医学论文发表-微生物群落中拥挤条件和代谢变异性的斯帕蒂奥-时间建模
· 莉莉安娜·安利安·马丁内斯
· 瓦西里·哈齐马尼卡蒂斯
· 发布时间： 2021年7月22日
· https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009140
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抽象
物种的代谢能力和当地环境通过代谢产品的交换或资源的竞争，塑造了社区中的微生物相互作用。细胞通常排列在彼此靠近的地方，从而形成一个不均衡地减少营养物质扩散的拥挤环境。在此，我们调查了细胞之间的拥挤条件和代谢变异性如何塑造微生物群落的动态。为此，我们开发了CROMICS，这是一个基于单个建模、缩放粒子理论和热力学通量分析等技术相结合的时空框架，明确结合了细胞代谢和大分子成分的存在对营养扩散的影响。该框架用于研究两个典型的微生物群落（一）大肠杆菌和沙门氏菌肠杆菌，通过交换代谢物相互合作，和 （ii） 两个E。大肠杆菌具有不同生产水平的细胞外聚合物物质 （EPS）， 竞争相同的营养物质。在相互主义社区中，我们的结果表明，拥挤通过减少代谢物从生产区域泄漏，避免了与非合作细胞的资源竞争，提高了合作突变体的适应能力。此外，我们也表明，E.大肠杆菌EPS分泌突变体通过创建密度较低的结构（即增加细胞之间的间距），使突变体能够扩大并到达离营养供应点更近的区域，从而赢得了与非分泌细胞的竞争。在模拟中考虑到拥挤效应时，发现EPS分泌细胞相对于非分泌细胞的相对适应性略有提高。细胞-细胞相互作用的出现以及生长与代谢物或EPS分泌之间的权衡引起的细胞内冲突，可以通过提供更多的交叉喂养代谢物或创建密度较低的邻里，为一个物种提供当地的竞争优势。
作者摘要
微生物群落在生物化学周期、生物补救和人类健康中起着关键作用。在拥挤的微生物系统（如生物膜和细胞聚合物）中，单个细胞之间的接近会减少营养物质扩散的自由空间。为了模拟这些微生物系统的异质性，我们开发了CROMICS，一个框架，整合了有关每个细胞的代谢能力以及细胞和大分子在介质中的大小和位置的信息。个体之间的相互作用自然产生于代谢物的竞争或交换。我们展示了突变体的存在和在拥挤的环境中减少扩散如何干扰当地营养物质的供应，从而改变微生物群落的动态。在拥挤的系统中微生物相互作用的发现的机制以及发达的框架是今后研究人类微生物群和宿主代谢、病原体入侵和抗生素有效性评估的宝贵起点。医学论文发表-
引文：洛杉矶-马丁内斯L，哈齐马尼卡蒂斯五世（2021年）在微生物群落的拥挤条件和代谢变异性斯帕蒂奥时间建模。PLoS 计算生物 17 （7）： e1009140.https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009140
编辑：基兰·劳萨赫布·帕蒂尔，英国剑桥大学
收到：2020年9月29日：接受：2021年6月1日：已发布：2021年7月22日
版权所有：2021年?洛杉矶-马丁内斯，哈齐马尼卡蒂斯。这是一个开放访问文章，根据《知识共享归属许可证》的条款分发，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到记分。
数据可用性：所有相关数据均在手稿和支持信息文件中。复制本文结果所需的 CROMICS 代码和数据集可在https://github.com/EPFL-LCSB/cromics.git提供。模拟数据可在 https://doi.org/10.5281/zenodo.5009045。
资金：这项工作的财政支持来自瑞士国家科学基金会（200021_188623）、微生物群系国家研究能力中心（http://www.snf.ch/ 51NF40_180575https://nccr-microbiomes.ch/）和欧盟2020年地平线研究与创新方案（686070）（https://ec.europa.eu/programmes/horizon2020/）向VH提供的赠款。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或编写手稿方面没有作用。
竞争利益：作者宣称不存在相互竞争的利益。
缩写列表：贝普斯，多物种生物膜由E.大肠杆菌野生类型和eps穆坦人;贝普斯，多物种生物膜由E.大肠杆菌野生类型和eps穆坦人;cLBM，格子博尔兹曼方法的拥挤适应;CN，曲柄-尼科尔森方法;克罗米斯，西里科社区系统的拥挤建模;埃普斯， E.大肠杆菌突变物，分泌0.11克gDW-1的EPS;埃普斯， E.大肠杆菌突变物，分泌0.43克gDW-1的EPS;EPS，细胞外聚合物物质;创业板，基因组规模代谢模型：IbM，基于个人的建模;nmse，规范化平均平方错误：NN，神经网络：SPT，缩放粒子理论：TFA，热力学通量分析;WT， 野生类型细胞+++++++++
介绍
微生物群落，如生物膜，参与多个过程，从有益的生物补救到工业设备的有害污染、食物污染和人类慢性感染[1]。这些社区的主要特征之一是个人之间距离很近，要么是因为它们被嵌入生物膜矩阵中，要么是因为系统的实际限制。个人的接近促进了代谢产品和细胞信号[2]的交换，因此促进了社区内部合作互动的出现，同时也促进了空间和资源的竞争[3-5]。生物膜基质（即大分子、DNA、多糖等）中细胞和其他细胞外聚合物（EPS）的存在，通过创造一个拥挤的环境，为系统增加了另一个复杂度，其中营养扩散不均匀地减少[6-11]。拥挤条件由单元格和 EPS 占用的体积分数提供。营养物质和溶解物的供应变化可能会对微生物动力学产生影响，例如限制生长速度[12]，降低抗生素治疗的有效性[13]，或改变细胞[14、15]的蛋白质表达水平，从而增加人口的代谢异质性。在此，我们调查拥挤和环境条件的影响，以及物种的代谢变异性对微生物群落内的动力学和相互作用。
通过应用该物种的基因组规模代谢模型（16-20），模拟代谢物的生物合成和分泌产生的微生物物种之间的竞争/合作及其在结构介质中的扩散。目前为微生物系统建模而提出的计算框架通过假设同质有效扩散（D）过于简单化了拥挤效应埃夫，会见了) x比水中的扩散慢一倍，这样。例如，在3DFBA[20]，D 
埃夫，会见了是非大小和形状的细胞占用的本地体积的函数。然而，实验证据表明，D埃夫，会见了是不对称的，取决于当地的生物膜成分，如EPS和细胞物种的丰度和大小，以及扩散分子的大小[6-11]。
为了更真实地反映微生物系统的异质性，并研究视时依赖的拥挤条件如何影响单个细胞之间的动态合作/竞争，我们为In-silico Community Systems（CROMICS）的CRO-Modeing-M奥德林制定了一个机械框架。CROMICS 结合了基于单个建模 （IbM） 和热力学通量分析 （TFA）[21]等技术，以捕获人群中的代谢变异性。为此，使用 GEM 在当地环境条件下估计每个细胞的代谢活动。此外，通过应用缩放粒子理论 （SPT）[22，23]将拥挤效应明确纳入模拟中，从而D埃夫，会见了系统每个区域的计算是细胞和 EPS 的大小和空间分布的函数，具有球形。
作为说明性案例研究，我们使用CROMICS模拟大肠杆菌和沙门氏菌的突变体的共同生长，以证明物种和亚种群之间的竞争和相互作用。我们通过在靠近产地的区域集中交换代谢物，避免代谢物向非合作物种占主导地位的地区泄漏，从而表明拥挤的条件如何有利于个人之间的合作。因此，随着拥挤程度的增加，合作突变体的健身能力得到增强。此外，我们还调查了挤挤对E两个突变体的竞争的影响。大肠杆菌与不同级别的EPS生产。EPS 分泌物为 EPS 分泌突变体提供了竞争优势，而不是开发密度较低的结构的非分泌竞争对手，从而增加突变细胞的营养物质量。在这种情况下，拥挤适度地增强了EPS分泌细胞相对于非分泌细胞的相对健康。这些结果进一步理解了微生物群落中局部组成和空间组织之间相互作用的机制以及物种间的相互作用。
结果和讨论
克罗米斯工作流程
CROMICS 允许微生物群落的时态建模，其中可以纳入系统的异质方面，如物种的代谢能力和拥挤条件。因此，在模拟中自然产生细胞存在的空间限制（以及分泌给介质的其他大分子）对微生物交换的营养物质和代谢物的扩散的影响。在这里，系统被分成小盒子或区域，细胞可以吸收盒子中本地提供的营养物质。模拟由三个迭退步骤（图1）组成。每次步骤Δt， （i） 每个微生物的生长速率和交换代谢通量都是从 GEM 获得使用 TFA 或神经网络 （NN）[24]专门训练的。NNs 可减轻与代谢通量计算相关的计算负担（参见方法）。这些代谢通量用于更新细胞的质量和体积，以及每个区域代谢物的数量（或浓度）。然后，（ii） 代谢物被允许扩散到其他地区，由于细胞的大小增大，其拥挤条件发生了变化。有效扩散计算为[25]，其中活动系数γ遇到（使用 SPT 计算）表示系统每个区域中新陈代谢物的总体积和可用体积之间的比率。2D 或 3D 系统中的代谢物扩散可以通过半隐含的曲柄-尼科尔森阿波奇[26]或格子博尔茨曼方法 （cLBM）[27]的拥挤适应来计算。最后，（iii） 按照 IbM 规则计算系统中的物种的细胞分裂和再分配。
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· 蒂夫
图1。克罗米斯的工作流程。
2D 或 3D 系统分为混合良好的框。每次Δ t，（i）生物体的代谢活动都是使用热力学通量分析（TFA）或神经网络（NNs）计算的，然后（ii）代谢物的扩散是近似的 由曲柄-尼科尔森方法（CN）或挤格-格子博尔茨曼方法（cLBM）计算，最后（iii）微生物细胞的行为和空间分布使用基于单个建模（IbM）的方法计算。在第一步（iii），实心箭头指示细胞运动，而虚线箭头表示细胞分裂将发生。由于代谢物的吸收和扩散比细胞分裂和推挤（S1文本IbM规则）更快，步骤（i）和（ii）可以在一段时间内模拟t升使用较小的时间步骤Δ t快递 之 家（Δ t快递 之 家≤ Δ t）。步骤（iii）在t时计算升=Δ t。当最终模拟时间t结束时，模拟结束模拟已到达。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009140.g001
当单个细胞之间没有代谢变异时，拥挤条件不会影响物种比例趋同
Spatio-时间模型可用于研究和模拟共享空间和资源所产生的微生物物种之间可能的相互依赖性。我们使用CROMICS来模拟由E组成的相互微生物群落的生长。大肠杆菌K12 Δ甲基B和S的甲基离子分泌突变体。在二维系统中的肠（被识别为甲状旁）。十个细菌点与E.大肠杆菌和甲状结石是随机接种的。每个细菌点包含 3 x 10++?7gDW分布于200个个体或代谢，其中一种代谢细菌是细胞的集合（见方法。社区模型 1）。为了简单起见，我们将使用细胞一词来指代代谢细菌。盒子高度被设定为Δz = 0.18 mm，因此初始拥挤条件（即细胞占用的盒子的体积部分）平均为 2%。只有乳糖和O2系统不断供应，所有箱中分别保持292m和0.21m的有效浓度。有效浓度被定义为每个盒子中每个可用体积（或未被细胞占用的体积）代谢物的量（Eq 2）。大肠杆菌能够在不同的氧化条件下代谢乳糖，并产生醋酸盐和乳糖作为副产品，尽管这种突变体无法合成甲氨酸。另一方面，甲基可以同时使用乳糖和醋酸盐（但不是乳糖）作为碳源，并合成每克细胞干重量0.5毫米的甲硫氨酸（g）+DW) [19]这两个物种之间的协同作用依赖于代谢物的相互交换，即E。大肠杆菌使用甲基丙氨酸分泌，后者使用E.大肠杆菌。虽然在模拟开始时，系统中没有甲氨酸（生物质合成必不可少的），E.大肠杆菌消耗乳糖，以满足其非生长ATP要求。少量的乳糖和醋酸盐由于乳糖代谢而分泌。因此，E.大肠杆菌开始与甲烷合作，释放出在电池维护能源生产过程中获得的废物。++
E的两个初始组成比率。大肠杆菌：甲烷被测试，即99：1和1：99。结果表明，无论初始接种结果如何，该系统的品种比例为76.3%±E的0.1%。 大肠杆菌和23.7%±14小时后甲烷的0.1%（当两种微生物覆盖整个系统时）。这种稳定性之所以实现，是因为社区存在相互依赖性，一个物种不能没有另一个物种生长。CROMICS 的收敛预测与实验数据和 COMETS 模拟[19]都非常一致，后者使用一个时态框架，通过结合通量平衡分析和扩散（S1 图） 来接近微生物种群的动态（即，而不是像 CROMICS 中那样的单个细胞）。与CROMICS不同，COMETS假设代谢物扩散系数是恒定的，这意味着细胞不会影响代谢物的扩散。为了确定拥挤条件是否影响了CROMICS在本案例研究中的预测，我们再次模拟了系统假设无体积细胞和。++
初始成分为 99% E。大肠杆菌和1%的甲烷，结果表明，在模拟开始时，当细胞占到其当前盒体积的不到10%时，两个模拟中计算的生物质总量没有差异。然而，这种生物量差异随着系统变得更加拥挤而增加，即细胞生长并占据了盒子体积的10%以上（图2A和2B）。在考虑到拥挤效应的模拟中，系统中积累的生物量较低（图2A）。这可能是因为代谢物的扩散随着系统变得更加拥挤而减少，使得细胞（甲基氨酸、醋酸酯和卡拉索）交换的代谢物难以重新分配和获取。然而，在两次模拟（图2C）中都获得了类似的相对丰度。+
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图 2.相互主义社区的动态E.大肠杆菌Δ甲b：S. 最初作文为99：1。+
（A） 生物质总量。（B） 细胞在其相应框中占用的平均体积分数（即拥挤条件）。（C） 甲烷的物种比例趋同。测试了三个初始拥挤条件：2% （使用盒子高度Δz = 0.18 mm）、20% （Δz = 0.018 mm） 和 40% （Δz = 0.009 mm）。封闭符号表示考虑拥挤效果的模拟（），而开放符号表示忽略拥挤（）的模拟。错误条显示五个独立模拟的标准偏差。+
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009140.g002
为了确定最初的拥挤条件是否对相对物种的丰度有影响，我们人为地增加了拥挤（即细胞占用的体积分数，V）细胞/V箱）通过降低系统的高度Δz，因此，盒子体积（V）箱=ΔxΔyΔz）也有所下降。这类似于在高度为两板的Δz室中的微生物群落。测试了三种初始拥挤条件：2% （Δz = 0.18 mm）、 20% （Δz = 0.018 mm） 和 40% （Δz = 0.009 mm）。对于初始比率E.大肠杆菌：99：1的甲烷，结果证实，在模拟中实现的生物量随着初始拥挤增加而减少，因为代谢物从生产点扩散速度较慢。然而，拥挤的条件并没有影响物种的收敛率（图2C）。这就是E的收敛率76%。大肠杆菌和24%的甲烷是由该物种交换的代谢物数量决定的。++
在拥挤的环境中，交换代谢物的获取取决于从生产点到消费点的距离。例如，我们模拟了甲氨酸在2.5毫米×2.5毫米的小系统中的生产和扩散，分为每边（图3A）和3以下的Δ×0.025毫米的盒装 不同的拥挤条件： 2% （Δz = 0.18 毫米）， 20% （Δz = 0.018 毫米） 和 40% （Δz = 0.009 毫米）。系统中充满了不活跃的细胞（即它们不能消耗甲氨酸或生长），并且只有一个甲烷细胞被放置在中心。每个细胞的质量被设置为7.5 x 10+?10gDW.O 的有效浓度2，乳糖和醋酸盐在系统中被固定到0.21，2.92和10m，分别是，即甲基不依赖于醋酸盐产生的E。大肠杆菌。该系统被划分为半径Δx的同心圆划定的区域或区域，2Δx,..., 50Δx 。不同区域每个盒子可用的甲氨酸是通过平均其中心位于两个同心圆之间的盒子中的甲氨酸含量获得的。模拟6分钟后每个盒子平均甲氨酸丰度的快照显示，随着拥挤增加（图3B），甲氨酸从甲氧中保留或浓缩在Δ×=0.025毫米的量增加。更何地说，模拟非活动细胞被活性E取代。大肠杆菌显示，在更拥挤的系统中，位于Δ×的细胞的适应性较高，例如在40%（图3C），这可能是由于该区域的甲氨酸保留率较高。然而，当拥挤被设置为40%，只有E。2Δx径向距离内的大肠杆菌细胞能够接触到冰毒产生的甲氨酸，从而允许它们生长（图3C），而在不太拥挤的系统（20%和2%）中，甲氨酸可以进一步扩散（5Δ x和14Δ x，重复），然后几乎耗尽E。大肠杆菌。这表明拥挤条件可以限制微生物相互作用的区域。因此，拥挤效应在异质系统中可能变得更加重要，代谢变异性在个人之间竞争相同的营养物质，如下一节所示。++++
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· 巴布亚新几内亚
图 3.在拥挤的环境中，甲氨酸和健身作为与生产点距离的函数。
微生物群落由E.大肠杆菌Δ甲b和甲氨酸分泌突变体S.肠。（A） 物种空间分布的示意图表示。（B） 假设E. ， 每个盒 （插装） 放大图的平均可用甲氨酸量。大肠杆菌细胞不活跃，并且（C）适合活性E。大肠杆菌细胞（内插）在不同的拥挤条件下放大图。错误条显示系统中的标准偏差（一个独立模拟）。
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拥挤的条件增强了合作突变体的适应能力
由于蛋白质表达水平或基因突变的差异[28，29]，同一物种种群个体之间的代谢变异性可能出现。在许多情况下，交叉喂养代谢物的（过度）生产是以微生物生长为代价的[30]。例如在S.肠子，甲基苯乙烯的分泌降低了细胞的适应性（以生长速度表示），因为更多的营养物质和蛋白酶资源被投入到氨基酸的合成中。TFA 计算的两个S的最大增长率的比较。肠子种群显示，与野生非甲氨酸分泌物（甲基）相比，一种甲氨酸分泌突变体（甲基）的增长率降低了7%。在这里，我们分析了拥挤对合作突变体的健身和两个亚人口之间的竞争的影响。+-
继之前的案例研究之后，我们模拟了S.肠和E。大肠杆菌ΔmetB，初始物种比为50：50，假设细胞占盒子体积的40%。美国肠子物种由亚种甲基和甲基组成。系统中接种了20个细菌斑点，E个体数量相等。大肠杆菌和S。肠癌，但只有一个点（确定为菌落A）含有甲基，我们测试了三个不同的初始数量的甲基细胞70，60和50（对应的相对丰度分别为8.8%，7.5%，和6.3%）。所有细胞都随机分配在细菌斑点。请参阅方法中的模型设置。社区模型 1.-+++
对甲基（Eq 10）的平均健身或生长的比较表明，甲基的适应性呈正频率依赖性，在最初建立的系统（图4A）中，甲基的健身性增加更为常见。这是因为当甲酸的丰度较高时，可以产生更多的甲氨酸，因此E.大肠杆菌可以生长得更快，合成更多的醋酸盐和乳糖为两个S。肠子人口。++++
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图4。社区的动态E.大肠杆菌-S。具有代谢变异性的肠状物。
（A） 26小时后计算的甲度和（B）相对丰度。测试了三种不同的初始拥挤条件：2% （Δz = 0.18 mm）、 20% （Δz = 0.018 mm） 和 40% （Δz = 0.009 mm），初始频率为 70、60 和 50 个甲基细胞。封闭符号表示考虑拥挤效果的模拟，而开放符号表示忽略拥挤的模拟。（C） 在一次模拟重复中以 t = 0h 和t = 26 h 的速度拍摄细胞空间分布的快照。只有1的20个细菌点，殖民地A，其中接种了70个甲基细胞，最初的拥挤条件被设定为40%。（D） 系统20个不同区域预测的物种相对丰度的动态（时间表示在每个象限的x轴上，而相对丰度在y轴上）。错误条显示五个独立模拟的标准偏差。+++
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009140.g004
为了确定拥挤是否对甲状丁石的健身有影响，我们测试了四个初始拥挤条件：2% （Δz = 0.18 mm）、 20% （Δz = 0.018 mm） 和 40% （Δz = 0.009 mm）。结果表明，在最初的甲烷频率相同的情况下，当拥挤增加时，甲烷的适应性得到增强。代谢物在拥挤的媒体（如殖民地或生物膜）中的扩散减少，这意味着拥挤可以最大限度地减少交换代谢物向甲状旁白等竞争对手占主导地位的地区泄漏，从而有利于合作突变体的扩散。相比之下，当在模拟中忽略拥挤效应时，甲基达到了较低的健身和相对丰度（图4A和4B中的开放符号），因为交换的代谢物在殖民地由无体积细胞组成时很容易从原点逃逸。因此，在初步测试的频率中，拥挤条件有利于合作突变体的入侵，而不是非合作突变体的入侵。+++-+
对于70个甲基细胞的初始频率和40%以下的初始拥挤条件（Δz = 0.009 mm），26小时后该物种的空间分布快照（图4C左图）显示，由于E之间的合作，A殖民地增殖。大肠杆菌和甲状肠杆菌。殖民地A最终扩大并合并了用甲基形成的邻近殖民地。甲基细胞受益于交叉喂养资源，它们在殖民地外围的密度增加（图4C）。将非合作物种排除在殖民地外围，例如在霍乱弧菌生物膜[31]中进行了实验观察。++--
仔细观察系统不同区域物种丰度的动态，发现甲虫比E更丰富。大肠杆菌在殖民地A附近的地区。例如，这可以在图4D的象限C4中看到，醋酸盐和甘氨酸由于从源菌群扩散而可用。然而，一旦甲基出现在象限由于殖民地A的扩大，E的丰度。大肠杆菌增加并超过S。肠质分。物种特征中发现的高度变异性表明，由于物种和亚种之间的局部相互作用，每个区域对中等刺激的反应可能不同。-+
这些结果表明，当突变提供竞争优势时，合作突变者可以轻松地主宰系统。在这种情况下，这种优势通过与其他物种的合作而发生，即使细胞牺牲了自身的生长速度，转而支持代谢物的合成。在E.大肠杆菌和S。肠WT在空间结构环境中进行了实验性观测[32]。虽然物种之间的合作在结构化环境中受到青睐，因为细胞之间的短距离有利于交换代谢物[33，34]，但我们的结果表明，拥挤的条件可以通过减少代谢物的扩散和泄漏来增强合作物种的适应能力。这表明微生物动力学取决于杂交代谢物的局部生产水平（即生产物种的初始频率）以及拥挤条件（图4）。+
拥挤的条件对物种之间的竞争影响不大
通常，微生物群落由物种的混合物组成，每个物种都有其自身的代谢能力、细胞大小和形状。实验测量表明，化学物种（代谢物、抗生素等）的有效扩散不仅取决于它们在生物膜中的位置，还取决于生物膜的物种组成[6-11]。这可能与微生物物种和不同大小和形状的EPS分子形成的结构有关。医学论文发表-
聚合物分泌物以前已被确定为多物种生物膜模拟的竞争优势，假设[3]。本节调查了EPS生产水平不同的两个品种的竞争拥挤效应。两个E的增长。由WT细胞和EPS分泌突变体组成的大肠杆菌生物膜被用作案例研究。在生物膜贝普斯，突变体分泌0.11克+DW-1EPS（确定为每股收益）;而在生物膜贝普斯，突变体分泌0.43克g+++DW-1每股收益（标识为每股收益）。突变体将部分资源投资于EPS生产，使eps和eps的增长率分别比WT降低10%和30%。由于 EPS 的产生和积累，每个盒子中可分配少量突变细胞。因此，WT、eps、eps的代谢细菌分别含有27、20和12个细胞，然后计算出最大代谢细菌质量为0.74M++++++++最大值，WT，而作为0.45M最大值，WT.在贝普斯和贝普斯，WT细胞最初位于生物膜的左侧，而突变体占据了右侧（图5A）。葡萄糖和O+++2已提供给系统。在CROMICS模拟中明确考虑了400 Da或以上的细胞大小和大分子。所有其他分子（≤400 Da）都被认为是无体积的。请参阅方法中的模型设置。社区模型2。
图 5.两个E的生物膜生长的动态。具有不同EPS生产水平的大肠杆菌物种。
（A） 以0 h 的E表示空间分布。大肠杆菌细胞WT和eps突变体（eps或eps）。（B） 生物膜贝普斯和贝普斯垂直层（0.06毫米，y， z）中仅由细胞和代谢区域占据的空间快照，在 25 h. （C） 与 WT.（D） 总生物量和 （E） 微生物群落产生的醋酸盐在 25 h 时相比，eps 突变体的健身。封闭符号表示考虑拥挤效果的模拟（），而打开的符号表示忽略拥挤（）的模拟。错误条显示五个独立模拟的标准偏差。++++++
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009140.g005
虽然eps和eps牺牲了自己的增长，有利于EPS合成，突变相对于WT的健身，w+++史诗 = 健康史诗/健康瓦特（Eqs 10和11），在两个生物膜计算表明，EPS分泌物提供了竞争优势突变体比WT（图5C）。通过将EPS分泌到介质中，突变体创建了密度较低的细胞结构，其中较少的eps或 eps细胞共享相同的框或区域（通过降低质量阈值来进行细胞分裂，与WT相比），因此每克可获得更多的营养物质+++DW突变体。更令人痛狂的情况阻碍了营养物质向生物膜底层的扩散，有利于生物膜表面物种的生长。在我们的案例研究中，EPS分子将突变细胞推上去，因此突变体比WT更容易到达上部生物膜层，从而获得拥挤条件所保留的营养物质。相比之下，eps 生产与 eps 相比的增量增强了生物膜中突变体的相对适应性 （图 5C）。这可能是因为eps积累了更多的EPS，使他们能够到达营养丰富的较高地区（靠近顶部边界），其中eps的生长速度可能快于WT。然而，由eps支付的生产EPS更高的健身成本导致生物膜贝普斯积累的总生物量低于在贝普斯（见图5D的插入）。++++++++++++
当细胞和EPS的体积在模拟（使扩散系数）中被忽视时，系统中进入营养物质的自由空间更大，因此社区在25小时内达到比在考虑到拥挤效应的模拟中获得的生物量更高的生物量（图5D）。然而，eps 和 eps 的相对适量低于考虑生物膜组件大小的模拟中获得的相对适合性。在这种情况下，拥挤条件对EPS分泌突变体和WT之间的竞争影响不大，这表明，当营养物质从外部（从顶部边界供应，而不是由物种伙伴产生）时，其他因素，如生物膜细胞结构（即细胞之间的间距），对微生物群落的微生物动力学影响更大。+++
由于WT和突变体（图5B）在EPS生产中的差异，两个生物膜左右两侧的细胞在25小时时所占用的空间发生了变化。由于生物膜贝普斯和贝普斯的细胞结构不同，细胞暴露在不同的营养浓度梯度中，这些营养物质可以改变其新陈代谢。使用代谢通量（Eq 9）识别出WT和突变体的表型。在生物膜中确定了三个表型区域：（一） 在表面层上 O+++2仍然可用，WT和突变细胞激活呼吸道，（ii） 中间层的细胞选择发酵通路产生大量的醋酸盐，（iii） 不活跃的细胞出现在葡萄糖和O的底层2耗尽 （图 5B） 。在WT占主导地位的区域，两个生物膜都发现了较大的非活动区域。这可以解释为WT与突变体相比形成的密度更强的结构，这使得从顶部边界（图5B）移动和补充营养物质变得困难。特别是，O的可用性较低2在生物膜中导致细胞转移到发酵代谢。一种代谢表型或另一种代谢表型的出现取决于营养的可用性，可导致不同数量的代谢物的分泌，例如生物膜贝普斯产生的醋酸盐低于贝普斯（图5E），如果系统中的一个物种依赖于醋酸盐的可用性，则这种交流可能会改变交叉喂养相互作用，就像我们之前的案例研究E一样。大肠杆菌-S。肠。此外，乙酸酯在系统中的生产和积累可能会对社区动态产生额外的影响。例如，由于离子平衡的扰动和脱钩效应（细胞必须消耗能量以排出 H 并保持膜电位），醋酸盐（和其他有机酸）的高浓度抑制微生物生长[35]，这在 CROMICS 模拟中未考虑。++++
如上所示，微生物群落的异质性也反映在系统的局部细胞结构中，即细胞和EPS组件的空间排列，有利于某些表型（因此产生代谢物）的出现，甚至为一个物种提供比其他物种更具竞争优势。在争夺相同资源的社区，如贝普斯或贝普斯，突变体到达的密度较低的结构允许他们进入营养丰富的地区，因此赢得了WT的竞争。在这个简化的示例中，细胞结构由 EPS 生成决定，但其他因素可能会影响配置，例如细胞的形状、不同类型的 EPS 分子的产生、防止近距离接触的分子之间的静电相互作用等。+++
结论
通过共享资源分泌（交换代谢物和EPS分子）对当地环境进行改造，可以为某些物种提供竞争优势，尽管这会使细胞层面的资源分配冲突导致增长率下降。拥挤的环境可以通过限制微生物群落中的相互作用区域来提升这种竞争优势。我们展示了拥挤如何通过减少生产点交换代谢物的泄漏来增强合作突变体的健身能力。在向生物膜群落外部提供营养物质（而不是由伙伴物种生产）的情况下，EPS分泌突变体相对于非分泌细胞的适应性因拥挤效应而略有增强，这表明由于EPS积累而形成密度较低的结构对这些物种之间的竞争有更大的影响，其中EPS分泌突变体是赢家。进一步研究，以确定拥挤的效应对微生物动力学变得重要的特定场景，可以帮助简化这一层复杂性。
像CROMICS这样的建模方法有助于弥合单细胞代谢建模与整个人群之间的差距。这些方法的多功能性使人们能够探索细胞生长和大分子分泌施加的物理限制之间的相互作用，这些限制对营养物质的扩散产生负面影响，并且细胞代谢对微生物系统中营养物质的局部可用性依赖。
方法
CROMICS开发的时态微生物建模是一个迭代过程，整合了有关（一） 细胞代谢、（ii） 代谢物扩散和 （iii） 系统中单个细胞再分配的信息 （图 1）。CROMICS 需要输入参数（如扩散系数、迈克尔斯-门滕常数）和系统初始设置（GEM、细胞和代谢物的初始种子）。系统在常规格子上进行分辨，网格大小Δx、Δy和沿空间坐标Δz。2D 系统通过假设矩形（或立方形）棱镜盒的单层进行模拟。
代谢物扩散过程和微生物物种的分布分别在两个不同的格子上模拟，分别被确定为IbM和CN晶格。为了说明简单性，相同的晶格大小（Δx）用于描述细胞物种和代谢物的间空分布。但是，对于代谢物的扩散，可以应用粗粒状光盘化（参见S1 文本粗粒化考虑）。假设球形细胞，则Δx是最大细胞半径R的两倍最大，细胞在细胞分裂发生之前。
在CROMICS中，营养物质和微生物物种的间断分布被计算为每个离散时间步骤Δ直到最后的模拟时间t模拟已到达。在微生物系统中，代谢物的扩散速度比细胞过程（如细胞分裂和推挤）快。推挤过程在S1 文本IbM 规则中进行了描述。因此，CROMICS工作流（图1）中描述的过程（i）和（ii）即细胞代谢和代谢物扩散，可以使用较小的时间步骤Δ t模拟快递 之 家，而蜂窝过程（iii）可以使用较长的Δ t计算，即Δ t快递 之 家≤ Δ t.下面介绍了 3D 系统对 CROMICS 框架的描述，并以简单的方式扩展到 2D 系统。模拟案例研究的设置（E.大肠杆菌肠科财团和E.大肠杆菌生物膜）在案例研究中给出。
（一） 代谢和细胞生长
细胞和介质之间的相互作用包含在同一个框ijk在一段时间内Δt快递 之 家由微生物的代谢能力和代谢物的汇率决定。细胞可以从当地的盒子ijk中摄取营养物质。如果营养吸收由蛋白质膜（即活性传输）进行中介，则最大吸收通量v美国f，前，遇见被迈克尔斯-门滕动力学所束缚。
(1)
而对于代谢物的被动运输，吸收率受制于ρ遇到是（细胞外）量代谢物在框中遇到的ijk[mmol]，和M细胞是细胞质量的时间t[gDW].最大吸收通量值（V）M，遇见）[毫米gDW-1h-1]和迈克尔斯-门滕常数（KM，遇见）[毫米醇L-1| 可从实验数据和/或数据库（如布伦达数据库）获得。C埃夫，会见了[毫米醇L-1? 表示代谢物在盒子ijk中的有效浓度， 由(2)其中一个盒子的体积是V箱=ΔxΔyΔz [毫米3], 106是毫米的转换因子3假设细胞和代谢物都是不同半径R [mm] 的硬球体，则活动系数γ遇到（即盒体积与在框ijk中遇到的可用音量之间的比率）可以按 SPT 估算 [22，23](3)其中变量Sx是由(4)
简单来说，该指数（ijk，t）已经从γ遇到和Sx.k乙代表博尔茨曼常数，和N一是阿沃加德罗的常数因子 103在Eq 4中表示从熔胶转换为mol。Eq 4被修改为能够穿透细胞膜的代谢物，请参阅S1 文本 SPT考虑中的细节。请注意，如果代谢物的大小与细胞的大小（即R）相比被认为是微不足道的遇到=0），最后三个术语从Eq 3的右侧消失。因此，1/γ遇到由未被单元格占用的体积分数给出。
一旦吸收通量限制v美国f，前，遇见根据介质（Eqs 1和2）中的有效营养浓度设置，然后增长率ν生物并交换代谢物的通量/从细胞νf，前，遇见[毫米醇gDW-1h-1[可按 TFA（涉及大规模保护和热力学约束）[21]或由 NN[24]计算。请参阅S1 文本代谢通量估计中的详细信息。还可应用其他测量模型和约束。当由于饥饿状况而找不到可行的通量溶液时，细胞被允许以速率v收缩收缩满足细胞维护要求，即ν生物 = v收缩.ν生物和νf，前，遇见用于更新细胞质量M细胞代谢物ρ量遇到在每个框中为下一次t+Δ t，以便(5)(6)
我们假设细胞体积与M成正比细胞和物种sp的具体数量（υsp），因此细胞半径R细胞在时间t+Δ t是由(7)
细胞大小的增加（以R表示）细胞）修改箱ijk中普遍存在的拥挤条件，使代谢物的活动系数γ遇到将按照Eq3进行更改。γ之间的直接关系遇到和C埃夫，会见了 (Eq 2）表明细胞所经历的有效浓度受以下（一） 时间依赖（局部）拥挤条件的影响：（ii） 由于代谢物的消耗/生产或邻近盒子中新分子的进入而满足量的变化。因此，C埃夫，会见了 (Eq 2）提供了挤塞条件导致的生物膜扩散问题与它对细胞代谢和微生物生长的影响之间的联系。
（二） 在拥挤的系统中扩散代谢物
在生物膜中，与任何其他拥挤的系统一样，代谢物的扩散受到微生物细胞和其他固体成分存在的负面影响，这些成分减少了分子运动的可用空间。通过解决扩散方程，可以计算整个系统代谢物的重新分布(8)
每个盒子的有效扩散由[25]给出，水和γ中的扩散系数在哪里遇到使用 SPT（Eq 3）计算。
在本文中，通过应用半隐含的曲柄-尼科尔森 （CN） 方法[26]或莱迪思·博尔兹曼方法[27]的拥挤版本来解决扩散方程，请参阅S1 文本代谢物扩散中的细节。cLBM 允许计算分子的平均平方位移 （MSD），这对于异常扩散[36]的研究很有用。
（三） 微生物细胞的空间分布
微生物细胞的行为及其与邻近细胞的相互作用由IbM规则模拟，该规则作为一个整体将决定微生物系统的进化和空间分布。每个个体的细胞属性，如框位置ijk ，M细胞，R细胞（分别为 Eqs 6和7）和代谢表型Phen在每次步骤中都会被跟踪。Phen是根据从 TFA/NN 获得的交换代谢通量和阈值θ = 10 计算的?4毫米醇gDW-1h-1.
(9)
当M时可能发生对称或不对称的细胞二分体细胞达到最大干质量M最大值.女儿细胞被分配在随机相邻的盒子里，旁边是留在当前网站ijk的母亲细胞。当所有相邻的盒子都被细胞占据时，女儿细胞将推/置换邻居的细胞。或者，当M时细胞在饥饿条件下死亡细胞小于最低干质量阈值M最小，sp.此外，细胞的随机或偏向行走也可以纳入模拟中。请参阅S1 文本 IbM规则中的详细信息。
克罗米斯框架在马特拉布 R2018b 中实施。代谢通量可以使用NN或TFA计算。TFA 代码可在https://github.com/EPFL-LCSB/mattfa提供。NN 培训所需的代谢通量样本使用 TFA 和 CPLEX 解算器进行计算，并且使用 Matlab 深度学习工具箱进行培训。
案例研究
社区模型1：E.大肠杆菌K12 Δ梅特布和S.肠。
社区由E.大肠杆菌K12 Δ梅特布和S.肠膜分泌突变体在2D系统上模拟，CN晶格为200×200盒（S1无花果）[19]。每个 CN 盒由侧面Δx组成快递 之 家=0.05毫米，高度为Δ z快递 之 家，这是为了获得所需的初始拥挤条件（即细胞占用的体积分数，V奥克).因此，参数Δ z快递 之 家计算为。CN 晶格叠加在 400 x 400 盒Δx的 IbM 晶格上伊布姆=0.025毫米和高度Δ z伊布姆=Δ z快递 之 家，其中每个CN盒包含四个IBM盒。t Δ的时间步骤被设置为Δ t=Δ t 快递 之 家=1.25 s.十个细菌斑点被随机接种E。大肠杆菌和S。肠子的比例为1：99或99：1。一个细菌点含有400个代谢菌分配在400个IBM盒。代谢细菌是同一物种细菌的集合，其大小和代谢能力相同，可以向同一方向移动（扩散）。每个代谢的初始质量使用平均值 4.89 x10 的正常分布进行随机化-13gDW和标准偏差1.32 x 10-13gDW [37] 对单个细胞有效，这乘以代谢（元）中的细胞数量。元B被计算为选择Δ z的框高度的函数伊布姆，即元=0.52Δ x伊布姆Δy伊布姆Δ z伊布姆/(M最大值υsp），其中因子 0.52 表示方格中球形细胞的最密集包装。每个细菌点总共含有3×10的生物量?7gDW.细胞的体积被认为与其质量成正比。细胞物种被允许通过扩散穿过格子。系统的参数在表1中给出。
表1。用于模拟社区模型 1 和 2 的参数。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009140.t001
乳糖和O2系统分别保持292m和0.21 mM的恒定有效浓度。其他代谢物，如乳糖、醋酸盐和甲氨酸，只有在微生物物种合成时，系统中才能获得。所有代谢物都允许通过四个边界从系统中逸出，其中代谢物浓度被设定为零。细菌物种采用零扩散通量边界。每个 CN 盒和 IbM 盒内都假设了混合条件。所有模拟都复制了 5 次。代谢物的扩散是使用CN方法计算的。
创业板模型为甲氨酸分泌S.肠和E。大肠杆菌ΔmetB是哈科姆等人描述的[19]建造的。对于E.大肠杆菌iJ01366核心[45]，由环菌素-γ合成酶催化的反应被阻止在创业板模型，以防止甲氨酸的合成。对于S.肠iRR1083[46]，生物质反应被修改为消耗0.5 mmol gDW-1细胞内甲氨酸平衡，由产生相同量的甲基氨酸，将分泌到介质。此外，模拟S.肠子（见下文），甲氨酸的比例：生物质（r甲基苯丙胺）在生物质反应被限制为0.5或0 mmol gDW-1.这样，不同的亚人口特征是甲氨酸生产，其中一个细胞与r甲基苯丙胺=0对应于S。肠野生类型（WT），不分泌甲基安（确定为甲基），而r-甲基苯丙胺= 0.5 对应于甲氨酸分泌S。肠突变体（甲烷）。+
为了减轻IbM模拟的计算负担，CROMICS 使用 NN 近似于代谢细菌的代谢活动。为此，使用v为每个物种创建了2个隐藏层和15个神经元的NN生物和vf，前，遇见由 TFA 计算 30，000 个通量样本（参见S1 文本神经网络作为代谢通量计算的替代方案）。对于E.大肠杆菌，NN输入是上通量限制v美国f乳糖、乳糖、醋酸盐和O2.简单来说，只有一个NN为所有S训练。肠子人口。为此，培训数据是通过随机修改r计算的甲基苯丙胺到0.5或0。因此，对S的估计。肠代谢（对于TFA和NN）需要作为输入v美国f醋酸盐，乳糖，O2，也r甲基苯丙胺.皮尔逊相关系数和规范化平均平方误差（nmse）估计为 0.9982 和 6.4 x 10?3对于E.大肠杆菌，和1和4.47 x 10?4对于S.肠子，分别（S2和S3无花果）。
NN 显著缩短了代谢通量估计所需的运行时间，例如，大约 0.04 s 计算了 10，000 种细菌的交换通量（基于E的 GEM 模型）。大肠杆菌）在 12 核英特尔 Xeon E5 中使用 Matlab， CPU 2.7 GHz. 相比之下， TFA 用于代谢分布并行计算所需的运行时间 （通过最大化增长率v生物，使用CPLEX）的类似细菌数量约为93分钟，而随着创业板型号的减少[47]，所需的时间是32分钟。因此，NNs 降低了与细胞代谢反应相关的计算成本，在需要精细时间盘点化 Δ的时态模拟中，需要大量的细胞和/或当使用的代谢模型计算成本高昂（例如新陈代谢和大分子表达的基因组比例模型）。然而，培训NNs需要事先了解物种之间交换的普遍代谢物，以选择最重要的代谢物来跟踪。在更复杂的问题（例如，当一个物种的代谢通量分布对少量的多个基材非常敏感时）中，使用 TFA 或其他基于气压计的模型可能更合适。
作为第二个案例研究，我们模拟了E.大肠杆菌Δ甲B和两个S。肠道亚种（物种比50：50）。系统中随机接种了20个细菌斑点，其尺寸与之前描述的相似。每个点代表200种E的代谢物。大肠杆菌和200个甲状同位。只有一个点（殖民地A）含有甲基代谢。测试了三种不同的甲基代谢初始数量：70、60和50代谢。所有代谢菌均在斑点中随机分配。-++
社区模型2：E.的EPS分泌突变体。大肠杆菌。
两个E的增长。葡萄糖和有氧条件下的大肠杆菌生物膜（鉴定为贝普斯和贝斯）在3D系统中模拟。生物膜贝普斯是由（非EPS分泌）野生类型的细胞和突变体组成的，这些细胞和突变体被确定为分泌0.11克的eps+++++DW-1EPS，而生物膜贝普斯含有WT和突变体确定为eps分泌0.43克g++++DW-1每股收益。我们假设1克EPS的合成代谢成本与1克相同DW生物质。
CN-晶格由11 x 11 x 34立方箱（V）定义CN 盒=1.4 x 10?6毫米3），而IbM-晶格分为22×22×68立方盒的Δ×=5.7×10?3毫米每边（即，V伊布姆盒子=1.8 x 10?7毫米3).每个 CN 盒包含 8 个 IbM 盒，最多可分配 1 个 IbM 盒。考虑到eps和eps累积EPS，因此可以在IBM盒中分配细胞数量较低，因此每个代谢细菌的细胞数被计算为元B+++sp=0.52Δx伊布姆Δy伊布姆Δ z伊布姆/(M最大值υsp+M每股收益，spυ每股收益），其中分母表示由物种sp细胞占用的最大体积和由此分泌的EPS。我们假设每股收益M每股收益，sp存在于一个盒子里是成正比的细胞质量，因此和eps突变体，而M每股收益，WT=0用于非EPS分泌WT。因此，一种代谢代表WT的27个细胞，20个eps细胞和12个eps细胞。细胞和EPS在一个盒子里所占的体积与这三种物种相似。然后通过乘以M获得最大的代谢细菌质量（或进行细胞分裂的质量阈值）+++最大值单个细胞 （表 1） 由元Bsp.
在生物膜贝普斯和贝普斯，系统初始化与1，220代谢随机分配在系统的底部，生物膜的左侧是由610 E组成。大肠杆菌WT细胞，而等数eps突变细胞位于右侧。与以前的社区模型一样，每个代谢细菌的初始质量是随机从相同的正常分布中获取的。我们假设细胞附着在生物膜上，它们的运动仅仅是由于细胞推挤，即D+++sp=0。 Δ t=Δ t快递 之 家=10.83毫秒。
在代谢物和细菌物种的x和y方向中假设了周期边界条件，而系统底部则位于零扩散通量。葡萄糖和O的营养物质2从边界顶部供应，其中5毫米的葡萄糖和0.21米的O浓度2保持恒定。代谢物和细胞都不允许通过顶部边界离开系统。所有CN盒都含有相当于5毫米葡萄糖和0.21立方米O的初始营养物质2.代谢物的扩散是使用 cLBM 方法计算的。
所有分子（代谢物、EPS和细胞）都假定为球形形状，体积与其分子重量成正比（参见S1文本Eq S3）。在模拟中，只有分子量大于400 Da的大分子体积被明确考虑。所有模拟都复制了 5 次。
与以往的案例研究一样，EPS突变体的创业板模型可以从E构建。大肠杆菌WT iJ01366[47]通过修改生物质反应产生0.11克DW-1或0.43克DW-1将分别通过eps和eps向媒体隐分的EPS。使用 TFA 为 GEM 模型计算的 30，000 个通量解决方案创建了 2 个隐藏层的 NN，每个层有 15 个神经元。NN的输入是上通量限制v+++美国f葡萄糖、醋酸盐和O2.皮尔逊相关系数估计为1，nmse为2.4 x 10?5 (S4 无花果）。
计算社区模型中的物种健身
模拟结束时，物种sp的平均适应度或生长被计算为(10)其中ρsp(t）是物种的总生物量sp在t，和t模拟是最后的模拟时间。此外，在与sp2的竞争中，物种sp1的相对适配性可以计算为(11)医学论文发表-
支持信息
大肠杆菌Δ甲B和甲氨酸分泌突变体。肠尼卡财团。
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S1 无花果。大肠杆菌Δ甲B和甲氨酸分泌突变体。肠尼卡财团。
（A） 微生物群落在二维系统中的示意图表示。（B， C）由CROMICS、彗星和实验观测预测的物种比例趋同在48小时后为初始组成E。大肠杆菌： S.肠 （B） 99：1 和 （C） 1：99.
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009140.s001
（蒂夫）
S2 无花果。神经网络 （NN） 和热力学通量分析 （TFA） 估计的代谢通量的均等和残留图。大肠杆菌Δ梅贝。
为了训练一个拥有2层15个神经元的NN，使用了30，000个通量样本。培训数据是通过假设乳糖的接受通量，O获得的2和甲氨酸，细胞产生醋酸盐，乳糖和增长率的平均通量值。Pearson 相关 r 估计为 0.9982，而 TFA 和 NN 预测的通量之间的规范化平均方差估计为 6.4 x 10?3.通量vf在毫米g中给予DW-1h-1，和v生物在 h-1.
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009140.s002
（蒂夫）
S3 无花果。NN 和 TFA估计的代谢通量的平价和剩余地块。肠。
为了训练一个拥有2层15个神经元的NN，使用了30，000个通量样本。培训数据是通过假设醋酸盐、乳糖、O的被给予吸收通量而获得的2，和甲氨酸：生物量比r甲基苯丙胺，细胞产生甲氨酸的平均通量值和生长速度。Pearson 相关性 r 估计为 1，而 TFA 和 NN 预测的通量之间的规范化平均方差估计为 4.47 x 10?4.通量vf在毫米g中给予DW-1h-1，和v生物在 h-1.
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009140.s003
（蒂夫）
S4 无花果。NN 和 TFA 估计的代谢通量的平价和剩余地块为E。大肠杆菌瓦特。
为了训练一个拥有2层15个神经元的NN，使用了30，000个通量样本。培训数据是通过假设葡萄糖和O的放弃吸收通量获得的2，细胞产生醋酸盐的平均通量值和生长速率。Pearson 相关性 r 估计为 1，而 TFA 和 NN 预测的通量之间的规范化平均方差估计为 2.4 x 10?5.通量vf在毫米g中给予DW-1h-1，和v生物在 h-1.通过修改生物质反应产生 0.11 g， 构建了 eps 和 eps 突变体的 Gem 模型+++DW-1和0.43克DW-1将秘密到媒体的EPS。相比之下，当使用相同的代谢上通量限制时，TFA计算突变体的增长率是，而其他代谢通量（葡萄糖，O）2，醋酸盐）预测是相同的三个类型E。大肠杆菌。因此，为了简单起多大，为WT创建的NN被修改为代表eps和eps，通过乘以原始NN计算的生物质+++瓦特乘以0.9和0.7。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009140.s004
（蒂夫）
S1 文本。克罗米斯使用的考虑和方法。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009140.s005
（文档）
确认
作者要感谢柳比萨·米斯科维奇博士和凯西·巴特勒博士对这份手稿校对的宝贵意见。
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