医学论文发表-马拉维疟原虫分离物全基因组分析确定临床疟疾的等位基因特异性免疫的可能目标

· 扎拉克·沙阿

· 明德，

· 卡拉·摩瑟

· 马修·亚当斯

· 安德里亚·布赫瓦尔德

· 安基特·德维维迪

抽象

在反复感染恶性疟原虫后，个人获得临床疟疾的免疫力。对疾病的免疫力被认为反映了对多种寄生虫抗原中多种等位基因的反应。在以前的研究中，我们通过研究纵向跟踪的个体中的抗原等位基因动力学，确定了与寄生虫免疫逃避相关的单个抗原中的多态位点。在这里，我们利用马拉维纵向研究中代表疟疾病例的140种寄生虫分离物的全基因组序列数据分析全基因组多态性，并确定25个基因，这些基因编码了自然获得的免疫力的可能目标，这些目标应在免疫学上得到验证，并进一步确定它们作为疫苗候选者的潜在特征。

作者摘要

每年有数以亿计的疟疾病例导致数十万人死亡。在疟疾流行地区传播率高，个人在一生中多次患疟疾，在多次感染后，发展免疫力，防止症状。获得免疫力所针对的蛋白质并不完全为人所知。了解哪些蛋白质是保护性免疫反应的目标可能有助于疟疾疫苗的开发。在这里，我们利用从马拉维有症状的个人那里收集的疟疾寄生虫的全基因组序列数据，根据不同免疫水平的人和个体中观察到的不同序列变异的频率来确定疟疾免疫的目标。利用这些方法的综合结果，我们确定了编码25种蛋白质的基因，这些蛋白质可能是疟疾临床免疫的目标，这些蛋白质将在未来的研究中进一步研究它们作为疫苗候选抗原的潜力。

引文：沙祖、南MT、摩泽尔卡、亚当斯M、布赫瓦尔德股份公司、德维迪A等人（2021年）对马拉维疟原虫分离物的全基因组分析确定了对临床疟疾的等位基因特异性免疫的可能目标。普洛斯基因 17 （5）： e1009576.https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009576医学论文发表-

编辑：泰恩·克拉克，英国伦敦卫生和热带医学学院

收到：2020年11月6日：接受：2021年5月4日：已发布：2021年5月25日

版权所有：2021年?沙阿等人。这是一个开放访问文章，根据《知识共享归属许可证》的条款分发，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到记分。

数据可用性：NCBI 可根据S6 表中列出的项目编号和加入编号提供测序数据。

资金：这项工作得到了国家卫生研究院授予的以下奖项的资金支持：R01AI101713 （ST-H）、R01AI125579 （ST-H）、R01AI141900 （JCS）、U19AI110820（PI： 弗雷泽， 项目负责人：JCS、K24AI114996（MKL）和马拉维疟疾国际卓越研究中心U19AI089683（DPM），以及国家卫生和医学研究理事会颁发的奖项：NHMRC APP1161066（AEB，ST-H）。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或编写手稿方面没有作用。

竞争利益：作者宣称不存在相互竞争的利益。

介绍

尽管最近在减轻疟疾负担方面取得了进展，但这种疾病仍然是全世界死亡的主要原因，2019年估计造成409 000人死亡[1]。在恶性疟原虫传播高的地区，个体对疟疾具有免疫力[2]。这种免疫力不能提供无菌保护，防止所有感染，但降低临床疾病的风险，并随着年龄的增长而增加，因为个体反复接触寄生虫[3，4]。这种与年龄相关的疾病免疫模式被认为反映了对多种寄生虫抗原中多种等位基因的免疫反应的需要[2、3、5、6]。P.猎鹰表面抗原被认为是几千年来作为寄生虫免疫逃避的一种手段进化而来的[7]。已证明对几种寄生虫抗原[8-15]有等位基因特异性免疫反应。在以前的工作中，我们检查了纵向后在个体中反复感染的寄生虫等位基因，并确定了寄生虫表面抗原（即AMA1和MSP1）中的特定多态位点，其中氨基酸的变化与免疫逃生和疾病风险增加有关，这与这些抗原的免疫力特异性获取一致[16，17]。此外，与自然寄生虫种群中观察到的不同等位基因（17-20）相比，基于单一抗原等位基因的疟疾亚单位疫苗对寄生虫的疗效更高，与疫苗菌株匹配的等位基因。当疫苗靶向等位基因在寄生虫人群中处于低频时，这种等位基因特异性疫苗的疗效可能导致疫苗整体疗效不佳，并可能导致选择能够逃逸疫苗的非疫苗等位基因[18]。克服这种情况可能需要设计一种多价疟疾疫苗[18]。然而，这种疫苗的设计受到不完全了解的阻碍，即寄生虫蛋白是获得自然免疫的目标。

允许在流行病学尺度上进行全基因组测序的技术的出现，使研究人员能够从单一抗原调查过渡到进行全基因组筛查，以确定可能参与获得疟疾保护性免疫力的位点，包括未知功能的未知基因编码产品[21，22]。虽然以前在P.这些研究根据平衡或多样化选择在人口层面（23-27）的基因组特征来识别免疫靶点，这些研究与流行地区个体的已识别特征与临床结果无关，因此很难将此类特征与免疫选择直接联系起来。此外，严格基于免疫方法确定保护相关性具有挑战性，因为很难区分反射暴露与保护的反应[28]。我们扩展了以前的方法，我们检查了疫苗抗原等位基因的动态，随着时间的推移，个人反复感染与症状的发展[16，17]，我们比较了从P生成的全基因组序列数据。在马拉维进行的纵向队列研究中，从参与者那里收集了恶性疟原虫感染，以确定对疟疾的等位基因特异性免疫的目标。具体来说，我们比较了不同疟疾免疫力水平的个体中出现症状感染的寄生虫等位基因的频率，以确定显著差异化的部位，并比较了个体内部重复感染中的等位基因与个体之间的等位基因，以确定个体内部变化最大的多态性位点。使用这两种方法确定的基因被认为是可能的免疫靶点，并进一步检查其作为疫苗候选者的潜力。作为我们方法在确定等位基因特异性免疫反应目标方面效用的概念的证明，我们比较了不同水平疟疾免疫力的个体中已识别的抗原之一（以前被认为是潜在疫苗候选者）中等位基因的频率，以测试一个假设，即免疫力较强的人在感染寄生虫时会生病，而寄生虫的等位基因较罕见，而他们尚未发展免疫力。医学论文发表-

结果

参与者/感染特征和免疫状态定义

为了确定对疟疾的等位基因特异性免疫目标，我们从马拉维纵向队列研究参与者中收集的140个寄生虫分离物中生成了全基因组序列数据[29]。

虽然年龄经常被用作高传播区（14、30-32）免疫状态的代名词，但该指标并未解释在传染性蚊虫叮咬的异质接触，在流行地区[33-38]观察到。为了更好地解释个别层面的异质性接触，我们使用两年研究期间有症状的总感染比例来分类免疫状态，使用中位数作为截止点来定义高免疫和低免疫组。虽然这些群体由年龄范围的人组成，但高免疫力组个人的中位年龄（13.2岁）明显高于低免疫组个人的中位年龄（7.3岁）（p-值 =0.0002、威尔科森-曼-惠特尼测试）（图1和表1），如马拉维等高疟疾传播环境所预期的那样。

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图1。症状感染比例与年龄之间的关系。

散射图（包括线性回归线（蓝色）显示了在研究过程中，每个人的症状感染比例与个人入学年龄之间的关系。虚线显示症状感染的中位数比例，用于定义高免疫和低免疫组。

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表1。高免疫和低免疫组的参与者/感染特征。#

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在高免疫和低免疫组之间的比较中，每个个体只包括一种感染，选择样本是为了减少感染之间的时间变异性（见方法）。使用DEploid-IBD[39]来估计感染中每个寄生虫克隆的比例。没有主要克隆的感染（即大多数克隆的频率在感染<60%）被定义为复杂感染。虽然大多数克隆的中位频率在两个免疫组（S1无花果，p值=0.34，威尔科森-曼-惠特尼测试）的感染之间没有显著差异，但高免疫组的复杂感染（n = 7）比低免疫组（n = 2）更多。这九种复杂的感染被排除在进一步分析之外，以避免因感染复杂性和可能促成临床疾病的等位基因的误分类而混淆。

高免疫组感染的寄生虫密度中位数明显低于低免疫组（表1，p值=7.74 x 10）?06，威尔科森-曼-惠特尼测试）。然而，寄生虫基因组的覆盖率至少为20倍（表1，p值=0.27，威尔科森-曼-惠特尼测试），或在两组感染产生的全基因组序列数据之间，寄生虫基因组的平均深度（表1，p值=0.25，威尔科森-曼-惠特尼测试）的百分比没有显著差异。

区分对临床疟疾免疫力不同的群体

我们假设，由于等位基因特异性免疫反应，对疟疾具有更高保护免疫力的个人在感染寄生虫种群中较稀有的寄生虫抗原等位基因时会遇到疾病，而寄生虫种群中已经对在人群中循环的更常见的等位基因发展了免疫力。因此，我们期望在高免疫力和低免疫力的个体中，抗原等位基因之间有显著的遗传差异，而叶子是等位基因特异性免疫的目标。

为了检验这个假设，赖特的固定指数（F）圣），两个种群之间的遗传分化测量[40]，估计每个非同义单核苷酸多态性 （SNP）， 以确定寄生虫之间的基因分化位点从高和低免疫组与意义阈值确定通过重新采样 （10，000 排列）.我们确定了寄生虫基因组中的160个位点（在145个基因中），这两个免疫组（p值≤0.009，无花果2A和S1表）显著差异。55个基因含有显著分化的位点（38%）编码与任何计算或策划的分子功能或基于基因本体论（S1表）的生物过程无关的未知功能蛋白质。这145种基因产品包括一些以前被确定为潜在疫苗候选的蛋白质，包括AMA1（阿皮膜抗原1）[17，20]， ASP （寿司蛋白， PF3D7_0405900）[41]，CLAG8 （细胞相关无性蛋白 8， PF3D7_0831600）[42，43]， SLARP （孢子虫和肝脏芦笋丰富的蛋白质， PF3D7_1147000）[44]和未知功能的保存蛋白 （PF3D7_1359000）[45]。医学论文发表-

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图 2.寄生虫与高免疫力之间的遗传分化与。免疫力低的群体。

a） 全基因组遗传分化（F）圣）免疫力较高的人的寄生虫与。免疫力降低。每个点表示一个可变的非同义词站点。结果被绘制为日志10 p-y轴上的值。每个点的颜色表示F圣值，较暗的点表示更高的F圣值。虚线表示统计意义（p值= 0.0095），p值由排列确定。b） 核苷酸多样性，用于使寄生虫中的核苷酸多样性与免疫力较高和免疫力较低的个体显著区分。c） 基于整个基因组序列中 SNP 的单个单个平均等位基因频率的盒图，这些序列与 （a） 显著区分了 SNP。红色表示高免疫力组，蓝色表示低免疫组。

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为了进一步检验这样一种假设，即免疫力较强的人在感染寄生虫时会出现症状，这些寄生虫具有寄生虫种群中较稀有的抗原等位基因， 我们估计了寄生虫中寄生虫中显著区分的非同义位点的核苷酸多样性，并观察到与低免疫组寄生虫（图2B，p值=4.74x 10）相比，高免疫组寄生虫的核苷酸中位多样性显著增加?05，威尔科森-曼-惠特尼测试）。此外，我们估计了每个感染中明显分化的部位和全基因组变量位点的平均等位基因频率。全基因组变异位点等位基因的中位频率在免疫组之间没有显著差异（图2C，p值=0.88，威尔科森-曼-惠特尼测试）：相比之下，在分化部位，与低免疫组（图2C，p值=0.007，威尔科森-曼-惠特尼测试）相比，高免疫组的等位基因中位频率明显较低。这些结果与高免疫组的个体与低免疫组中感染具有更常见等位基因的寄生虫不同的情况一致。

在23种多克隆感染中，我们还比较了主要和次要克隆在显著分化的部位和全基因组可变位点之间不匹配的等位基因的比例，以评估这些克隆在被认为与免疫相关的部位是否不同。我们观察到，与全基因组变量位点（S2无图，p值=8 x 10）相比，在差异化部位感染的主要克隆和次要克隆之间的不匹配中位数比例要高得多?05，威尔科森-曼-惠特尼测试），符合以下假设，即主要克隆代表一种突破性的感染，它逃脱了等位基因特异性免疫反应，维持在亚夹层水平的小克隆。

个人内部的洛西比个人之间的差异更大

我们预计，与在不同个体中引起感染的寄生虫相比，等位基因特异性免疫反应将导致寄生虫在个体内造成多重症状感染的遗传差异比例更大，而寄生虫是免疫目标。为了确定寄生虫基因组中发生在个体与个体之间感染中最不同的区域，我们比较了基因组中每个可变非同义位点的均质状态，在个体和个体之间采样对之间，并估计了每个组每个部位的不匹配比例（图3A）。图 3B（另见S3A 图）显示了两组之间所有非同义可变站点之间不匹配比例的分布（减去）。每个站点的不匹配比例差异的中位数和模式等于零，表明大多数站点的个人内部和个人之间不匹配的比例没有差异。一对感染天数与不匹配比例之间没有显著相关性（S3B图，Pearson的相关性r =0.065，p值=0.3），表明时间在分析中不是一个重大的混淆因素。我们进一步检查了个人内部差异最大的前1%的站点，与个体之间相比，其中包括位于173个基因（S2表）中的223个SNP。68 （39%）在这173个基因编码的未知功能蛋白质，与任何计算或策划的分子功能或生物过程基于基因本体论，和至少15（8.7%）编码的蛋白质，以前已被确定为潜在的疫苗候选。

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图 3.分析个人内部和个人之间配对样本中的不匹配。

a） 与人群中随机对寄生虫（个体之间）相比，分析的插图，以识别基因组中寄生虫随时间而导致同一个体内疾病的区域变化更大。b） 在组内和组之间错配等位基因比例的分布差异。差额计算为组内每个非同义SNP中的不匹配比例减去组之间每个非同义SNP中的不匹配比例。虚线黑线表示与组之间相比，组内最不同的 1% SNP 的阈值。

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洛西通过两种分析方法确定为可能的免疫目标

两种分析方法都发现了25个基因，其中11个（44%）编码功能未知的蛋白质（表2）。根据公开的数据，25个基因中的20个在寄生虫生命周期的红细胞阶段有中度到高位的表达[46]（S3表）。八个基因的突变指数得分接近零，表明它们可能是必不可少的[47]，至少有 12 个基因有已知或预测的跨膜域或信号肽[48]（S4 表）。在这25种基因产品中，有蛋白质，其假定功能使他们成为生物学上合理的疫苗候选者，包括SURFIN4.2（被认为在红细胞入侵期间参与形成移动的结）[49]，以及蛤和磷多基因家族的成员（都被认为在寄生虫细胞遗传方面发挥作用）[50，51]。

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表2。基于两种分析方法，基因产品被确定为疟疾等位基因特异性免疫的可能目标。

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作为我们识别等位基因特异性免疫目标方法效用的概念的证明，我们使用了来自Pf3K[52]的公开序列数据，以及来自巴布亚新几内亚 （PNG）[53，54]来自疟疾根P的 156 个序列。法尔西帕鲁姆社区项目[55]以检查clag8中的全球多样性，这是 25 个先前被认为是潜在疫苗候选的基因之一，并发现了高核苷酸多样性、Tajima 的 D 和Clag8C 终端区域的隔离点数量。在比较马拉维收集的寄生虫与世界其他地区寄生虫的数据（图4A）时，这种模式是一致的。使用来自多个地理区域的clag8序列生成的单体型网络没有显示区域适应的证据 （图 4B），包括低F圣来自非洲、亚洲和巴布亚新几内亚（S5 表）的clag8序列之间的值。对CLAG8蛋白质序列的进一步分析显示高蛋白紊乱和B细胞表位位的区域，特别是在C-终端区域（S4图）。为了检验我们最初的假设，即免疫个体在感染寄生虫种群中更稀有的寄生虫抗原等位基因时会生病， 我们比较了基于不同免疫水平个体中基因C-末期区域的克拉格8单体型的频率，并观察到高免疫组个体中导致疾病的寄生虫往往具有与低免疫组个体相比频率较低的克拉格8单体型，尽管其意义是边缘（S5无花果，p-值=0.09， 威尔科森-曼-惠特尼测试）。医学论文发表-

下载：图4。克拉格8的全球多样性。

a） 泰吉马的D沿克拉格8基因在泰国，巴布亚新几内亚，马拉维和加纳的样本。虚线红线代表塔吉马的 D 值（≥ 2）的正值，暗示着平衡选择。b）使用P.猎鹰序列数据。

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讨论

先前的研究表明，有证据表明，等位基因对P.单一基因或蛋白质中的恶性疟原（8-10，12，16，17），已被确定为潜在的疫苗抗原基于传统的疫苗学方法， 经验上识别免疫原蛋白。其他研究已经进行了全基因组筛选，以平衡选择的基因组特征来识别抗原，但与临床结果无关，这些临床结果可能将特定特征与保护性免疫反应[23-27]联系起来。在这项研究中，我们进行了全基因组的、个人层面的分析，以确定使用P对临床疟疾的等位基因特异性免疫的目标。通过识别对疟疾免疫水平不同的个体和寄生虫在导致同一个体与个体之间疾病的最不同的基因组区域之间进行基因分化的寄生虫基因，从而确定恶性疟原虫全基因组序列数据。通过分析方法和编码对临床疟疾的等位基因特异性获得免疫力的可能目标，包括被认为与红细胞入侵和细胞遗传性有关的基因等功能，确定了25个基因。对clag8的全球多样性的检查（一种编码了以前被认为是疫苗候选的蛋白质的蛋白质）的基因，提供了该基因 C 端区域免疫选择的证据，并没有表明可能表明局部适应或遗传漂移的地理差异。与等位基因特异性获得免疫力的假设一致，在免疫力较强的个人中引起疾病的寄生虫的clag8单体型与免疫力较低的个体相比，频率较低。这些发现支持了我们确定等位基因特异性免疫目标以及进一步调查这25个位点作为潜在疫苗候选者的方法的效用。

在这项研究中，我们估计了感染的遗传复杂性，并观察到免疫力较高的群体中的人通常比免疫力较低的人感染更复杂。虽然在统计学上没有显著性，但这种模式与其他研究的结果大致一致，这些研究报告了感染复杂性与年龄和/或疾病风险之间的关联[16，56]。免疫力较高的个体感染的复杂性更大，这与免疫个体能够在亚细胞水平上维持一些寄生虫克隆的想法一致，并可能表明多克隆感染在通过连续接触不同菌株[57，58]来维持免疫力方面可能发挥的作用。或者，两组人之间感染复杂性的差异也可以反映社区内的传播水平，而不仅仅是免疫力的反映。在我们的数据集的多克隆感染中，我们观察到，在我们的分析中，在被确定为潜在免疫目标的部位，主要克隆比小克隆的等位基因更有可能具有不同的等位基因。这一发现与以下假设一致：少数克隆通过获得免疫力维持在亚克隆水平，而主要克隆人能够逃脱免疫反应（因为它有未识别的等位基因），导致症状感染。在下游分析之前，排除了缺乏主要克隆的感染，以避免因感染复杂性和可能导致疾病症状的克隆人分类错误而混淆。排除缺乏主要克隆体的感染导致从高免疫组中清除的感染比例高于低免疫组，这可能导致高免疫组寄生虫多样性的低估。然而，我们认为这种低估并没有影响我们的结论，因为即使在排除了这些高度复杂的感染之后，高免疫组内的感染在差异化的部位也明显更加多样化。

我们假设，对疟疾免疫力较高的人，如果感染了在当地寄生虫人群中具有较低频率的蛋白质变异寄生虫，就会有更大的疟疾症状风险，因为他们已经获得了对更常见等位基因编码的变种的免疫力。当我们估计两个免疫组中不同程度的细胞的核苷酸多样性时，我们发现与免疫力较低的群体相比，免疫力较高的群体的多样性显著增加。这种多样性的差异可能反映了这样一个事实，即免疫力较高的个体有寄生虫等位基因的症状感染，这些寄生虫等位基因在人群中更为罕见，因此在有区别的位点更可能彼此不同。我们的发现也支持了这种情况，即感染等位基因的中位频率在更多的免疫个体中明显低于在检查分化的位点时免疫力较低的个体。这些结果还表明，在疫苗设计中，对稀有等位基因进行核算非常重要，因为它们也可能导致疫苗引起的免疫力的逃避。

平衡选择特征的全基因组筛选之前已经确定了我们在这项研究中发现的25个基因中的一部分，包括来自冲浪和phist多基因家族的PF3D7_0710200、clag8和其他基因[23-25，27]。PF3D7_0710200，一种编码未知功能的保存蛋白的基因，被四个独立的研究确定为潜在的免疫目标[23-25，27]：然而，人们对这种蛋白质的功能知之甚少。事实上，25个基因中的11个（44%）在这项研究中，识别了功能未知的蛋白质，突出了进一步的基因筛选的重要性，以确定这些基因的作用，这些基因占寄生虫基因组的35%[59]。最近的一项研究表明，大多数参与宿主-寄生虫相互作用的基因，包括许多已知的抗原，都是非必不可少的[47]：然而，在这项研究中发现的25个基因中，有8个将被视为基本基因，基于它们的低诱变指数得分[47]。这些基本基因可能是有吸引力的疫苗目标，因为功能上的冗余可能较少，使寄生虫能够适应和逃避疫苗引起的抑制。

作为我们确定等位基因特异性免疫目标的方法效用的概念的证明，我们进一步研究了25个已确定的基因之一clag8的全球多样性，该基因以前被认为是疟疾疫苗候选者。clag8属于克拉格多基因家族，是克拉格家族中研究最少的基因之一。clag8在红细胞入侵后的最初几个小时（早期环形阶段）中表达强烈，显示从入侵后的5小时减少到35小时，然后在分裂阶段[46]增加表达。它被认为是罗普复合物的一部分，由罗氏1/克拉格基因家族的成员组成。RhopH复合物是一种红细胞结合蛋白复合物，已被建议在寄生磷蒸发物[43，60，61]的建立中发挥重要作用。先前的研究已经报告了这一基因选择积极多样化的证据，核苷酸多样性高，每个部位的非同义替代物比例很高（dN) [43]. 我们对克拉格8多样性的全球分析显示，该基因的C-终端区域具有高核苷酸多样性和Tajima的D值，以及高蛋白紊乱的证据，并预测了该蛋白质C-终端区域的B细胞表皮，表明它很可能具有免疫原性[62]。这些结果在数据集所包括的所有国家都是一致的，这些数据集代表寄生虫分离出三个主要疟疾流行地区[52]。此外，clag8单体型没有显示地理适应的证据，在所有地理区域都观察到主要的单体型，并且似乎聚集成三个主要组。需要进一步研究，以确定蛋白质内的功能表位和潜在的交叉反应，以确定是否可将相关的单体型组合成血清型，以便设计一种具有广泛保护性的疫苗。在个人层面上，为了支持我们的总体假设，对疟疾免疫力较高的个人感染了clag8单体型，与感染免疫力较低的个体相比，clag8单体型感染频率较低。医学论文发表-

值得注意的是，我们基于这两种分析方法的基因组合列表不包括领先的血期疫苗候选者，如AMA1和MSP，尽管其中一些基因是在单一方法中发现的。使用蛋白质微阵列，克兰普顿等人。发现抗体对领先的疫苗候选者（如AMA1、MSP1和MSP2）的反应没有区分那些受到预防临床感染的个人与那些不在马里（15岁）人群中的人，这表明对这些蛋白质的反应可能不是临床免疫力的主要驱动因素。其他研究[17，63，64]支持了这样一个假设，即对抗原（如AMA1）的反应有助于过敏细胞特异性临床免疫力，但可能是短暂的。在我们的分析中，个人体内的感染对不一定是连续感染，感染时间从27天到696天不等。虽然我们没有看到等位基因不匹配的比例与一对感染之间的天数之间有显著的相关性，但我们可能无法识别参与等位基因特异性免疫获取的抗原，这些抗原会引起短暂的免疫反应。可能需要对样本量较大的研究来区分具有不同抗体动力学的抗原。

此外，本研究中的分析只包括核心基因组，因为我们在测序前使用选择性全基因组扩增来丰富寄生虫DNA，这已被证明导致端粒和中微子区域测序覆盖率低[65，66]。将分析限制在核心基因组上，可能使我们无法确定对临床疟疾免疫力发展可能很重要的多基因家族成员，因为许多这些基因位于基因组的这些低覆盖率区域。然而，由于多基因家庭与严重疟疾有牵连，对这些不同抗原的免疫力可能与预防严重疟疾而不是简单疟疾更相关。

这项研究的其他局限性包括无法检查无症状感染，因为难以从这些低寄生虫血症感染中获取全基因组序列数据，以及关注SNP数据与其他类型的变种（如英德尔或结构变异）相比，这些变种也有助于等位基因特异性免疫。具体来说，我们的方法不会检测到在一些已知疟疾疫苗抗原的重复区域观察到的过敏性二态，如MSP1和MSP2[67]。这种低复杂性区域很难使用短读测序数据解决，因为跨越这些区域的读数并不与参考基因组单独映射。使用长读测序平台对特定基因进行有针对性的测序，可以测序无症状感染，并检查其他类型的变异对等位基因特异性免疫力的贡献。

在这里，我们描述了一种很有前途的全基因组方法，以确定对临床疟疾的等位基因特异性免疫的潜在目标。此方法可识别抗原等位基因动力学与患者临床结果之间的单级关联。推论基于个体寄生虫等位率频率的变化，可能允许识别亚多面体，但保护性表皮，否则可能难以在免疫学研究中检测，因为它们被免疫多维丹的反应所掩盖，而不是保护性， loci。利用这种方法，我们确定了25个基因，许多未知功能，通过免疫表位图和这些蛋白质所诱发的抗体功能研究，编码蛋白质，这些蛋白质可以进一步描述其作为多价亚单位疟疾疫苗候选的潜力。

方法

道德声明

临床样本是根据马拉维布兰太尔医学院和巴尔的摩马里兰大学伦理委员会批准的协议收集的。研究参与者或其监护人提供了书面知情同意。

研究设计和样品

在马拉维南部的奇赫瓦瓦区进行的纵向队列研究中，从参与者那里收集了寄生虫分离物。布赫瓦尔德等人以前曾描述过有关参与者和研究程序的细节[29]。简言之，在2014年6月至2015年3月间，每月有120名儿童和成人向Mfera健康中心报告，在两年内每月报告一次疟疾。每月访问和所有计划内采集的血液样本，个人向卫生中心报告有疟疾症状的情况。每次访问，寄生虫血都由显微镜和PCR诊断。本研究中分析的数据来自从被动随访期间发现的有症状、简单疟疾感染中收集的红细胞颗粒。经显微镜测定的样本感染的寄生虫中位数为21，960寄生虫/μL，范围从0寄生虫/μL（但快速诊断测试呈阳性）到241，260寄生虫/μL。所有样本均被证实为P阳性。恶性疟原虫由PCR。为了确保分析中只包括独立感染，除以<14天分开的个人内的感染不包括在内。使用扎伊纳巴迪等人的方法从红细胞颗粒中提取DNA[68]。提取的DNA被丰富为寄生虫DNA使用优化的选择性全基因组扩增方法描述的Shah等人[65]。

全基因组测序

基因组DNA库是使用KAPA图书馆准备套件（卡帕生物系统，沃本，马房，马）进行测序而建造的。DNA（≥200 ng）与科瓦里斯E210到200个基点分化。图书馆是使用制造商协议的修改版本编写的。DNA在酶反应和库大小选择之间进行了纯化，并进行了AMPure XT珠。使用 LabChip GX 上的 DNA 高灵敏度测定（马萨勒姆沃尔瑟姆的珀金埃尔默）对图书馆的浓度和碎片大小进行了评估。使用 KAPA 图书馆量化套件，qPCR 还评估了图书馆的浓度。图书馆被汇集，随后在 Illumina HiSeq 4000（加利福尼亚州圣地亚哥的 Illumina）上进行排序，以生成 150 bp 的配对端读数。

阅读映射和SNP调用

通过使用 Bowtie2[69]将原始 fastq 文件映射到 3D7 参考基因组来分析测序数据。在 GATK 最佳实践工作流程之后处理二进制对齐映射 （BAM） 文件，以获得分析就绪读数[70，71]。Bedtools[72]用于从处理过的读数生成覆盖范围和深度估计值，并遵循 GATK 最佳实践工作流程进行变种调用[70，71]。哈弗洛特型呼叫者用于为每个示例创建基因组变异呼叫格式 （GVCF） 文件，并执行联合 SNP 呼叫（GATK v3.7）。如果变种符合以下筛选标准，则会删除变体：按深度 （QD） < 2.0 的变异置信度/质量， 链偏差 （FS） > 60.0，根平均方的映射质量 （MQ） < 40.0，映射质量排名总和 （MQRankSum） < -12.5，读取位置排名总和 （ReadPosRankSum） < -8.0，质量 （QUAL） < 50。使用vcftools还删除了具有>20%缺失基因型的变异站点和缺少数据>30%的样本。如果至少两个样本中不存在小等位基因，则也会去除变体。只有核心基因组用于进一步分析，以前通过排除基因组中高度可变的端粒和中微子区域[73]来定义。≥20读取所覆盖的基因组中位数百分比为88.9%[65]。应用质量控制过滤器后，核心基因组中需要 55，970 个 SNP，包括 22，177 个非同义 SNP，每个基因平均称为 11.6 个变种。医学论文发表-

免疫状态的定义

临床疟疾的免疫程度是根据所有P型感染的症状感染比例确定的。在为期两年的研究过程中，每个研究参与者都经历过恶性疟原虫感染。为了说明接触情况，总感染少于5人的个人，包括症状和无症状感染，被排除在分析之外。症状感染的中位数比例被用作将个人归类为更高和更低的免疫组的截止点。我们研究的样本量有限，不允许我们将免疫状态归类为一种普通变量。

感染和遗传分化的复杂性

在高低免疫组之间的比较中，每个个体只包括一种感染。根据接近采样日期分布中位数以减少时间变化而选择感染。使用DEploid-IBD[39]来估计感染中每个克隆的比例。没有主要克隆的感染（即大多数克隆的频率在感染范围内为<60%）被定义为复杂感染，并被排除在下游分析之外。对于剩余的样本，如果等位基因得到 70% 读数的≥支持，则主要等位基因在异质位置调用：否则，基因型被编码为缺失。威尔科森-曼-惠特尼测试用于评估两个免疫组感染中大多数克隆的频率差异。

Vcftools[74]用于估计威尔和科克汉姆F圣在可变非同义词，双等同位位会。意义是使用10，000个排列确定的，观察到的人口在没有替代的情况下被重新采样。为了确定基于胆汁位点中主要等位基因进行分析的影响，我们还使用感染中的多基位点和所有等位基因进行了分析。虽然F圣与单个主要等位基因的分析相比，多等位基因的分析值通常较高，在基于主要等位基因的分析中显著区分的位点在也包含小等位基因的分析中也显著差异。使用vcftools[74]估计显著分化的站点的核苷酸多样性。普拉斯莫德布 （v44）[22]用于识别含有差异化 SNP 的基因。

在所有多克隆感染中，主要和次要克隆（由从DEploid-IBD[39]获得的克隆频率定义）进行比较，前提是克隆频率小于 80%，大于 10%（n = 23）。在每个非同义词站点，估计主要和次要克隆的等位基因不匹配的样本比例。然后，将显著差异化的位点和基因组中所有剩余的可变位点之间比较不匹配的比例。p值的估算是通过进行威尔科森-曼-惠特尼测试来确定不同地点的克隆与剩余的全基因组变量位点之间的不匹配是否有显著差异。

配对感染分析

将同一宿主内发生的感染与不同宿主发生的感染进行比较，其中包括了至少两次相隔至少14天的症状感染的寄生虫全基因组序列数据。与基因分化分析相比，多同位异位位被纳入了对配对感染的分析中。"内部"组包括从同一个人的不同时间点收集的所有寄生虫对。"群间"包括来自不同个体的所有寄生虫对。本次分析共包括116个样本。小组内有124对样品，组内有6546对样品。对于所有对，每个站点都比较了均等状态，并且按站点估计了与非匹配等同状态的对的比例（图 3中示）。通过减去每个站点中具有非匹配等合状态的对的比例来计算组内和组之间的差异。p 值的估计是使用两组之间不匹配等位基因比例的差异进行片面 z 测试。普拉斯莫德布[22]用于识别含有感兴趣的 Snps 的基因。

克拉格8的全球多样性

疟疾基因Pf3K项目发布了5.1个数据[52]，用于估计本研究中发现的这些基因的全球多样性。Pf3K 数据集包括来自亚洲和非洲多个地点收集的 2，512 个样本的全基因组测序数据。分析中还包括来自巴布亚新几内亚的156个额外隔离区的数据[53，54]。VaxPack（https://github.com/BarryLab01/vaxpack） 用于全球人口遗传分析。GATKv4.0用于变种调用。取出了含有模棱两可碱基的样品。单顿 SNP 被转换回参考， 以防止误报变种。核苷酸多样性和Tajima的D分别计算给每个样本量大于50的国家的所有多态性站点。邓普顿、克兰德尔和唱歌 （TCS） [75]波普艺术[76]方法用于使用非同义 Snps 构建单体型网络。 蛋白质紊乱区域和 B 细胞表位区域使用 PlasmoSIP[62]预测。马拉维C-终端区域的单体型频率与不同免疫组分离，估计为使用DnaSP v6[77]的非同义词站点。

支持信息

Proportion of the infection comprised by the majority clone in infections from the high (n = 35) and low (n = 35) immunity groups.

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S1 无花果。在高（n = 35）和低（n = 35）免疫组的感染中，大多数克隆人所构成的感染比例。

没有主要克隆（≥0.6）的样本，由虚线指示，被定义为复杂的感染，并从下游分析中删除。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009576.s001

（蒂夫）

S2 无花果。23种多克隆感染中主要克隆和小克隆之间的不匹配比例。

与全基因组位点（p-value= 8x10）相比，被认为是等位基因特异性免疫目标的差异化地点的不匹配中位数比例显著提高-05，威尔科森-曼-惠特尼测试），符合以下假设，即主要克隆代表一种突破性的感染，它逃脱了等位基因特异性免疫反应，维持在亚夹层水平的小克隆。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009576.s002

（蒂夫）

S3 无花果。

（a） 个人与个人之间不匹配等位基因的比例。每个点都是非同义 SNP 中不匹配的比例。黑点代表个人中最不匹配的等位基因前 1% 。（b） 个人（y轴）中每对不匹配的SNP比例与感染（x轴）之间的时间之间的相关性。蓝线表示线性回归线，阴影区域显示的置信区为 95%。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009576.s003

（蒂夫）

S4 无花果。预测蛋白质紊乱和B细胞表皮在克拉格8。

橙色线和方块分别显示线性 B 细胞表位映射分数和预测 B 细胞表位位。蓝线和方块分别显示蛋白质紊乱评分和高度无序区域。底部的星号表示已知的 SNP。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009576.s004

（蒂夫）

S5 无花果。clag8 c-终端区域（氨基酸位置>1000）的Haplotype频率，来自本研究中使用的马拉维全基因组序列，来自两个免疫组的个人。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009576.s005

（蒂夫）

S1 表。寄生虫中显著差异化的SNP感染对临床疟疾具有不同免疫力的个人。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009576.s006

（文档）

S2 表。与个人之间相比，个人内部最不同的SNP最多为1%。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009576.s007

（文档）

S3 表。每百万张映射读数 （FPKM） 值的每个基洛基片段的热图，以显示寄生虫生命周期的细胞内阶段 25 个已识别基因的表达。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009576.s008

（文档）

S4 表。两种分析方法都识别出的基因的蛋白质/基因特征。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009576.s009

（文档）

S5 表。对子遗传分化（F圣）来自非洲、亚洲和巴布亚新几内亚（巴布亚新几内亚）的克拉格8序列之间。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009576.s010

（文档）

S6 表。NCBI 加入编号。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009576.s011

（文档）

确认

我们感谢姆费拉共同研究的参与者。我们要感谢比拉杰·什雷斯塔和吉莉安·姆班博在样品处理方面给予的帮助。我们还要感谢蒂莫西·奥康纳、迈克尔·卡明斯和亚历克西斯·博莱达的宝贵意见和建议，感谢特里·泰勒在领导马拉维疟疾国际卓越研究中心方面所发挥的作用。

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