖性增加）或无花果 1E（p21蛋白质感应）中显示的数据，情况似乎并非如此。为了进一步探索基础机制，我们接下来评估了依赖坚果林的p53激活如何影响Δ40p53：WTp53与WTp53细胞的转录。

Δ40p53：WTp53 在 Nutlin-3a 治疗时对 pol II 转录体有差异

为了比较和对比Δ40p53：WTp53细胞（与WTp53）的转录变化，我们使用了PRO-seq，用于测量新生转录全基因组[34]。PRO-seq 检测所有 3 种 RNA 聚合酶的抄本，并测量所有类型的 pol II 成绩单，包括非编码RNA 和非注释区域。细胞（Δ40p53：WTp53、WTp53 和 WTp53：WTp53）使用 Nutlin-3a 治疗 3 小时，并使用 DEseq2[35]对微分转录进行量化。3小时的时间点是经验确定的（S7图），参考了我们之前评估的坚果林处理的HCT116细胞[36]。Nutlin 刺激之后的早期时间点倾向于识别直接（即初级） p53 转录目标。

在WTp53细胞中，在Nutlin-3a治疗（图2A）之后，有4，338个注释区域被不同地转录（p值≤0.01），WTp53：WTp53细胞（S8无图）的转录变化相似。相比之下，在Nutlin-3a治疗（图2A）后，只有315个注释区域被分形转录在Δ40p53：WTp53细胞中（p-值≤0.01）。在Δ40p53：WTp53细胞的315个坚果素诱导记录中，268个在WTp53细胞中也观察到，47个注释基因在Δ40p53：WTp53与WTp53细胞（S9A图）中进行了微分转录，其中大多数与细胞生长有关。我们确认，通过在p53空MCF10A细胞（S9B–S9D无图）中完成平行PRO-seq实验，在Δ40p53：WTp53细胞中发生了显著的p53响应。因此，Nutlin-3a感应的幅度在WTp53细胞中比在Δ40p53：WTp53中要大，例如S9E图。

图 2.Δ40p53改变 WTp53 功能;Δ40p53：WTp53 未能诱导 eRNA 转录，尽管与 WTp53 相比，基因组占用率相似。

（A） WTp53 （y 轴）与Δ40p53：WTp53 （x 轴）的 PRO-seq 数据摘要。虚线表示p值 0.01。维恩图显示 WTp53 和Δ40p53：WTp53 细胞之间的重叠。（B）基于 PRO-seq 数据（3 小时 Nutlin-3a）比较Δ40p53：WTp53 与 WTp53. 与 FDR 的路径（q - val <0.1）是彩色点。与 WTp53 相比，红色表示Δ40p53：WTp53 增加，绿色表示减少。X轴是NES。最重要的路径在排名列表中。（C） WTp53 （y 轴）与Δ40p53：WTp53 （x 轴）的 eRNA 转录的 PRO-seq 数据摘要。虚线表示p值 0.01。维恩图显示 WTp53 和Δ40p53：WTp53 细胞之间的重叠。（D） PRO-seq 数据示例，显示 WTp53 细胞中的坚果林诱导的 eRNA 转录，但未显示Δ40p53：WTp53. p53 绑定图案的位置（p-val ≤ 1 × 10?5）表示与虚线。（E）元基因分析显示，WTp53 或Δ40p53：WTp53 细胞中的平均 eRNA 峰值高度（全基因组，响应性 eRNA（p -val < 0.25）。（F）与DMSO控制相比，在纳特林处理（6小时）WTp53或Δ40p53：WTp53细胞中的ChIP-seq数据示例：与面板 D. （G）元数据分析中的 PRO-seq 位置一致，显示控制中的 p53 结合点与坚果林处理的 WTp53 或Δ40p53：WTp53 细胞的平均 ChIP-seq 信号，全基因组信号。 S2数据中面板 A– C、E 和 G 的原始数据。ChIP-seq，色度免疫沉淀测序：电子RNA，增强剂RNA：罗斯福，错误发现率;GSEA，基因集富集分析：NES，标准化浓缩分数：亲本身，精确核运行测序：WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.g002

坚果林诱导基因的基因集富集分析（GSEA）揭示了巨大的差异，与生长和细胞周期进展相关的通路在Δ40p53：WTp53细胞（图2B）中增加。在坚果林处理的Δ40p53：WTp53细胞（与WTp53相比）中E2F通路的浓缩是值得注意的，因为E2F TF家族与p53[37]具有重叠功能。与WTp53相比，p53通路活性（GSEA，图2B）的减少与Δ40p53：WTp53细胞的减震反应一致。对坚果林诱导基因的综合通路分析显示，结果与GSEA一致，生长和细胞周期通路在Δ40p53：WTp53细胞（S9F图）中增强。特别是哺乳动物的拉帕霉素（mTOR）信号和胰岛素样生长因子1（IGF-1）信号的目标增加了Δ40p53：WTp53细胞相比WTp53：这些途径中的每一个都与人类细胞[15]或小鼠模型[16]中的Δ40p53表达有关，作为加速衰老表型Δ40p53的潜在贡献者。医学论文发表-

虽然S9A图总结的转录变化可能有助于Nutlin-3a治疗（S5D无花果）后Δ40p53：WTp53细胞（与WTp53）的增殖，但我们强调，PRO-seq数据是在仅3小时治疗后获得的：稍后将描述经过较长时间坚果林-3a治疗后稳定状态 mRNA 水平（即 RNA-seq）的变化。

Δ40p53：WTp53 四合院未能诱导电子RNA转录

除了注释区域的基因表达变化外，PRO-seq 数据还显示 eRNA 的转录存在明显差异。WTp53细胞在经过3小时的Nutlin-3a治疗后，有510个微分转录（p值≤0.01）eRNA，而Δ40p53：WTp53细胞中只有118个电子RNA发生变化。在 510 WTp53 eRNA （图 2C）中， 109 映射到 ChIP-seq 识别的 p53 绑定位点（见下文;WTp53：WTp53 单元格、S10 无花果中的类似结果）。这些 109 p53 相关 eRNA 表示通过 p53[36、38]直接激活 eRNA。相比之下，只有6个电子RNA映射到Δ40p53：WTp53细胞中的p53结合位点，揭示了其诱导电子RNA转录的能力缺陷。图 2D和S11 图中显示的示例进一步突出了 WTp53 和Δ40p53：WTp53 四合器之间的 eRNA 感应对比。我们注意到，绘制到不受 p53 约束的站点的 Nutlin 诱发的 eRNA 可能表示 p53 绑定（即低于截止）或 p53 激活的二次影响。

虽然电子RNA转录的生物学作用尚不清楚，但它们显示细胞类型——特定表达模式[39]，并迅速对外部刺激做出反应。与这项研究最相关的是，eRNA是针对p53结合事件[36]进行转录的，并与p53目标基因的表达[38]相关。为了进一步探索电子RNA转录变化，我们应用了转录因子浓缩分析（TFEA），这是一种改进的计算方法[40]，可以检测双向电子RNA转录的变化。然后，TFEA 将这些 eRNA 映射到基因组中，并识别任何潜在的 TF 绑定图案。通过这种方式，TFEA 可以准确地识别哪些 TF 在刺激期间被激活或压抑。如S12A图所示，TFEA显示，如预期的那样，在坚果林处理的WTp53细胞（和WTp53：WTp53细胞，S12B无花果）中，有一个强大的p53激活。然而，在Δ40p53：WTp53细胞中，没有明显的证据证明p53激活（S12C图）：此外，TFEA对WTp53与Δ40p53：WTp53细胞的比较表明，p53激活存在缺陷，Δ40p53：WTp53四重奏（S12D无花果）。元数据分析进一步说明了坚果林处理的WTp53中的电子RNA转录与Δ40p53：WTp53细胞（图2E）之间的对比： WTp53：S12E无花果中的 WTp53 数据）。根据 TFEA 结果，ChIP-seq 分析证实，Δ40p53：WTp53 绑定未能诱导 eRNA 转录，与 WTp53 形成直接对比（见下文）。这些结果共同证明，Δ40p53：WTp53四重奏不能在p53激活时诱导电子RNA转录。

Δ40p53：WTp53 的基因组占用率与 WTp53 相同

由于 eRNA 感应依赖于 TF 绑定[36，41，42]， eRNA 可能没有在Δ40p53：WTp53 细胞中受到影响，因为Δ40p53：WTp53 没有绑定 p53 序列，即使在 Nutlin 治疗之后也是如此。但是，Δ40p53包含整个 DNA 结合域（残留 101 到 300）;因此，我们预计，Δ40p53：WTp53四合院的基因组占用率将类似于WTp53。如图2F和S13A和S13B无花果所示，ChIP-seq数据显示，Δ40p53：WTp53与WTp53的同一个站点，全基因组，因为他们的DNA结合域相同，正如预期的那样。相应的电子RNA显示在图2D中。与TFEA结果（S12C图）一致，这些数据表明，与WTp53相比，Δ40p53：WTp53结合未能诱导电子RNA转录。元数据分析显示，在Nutlin-3a治疗后，WTp53和Δ40p53：WTp53的入住率均如预期的那样增加（图2G：WTp53：WTp53 显示在S13C 无花果中）。未检测到Δ40p53：WTp53 特定绑定站点。

请注意，用于 ChIP-seq 的抗体可识别Δ40p53中不存在的 p53 N 终点站：因此，Δ40p53：WTp53每四聚物的表皮少50%，这将减少其整体信号。然而，在基底或坚果林处理条件下（S13B图）下，WTp53：WTp53和Δ40p53：WTp53的占用率几乎相同。由于 ChIP-seq 是定性的，因此我们无法对整个细胞系中 p53 绑定的相对水平得出结论。此外，分子量增加的蛋白质（例如WTp53：WTp53）在声波化（43）中更容易降解，这可能降低了系绳p53细胞系的ChIP效率。尽管有这些警告，但很明显：（1） Δ40p53：WTp53 是针对与 WTp53 类似的 Nutlin-3a 治疗而适当动员的：（2） Δ40p53：WTp53在基底和坚果林诱导条件下占据相同的p53结合位点（与WTp53相比），全基因组：与WTp53不同，wTp53 Δ40p53：WTp53结合不能诱导电子RNA转录。医学论文发表-

RNA-seq 数据表明，Δ40p53：WTp53 诱导的脚本的 mRNA 生物生成存在缺陷

接下来，我们完成了生物复制RNA-seq实验，将细胞mRNA水平与PRO-seq识别的新生RNA变化进行比较。我们用Nutlin-3a治疗了每条细胞系（WTp53、Δ40p53：WTp53和WTp53：WTp53）20小时。选择这个时间点是为了给坚果林引起的变化留出时间，以表现在稳定状态的 mRNA 转录组中。如图3A所示，WTp53细胞中有1，132个基因被不同地表达（p值≤0.01），WTp53：WTp53细胞（S14A无花果）也有类似的结果。与此形成鲜明对比的是，Δ40p53：WTp53细胞在mRNA水平上基本上没有坚果素反应：CDKN1A/p21是唯一诱导的基因（图3A）。在S14B无图中显示的p53通路基因的热图进一步突出了p53激活Δ40p53：WTp53细胞的缺乏。与 PRO-seq 数据（图 2B）一样，GSEA 在比较来自坚果林处理Δ40p53：WTp53 和 WTp53 细胞（图 3B）的 RNA-seq 数据后确定了相同的路径。例如，抑制（p53通路）和激活（G2M检查点，E2F目标）通路是一致的，再次支持在Nutlin治疗期间Δ40p53：WTp53细胞的增强增殖（S5D图）。

图 3.p53激活不能增加Δ40p53：WTp53细胞中的mRNA水平。

（A）在 WTp53 或Δ40p53：WTp53 细胞中，在 20 小时坚果林治疗（与 DMSO 控制）后显示不同表达 mRNA 的火山图。绿点表示向下调节，红点表示向上调节的成绩单（p-val ≤ 0.01）。（B）基于RNA-seq数据（20小时Nutlin-3a）比较Δ40p53：WTp53与WTp53.路径与FDR q-val<0.1是彩色点。与 WTp53 相比，红色表示Δ40p53：WTp53 增加，绿色表示减少。X轴是NES。排名列表中显示了最重要的路径。（C）显示 PRO-seq 数据（3 小时 Nutlin）和 RNA-seq 数据（20 小时 Nutlin）显著诱导成绩单之间的重叠的 Venn 图表。虽然大约 10% 的新生成绩单显示 WTp53 细胞的 mRNA 水平相应增加，但只有 CDKN1A/p21 在Δ40p53：WTp53 细胞（1/316; 0.3%）中显示此行为。 S3数据中面板 A 和 B 的原始数据。罗斯福，错误发现率;GSEA，基因集富集分析：NES，标准化浓缩分数：亲本身，精确核运行测序：RNA-seq，RNA测序;WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.g003

如图3C所示，大约10%的基因（439/4，338）在PRO-seq（鼻转录）中被识别为微分表达（p-值≤0.01）， 3 小时）和 RNA-seq （稳定状态 mRNA， 20 小时）在坚果林处理的 WTp53 细胞（WTp53：WTp53 数据显示在S14C 图）中。这一百分比与先前比较了纳特林处理细胞（31）中的全球运行测序（GRO-seq）和RNA-seq数据的研究大致一致，并为在纳特林诱导的p53响应期间mRNA生物发生效率提供了基准。虽然在3小时（图3C）的Nutlin处理Δ40p53：WTp53细胞中，不同表达的新生成绩单（n = 315）的数量减少了，但预计在mRNA水平上会诱导超过30个基因，但是没有观察到这一点。这些结果表明，mRNA生物生成对于由Δ40p53：WTp53诱导的脚本有缺陷。此外，mRNA 数据显示与双向 eRNA 转录的显著相似之处。与 mRNA 转录组一样，Δ40p53：WTp53 细胞中基本不存在 p53 依赖 eRNA 转录的变化。

p53 参数 p63 或 p73 不影响Δ40p53：WTp53 响应

对PRO-seq和RNA-seq数据的分析表明，虽然p63在MCF10A细胞中表达，但p73不是（S15图）。与控制（S16B和S16C无花果）相比，每个细胞系（WTp53、WTp53：WTp53或Δ40p53：WTp53）的p63（S16A无花果）的稳定击倒不会影响增殖或细胞周期：此外，p63不是由Nutlin-3a在任何细胞系（S15图）诱导的。最后，反向转录定量PCR（RT-qPCR）实验表明，p63的损失没有显著影响CDKN1A/p21或PUMA基因诱导在坚果林处理WTp53，WTp53：WTp53，或Δ40p53：WTp53细胞（S16D无花果）。总的来说，这些结果表明，p63和p73不会对Δ40p53：WTp53细胞中的微分表型或转录反应产生贡献。

WTp53 和Δ40p53：WTp53 支持通过不同的 TF 对 5 氟酸性反应提供类似的蜂窝反应

最后，我们问不同的p53刺激是否会导致Δ40p53：WTp53细胞的转录缺陷，即在mRNA水平上缺乏反应。由于 Nutlin-3a 对 p53 具有高度选择性（即其他 TFs 不受影响），因此它提供了一种有效的方法来询问 p53 特定的转录效果。然而，Nutlin-3a在生理上并不相关，典型的应激反应激活了多个通路和各自的信号特定的 TF。因此，我们选择了5氟酸性（5FU），这是一种经过充分研究、临床相关的化疗，不仅激活了p53通路，还激活了与DNA损伤相关的其他信号级联[44]。WTp53、WTp53：WTp53和Δ40p53：WTp53细胞用375μM 5FU治疗20小时。细胞周期分析表明，5FU导致WTp53与Δ40p53：WTp53细胞（图4A）发生类似变化，S相显著增加，G2相显著减少。不出所料，WTp53和WTp53：WTp53细胞在治疗5FU（S17A图）时也显示出类似的结果。这些结果并不完全令人惊讶，因为除了TP53轨迹之外，每个细胞系（WTp53、WTp53：WTp53和Δ40p53：WTp53）都是同源的：因此，所有辅助路径都期望作出类似的反应。医学论文发表-

图4。WTp53 与Δ40p53：WTp53 细胞对 5FU 的蜂窝反应相似，但由不同的 TF 驱动。

（A）细胞周期分析（PI）：图表（插图）表示3个实验的平均值（条形=SEM）。箭头突出了 WTp53 和Δ40p53：WTp53 细胞在 5FU 治疗后增加的 S 相。（B）在 WTp53 或Δ40p53：WTp53 细胞中，在 20 小时 5FU 治疗（与 DMSO 控制相比）后显示不同表达 mRNA 的火山图。绿点表示向下调节，红点表示向上调节的成绩单（p-val ≤ 0.01）。Venn 图显示了 IPA 上游调节器在 5FU 处理 WTp53 与Δ40p53：WTp53 细胞之间的重叠。对于每个基因子集（WTp53 特定、共享或Δ40p53：WTp53 特定），列出与这些基因相关的顶级 IPA 转录调节器（最低 Z 分截止 2.0）。（C）火山图显示 5FU 处理Δ40p53：WTp53 与 WTp53 细胞的相对 mRNA 差异。（D）根据RNA-seq数据（20小时5FU处理）显示GSEA的胡子图，比较Δ40p53：WTp53与WTp53.与无花果2B和3B一致。带有 FDR q-val <0.1 的路径为彩色点。与 WTp53 相比，红色表示Δ40p53：WTp53 增加，绿色表示减少。X轴是NES。排名列表中显示了最重要的路径。（E） RNA-seq 数据（GSEA）显示，差异 E2F2 TF 活动的特点是Δ40p53：WTp53 对 5FU 的转录响应。（F）模型。WTp53 诱导 eRNA 转录并驱动细胞应激反应，而Δ40p53：WTp53 四重奏使可调的 p53 响应能够使其他信号特定 TFs 控制转录结果。尽管在Δ40p53：WTp53细胞中，依赖坚果素激活p53靶基因新生转录（PRO-seq，3小时），但随后mRNA水平（RNA-seq，20小时）没有观察到增加：此外，在Δ40p53：WTp53细胞中不存在依赖性eRNA的p53诱导。p53目标基因的新生转录和mRNA诱导之间的这种脱节，将电子RNA转录作为mRNA生物发生调节器。加入编号为 S-BSST672 的生物研究数据库中的基础 FACS 数据。 S4数据中面板 A– E 的原始数据。5FU， 5 氟酸：电子RNA，增强剂RNA：FACS，荧光激活细胞排序;FDA，假发现率;GSEA，基因集富集分析：IPA，独创性通路分析：NES，标准化浓缩分数：PI，碘化物丙酸：亲本身，精确核运行测序：RNA-seq，RNA测序;TF，转录因子：TNF，肿瘤坏死因子：WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.g004

为了进一步比较和对比细胞反应与5FU，我们进行了生物复制RNA-seq实验。如图4B所示，5FU在WTp53细胞中引起926个基因的微分表达，在Δ40p53：WTp53细胞中产生823个基因的微分表达（p-值≤0.01：WTp53：WTp53 数据显示在S17B 无花果中）。其中，415个在WTp53和Δ40p53：WTp53之间共享，其中许多基因是p53靶点（图4B），IPA显示。在Δ40p53：WTp53细胞中，大约一半（823个中的408个）是由其他TF（如E2F1（图4B）调节的。这一结果表明，与针对p53特定的Nutlin响应相比，5FU引起的复杂应激反应使其他信号特定的TF能够增强Δ40p53：WTp53细胞中衰减的p53响应。

如图4C所示，TF E2F2的mRNA水平在Δ40p53：WTp53细胞中有选择地被向上调节，这表明E2F2有助于补偿表达Δ40p53：WTp53的细胞中p53响应的减少。在WTp53细胞中，E2F2 mRNA水平在5FU治疗后下降了57%（与DMSO相比，WTp53：WTp53细胞的降幅为10%）。相比之下，E2F2 mRNA水平在Δ40p53中增加了398%：WTp53细胞（折叠变化为14.4），E2F2通路基因在Δ40p53：WTp53细胞（无花果4D，E：WTp53：WTp53 S18A 无花果）。有趣的是，TF的E2F系列与p53具有重叠功能，但p53激活通常会降低E2F基因表达[37]。5FU处理Δ40p53：WTp53细胞中的E2F2感应表明，E2F和其他TF不是p53，而是驱动对类似于WTp53的细胞结果的转录反应。这一概念得到了通路分析的进一步支持，分析表明，尽管在Δ40p53：WTp53细胞与WTp53（S18B图）中，有一组不同的活跃和压抑的TF，但IPA确定的上游调节器是相似的（S18C图）。与这些结果一致，5FU治疗导致WTp53与Δ40p53：WTp53细胞（图4A）的细胞周期变化相似。

为了进一步探讨p53依赖对5FU反应的影响，以及E2F和其他TF是否补偿Δ40p53：WTp53细胞p53活性降低，我们用375μM 5FU（条件与先前实验相同）在20小时治疗后完成了p53空MCF10A细胞的细胞周期分析。结果表明，细胞反应与WTp53（S18D无花果）相似，这表明，尽管在WT细胞中5FU具有很强的p53激活性，但在这种情况下，细胞周期变化不需要p53。接下来，我们分析了已发布的RNA-seq数据，比较了5FU处理的WTp53和p53空HCT116细胞[45]。值得注意的是，GSEA 确定了类似的路径和 TFs（例如， E2F）由5FU在p53无细胞（S18E图）激活，相比之下，Δ40p53：WTp53细胞（图4D），为TF网络提供进一步的支持，如果其活性降低（例如，在Δ40p53：WTp53细胞）甚至丢失（如p53空细胞）。。综合起来，来自5FU处理细胞的结果表明，其他信号特定的TF可以在有缓和p53活性的条件下驱动转录程序，例如在Δ40p53：WTp53细胞（图4F）。医学论文发表-

讨论

Δ40p53等形是自然发生的，其水平似乎在细胞应激[20，24-27]或特定发育阶段 [46]增加。Δ40p53与WTp53的相对水平无疑将决定在这种情况下它对WTp53功能的影响。在这里，我们专注于p53四重奏与定义的2：2比率（Δ40p53：WTp53）。由于自发的TP53突变可以在培养细胞[47]中产生增殖优势，我们选择了MCF10A细胞系进行这项研究，因为它具有遗传稳定性（S2图），不像许多癌症衍生的细胞系。MCF10A细胞也内源性地表达WTp53，我们确认WTp53或WTp53：WTp53细胞在正常或p53刺激条件下与未经编辑的MCF10A细胞表型相似（S3图）。我们还测试了额外的基因组编辑细胞克隆，以排除克隆扩张（S19无花果）的潜在影响。虽然更多的细胞系可以通过相同的实验来测试，但其他人已经表明，基本的p53转录反应在细胞类型（31，48）中是相似的，而p53转录反应是这项工作的主要焦点。

根据转录经济学数据，出现了几个关于Δ40p53如何改变WTp53函数（图4F）的主题。Δ40p53的表达（1）调节 WTp53 的转录活动，使Δ40p53：WTp53 四重奏抑制典型的 p53 转录响应。尽管如此，（2）Δ40p53：WTp53四胞胎保留激活p53靶基因的能力，这在5FU处理细胞（图4B）或与p53无细胞（S9B*S9D图）比较时最为明显。即Δ40p53：WTp53 四合院不模仿 p53 空条件。这种Δ40p53抑制p53响应3的能力允许其他特定序列的DNA结合TF调整细胞应激反应，因为它们不是由p53主导的。例如，信号特定的 TF E2F2 的基因表达特征极大地促进了Δ40p53：WTp53 细胞（无花果 4C–4E）中的 5FU 响应。这样，Δ40p53允许其他应力或响应信号的 TF 增强 p53 响应。这种功能多功能性在特定环境、细胞类型或发育阶段可能特别重要，需要修改 p53 响应[49，50]，例如，允许细胞合作[51]和胚胎发育期间增殖[46]或伤口愈合[52]。

此外，（4）在WTp53（即Δ40p53+WTp53）的背景下，持续、强制地表达Δ40p53会导致小鼠加速衰老[16]。虽然衰老的生物学是复杂的[53]，但我们观察到，许多与生物体老化有关的道路受到Δ40p53：WTp53的可预测影响。例如，mTOR 和 IGF 信号通路在Δ40p53：WTp53 细胞（与 WTp53 相比： S9F无花果），和每个途径被广泛牵连到老化[54，55]。在p53空H1299细胞中传输Δ40p53：WTp53时，也注意到p53和mTOR通路的共生激活[15]：值得注意的是，同时激活p53和mTOR可以触发衰老[56，57]。衰老细胞在生理老化期间积聚[58]，并且，与老化的表型一致，与 WTp53 共同表达 N 端 p53 截断的小鼠表现出早期衰老相关的表型[17]。

Δ40p53调和WTp53功能，使其他TF能够驱动蜂窝过程

与上述项目（3）和（4）相关，Nutlin-3a 和 5FU 之间的对比特别翔实。由于 Nutlin-3a 对于 p53[30，31]非常具体，因此它是选择性地询问 p53 响应的宝贵工具。然而，坚果素刺激在生理上不相关，也不激活其他信号特定的 TFs（即仅 p53）。相比之下，5FU 会诱导 DNA 损伤响应，激活多个信号级联。

在用5FU（与坚果林）治疗的细胞中观察到mRNA生物生成的明显区别。在用5FU治疗20小时后，在Δ40p53：WTp53细胞中诱导了数百个mRNA，包括许多规范的p53靶基因（图4B）。这些结果表明，其他信号特定 TF 之间的功能协调有助于推动Δ40p53：WTp53 细胞中的 mRNA 生物发生。而5FU治疗的Δ40p53：WTp53细胞显示p53激活（与WTp53细胞相比）减少，E2F2表达水平（及其下游目标基因：无花果 4D 和 4E）显著增加，显示其他响应信号的 TFs 在Δ40p53：WTp53 存在的情况下增强蜂窝响应。因此，Δ40p53：WTp53 细胞中受挫的 p53 响应允许其他 TF 驱动蜂窝响应。这些结果与协作 TF 网络的概念一致，该网络在典型"驱动程序"TF 的功能受到损害时能够做出补偿性响应[59]。这种补偿机制似乎对硬线细胞应激反应有影响，以确保产生稳健和一致的结果：这可能在体内特别重要，以协调器官和组织的转录反应。值得注意的是，内质性视网膜（ER）应激[24，26]，饥饿后的血清刺激 [20]和氧化应激[25]期间，Δ40p53水平增加。在这种情况下，多个 TF 和信号级联被激活，并且存在Δ40p53：WTp53 四重奏可能很重要，允许其他通路和信号特定 TF 的集成以细胞类型– 或上下文特定的方式调节蜂窝响应。

电子RNA转录和mRNA生物生成

许多研究将 eRNA 转录与 mRNA 表达[60]联系起来，包括响应 p53 激活[38，61]。一个普遍的主题是，增加的电子RNA转录与蛋白质编码基因的表达增加有关：此外，eRNA诱导的时机意味着一种调节作用，因为 eRNA 在刺激后会迅速诱导，随后蛋白质编码基因的 mRNA 水平会增加。

在这里，我们无意中建立了一个系统，该系统首次允许在存在或不存在p53依赖的电子RNA诱导时，在主要同源细胞系中分析对p53激活的转录响应。我们的结果将 eRNA 转录作为 mRNA 生物生成的先决条件。为了支持这一结论，p53结合位点的电子RNA转录在Δ40p53：WTp53细胞（例如S12C图）中被阻止——尽管基因组占用率与WTp53相似——并且这跟踪了mRNA水平。例如，PRO-seq数据显示，在Δ40p53：WTp53细胞（图2A）的3小时坚果素治疗后，几百个成绩单增加，但只有1个基因（0.3%），CDKN1A/p21在mRNA水平（图3A）增加。相比之下，来自纳特林诱导的WTp53细胞的PRO-seq数据显示，4，607个成绩单有所增加，其中439个在mRNA水平上增加（约10%）：无花果 3C）。这些结果在电子RNA转录和mRNA生物发生（图4F）之间建立了直接的联系。事实上，本文描述的实验（i）以几乎同源细胞系完成，（ii）几乎相同的 TF（仅缺少 4 个 AD1 域中的 2 个，用于Δ40p53：WTp53），（iii）相同的基因组占用率，和（iv）处于相同的刺激下。机械基础仍有待确定，但对RNA加工（如拼接、裂解和聚苯乙烯化）或核出口的电子RNA依赖性调节可能作出贡献。

eRNA 转录需要四个完整的 p53 激活域

因为Δ40p53：WTp53是从原生TP53轨迹表示的，因此上岗的时间和水平与WTp53相匹配：此外，ChIP-seq的数据表明，在基底和坚果林诱发条件下，基因组DNA上Δ40p53：WTp53与WTp53的占用率相似。因此，由于四合院4 p53AD1区域中只有2个区域损失，因此，Δ40p53：WTp53缺乏p53依赖性电子RNA诱导。即2个激活域不足以满足细胞中正常的p53四聚物功能。这些发现表明，p53可能已演变为四聚合器（即向基因组DNA提供4个ADs），至少部分地，诱导电子RNA转录。虽然需要进行更多的实验来更好地定义这一意外结果背后的分子机制，但值得注意的是，p53结合位点在人类基因组[62]中更加孤立，而其他TF在增强剂内发挥作用，具有针对许多因素的聚类结合位点[63]。可能需要 4 个完整的 p53 激活域（即 AD1 + AD2）来稳定地招募同化剂，如介质器、色素重塑器和 CBP/p300，以诱导 eRNA 转录。另外，4个完整的p53激活域可能促进分子凝结物的形成，这有助于推动RNA聚合酶II[64]的电子RNA转录。为了支持这一假设，p53的激活域本质上是无序的，并且p53已被证明在体外形成相分离的凝结物[65]。这些机制（共体招募或凝结形成）不是相互排斥的，可以在细胞中协同作用。医学论文发表-

对p53四合器结构的影响

迄今为止，整个p53四重奏在原子分辨率方面没有结构数据，很明显，p53四重奏在结构上是动态的[66，67]。这给结构分析带来了挑战，即使具有低温EM。此处描述的灵活系绳 p53 四合器（WTp53：WTp53 或Δ40p53：WTp53）是根据原生 p53 四重奏的低温 EM 结构在中间分辨率[29]下设计的。据我们所知，Orlova 及其同事的这种结构是唯一使用野生型全长 p53 的实例，并且它仍然是迄今为止分辨率最高的 p53 四重奏结构（13.7 é）。虽然p53四合星的替代结构模型已经提出[68，69]，但这些模型使用了p53的突变版本（在每个核心DNA结合域中出现4个突变，因此每个四重奏有16个突变），这些模型显示了结构不稳定性和异质性的证据，并产生了较低的分辨率信息。

先前的概念证明生化和转录学实验表明，连接p53单体的柔性系绳不会破坏正常的p53四合器功能。例如，WTp53：WTp53 四合院匹配了 WTp53 在 H1299 细胞[15]中诱发的基因表达变化。类似的结果也获得了基因组编辑的MCF10A细胞在这里（如S8无花果），和ChIP-seq数据显示类似的基因组占用WTp53与WTp53：WTp53（S13无花果）。同样，表达WTp53或WTp53：WTp53的MCF10A细胞在正常生长条件下或对Nutlin-3a或基因毒剂5FU的反应中，是表型上无法区分的。这些结果最能支持奥洛娃及其同事的结构模型[29，70]。然而，我们强调，我们灵活的系绳策略可以形成"替代"p53四重奏结构，以及[68，69]。由于WTp53四合院缺乏高分辨率数据，其结构组织一直存在争议，全长p53可能采用多个与功能相关的结构状态，这一点仍有道理。

CDKN1A/p21 感应和Δ40p53：WTp53 生物功能

尽管Δ40p53：WTp53四胞胎无法诱导坚果林处理细胞中的电子RNA转录或mRNA生成，但CDKN1A（又名p21）是个例外，它是一个成熟的p53靶基因。CDKN1A抑制依赖环素的激酶（CDK）CDK2和CDK4/6，其中磷酸酯RB相关蛋白质，以促进G1/S细胞周期的阻断。而依赖坚果的激活p53触发细胞周期逮捕在WTp53细胞，这是观察到与Δ40p53：WTp53（图1D）。这种表型差异（p53激活而不进行细胞循环阻塞）表明，Δ40p53表达可能是原生的：然而，这在鼠标模型[16]中未观察到。值得注意的是，p21仍然诱导在坚果林处理的Δ40p53：WTp53细胞（虽然较少相比WTp53），在蛋白质和mRNA水平（无花果1E和3A）。这种低水平的p21表达可能是生物学中Δ40p53：WTp53功能的一个重要方面。p21 的损失导致多倍体，由于 DNA 损伤反应缺陷和在没有线粒体的情况下循环[71]。Δ40p53：WTp53 的低级 p21 表达可能有助于保持基因组稳定性，保留线粒体检查点以防止多倍体。作为一种自然发生的等形形式，这种基本功能可能是必不可少的，而Δ40p53调节整个哺乳动物的寿命的压力反应。

方法

卡斯-9蛋白质纯化

Cas-9 净化工作按描述[72]完成。

卡斯-9 RNP形成

单向RNA（sgRNA）是通过添加tracrRNA（IDT猫+1072533）和crna（TP53 exon 2，正链，AGG PAM站点，序列：GATCCACTCACAGTCCAT）在1：1的比例和加热到95°C，然后慢慢冷却到室温超过1小时。纯化的 Cas-9 以 1：1.2 的比例添加到 sgRNA 中，并在 37°C 下孵育 15 分钟，形成 Cas-9 RNP。在一小时内以 10μM 浓度使用 Cas-9 RNP。

捐赠质粒结构

矢量构建器用于构建质粒。插入（见S1A 无花果）侧翼为 1 . 5 kb 同源臂， mCherry 入作为选择标记。插入大小如下：WTp53：2820bp，WTp53：WTp53：4041bp，以及Δ40p53：WTp53：3924bp。

克里斯普/卡斯-9基因组编辑

MCF10A细胞在每次实验前24小时被分离，在15厘米的板上生长到大约70%的汇合。细胞用PBS清洗，然后尝试消精（每盘4毫升），并在悬念介质（8毫升DMEM/F12中含有20%马血清和1x笔/链球菌）中恢复。此外，5×105细胞被放置在1.5mL埃彭多夫管中，用于与霓虹灯转染系统（英异原，#MPK5000）的传输。细胞在悬念缓冲 R （英维特罗根， #MPK1025）中再悬念， 10 μM Cas-9 RNP 和 1μg 捐赠质粒（WTp53， WTp53：WTp53，或Δ40p53：WTp53）.此外，10 μL 霓虹灯管尖（英异原，#MPK1025）使用霓虹灯传输套件（1，400 V，20ms 宽度，2 脉冲）进行电波处理。受感染的细胞被转移到2mL抗生素自由介质。切割位置： hg38 chr17：7，676，510.插入位置： hg38 chr17：7，676，591;在exon 2中TP53的第一个ATG之后。细胞是单细胞，根据mCherry表达分为96井板。然后用测序、PCR 和西方污点验证克隆。

MCF10A细胞培养

MCF10a细胞培养在DMEM/F12（英异原#11330+032）介质中，含有5%马血清（生命科技#16050+122），20 ng/mL表皮生长因子（EGF）：PeproTech #AF-100-15）， 0.5 ug/mL 氢皮质松（西格玛#H0888-1g）， 100 ng/mL 霍乱毒素（西格玛#C8052-2 毫克），10微克/mL胰岛素（西格玛#I1882-200毫克）和1x Gibco 100x抗生素抗菌（费舍尔科学，15240062）青霉素-链霉素。医学论文发表-

TP53轨迹插入物的PCR验证

NEB磷聚合酶（NEB，#M0530S）已用于制造商的规格。Seq_TP53_exon2_Forward和Seq_TP53_exon2_Reverse引因使用在65至68°C：同源的克隆没有500bb产品。产品使用 TP53exon2 转发引物进行排序。使用DBD_Forward和Seq_TP53_exon2_Reverse底漆在67.8°C，一个2，542-bp波段指示敲击至少1个等位基因（同源或异质克隆）。然后验证同源克隆，如果Seq_TP53_exon2_Forward和Seq_TP53_exon2_Reverse引物在65至68°C没有500bp的产品。

由于p53中的突变可以产生生存优势[47]，我们定期重新排序TP53轨迹。使用的引号为 CL802 和 CL803，在 65°C 时，用于测序DBD_Forward和DBD_Reverse。对于插入的下游测序，我们使用DBD_Forward，并在 70°C 时Seq_TP53_exon2_Reverse。为了放大插入的上游，我们使用CRISPR3 seq引物和CL803在70°C，DBD_Reverse和Seq_TP53_exon2_Forward引物用于测序。引物序列列在S3 表中。

复合治疗

Nutlin-3a（塞莱克，#S8059）库存浓度为10m，治疗浓度为10μM。5FU（塞莱克，#S1209）库存浓度100m，治疗浓度375μM。用于控制使用等量的 DMSO 车辆。

代谢学

通过 Nutlin-3a （10 μM）或 0.1% DMSO 控制进行 20 小时治疗后，细胞被收获，每个细胞系和每个条件有 6 个生物复制品。样品准备是在梅塔博隆（美国北卡罗来纳州杜勒姆）进行的，其方式与先前的研究[73]相似。简言之，个别样品被甲醇提取，然后分成别名，通过超高性能液相色谱/质谱法（UHPLC/MS）进行分析。全球生化剖析分析包括4个独特的武器，包括反相色谱，为亲水化合物（LC/MS Pos Polar）和疏水化合物（LC/MS Pos Lipid）、具有负电热条件的反相色谱（LC/MS Neg）以及与负电热（LC/MS极性）耦合的HILIC色谱法[74]优化的正电传方法。所有方法在完全扫描 MS 和数据依赖 MS 之间交替n扫描。扫描范围略有不同，但一般覆盖70至1000米/z。

通过将实验样品中的离子特征与化学标准条目参考库的自动比较来识别代谢物，这些条目包括保留时间、分子重量（m/z）、首选导管和源内片段以及相关的 MS 光谱，并通过使用 Metabolon 开发的软件进行质量控制的目视检查进行策划。对已知化学实体的鉴定基于对纯化标准的代谢库条目[75]的比较。所有代谢学数据的摘要显示在S4 表中。

代谢学数据统计分析

进行了两种类型的统计分析：（1）意义测试和（2）分类分析。在阵列工作室对日志转换数据进行了标准统计分析。对于阵列工作室中不标准的分析，使用了 R 程序（http://cran.r-project.org/）。在日志转换和缺失值的计算（如果有的话）之后，Welch 2 样本t测试被用作识别实验组之间显著差异的生化物质（p < 0.05）的意义测试。计算假发现率（q-value）的估计值，以考虑到通常发生在基于代谢学研究中的多重比较。分类分析包括主要成分分析（PCA）、分层聚类和随机森林。对于缩放强度图形，对原始比例（原始面积计数）中的每个生化物进行重新缩放，以在所有样本和时间点中设置中位数等于 1。

细胞周期分析

WTp53、WTp53：WTp53 或Δ40p53：WTp53 细胞与 DMSO 控制并行 20 小时，分别使用 10μM Nutlin-3a 或 375 μM 5FU 进行 20 小时治疗，分别为 0.1% 和 0.375%。制造商按照指定使用碘化物（PI）流细胞学套件（Abcam， ab139418）。然后将样品放在冰上，用BS法塞莱斯塔细胞分析仪进行分析。FLOWJO 用于分析荧光激活细胞排序（FACS）数据。所有实验都是用生物三方体进行的。

免疫荧光

WTp53、WTp53：WTp53 和Δ40p53：WTp53 使用 10 μM Nutlin-3a 或 0.1% DMSO 进行了 20 小时的治疗，收集并固定在 66% 乙醇中至少 24 小时。然后，细胞在室温下用阻塞/渗透缓冲（3% BSA，0.1% Triton X-100）孵育1小时。主要抗体，抗p21（CST，2947）在1：250稀释，染色在阻塞缓冲区4°C过夜进行，并使用二次抗体与Alexa Fluor 488结合可视化。

增长率计算

为了检查生长速度如何随时间变化，细胞接受0.1%DMSO或10μM Nutlin-3a治疗20小时，通过1：10，并给予48小时恢复（治疗周期： S5D无花果）。增长率是通过将细胞总生长除以生长时间（68小时）计算的。细胞总生长量是通过计算Nexcelom生物科学细胞组自动T4光明场细胞计数器计算的。所有实验都是用生物三方体进行的。

p63 扁豆的击倒

WTp53、WTp53：WTp53 和Δ40p53：WTp53 细胞通过针对 p63 （shRNA TRCN0000006506; 从科罗拉多大学功能基因组学核心获得）的病毒构造进行转化，该构建 hU6 促进器具有普洛霉素耐药性。通过48小时治疗2μg/mL普洛霉素，然后在标准生长介质中恢复，选择击倒细胞。

RT-qPCR

WTp53， WTp53：WTp53， Δ40p53：WTp53 细胞± p63 击倒或备用 p53 细胞克隆处理 10 μM Nutlin-3a 或 DMSO 控制 20 小时之前，使用 TRizol （异性物质，#15596026）使用制造商指定的 RNA 隔离。总RNA被转换为cDNA使用高容量cDNA反向转录套件（应用生物系统，4368813）由制造商指定，然后使用0.8X AMPure XP珠（贝克曼库尔特）进行清理。Sybr 选择主混合（热费舍尔科学， 4472908）被添加到 cDNA 在 0.1 ng/μL 和放大每个制造商的说明。ΔΔCT值是使用基因沙漠进行背景标准化的。PCR 引正器列在S3 表中。

纳塞克

总RNA从WTp53、WTp53：WTp53和Δ40p53：WTp53细胞中分离，使用制造商指定的TRizol（异种基因、#15596026）处理10μM坚果素-3a、375μM 5FU或DMSO控制（分别为0.1%和0.375%）。此外，1μg 的总 RNA 与 RIN 数量为 ≥8 用于 RNA-seq 库准备。使用 NEBNext Poly （A） mRNA 磁隔离模块（E7490）丰富了 mRNA 的样本，并且使用来自 Illlumina （E7765）的 NEBNext 超 II 定向 RNA 库准备套件编写了库。

奇普塞克

MCF10A细胞系（WTp53、WTp53：WTp53和Δ40p53：WTp53;大约60×106每个实验的细胞）用10μM坚果素-3a或0.1%DMSO治疗6小时，然后与1%甲醛交叉连接10分钟，在25°C，然后甘氨酸（0.125M）淬火5分钟。核通过NRO缓冲区（80μl/百万细胞;10m特里斯-HCl[pH 8]，4毫微米MgCl中的再悬念细胞进行分离2,10 mM NaCl， 0.5% [vol/vol] NP-40， 1 mM DTT，和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（1 mM 苯胺（西格玛， #B6506-100G）， 1 mM 甲基硫酸钠（西格玛， #255556-100G），0.25 m 苯甲基硫氟化物（美国生物分析，#AB01620） 0.012 TIU/mL 阿普罗汀（西格玛，#A6106），然后在冰上孵育5分钟，低速旋转，然后用NRO缓冲器进行最后洗涤。分离核是准备剪切基于科瓦里斯特鲁奇普色板剪切套件（科瓦里斯：PN 520237），并剪断11分钟与科瓦里斯M220聚焦超声波器。每100微克色度（约1500万核）共使用25微升蛋白质G Dynabeads珠（英维他根，#10003D）。珠子在阻塞溶液（PBS，0.5%BSA）中孵育，然后6微克DO1 p53抗体（BD生物科学：BD554293）在阻塞溶液中与珠子结合，在4°C下螺母化4小时。共生珠子被洗1x块溶液和1x IP缓冲（15 mM特里斯-HCl[pH 8]，150m NaCl，1m EDTA，1%特里顿X-100和蛋白酶抑制剂鸡尾酒）。在 IP 缓冲器中将剪切染色素（100μg 染色质（约 1500 万核）添加到结合珠中，然后在 4°C 下螺母至少 12 小时。绑定色度用 IP 缓冲器清洗 3 倍，使用 RIPA 缓冲区洗 3 次（20 mM 特里斯-HCl [pH 8]，500 mM NaCl，1 mM EDTA，1% 特里顿 X-100 和 0.1% SDS），2 倍带 LiCl 缓冲器（20 mM 特里斯-HCl [pH 8]， 500 m M LiCl， 1 mM EDTA， 1% 脱氧酸钠和 1% NP-40）和 2x 与 TE 盐缓冲（10 mM 特里斯-HCl [pH 8]， 50 mM 纳克， 1 mM EDTA）.样品从珠子中抽取，PK缓冲（10 mM Tris-HCl [pH 8]、1 mM EDTA 和 1% SDS）含有 100 μg 蛋白酶 K （NEB： P81075）在 50°C 孵化，震动 1 小时，然后在 65°C 下 1 小时。Elated DNA 被转移到一个新的管子上，在 65°C 下孵育 12 小时，以逆转交叉连接。DNA 是通过根据制造商的说明，使用 Light-5PRIME 相锁管（昆塔比奥：2302820）提取的酚氯仿纯化的。图书馆使用KAPA超准备套件（卡帕生物系统：KK8502）编写，并在光照器NextSeq V2高输出75周期上进行排序。医学论文发表-

PRO-seq 核制备、核运行和 RNA 制备

核收获为WTp53，WTp53：WTp53，Δ40p53：WTp53，或p53空MCF10A细胞，如描述的那样[76]。细胞在收获前生长24小时，达到70%的共生。此时，细胞在收获前3小时与10μM坚果素-3a（DMSO）或0.1%DMSO同时治疗。核运行实验是用生物重复物进行的，如描述的那样[76]。

测序

在生物前台测序设施（UC 博尔德）对 RNA 顺序、CHIP-seq 和 PRO-Seq 库进行了测序。单端片段库（75 bp）在 Illumina NextSeq 500 平台上进行了排序（RTA 版本： 2.4.11，仪器 ID： NB501447），使用 bcl2fastq （bcl2fastq v2.20.0.422）将 BCL 解构并转换为 fastq 格式;使用 FASTQC （v0.11.5）（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）和快速Q 屏幕（v0.11.0， https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/）评估测序数据质量。使用BBDUK从BBTools（v37.99）（https://www.osti.gov/servlets/purl/1241166）和FASTQ-MCF从EAUtils（v1.05）[77]进行低质量读数的修剪和过滤。与人类参考基因组（hg38）的对齐使用 Hisat2 （v2.1.0）[78]在未修饰、无拼接对齐模式下与 hg38 索引进行，并使用 Samtools （v1.5）[79]对齐进行排序和筛选，以了解映射质量（MAPQ>10）。

RNA-seq 计算分析

RNA-seq 数据使用下一个流管道 v1.1（https://github.com/Dowell-Lab/RNAseq-Flow）进行处理。运行的完整管道报告以及由 MultiQC 生成的质量控制报告（v. 1.7），包括修剪、映射、覆盖范围、拼接和复杂性指标都包含在S5 表中。基因计数使用特征计数[80]生成，并且使用 DESeq2[35]进行微分基因表达分析。复制基因被过滤，那些具有最高FPKM的基因被保存进行分析。Qiagen 独创性通路分析（IPA）和 GSEA 4.03[81]用于根据表达变化识别激活和抑制通路和上游调节器。

奇普-塞克计算分析

所有 ChIP-seq 数据均使用下一个流管道 ChIP-Flow v1.0（https://github.com/Dowell-Lab/ChIP-Flow）进行处理（映射和质量检查）。运行的完整管道报告以及由 MultiQC 生成的质量控制报告（v. 1.7），包括修剪、映射、覆盖范围和复杂性指标，包含在S6 表中。峰值呼叫是使用 MACS2 窄嘴生成的。q 值默认截止值也从 0.05 的默认值减少到 1e-5。黑名单区域（那些具有人工高信号和读取映射，http://mitra.stanford.edu/kundaje/akundaje/release/blacklists/hg38-human）被删除使用BEDTools交叉[82]。PyGenome轨道[83]用于生成轨道图像。

电子RNA的数据处理、可视化和标识

每个治疗（DMSO/Nutlin-3a）的两个生物复制品被生成为每个3个细胞系使用Nextflow管道处理新生数据（https://doi.org/10.5281/zenodo.2641755）。 S7 表中包括运行的完整管道报告以及 MultiQC 生成的质量控制报告（v. 1.7），包括修剪、映射、覆盖范围和复杂性指标。PyGenome轨道[83]用于生成轨道图像。Tfit 用于识别具有双向转录的区域[84]。请注意，在坚果林处理的Δ40p53：WTp53细胞中，86个电子RNA被识别为p值≤0.01：清除所有重复区域后，仍保留 25 个 eRNA。TFEA 用于识别双向转录中的变化，并映射到基础 TF 序列主题，以推断 TF 活动的变化[40]。

基因和双向/增强剂的微分转录分析（PRO-seq）

使用 RefSeq： hg38 的 NCBI 参考序列，包括 NM 和 NR 加入类型（2018 年 5 月 18 日从 UCSC 跟踪浏览器下载），在 BEDTools 套件中使用多BamCov计算每个排序 BAM 文件的计数（v. 2.25.0）。然后过滤基因（NM加入类型）和lncRNA（NR加入类型），以便只保留每个注释长度读数最高的等形，以尽量减少差异转录分析中包含的重复样本。然后使用DESeq2（v.1.20.0，生物导体释放v.3.7）来确定不同治疗之间和时间点之间的差异转录基因。使用每个对比的差分分析结果生成预序文件，并使用 GSEA 4.0.3 使用标志通路基因集用于微分通路分析。Qiagen IPA （v7.2）用于根据转录变化识别激活和抑制通路。对于双向/增强器比较，所有双向预测 Tfit 呼叫都使用木乃伊软件（TFEA 的合并组件）合并以生成注释文件。然后使用 BEDTools 套件（v. 2.28.0）[82]计算每个样本的计数，并使用 DESeq2[35]来计算差额转录的双向数。TFEA 用于根据 eRNA 表达式[40]评估 p53 激活。

其他细胞系验证

细胞系通过使用 Hisat2 （v2.1.0）[78]将 PRO-seq 读数映射到 p53 构造为迷你"基因组"进行内部验证，并且使用 Samtools （v1.5） [79]对齐排序。然后使用 BEDTools 套件（v. 2.28.0）[82]的多面体计算每个样本的计数，并将 TAD1 以上的读数密度与 p53 的中心区域（TAD2、DBD 和车箱终端区域）进行比较。

量化和统计分析

PRO-seq和RNA-seq实验在生物复制中完成。用生物三脚架完成了 CHIP-seq 实验。代谢学实验完成了6个生物复制品。方法详细信息中提供了测序数据和代谢学数据的统计分析。

支持信息

Additional information about genome-edited cell lines.

Showing 1/46: pbio.3001364.s001.eps

Skip to figshare navigation

sorry, we can't preview this file

1 / 46

Download

figshare

S1 无花果。有关基因组编辑细胞系的其他信息。

（A）与 Cas-9 RNP 共同传输的捐赠者修复质粒概述。（B）在原生 TP53 轨迹插入 CRISPR/Cas-9 的计划：WTp53 （2820bp）、WTp53：WTp53 （4041bp）和Δ40p53：WTp53 （3924bp）。（C） PCR 验证。蓝色引物集跨越插入，红色引物集在插入内具有前向引物，在插入外具有反向引物。缺少带有蓝色引物的 500 bp 波段表示同源插入。PCR实验是在从每个指示的细胞系中分离出的基因组DNA上完成的。未经编辑的 MCF10A 细胞被测试为附加控制。（D）使用 p53 抗体（DO-1）对每个基因组编辑的细胞系进行西斑验证。按照设计，每个系绳结构（Δ40p53：WTp53 或 WTp53：WTp53）以大约 100kDa 的速度迁移，指示以更暗的表达形式作为单个成绩单。Δ40p53： WTp53 或 WTp53 ： WTp53 的柔性系绳包含 TEV 部位，使用 TEV 蛋白酶（如图所示）处理将变暗器切成 p53 单体，如预期的那样。请注意，单体Δ40p53缺乏 p53 医学论文发表- DO-1 抗体检测到的表皮。有关未克罗克的凝胶，请参阅S1 原始图像。CTR，卡盒终端区域;IRES，内部核糖体入口网站;PolyA，SV40多A序列与终结者，以防止下游转录：TA1，交易激活域1：TA2，交易激活域2：WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s001

（每股收益）

S2 无花果。CRISPR/Cas-9敲击细胞系的其他验证。

（A） p53 DNA结合域的测序结果显示，任何细胞系中常见的热点都没有突变。由于p53突变在培养物[47]中可以产生扩散优势，因此在整个项目中进行了多次DNA结合域测序，以确保在我们的实验过程中不会发生突变。（B）使用 PRO-seq 数据对编辑后的 p53 细胞系进行内部验证。PRO-seq 数据映射到原生 TP53 轨迹中插入的 p53 序列。与p53的前39个氨基酸相对应的RNA序列在Δ40p53：WTp53细胞系与WTp53中减少了一半，如预期的那样。此方法还允许以每单元 2 的 2 点验证 p53 副本编号。亲本身，精确核运行测序：WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s002

（每股收益）

S3 无花果。内源性MCF10A细胞表型与CRISPR/Cas-9编辑的WTp53和WTp53：WTp53细胞系匹配。

未经编辑的"现成"MCF10A细胞、经过编辑的WTp53和WTp53：WTp53单元分别显示相同的细胞周期表型。（A）细胞周期分析（PI）和条图（B）表示 6 个生物复制的平均值（条 = 平均标准误差）。请注意，MCF10A细胞内源性地表示WTp53. 加入编号S-BSST672的生物研究数据库中的基础FACS数据。 S5数据中面板 B 的原始数据。FACS，荧光激活细胞排序;PI，碘化物丙酸：WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s003

（每股收益）

S4 无花果。WTp53 vs. Δ40p53：WTp53 表型和代谢相似性在正常生长条件下，但与 Nutlin-3a 的 p53 激活时存在差异。

（A）每个基因组编辑的细胞系的细胞周期分析（PI）。图表（插图）表示平均 6 个实验（条 = 平均标准误差）。（B）比较IPA的代谢学数据样本，在每个细胞系的正常生长条件下识别出细胞周期代谢物（每个细胞系6个生物复制物）。Log2（折叠更改）已正常化为WTp53.加入编号S-BSST672的生物研究数据库中的基础FACS数据。 S6数据中面板 A 和 B 的原始数据。FACS，荧光激活细胞排序;IPA，独创性通路分析：PI，碘化物丙酸：WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s004

（每股收益）

S5 无花果。WTp53：WTp53细胞在代谢和表型上与WTp53细胞相似。

（A） WTp53中的细胞周期分析（PI：WTp53细胞：图表（插图）表示6个生物复制实验的平均值（条=平均标准误差）。箭头突出显示 S 相细胞的损失，类似于 WTp53 细胞（与Δ40p53：WTp53 细胞形成鲜明对比）。（B） FACS测量p21蛋白质水平;与WTp53类似，在Nutlin-3a治疗后，WTp53：WTp53细胞中的p21蛋白水平增加。（C） p53 空 MCF10a 细胞中的细胞周期分析（PI）：图表（插图）表示3个生物复制实验的平均值（条=平均标准误差）。条图显示时间相关 p21 RT-qPCR（没有统计学意义的 pval > 0.05）。（D）超过5个治疗周期的增长率：每个周期包括20小时的Nutlin治疗，然后分裂细胞1：10，然后在正常条件下生长48小时（3个生物复制品;条=SEM）。注意 WTp53 与 WTp53：WTp53 细胞的相似生长特征。加入编号为 S-BSST672 的生物研究数据库中的基础 FACS 数据。 S7数据中面板A、C和D的原始数据。FACS，荧光激活细胞排序;PI，碘化物丙酸：RT-qPCR，反向转录定量PCR;WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s005

（每股收益）

S6 无花果。代谢学显示，Δ40p53：WTp53细胞中的磷酸盐代谢物增加。

Δ40p53：WTp53细胞的代谢变化与WTp53：WTp53细胞相似，与WTp53细胞相似，在Nutlin-3a治疗20小时后与WTp53细胞相似。WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s006

（每股收益）

S7 无花果。在MCF10A细胞中进行3小时的Nutlin-3a后进行PRO-seq分析的理由。

HCT116 或 MCF10A 细胞 CDKN1A/p21 的核RNA水平 RT-qPCR 在 1 小时 3 小时。这些数据显示，MCF10A细胞与HCT116的p53响应延迟，3小时感应大致与HCT116细胞（箭头）的1小时p21核RNA水平相当。过去的GRO-seq结果在1小时内坚果素处理HCT116细胞[36]用于指导为MCF10A选择的3小时时间点。 S8数据中的原始数据。GRO-顺序，全球运行对序;亲本身，精确核运行测序：RT-qPCR，反向转录定量PCR。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s007

（每股收益）

S8 无花果。坚果素在WTp53：WTp53和WTp53细胞中诱发类似的转录变化。

WTp53 （y 轴）与 WTp53：WTp53 细胞（x 轴）中不同转录的注释基因的 PRO-seq 数据摘要。虚线表示p值 0.01。维恩图显示 WTp53 和 WTp53：WTp53 细胞之间的重叠。 S9数据中的原始数据。亲本身，精确核运行测序：WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s008

（每股收益）

S9 无花果。Δ40p53：WTp53细胞的微分转录：Δ40p53：WTp53 激活 p53 响应，与 p53 空细胞形成对比。

（A）选择性转录在Δ40p53：WTp53与WTp53细胞（PRO-seq数据，3小时纳特林）中的基因列表。（B， C）火山图显示在基因体中不同表达的 transcript （PRO-seq）后 3 小时 Nutlin-3a 治疗（与 DMSO 控制）在（B） p53 空或（C） Δ40p53：WTp53 MCF10A 细胞。绿点表示向下调节，红点表示向上调节的成绩单（p-val ≤ 0.01）。（D）在3小时Nutlin-3a治疗（PRO-seq）后，在Δ40p53：WTp53（左）或p53空MCF10A细胞（右）中绘制的规范p53靶基因富集图。（E）来自坚果林处理的 WTp53 或Δ40p53：WTp53 细胞和 DMSO 控制的代表 PRO-seq 数据。虽然在每个细胞系中观察到坚果素诱导，但在Δ40p53：WTp53细胞中激活减少。（F）基于 PRO-seq 数据（3 小时纳特林治疗）的 IPA。粗体字体突出显示的路径已链接到表示Δ40p53 + WTp53 [16，17]的小鼠的原生表型。 S10数据中面板 B–D 和 F 的原始数据。IPA，独创性通路分析：亲本身，精确核运行测序：WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s009

（每股收益）

S10 无花果。坚果素在WTp53：WTp53和WTp53细胞中诱导类似的转录变化（eRNA）。

WTp53 （y 轴）与 WTp53：WTp53 （x 轴）的 eRNA 转录的 PRO-seq 数据摘要。虚线表示p值 0.01。维恩图显示 WTp53 和 WTp53：WTp53 细胞之间的重叠。 S11数据中面板 C 的原始数据。电子RNA，增强剂RNA：亲本身，精确核运行测序：WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s010

（每股收益）

S11 无花果。来自所有 3 个细胞系（3 小时坚果素处理）和 DMSO 控制的 PRO-seq 数据。

请注意 WTp53 和 WTp53：WTp53 细胞中的类似反应，而Δ40p53：WTp53 细胞缺乏诱导双向 eRNA 转录的能力。p53 绑定主题（p-值 ≤ 1 × 10?5）显示与虚线，和峰值直接对应于在S13B图显示的ChIP-seq峰。ChIP-seq，色度免疫沉淀测序：电子RNA，增强剂RNA：亲本身，精确核运行测序：WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s011

（每股收益）

S12 无花果。TFEA 揭示了坚果林处理细胞中的差异 TF 激活。

（A–C）TFEA[40]来自 WTp53 中的 PRO-seq 数据（3 小时 Nutlin-3a），WTp53：WTp53 和Δ40p53：WTp53 单元格。虽然p53感应在WTp53和WTp53：WTp53细胞中是强大的，但在坚果林处理的Δ40p53：WTp53细胞（p-val≤1×10中却没有观察到这一点?6).这反映了在Δ40p53：WTp53细胞的p53结合位点缺乏电子RNA转录。请注意，TP53 和 TP63 具有几乎相同的绑定主题。（D） TFEA[40]来自 WTp53 中的 PRO-seq 数据（3 小时 Nutlin-3a）与Δ40p53：WTp53 细胞，表明Δ40p53：WTp53 单元中的 p53 （和 p63）活性减少（p-val ≤ 1 × 10?6).这反映了在Δ40p53：WTp53细胞的p53结合位点缺乏电子RNA转录。请注意，TP53 和 TP63 具有几乎相同的绑定主题。（E）元基因分析显示，WTp53：WTp53细胞中的平均电子RNA峰值高度（全基因组，响应性电子RNA（p-val< 0.25）。 S12数据中面板 A– E 的原始数据。电子RNA，增强剂RNA：亲本身，精确核运行测序：TFEA，转录因子富集分析;WTp53，野生型p53。医学论文发表-

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s012

（每股收益）

S13 无花果。所有 3 个单元格线上的其他 ChIP-seq 数据。

（A）在Nutlin-3a治疗后1小时、3小时或6小时完成了一系列ChIP-seq实验，以评估p53占用率变化的时间依赖性。在 Nutlin-3a 处理的 WTp53、WTp53：WTp53 或Δ40p53：WTp53 细胞的 p53 绑定点显示元数据分析（平均 ChIP-seq 信号）为 1 小时 3 小时 6 小时。据我们所知，在纳特林治疗后，所有发布的p53 ChIP-seq数据集都使用了6小时或更长时间点。（B）与 DMSO 控制相比，Nutlin 处理（6 小时）细胞中的 ChIP-seq 数据示例。ChIP-seq 峰值与S11 图中显示的 PRO-seq eRNA 峰值直接对应。（C）元基因分析（过滤含有p53图案的峰值）显示DMSO控制与坚果林处理的WTp53：WTp53细胞中p53结合点的平均ChIP-seq信号，全基因组。 S13数据中面板 A 和 C 的原始数据。ChIP-seq，色度免疫沉淀测序：电子RNA，增强剂RNA：亲本身，精确核运行测序：WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s013

（每股收益）

S14 无花果。WTp53：WTp53细胞的转录变化：IPA 比较Δ40p53：WTp53 和 WTp53。

（A）在 WTp53：WTp53 细胞中显示 20 小时后不同表达的 mRNA 的火山图纳特林治疗（与 DMSO 控制）。绿点表示向下调节，红点表示向上调节的成绩单（p-val ≤ 0.01）。（B） Venn 图显示来自 WTp53：WTp53 细胞中的 PRO-seq 数据（3 小时 Nutlin）和 RNA-seq 数据（20 小时 Nutlin）中显著诱导的脚本之间的重叠。（C） 20小时后，RNA-seq数据中的规范通路IPA在Δ40p53：WTp53与WTp53细胞的Nutlin-3a治疗中，其两侧是左侧p53基因的日志2（折叠变化）热图，右侧的细胞周期染色体复制通路。P53和细胞周期染色体复制分别代表Δ40p53：WTp53细胞（与WTp53）中最显著的向下调节或向上调节的通路。 S14数据中面板 A 和 B 的原始数据。IPA，独创性通路分析：亲本身，精确核运行测序：RNA-seq，RNA测序;WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s014

（每股收益）

S15 无花果。在WTp53、WTp53：WTp53和Δ40p53：WTp53细胞的TP63和TP73洛西的PRO-seq和RNA-seq数据。

p63 和 p73 的基因组浏览器视图，显示 p63 在右侧列出的 MCF10A 细胞系中转录（PRO-seq）并表达（RNA-seq）。相比之下，p73轨迹显示p73-AS1（p73反感1）的转录，这是一个成熟的反感转录。p63 和 p73 均未由 Nutlin-3a 治疗诱导。由于p73没有在MCF10A细胞中转录，我们专注于p63，但我们注意到从相邻的TP73-AS1轨迹观察到一些转录。顶部： DMSO 和 Nutlin-3a 轨道在 WTp53 中为 PRO-seq，WTp53：WTp53，以及Δ40p53：WTp53 单元：底部： DMSO 和 Nutlin-3a 轨道用于 WTp53 中的 RNA-seq、WTp53：WTp53 和Δ40p53：WTp53 单元。亲本身，精确核运行测序：RNA-seq，RNA测序;WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s015

（每股收益）

S16 无花果。p53 对羟基p63不影响Δ40p53：WTp53表型或功能。

（A）在扁桃体 p63 击倒之前或之后探测 p63 级别的西方污点。（B）超过5个坚果林治疗周期的增长率：每个周期包括 20 小时在基底（0.1% DMSO）与 Nutlin 处理的条件，分裂细胞 1：10，然后增长 48 小时。（C）控制或p63击倒中每个基因组编辑的细胞系的细胞周期分析（PI）。左图显示 20 小时 0.1% DMSO 治疗（控制）后的细胞周期，右图显示 20 小时 Nutlin3a 治疗后的细胞周期。（D） p63的敲击对WTp53、WTp53：WTp53或Δ40p53：WTp53细胞系中的p53目标基因诱导没有影响。RT-qPCR数据显示为p21和PUMA（2个生物复制品;条=SEM）。N.S. 指定非重大比较。加入编号为 S-BSST672 的生物研究数据库中的基础 FACS 数据。 S15数据中面板 B 和 D 的原始数据。FACS，荧光激活细胞排序;PI，碘化物丙酸：RT-qPCR，反向转录定量PCR;WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s016

（每股收益）

S17 无花果。关于5FU的蜂窝反应的其他数据。

（A）细胞周期分析（PI）：图表（插图）表示3个实验的平均值（条=平均标准误差）。箭头突出显示 5FU 处理的 WTp53：WTp53 细胞中增加的 S 相，类似于 WTp53 和Δ40p53：WTp53 细胞（图 4A）。（B）在WTp53：WTp53细胞中显示20小时5FU治疗（与DMSO控制）后不同表达的mRNA的火山图。绿点表示向下调节，红点表示向上调节的成绩单（p-val ≤ 0.01）。加入编号为 S-BSST672 的生物研究数据库中的基础 FACS 数据。 S16数据中面板 A 和 B 的原始数据。5FU， 5 氟酸：FACS，荧光激活细胞排序;PI，碘化物丙酸：WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s017

（每股收益）

S18 无花果。E2F 通路在 5FU 处理的Δ40p53：WTp53 细胞中激活。

（A） RNA-seq 数据（GSEA）显示，与 WTp53 和 WTp53：WTp53 相比，差异 E2F2 TF 活动的特点是Δ40p53：WTp53 对 5FU 的转录响应。 （B） IPA 显示上游监管 TF，从 5FU 处理Δ40p53：WTp53 与 WTp53 细胞中的 RNA-seq 数据推断出来。（C）控制对 5FU 的蜂窝反应的一般上游调节器（IPA）在 Δ40p53：WTp53 和 WTp53 细胞之间相似（在椭圆形内共享），但少数例外（p < 0.01）。（D）细胞周期分析（PI）：图表（插图）表示3个实验的平均值（条=平均标准误差）。箭头突出显示5FU处理p53空MCF10a细胞中增加的S相。（E） GSEA基于杨和同事的RNA-seq数据，在24小时5FU治疗后，将p53空HCT116细胞与WTp53 HCT116细胞进行比较。FDR q-val < 0.1 的路径为彩色点。与WTp53细胞相比，p53无细胞中的红色表示增加，绿色减少。X轴是NES。排名列表中显示了最重要的路径。加入编号为 S-BSST672 的生物研究数据库中的基础 FACS 数据。 S17数据中面板 A– E 的原始数据。5FU， 5 氟酸：FACS，荧光激活细胞排序;罗斯福，错误发现率;GSEA，基因集富集分析：IPA，独创性通路分析：NES，标准化浓缩分数：PI，碘化物丙酸：RNA-seq，RNA测序;WTp53，野生型p53。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001364.s018

（每股收益）

S19 无花果。与选择的原始细胞系克隆相比，替代基因组编辑的克隆显示出类似的结果。

（A） PCR 验证其他克隆。蓝色引物集跨越插入，红色引物集在插入内具有前向引物，在插入外具有反向引物。缺少带有蓝色引物的 500 bp 波段表示同源插入。PCR实验是在从每个指示的细胞系中分离出的基因组DNA上完成的。未经编辑的 MCF10A 细胞被测试为附加控制。（B）使用 p53 抗体（DO-1）对每个基因组编辑的细胞系进行西斑验证。按照设计，每个系绳结构（Δ40p53：WTp53 或 WTp53：WTp53）以大约 100 kDa 的速度迁移，指示以更暗的表达方式作为单个成绩单。（C）不同的WTp53、WTp53：WTp53或Δ40p53：WTp53克隆之间的差异最小，如p21（2个生物复制品;条=SEM）的相对感应（RT-qPCR）所示。（D）每个基因组编辑细胞系的替代克隆的细胞周期分析（PI）。细胞周期在 20 小时 0.1% DMSO 治疗（控制）或 20 小时的 Nutlin-3a （治疗）下进行。加入编号为 S-BSST672 的生物研究数据库中的基础 FACS 数据。 S18数据中面板 C 和 D 的原始数据。有关未克罗克的凝胶，请参阅S2 原始图像。FACS，荧光激活细胞排序;PI，碘化物丙酸：RT-qPCR，反向转录定量PCR;WTp53，野生型p53。