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《医学论文发表--H3.3K27M 在德罗索菲拉对抗重新编程》

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《医学论文发表--H3.3K27M 在德罗索菲拉对抗重新编程》期刊在线投稿系统

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《医学论文发表--H3.3K27M 在德罗索菲拉对抗重新编程》期刊简介

医学论文发表--H3.3K27M 在德罗索菲拉对抗重新编程

· 卡米·艾哈迈德

· 史蒂文·赫尼科夫

发布时间： 2021年7月19日

· https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009225

抽象

发展通过转录因子激活基因和通过染色素介导基因沉默而使其他人失活。在某些情况下，发展可以通过主调节器转录因子的误表达来逆转或重定向。这必须涉及激活先前沉默的基因，这种发育畸变被认为是各种癌症的基础。在这里，我们表达机翼特异性 Vestigial 主调节器重新编程发育的眼睛，并测试沉默在重新编程中的作用使用 H3.3K27M 的异石突变，主要抑制 histone H3K27 三甲基化。我们发现，在石碑的生产阻止眼睛对翼重新编程。切割标签变异组织的染色质分析表明，H3K27me3 的域在肿瘤生产时通常会减少，这表明必须静默以前的开发计划才能进行有效的转化。引人注目的是，Vg 和 H3.3K27M 协同作用刺激眼组织的过度生长，这种表型类似于 Polycomb 沉默组件中的突变。拉长RNA聚合酶II的抄本分析，涉及过度生长中信号因子的误判。我们的结果表明，生长障碍调节可能是由于残废沉默和转录因子表达错误这一简单组合造成的，这种影响可能解释含结石癌的起源。

作者摘要

多细胞生物体内细胞命运的分化要求激活某些基因，而替代细胞命运的基因则被色度沉默所抑制。在人类患者中发现与脑癌相关的特定的结石突变，这些癌症可能源于细胞命运的不稳定。我们通过在德罗索菲拉眼睛中表达翅膀规格因子来重新编程细胞命运并创建有翅膀的眼睛来测试这个想法。为了测试色度沉默的缺陷是否增加了细胞重新编程，我们同时表达了一种致残的突变石。与预期相反，我们发现，翼对眼重新编程不再发生，而是眼睛过度生长，这种表型让人联想到首次发现组石突变的癌症。我们建议，重新编程需要对以前的开发程序进行色素沉默，而阻止重新编程可以解开组织规范转录因子之一的发育促进作用。

引文：艾哈迈德 K，赫尼科夫 S （2021） H3.3K27M 在德罗索菲拉对抗重新编程。普洛斯基因 17 （7）： e1009225.https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009225

编辑：乔瓦尼·博斯科，美国达特茅斯盖塞尔医学院

收到：2020年11月13日：接受：2021年6月11日：已发布：2021年7月19日

数据可用性：所有测序数据均可从 GEO 数据库（GSE161919）获得。网址是https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161919。

资金：这项工作由国家卫生研究院（R01HG010492，SH）资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或编写手稿方面没有作用。

竞争利益：作者宣称不存在相互竞争的利益。

介绍

多细胞生物体的发展方案由转录因子指定，转录因子激活和抑制基因电池，从而决定细胞命运。特定转录因子的异位表达可以推动细胞命运的变化，要么通过诱导多能性从分化状态[1]，或通过在称为"转定"或"直接重新编程"的过程中将一个细胞类型转换为另一个细胞类型 [2]。转录因子误表达引起的异常重新编程是一些发育和恶性疾病的基础。

在真核生物转录因子中，转录因子与色质相互作用，其中基因组DNA包裹在核糖体中的希斯通八度体上。核体上的隐性高石修饰抑制因子结合和转录，从而调节基因表达程序。有人建议沉默，以施加方向性和可靠性的发展进展[3]。一个关键的染色素机制是由受聚合物蛋白约束的希斯通H3（H3K27me3）赖氨酸-27残留物的三甲基化来调解的。Polycomb蛋白的突变抑制了发育转录因子基因，从而在动物、植物和真菌中诱发异常命运转换，突出了这种染色质系统[4-6]的保守重要性。

在德罗索菲拉，高石H3-K27残留物的突变重新概括了聚团转换[7]。在人类中，癌细胞的筛查发现某些小儿胶质母细胞瘤[8，9]中这种残留物的突变。这些肿瘤突变是赖氨酸对甲基离子（K27M）误感替代，主要抑制EZH1+2高石甲基转移酶，减少染色质甲基化[10-14]。肿瘤石本身不是肿瘤原体，但可能预后细胞到以后的致癌突变[15，16]。然而，由于肿瘤形成的关键窗口处于早期发展血统中，分析无法访问启动事件的序列。医学论文发表-

在真核生物中保存着希氏体和希斯通修饰酶，在嗜血杆菌细胞中表达H3K27M肿瘤石可重新概括胶质瘤中出现的色质和沉默缺陷[17]。在这里，我们使用Drosophila来表明，H3K27M在科希斯通块直接重新编程诱导的异位表达的机翼主调节器转录激活器Vestigial（Vg）。虽然在自身的组织石生产抑制细胞增殖，与Vg共同生产导致细胞过度生长，这些细胞保留眼睛身份。CUT&Tag[18]的色度素分析显示，H3K27me3 高石修饰普遍减少，这可能在重新编程期间削弱沉默，并识别可能诱导肿瘤生长的基因表达变化。H3K27M对结石的影响不同于消除E（z）高石甲基转移酶，表明色度沉默与异常转录因子表达的中度缺陷足以诱导肿瘤生长，对胶质瘤的发育起源有影响。

结果

H3K27M 在科希斯通块直接重新编程

为了探索重新编程和色度沉默之间的相互作用，我们使用可诱导的转基因Vg主调节器转录因子和H3.3K27M肿瘤石。Vg 编码转录激活域，当与 DNA 结合扇贝（Sd）蛋白异质化时，确定机翼假想盘袋中细胞的身份[19]。Vg 是机翼开发的主要调节器，因为 Vg 的异位生产将组织转换为机翼结构[20]。我们使用无眼GAL4 （eyGAL）驱动程序在眼睛发育过程中诱导转基因[21]。眼睛中Vg的表达是半致命的（表1），许多垂死的小狗有小头，缺乏眼组织（图1A和1B）。那些幸存下来的成年人表现出不同程度的转变：有些动物缺乏眼睛，而另一些动物则减少了眼部omatidia的数量，并且有深色的色素生长，类似于翅膀组织，有小毛刺和三叶虫状的头发，而不是正常眼睛（图1C和表1）。这些类似翅膀的外生长是由 Vg 主调节器重新编程眼睛的结果。

· 原始图像

图1。Vg 表达将眼睛转换为翅膀组织。

（A-C）野生类型eyGAL/CyO成人（A）和eyGAL >Vg成人（B，C）的头部和眼睛的侧面和背视图。大约一半的成年人与>Vg生产显示色素翅膀般的投影，而其余的完全缺乏眼睛。（D，E）来自野生类型eyGAL>RFP幼虫（D）和来自伊加尔>RFP>Vg幼虫（E）的眼部想象光盘。光盘被免疫，用于 Vg 蛋白和 ELAV，这是区分光感受器的标志。表示光盘的天线（a）和眼睛（e）部分，并且将眼睛前部的线粒活性未分化细胞与后部分化光感受器分离的形态遗传沟用橙色箭头标记。具有 Vg 生产的光盘的眼部部分被扭曲，具有可检测的 Vg、低 RFP 信号，并且后边缘很少区分光感受器。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009225.g001

表1。Vg、H3.3 突变和 RNAi 对眼睛到翅膀重新编程的影响。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009225.t001

我们解剖和免疫染色开发眼部虚拟盘，以确定异位Vg和H3.3K27M的细胞效应。eyGAL驱动程序诱导 RFP 报告器基因，标记假想光盘（图 1D）的眼睛原。诱导 Vg 生产可将光盘的眼睛部分降低和扭曲到可变的程度，从许多到极少数在眼盘后边缘（图 1E）发展的照片感应器不等。虽然光盘之间可检测到的 Vg 蛋白量各不相同，但 RFP 报告器在所有光盘中均减少，这与eyGAL驱动程序在 Vg 重新编程眼盘时灭活一致。

我们使用转基因编码一个不可推断的H3.3K27M基因[22]和同一个eyGAL驱动程序在眼睛中产生角石。肿瘤石会随着剂量（图 2A–2C）的比例而减少成人眼睛的大小。因此，虽然肿瘤结石与癌症的增殖有关，但本身会抑制组织生长。在假想光盘中，在光盘的整个眼睛部分（图2D和2E）可检测到翁科希斯通，并导致H3K27me3的污渍减少，而在天线部分的H3K27me3染色不受影响（图2G和2H）。这些光盘比野生型光盘略小，但具有正常的形态和开发光感受器。相比之下，H3K27me3 修改不受 Vg 的异位表达的影响，显示光盘的眼睛和天线部分（图 2I）均具有高水平。医学论文发表-

图 2.H3.3K27M 基石块直接重新编程。

(A-C）野生类型未诱导的UAS-H3眼睛的侧视图。3K27M成人（A），成人与异质性为eyGAL和H3。3K27M转基因（B），或同源的两个眼睛和H3。3K27M转基因（C）。生产上石会减少眼睛的大小。（D-F）从幼虫与眼睛GAL诱导生产的RFP，H3.3K27M和Vg.光盘的眼部想象光盘被免疫，用于K27M表位和光感受器ELAV标记。oncohistone 是在整个光盘的发育眼部生产的。（G - J）眼天想象光盘与eygal诱导生产 Rfp， H3.3k27m 和 Vg，并免疫为 H3k27me3 希斯通修改和 Elav 。与产生上石的光盘的天线部分的染色相比，光盘眼睛部的希斯通甲基化减少。（K， L）共同生产 Vg 和 H3.3K27M 的成人眼睛的例子。眼睛过度生长和错综复杂（K， K'）或过度生长与极端投影（L， L'）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009225.g002

为了测试H3K27me3色素沉默在重新编程中的重要性，我们共同诱导生产Vg和K27M肿瘤石一起在发展眼睛。令人惊讶的是，这完全抑制了眼睛对翼重新编程（表1）。H3.3K27M 生产挽救了 Vg 生产的杀伤力，但电子封闭动物通过各种投影、茎和褶皱（图 2K 和 2L）严重干扰和扩大眼睛。这些错综复杂的眼睛含有没有翅膀状组织的奥马蒂迪亚，这意味着共同生产的卵石会阻断Vg的重新编程效果，从而保持这些细胞的眼睛身份。这在开发假想光盘中很明显，在产生上皮石的地方，光盘的眼睛部分会大大扩展，沿着光盘的复杂边缘（图 2F 和 2J）开发光感受器。抑制重新编程是特定于 K27M 的异石，因为具有野生类型 H3.3 histone 的转基因，具有 H3.3K27R 替代，或使用 H3K9M 替代[17]不会阻止重新编程（表 1）。我们测试了额外的独立eyGAL4驱动程序构造和插入，以诱导H3.3K27M的粘结石和诱导Vg（见S1文本），所有这些都再现了Vg诱导的重新编程和上石引起的过度生长的表型。因此，H3K27me3介导沉默既需要转录因子诱导眼睛重新编程，也需要限制因子诱发的肿瘤生长。

Vg 和 H3K27M 诱发细胞死亡和增殖

假想圆盘和成人眼睛的大小与 Vg 或 H3.3K27M 产量的增殖减少一致，但与两种蛋白质共同生产的增殖增加。我们通过用线粒体标记 histone（H3S10 磷酸化）和细胞死亡标记（裂解 DCP-1）染色眼睛想象光盘来检查细胞分裂率和细胞死亡率。在野生型控制中，线粒分散在眼盘前部，但一旦光感受器开始分化（图3A和3A'），其细胞死亡（图3E）将基本消失。H3.3K27M的表达不影响光盘中的线粒体（图3B和3B），但细胞死亡的条纹出现在光盘中，细胞从增殖到分化区域（图3F）过渡。因此，H3.3K27M 生产的眼部尺寸的缩小至少部分是由于细胞生存能力降低。相比之下，Vg 的诱导与整个光盘（图 3C 和 3C' 和 3G）中线病增加和细胞死亡增加有关。因此，细胞生存能力的降低限制了重新编程组织的大小。最后，H3.3K27M和Vg的联合生产导致非常大的光盘与线粒体斑块经常明显（图3D和3D'），但这些光盘显示广泛的细胞死亡在未分化的区域（图3H）。尽管其他地区存在大量由结石引起的细胞死亡，但某些地区的过度扩散导致生长过度。

图 3.H3.3K27M 和 Vg 刺激细胞死亡和增殖。

(A-D）眼部视盘免疫，用于H3S10-磷酸化标志物的线粒体（A-D），在形态遗传沟（箭头， A-D'周围具有更高的放大成像。（E-H）为裂开的 DCP-1 凋亡标记（E-H）免疫的光盘。野生类型"+"菌株是w1118，所有的光盘都为ELAV接种了免疫剂。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009225.g003

Vg 重新编程组织中的基因表达

一旦细胞转化，眼睛的重新编程就会使eyGAL驱动程序失活，当 Vg 被诱导时（图 1E），RFP产量的减少就很明显了。eyGAL驱动程序的失活意味着 Vg 转基因也将失活，因此必须激活内源性 vg基因才能成功重新编程。为了测试这一点，我们用eyGAL驱动程序和不可切割的Vg转基因建造了动物，但缺乏内源性vg基因。不出所料，这些动物的眼睛非常小，没有翅膀组织生长（图4A）。这意味着Vg的瞬时生产激活了翅膀规格的内源基因。内源性vg基因也需要眼睛盘的过度生长与异位 Vg 表达，作为占主导地位的负vg美国等位基因减少眼睛大小（图 4B）.医学论文发表-

下载：

图4。在直接重新编程过程中，组织特定的基因表达发生变化。

(A） vg的侧视图CL7A突变成人与眼睛诱导Vg生产的眼睛。眼睛尺寸缩小，但不会变成翅膀。（B） vg的侧视图美国/+头部与眼睛诱导H3.3K27M和Vg共同生产的眼睛。眼睛是错综复杂的，但缩小的大小，而不是过度生长。（C-F）眼部解剖盘与眼睛诱导生产RFP，H3.3K27M和Vg和免疫染色眼特异性Dak蛋白和ELAV。Vg 和 H3.3K27M 生产均无法阻止 Dac 表达，尽管这些光盘杂乱无章。野生型"+"菌株是伊加尔4>UASRFP/Cyo。（G-K）野生类型（''， eyGAL4>UASRFP/CyO）翅膀想象光盘（G）和眼部解剖盘与eyGAL诱导生产 H3.3K27M 和 Vg（H-K）免疫染色机翼特异性 Nub 蛋白和 ELAV.机翼袋上贴有 Nub 的大量标签，Vg 生产的眼盘有低水平 Nub 染色的贴片。在生产 H3.3K27M 的眼睛光盘中或在 H3.3K27M 和 Vg 共同生产的光盘中看不到 Nub 染色。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009225.g004

为了进一步描述翅膀特异性基因的激活，我们为眼睛或翅膀特有的蛋白质染色了圆盘。这些光盘继续表达眼睛因子达赫松德（Dac），虽然这个因素的正常条纹模式被重新编程光盘（图 4C– 4F）的粗制滥布扭曲。重新编程眼盘中的机翼规格因子 Nubbin （Nub）可检测，但比机翼光盘（图 4G–4I）弱，这意味着机翼测定程序无法有效激活。值得注意的是，在>H3中，没有可探测到的Nib生产。3K27M >V增长过度增长的光盘（图 4J），而RFP和dac表达强烈。因此，在此设置中，Vg 的异位生产不会激活机翼确定性，并且眼睛因素继续被表达。

重新编程组织中 H3K27me3 域的色度分析

为了在 Vg 重新编程的眼睛中剖析色素域，我们调整了 CUT&标签方法[18]从果蝇幼虫解剖假想光盘。CUT&Tag 的工作原理是首先用与染色质部位结合的因子特异性抗体浸泡未修复的细胞，然后用二次抗体进行装饰。接下来，一种含有适配器序列的蛋白质-A-Tn5（pA-Tn5）转位体被浸泡在染色质结合的抗体中。通过添加镁激活系绳转位体，然后将适配器集成在结合位点周围，并利用 PCR 浓缩和测序生成库，从而绘制目标染色质蛋白的地图。我们以前已经调整了基于微结核糖的切割运行方法，用于解剖假想光盘[22]，并可靠地调整了 CUT&Tag 工作的缓冲器。对于带有组织样本的 CUT&Tag，我们解剖机翼或眼睛想象光盘，用康卡纳瓦林 A 磁珠涂上它们，用于处理，用数字素轻轻渗透，然后依次用抗体孵育，然后用 pA-Tn5 孵化。由此产生的库受光照素配对端测序，并映射到德罗索菲拉 dm6 基因组组装。来自 2–3 幼虫的想象光盘足以生成染色质轮廓，尽管 CUT&TAG 能够剖析非常小的样本量，但应适用于更少的组织[17，23]。

我们首先绘制了H3K27me3沉默修改的眼睛和翅膀想象光盘从野生类型幼虫（S1文本和S1A图）。先前的研究发现，H3K27me3标记的域在幼虫组织之间共享，但染色质甲基化的定量差异与包括基因的表达相对应[22，24]。例如，一个350 kb H3K27me3域包括眼睛和翅膀假想光盘细胞（图5A）中的母细胞群。ANTENPEDIA-COMPLEX（ANTP-C）。在眼睛想象光盘中，安特普基因被沉默，并大量涂上H3K27me3标记的色度素，而在翅膀想象光盘中，安特普基因被转录，而H3K27me3在该基因上也相应耗尽。为了量化色度景观的变化，我们测量了机翼和眼盘中 166 个带注释的 H3K27me3 域（S1 数据）的平均 H3K27me3 信号，并在散射图（图 5B）上比较了这些信号。包含翅膀规格中涉及的基因的域在眼盘中具有中等高的染色质甲基化，当基因处于活动状态时，在翼盘中丢失信号。相反的趋势发生在眼睛规格基因。因此，正如预期的那样，H3K27me3领域组织特异性基因的激活伴随着高结石甲基化的减少。

图 5.在重新编程的眼睛想象光盘中对 H3K27me3 域进行色度分析。

(A）在机翼和眼睛想象光盘的ANTP-C H3K27me3 域的色度分析。箭头标记了 H3K27me3 在 166 个带注释的多科姆域中，机翼和眼睛想象光盘之间主要聚通信绑定PRE（B）平均碎片密度（CPKM）的变化的位置。域的排名是通过减少平均H3K27me3 CPKM的翅膀和眼睛想象光盘。包含眼睛特异性基因（粉红色）、翅膀特异性基因（蓝色）或常见压抑基因（红色）的选定域被标记。（C）选定的领域包括眼睛特异性基因（粉红色）、翅膀特异性基因（蓝色）或普通域（灰色），用于机翼和眼睛控制以及 Vg 和 H3.3K27M 的生产。（D-F）在w之间的聚通信域中H3K27me3的平均碎片密度（CPKM）的变化1118眼睛想象光盘和光盘与H3.3K27M和Vg生产。标记了染色质甲基化变化最大的选定域。（G）平均 H3K27me3 覆盖 H3K27me3 域（实线）内约 700 个聚通信绑定PREs[24]以及推广人（虚线）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009225.g005

对于生产 Vg、H33K27M 或共同生产 Vg 和 H3.3K27M 的光盘，我们解剖了光盘的天线部分，仅对眼组织进行了剖析。与眼盘（图 5C 和 5D 和 S1 数据）相比，眼盘中 Vg 的生产导致跨域的 H3K27me3 变化有限。包括vg和nub基因在内的域明显较少甲基化，但保留的甲基化比翅膀想象光盘多。因此，眼细胞的重新编程不会伴随着染色质甲基化模式的广泛变化，翅膀特异性基因的变化比翅膀盘的变化更有限，这表明Vg表达并没有完全重新连接基因表达程序。

接下来，我们来看看H3.3K27M对H3K27me3图案的影响。在活性促进剂和增强剂中，由高石H3.3特异性伴郎结合到染色质中，通过整个基因组（25）的DNA复制在较低水平，在眼盘中产生H3.3K27M，在使用抗体对K27M表皮（S1B图）进行剖析时，具有与整个基因组背景类似的促进因素丰富。肿瘤石可减少眼睛中的 H3K27me3 染色（图2D–2F），胶质瘤细胞系的定量染色质分析以前表明 H3K27me3 在全球范围内减少，但少数领域仍然存在[25]。在眼睛想象光盘中，H3K27me3 在产生翁科希斯通时仍然涂抹域，尽管甲基化较少的域比强域（图 5E）更耗竭，分散性更强。当翁科希斯通和Vg共同生产（图5F）时，弱域的中度耗竭也很明显。此外，我们注意到，包括vg基因在内的域保留甲基化，这意味着内源基因没有被有效激活，H3K27me3信号在其他翅膀和眼睛确定基因没有显著改变（S1数据）。

我们将对弱域的影响归因于在产生基石的细胞中整体较低的H3K27me3信号。但是，即使在强域 H3K27me3 分布也会受到影响。在 Drosophila H3K27me3 域中，核素耗竭聚团响应元素（PREs）和色氨酸甲基化随后扩散到整个域[26]。H3.3K27M 异丙基石特别干扰甲基化扩散[27，28]， H3K27me3 甲基化模式的变化在ANTP-C （图 5A）等各个领域显而易见。在此域中，PREs 仍然带有高石修改的重标记，但PRE之间的间隔会减少，这与禁止PRE修改的原石传播一致。为了评估传播情况，我们使用在 H3K27me3 域（[24]和S1 数据）内已发布的 Polycomb 绑定站点来定义PREs 的位置并显示这些站点周围的 H3K27me3 信号。此分析确认在PRE峰值（图 5E 和 5G）周围持续甲基化损失。H3K27me3 眼盘部分的剖析共同产生 Vg 和 H3.3K27M，在强域中减少PREs 周围的传播，而弱域则更分散（图 5E）。因此，眼睛中的角石生产不会消融 H3K27me3 域，但确实会降低所有域的甲基化密度。

重新编程组织的记录剖析

我们剖析了高石 H3-K4 二甲基化（H3K4me2）高石修饰的翅膀和眼睛想象光盘，以确定活性促进剂，以及用于 RNA 聚合酶 II （RNAPII-S2p）的磷酸拉长形式，以测量每个组织的转录。虽然RNA-seq在细胞中描述成熟的mRNA丰度，但高石修饰和RNAPII测量直接对应于基因激活和沉默的变化。H3K4me2 和 RNAPII-S2p 的全基因组模式在机翼和眼盘之间非常相似，反映了它们对家政基因（图 S1B）的相似表达特征。相比之下，翅膀和眼睛特异性基因显示，在它们活跃的组织（图6A和6B）中，促进者H3K4me2和基因体RNAPII-S2p信号增加。此外，H3K4me2 信号通过替代促进剂（图 6B）识别基因的活性 TSS。为了识别不同表达的基因，我们通过将 H3K4me2 信号± 500 bp 围绕每个注释的促进者绑定，并通过将 RNAPII-S2p 信号装箱到每个注释基因（S1 Data）中分配基因转录分数来分配促进者活动分数。由于 RNAPII 分析集成了基因上的信号，因此我们专注于此作为基因转录的有力测量。我们为每个组织进行了4-6次生物复制，每次复制的映射读数高达1000万次，并将规范化计数表与机翼和眼盘中的基因（图6C和S1数据）进行比较。在严格的阈值（FDR≤0.05）下，我们确定了50个在机翼假想光盘中向上调节的基因，包括15个转录因子，如vg、安特普、ap、Dr、nub、Sox15、rn和zfh2（S1数据和图6C）。 相比之下，233个基因在眼假想盘中受到向上调节，包括许多眼睛特异性转录因子，如Optix、dac、dan、eya、lz、实验室、所以、B-H2、ey、玩具、gl和oc。 恢复的微分组织特异性转录因子基因数量略好于在眼睛和翅膀想象盘之间公布的RNA-seq数据[29]，表明RNAPII分析能够有效地检测组织规范基因的表达变化。

· 下载：

图6。在重新编程的眼睛想象光盘中拉长 RNAPII 和 H3K4me2 的色度分析。

(A，B）RNAPII-S2p和H3K4me2信号跨越安非他来-C （A）和眼睛基因（B）。箭头指示蚂蚁和眼睛基因的替代促进者，绿色箭头指示转录的方向。（C-F）野生类型之间不同表达基因的火山图（w）1118）眼睛想象光盘，翅膀想象光盘，和眼睛光盘与H3.3K27M和Vg生产。显著微分表达的选定基因被标记。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009225.g006

然后，我们在剖析的眼盘中对 RNAPII 进行剖析，以生成 Vg。Vg 生成样本中有 30 个基因受到向上调节，而与野生型眼想象光盘（S1 Data和图 6D）相比，138 个基因受到低监管。虽然内源性vg基因的促进者获得H3K4me2并被转录，只有51（30%）微分表达基因与翼盘样本共享。这可能是由于Vg表达样本的马赛克化或翅膀规格基因的不完全激活，但更有限的变化表明，通过异位Vg重新编程的眼睛是不完整的。

然后，我们在生产H3.3K27M的眼盘中对RNAPII进行了剖析。翁科希斯通的产生对全基因组转录（图6E和S1数据）影响甚微，这与这种基因型的正常发展是一致的。对共同生产H3.3K27M和Vg的样本进行分析，区分了14个上调节基因和45个低监管基因（图6F和S1数据）。值得注意的是，内源性vg基因没有诱导，只有28个不同转录的基因在翼盘样本中受到类似的调节，这与这些样本中重新编程的失败一致。H3.3K27M 和 Vg 共同生成光盘（S1 数据）中具有 31 个独特的微分转录基因。在这个样本中的11个过度转录的基因中，有两个基因（hppy和Stlk）编码了STE20子家族中的信号激酶：特别是快乐（hppy）激酶与多发育信号通路的积极调节有关，包括JNK、Egfr、河马、TORC1和托尔通路[30-33]，并影响假想盘中的细胞分裂和凋亡[32]。第三个超额转录基因是Rnf146，它影响Wnt信号。令人吃惊的是，具有H3.3K27M突变的人类小儿肿瘤与发育信号受体PDGFRA[34]的向上调节有关。

受管制的基因也可能导致过度生长：在 H3.3K27M 和 Vg- 共同表达光盘中，18 个基因中唯一受到低监管的基因中，Eip78C是 ecdysone 响应计划的一部分，而其他类似转录因子的前 lola-G则没有已知功能。最后，基因调控的某些常见变化可能会推动H3.3K27M和Vg-共同表达组织的肿瘤生长。两个有趣的向上调节的基因是IntS3，一个总转录集成复合物[35]的组成部分，和哈斯平，它编码的线粒体组基激酶，也影响聚通信介导沉默[36，37]。还需要进一步的研究，以确定哪些基因驱动眼盘的肿瘤生长共同调节Vg和H3.3K27M肿瘤石。

H3K27M 和 Vg 共同表达模仿 PRC1 突变体

组织重新编程与聚梳沉默系统中的多个组件[38]相关联。H3K27 三甲基化是由 E（z）高石修饰酶催化的，E（z） histone 改性酶是聚压缩抑制复合物 2 的组成部分，而聚压缩抑制复合物 1 （PRC1）复合物将 H3K27me3 标记与核糖体[39]结合在一起。PRC1 还将许多发起人独立于 PRC2 或 H3K27me3，这意味着它具有额外的功能[24]。事实上，PRC1组件的突变导致假想盘的过度生长，而CPR2组件的突变抑制细胞生长[24，40]。我们考察了中国1和中2在重新编程眼睛方面的作用。先前的一项研究将EYGAL引起的中国1和中华人民共和国2组件（41个）的敲击描述为eyGAL，我们在这里重复了这些。击倒中国2号高石甲基转移酶E（z）的效果比H3.3K27M的表达要戏剧化得多，导致假想盘（图7A）的眼睛部分几乎消除。这些动物死亡作为小狗缺乏所有头部结构从眼睛天生的想象光盘（图 7C）派生。同时击倒E （z）和 Vg 的表达同样导致小圆盘和无头部结构（图 7D）。因此，H3.3K27M表达的生长抑制类似于E（z）酶的中间减少，这些中间水平将E（z）的重新编程要求与其细胞生存能力的要求区分开来。

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图 7.减少的C01和C2对直接重新编程和细胞增殖的影响。

(A-B）眼部光盘与eyGAL诱导的RFP和 RNAi 构造的表达针对E （z） （A）或Pc （B）成绩单。两个圆盘都接种了针对机翼特异性 Nub 蛋白和 ELAV 的免疫。随着E （z）击倒，光盘的眼睛和天线部分大大减少，而Pc击倒导致眼睛部分的过度生长和 Nub 在圆盘的后缘表达。（C-D）解剖死亡的噬菌体头与E（z）击倒（C， C'或E （z）击倒和 Vg 生产（D， D'）。E（z）的丧失消融了所有从眼部盘中提取的组织，包括头部胶囊和眼睛，而不影响口腔部分。（电子 - F）解剖垂死的噬菌体与Pc击倒（E， E'或Pc击倒和 Vg 生产（F， F'）的负责人。Pc的丢失在眼睛的后部边缘（箭头）诱导异位翼状结构，并将天线转换为腿部（箭头）。Vg 生产与Pc击倒结果大大减少了眼睛和扩大和扁平的翅膀状结构（支架）。（G）野生类型之间不同表达基因的火山图（w）1118）眼睛想象光盘和眼盘与Pc击倒。安特普和乌布克斯是表达差异最大的地区。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009225.g007

波利科姆的眼部特异性击倒也是致命的，但表型不同于E （z）击倒。先前的工作还表明，Polycomb击倒将部分眼睛重新编程为翅膀状组织，并诱导光盘中过度生长[41]。带Polycomb击倒的眼盘在圆盘的后侧[41]具有高表达机翼特异性 Nub 转录因子（图7B），眼盘的后缘倾向于重新编程[41，42]。垂死的小狗头部有眼睛和翅膀组织，翅膀状的外生长出眼睛的后侧[41]（图 7E）。通过同时进行Polycomb击倒和 Vg 表达来增强重新编程，减少眼组织的数量，使翅膀组织在更扁平的结构中展开（图 7F）。

我们从聚科姆击倒光盘（S1 数据）中分析了隐藏石修改和 RNAPII 。这些光盘是马赛克的眼睛和重新编程的命运，但诱导一些基因被检测到，包括安特普和Ubx（无花果7G和S1数据）。这与组织的转换相匹配：当眼细胞被重新编程为翅膀命运[41]时，Antp被激活，而 Ubx表达可能是由于光盘的天线部分转换为腿部命运 [图 7E]。我们没想到天线效应，因为eyGAL4驱动程序仅限于后期幼虫阶段的光盘的眼睛部分，但这个驱动程序确实在早期阶段的天线部分短暂表达[43]。此早期表达式解释了E（z）或Polycomb击倒时光盘天线部分的变化（[41];无花果 7A 和 7B）。最后，重新编程眼盘的免疫染色检测到机翼规格基因（图7B和[41]）的额外诱导，RNAPII分析未检测到这些基因，可能是由于这些转录因子的表达率低或光盘的异质性限制了检测。

虽然我们的结果与中国1和 PRC2 突变的发布效果有相似之处，但在重新编程时的监管后果方面存在重大差异。当eyGAL4诱导 Vg 表达重新编程眼睛时，eyGAL4驱动程序关闭。同样，Polycomb击倒的成功重新编程使eyGAL4驱动程序（图7B）失效，因此聚通信表达将在重新编程的单元格中恢复。这与共同表达H3.3K27M和Vg的细胞不同，也不同于中国1或中国2的基因突变体[24，40]。在这些情况下，细胞必须随着瘫痪的沉默而增殖。换句话说，Polycomb的瞬时损失会导致重新编程，而永久损失会导致肿瘤生长。E（z）活性部分减少使细胞能够存活，从而揭示了其通过单个转录因子重新编程的要求。医学论文发表-

讨论

细胞命运计划通过替代途径的色度沉默而得到强化，这意味着减少限制细胞命运的表观遗传障碍将刺激细胞命运的转化。我们发现相反——使用Vg主调节因子的异位表达，我们发现，妥协的沉默并不能增强眼睛的转化：而不是眼盘的细胞过度增殖。在生长中的嗜睡症中产生过度生长的肿瘤非常简单：仅表达两种蛋白质——H3.3K27M肿瘤和转录因子——就足够了。对发育命运的承诺既需要基因表达决定性转录因素，也需要基因的沉默来替代命运。协调激活和沉默可能塑造和稳定发展轨迹。我们的研究结果突出表明，色度沉默对于转录因子诱发的发展重新编程至关重要。嗜血性眼中的细胞身份由自我强化转录因子网络决定。要重新编程Vg的这种组织表达必须同时诱导翅膀规格基因和沉默眼睛指定因素。令人惊讶的是，H3K27甲基化的抑制并没有加强重新编程，这意味着静音翼规格基因的激活并没有受到限制。相反，我们的结果表明，H3K27me3介导的眼部特定因素沉默是成功重新编程的必要。此要求可能来自在已经建立眼部确定程序的环境中诱导 Vg。此外，视网膜细胞的分化，即使Vg被表达表明，眼睛确定因素必须占主导地位的翅膀规格因素，类似于在德罗索菲拉[44]组织损伤后观察到的。有趣的是，过度表达的希斯通基因转录因子Wge也可以驱动眼睛到翼重新编程，但这种情况需要色度沉默调解的希斯通H3K9甲基转移酶苏（var）3-9 [29，45]。因此，重新编程似乎需要通过 H3K27me3 或 H3K9me3 介导路径来压制既定的发展计划。

为什么用H3K27M肿瘤石抑制重新编程会导致肿瘤生长？哺乳动物系统的基因研究表明，H3K27M肿瘤石不足以自行诱发肿瘤发生[46]。相反，继发突变是必要的，患者中携带H3K27M的低突变负担意味着特定突变足以引起恶性肿瘤。一些突变是在经典肿瘤抑制基因，如TP53，从而抑制恶性肿瘤。在儿科中线胶质瘤中，额外的激活突变通常出现在特定的信号受体中，如PDGFRA或ACVR1 [8、34、47-49]，发育信号的过度激活可能诱发发育转录因子的误表达。H3.3K27M 在科希斯通和 Vg 的共同表达似乎模仿了这种效果，也许通过通过转录分析我们识别的 STE20 样激酶的表达增加。Vg 因子既能促进翼细胞的命运，又能刺激细胞生长[50]，因此抑制重新编程可能导致无拘无束的增殖。虽然在胶质瘤中未观察到人类四个Vg同源基因的突变，但三个参数的误表达与其他癌症[51]有关。更笼统地说，简单地错误地表达发育转录因子和肿瘤基刺激增殖这一事实表明，其他转录因子也可能这样做，这将解释肿瘤驱动癌症的细胞类型和阶段特异性。

引人注目的是，PRC1成分的突变刺激了不受控制的增殖，而中国2组件的突变则不会[24，40]。这两个复合物通常协同工作，以沉默基因组中的域，但中国1也调节一些发育目标的基因表达[52，53]。我们的结果表明，PRC1成分的突变既会失去色素沉默，又会错误地表达发育调节器，导致细胞增殖。

方法

飞行菌株

所有十字架均在 25°C 下进行。此处使用的所有突变和染色体重新排列均在飞基（http://www.flybase.org）中描述，来源列在S1 文本中。eyGAL4-3-8 驱动程序用于此处显示的所有实验，尽管与其他eyGAL4构造和插入结果相同。

转基因

诱导H3.3结构是通过克隆UASp发起人和H3建造的。3A ORF 进入 pKC27mw 转换矢量[54]（来自 L. 林罗斯、洪堡 - 乌尼维特祖柏林的礼物），然后使用现场定向突变 PCR 制作 K27M 和 K27R 变异版本。每个质粒被注射到y M [血管内。德姆]ZH-2A w：P[atp，y]， w3'[ VIE -260B 胚胎由贝斯特根公司（奇诺山，加利福尼亚州）。这条线包含两个着陆点[55];本研究使用了25C着陆点的内联体。

成像想象光盘

从3号晚期的星幼虫的想象光盘被解剖和固定10分钟，在4%甲醛/PBST（PBS与0.1%三吨-X100），然后孵育两次在0.3%钠脱氧甲酸酯/PBST为20' 。样品在PBST中用原发性抗血清稀释，在4°过夜时补充10%山羊血清，最后用荧光标记的二级抗体（1：200稀释，杰克逊免疫研究）。所有组织都沾染了 0.5 微克/mL DAPI/PBS，安装在幻灯片上的 80% 甘油中，并在 EVOS FL 自动 2 倒显微镜（热费舍尔科学）上通过表皮荧光成像，目标为 10 倍。每个基因型至少对 20 张光盘进行了成像。在Adobe摄影店和Adobe插图画家中对伪彩色图像进行了调整和合成。使用的所有抗体都列在S1 文本中。医学论文发表-

成像成人眼睛

成人在冰柜中安乐死，然后使用安装在尼康SMZ1500立体显微镜上的索尼数码相机进行成像。图像与Adobe照片店进行了颜色校正，并在Adobe插图画家中进行了合成。

色度分析和测序

我们剖析了在Wash+缓冲区的第三星幼虫（20 mM HEPES pH 7.5，150m纳米NaCl，0.5 mm精氨酸与罗氏丙酮蛋白酶抑制剂）的假想光盘。我们使用4个翅膀想象光盘和6个眼部想象光盘为每个染色质分析实验。实验是重复和并行进行的，以尽量减少技术变化。我们使用免疫系切割标签染色质分析[18]与抗体到希斯通 H3K27me3 （C36B11，细胞信号技术）和希斯通 H3K4me2 （13-0027，史诗）修改.为了适应整个组织的切割标签，我们在 8 管 PCR 条中涂上 BioMag Plus Concanavalin-A 共聚磁珠（ConA 珠，多科学公司）的假想光盘，并在磁性支架上交换解决方案（MSR812，永久根）。组织在 dbe? 缓冲区中用原抗体孵育（20 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，0.5 mM 精氨酸，2 mM EDTA，1% BSA， 0.05% 数字宁与罗氏 cOmplete 蛋白酶抑制剂）过夜在 4°，在 dbe? 缓冲区中用二次抗体在室温下孵育 1 小时，然后在 300Wash? 缓冲区中用装有适配器的蛋白质 A-Tn5 孵育（20 mM HEPES pH 7.5，300 mM NaCl，0.5 mM 精氨酸与罗氏 cOmplete 蛋白酶抑制剂）1 小时。使用 300Wash? 缓冲器进行一次洗涤后，样品在 300Wash? 缓冲区中孵化，并辅以 10 mM MgCl2在37°标记染色质1小时。反应停止添加SDS到0.16%和蛋白酶K到0.3毫克/mL，孵育在58°1小时，DNA被净化酚：氯仿提取和乙醇降水。

图书馆按照描述[23]编写，14个PCR周期，10秒合并退化和延伸，以丰富短的DNA片段。在弗雷德·哈钦森癌症研究中心基因组学共享资源的 Illumina HiSeq 2500 平台上，图书馆以配对结束模式对 25 个周期进行了排序。配对端读数映射以释放D的 r6.30 。利用Bowtie2从飞基地获得的黑色素加斯特基因组，以及用于尖峰正常化的大肠杆菌基因组。发布分步协议：https://www.protocols.io/view/cut-tag-with-drosophila-tissues-bnx5mfq6

数据分析

使用UCSC基因组浏览器（http://genome.ucsc.edu）[56]生成跟踪截图。我们手动注释H3K27me3域作为丰富的块在翅膀或眼睛想象光盘，或在幼虫大脑的分析[22]，并列在S1 数据.我们使用 EPDnew 在 dm6 基因组组装[57]中用于发起人位置， FB 2020_03 用于基因注释[58]。在 usegalaxy.org 和 MS Excel 中使用深凳 v3.3.2 和床凳 v.2.29.2 进行分析和显示。发起人信号被提取为碎片计数 +500 bp 围绕 EPDnew 注释基因 TSS 使用 "床凳多可胶合"在床上凳子。每个数据集的值均以S1 数据提供。域名信号中的 H3K27me3 信号在带注释的 H3K27me3 域中使用床上凳子多音素在床凳上以每千基读数（CPKM）的片段计数提取。每个数据集的值均以S1 数据提供。差分表达的基因被定义为在床凳上使用"床凳多科床"在基因长度上拉长RNAPII-S2p的切割和标记的片段。计数表被导入到 degust 诉 4.1.1 （degust.erc.monash.edu），正常化与石灰，并显示为火山情节。基因、折叠变化、FDR 列在S1 数据中。对于发起人热图，分析覆盖范围被垃圾箱 10 bp -1 kb 到 +2 kb 围绕 EPDnew 促销员的注释 TSss，按平均信号订购，并使用深图绘制。显示范围调整为每个热图的最大和最小信号。对于PREs 周围的平均 H3K27me3 覆盖范围，我们在眼假想光盘[24]中使用了 2000 个称为 Polycomb 绑定站点，并选择了属于 H3K27me3 标记域内的前 700 个站点。此列表以S1 数据提供。我们提取并显示平均 H3K27me3 信号 +20 kb 围绕这些网站使用 "计算矩阵" 和 "plotHeatmap" 功能的深图与 10 bp 装箱。图分别缩放到每个数据集中的最大平均信号。对于域的排名排序，跨域的 H3K27me3 的 CPKM 针对每个示例进行了排序，并在 MS Excel 中使用三色条件格式进行热映射，用于低到高值的绿色-黄色-红色。完整列表以S1 数据提供。

protocols.io的详细协议

无花果份额

S1 文本。关键资源表。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009225.s001

（文档）

S1 无花果。机翼和眼睛假想盘的色度分析。

(A）斯皮尔曼在 H3K27me3、H3K4me2 和 RNAPII-S2p 覆盖范围的样本之间相关。数据集之间的相关性由深图中的"绘图关系"功能生成和显示。（B） H3K4me2、RNAPII-S2p 和 K27M 的热图覆盖以基因为中心，从>H3开始。3K27M和>H3 。3K27M >Vg眼盘。K27M 剖析的床图文件用于"计算矩阵"的热图，通过减少深图中的信号来订购 1 bp 装箱和"绘图热图"功能。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009225.s002

（每股收益）

S1 数据。示例和功能。

表1：分析样本ID。表2：H3K27me3域坐标和CPKM表。表3：眼睛和翅膀、眼睛和>Vg、眼睛和>H3.3K27M以及眼睛和>H3.3K27M>Vg假想光盘之间的差异标记H3K27me3域。表4：称为聚通信站点，由[24]策划。表5：EPD新推广器和H3K4me2计数表。表6：眼睛和翅膀想象光盘之间的不同表达基因。表7：眼睛和>Vg假想盘之间的不同表达基因。表8：眼睛和>H3之间的微分表达基因。3K27M假想光盘。表9：眼睛和>H3之间的微分表达基因。3K27M >Vg想象光盘。表10：眼睛和>Polycomb_RNAi假想盘之间的不同表达基因。表11：眼睛和翅膀想象光盘之间的不同表达基因。表12：眼睛和>Vg假想盘之间的不同表达基因。表13：眼睛和>H3之间的微分表达基因。3K27M假想光盘。表14：眼睛和>H3之间的微分表达基因。3K27M >Vg想象光盘。表15：眼睛和>Polycomb_RNAi假想盘之间的不同表达基因。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009225.s003

（XLSX）

确认

我们感谢杰伊·萨西和德里克·詹森斯的评论。本研究使用了从布卢明顿德罗索菲拉股票中心（NIH P40OD018537）获得的股票和从发育研究杂交瘤银行（由NIH的NICHD创建）获得的抗体。

引用

00001. 1.高桥 K，山中 S （2006）.通过定义的因素从小鼠胚胎和成人成纤维细胞培养物中诱导多能干细胞。单元格 126：663–76。下午：16904174。

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